专利名称：一种从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种从谷胱甘肽发酵液中采 用磁性纳米材料提取分离高纯度谷胱甘肽的方法，属于谷胱甘肽制备技术领域。
背景技术：
谷胱甘肽是一种具有重要生理活性的三肽，即r-L-谷氨酰-L-半胱 氨酰-甘氨酸(glutathione, GSH)。半胱氨酸上的巯基为其活性基团，但巯基 容易引起两个分子谷胱甘肽的偶联，谷胱甘肽有两种形式还原型(GSH)和氧 化型(GSSG)，在生理条件下以还原型谷胱甘肽占绝大多数，谷胱甘肽还原酶 能催化两型间的互变。谷胱甘肽的相对分子量为307.33，熔点189 193"C，晶 体呈无色透明长柱状，等电点为2.83。它易溶于水，可溶于稀醇、液氨。不溶 于醇，醚和丙酮。它广泛分布于动物、植物和油料种子中。它在细胞中的功能 之一就是抵御各种毒素和致癌剂。有研究表明(孙洪刚，等.谷胱甘肽的代谢和 应用.卫生职业教育.2004， 10: 126-127):谷胱甘肽在小肠中能被完全吸收， 并且某些上皮细胞能利用外源谷胱甘肽去毒，这说明膳食中的谷胱甘肽决定着 人体中细胞免受损伤的程度。除作为抗毒剂外，谷胱甘肽还对一些巯基酶有激 活作用，可作为保护酶和其它蛋白巯基的抗氧化剂，在生物氧化、氨基酸转运、 保护血红蛋白等过程中起一定作用。另外，谷胱甘肽还具有抑制衰老、预防糖 尿病、消除疲劳等作用。谷胱甘肽在强化食品风味的同时对人体有保健作用， 它的应用前景明显优于其它类型的抗氧化剂和防腐剂。最近研究还发现谷胱甘 肽具有抑制艾滋病的作用。因此，研究谷胱甘肽对人类的健康和生活具有重要 的意义。
经破壁离心后的酵母谷胱甘肽粗提液浓度很低，而且含有蛋白质、多糖、 多肽、氨基酸、色素、盐类等很多杂质，因此高纯度、高收率的谷胱甘肽工业 化分离非常困难。目前报道的提取分离发酵液中的谷胱甘肽GSH分离方法有萃取法、铜盐法、离子交换法、电渗析法、金属亲和层析法、双水相分离等方法。
萃取法制备GSH所使用的溶剂可以是水、有机酸溶液和稀醇等，但提取收率低，
且造成严重的环境污染。铜盐污染大，影响产品纯度。复旦大学的苑小林等人
(苑小林，等.鲜酵母中谷胱甘肽(GSH)分离纯化的初步研究[J].药物生物技 术，1998， 5 (2): 89-91)将对氨基苯汞乙酸连接到聚苯乙烯-二乙烯基苯载体 上，形成含有机汞的化学亲和树脂，用于吸附GSH，回收率为83%，但在高浓度 盐作用下，汞容易从树脂上断开，影响后续分离和产品纯度。
在国家专利(申请号200610040606. 3)"—种从谷胱甘肽发酵液中提取谷胱 甘肽的方法"中指出采用谷胱甘肽发酵液离心得酵母细胞、调节pH、沸水破 壁方法，提取细胞中的谷胱甘肽；使用001X7阳离子交换技术去除小分子物质， 最终达到从发酵液中浓縮纯化谷胱甘肽的目的，制得分子量为307.33，蛋白质 含量为23%、提取收率为80.5°/。的白色粉末状谷胱甘肽成品。但是，离子交换树 脂不能彻底的去除料液中的杂质与色素，尚不能达到结晶浓度，且在解析过程 利用盐酸解析，在解析液pH很低，欲进行结晶，必须用碱调节pH，在溶液中产 生盐份，在浓縮结晶过程形成干扰，不利于结晶。无法做到药用98%以上的纯度 要求。另外在细胞破壁时温度控制95-10(TC，温度过高会导致GSH氧化，影响 收率。而且在我国部分地区由于海拔高，在常压下无法达到该温度，不便于生 产操作。
在国家专利(申请号200510002408. 3)"谷胱甘肽分离纯化方法"中指出 选择含有-S-R基团或-S-S-R'基团的分离介质，将分离谷胱甘肽的介质进行预 处理后，填装成层析柱，用pH值1. 0-10. 0的缓冲液平衡层析柱，调pH值1. 0-10. 0 的谷胱甘肽抽提液上样，用同样的缓冲液冲洗后，用碱或酸洗脱，可得到只含 谷胱甘肽的洗脱液。由于介质对谷胱甘肽的高度专一选择吸附，可以有效的将 谷胱甘肽分离出来，实现从谷胱甘肽抽提液中一步分离就高度纯化，谷胱甘肽结晶后可以得到纯度为99°/。的产品。但是，该方法因为利用层析理论进行分离，
由于边缘效应的影响，无法进行生产放大。
到目前为止，谷胱甘肽的工业化分离纯化存在收率低、污染严重、浓縮和 层析过程成本高等问题。如何提高收率、降低成本、减小对环境污染，是实现 工业化生产的重点，本发明方法具有工艺流程简单、高效、节省成本、环境污染 小等优点，具有重要的工业应用价值
发明内容
本发明的目的是提供一种从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽 的方法，利用磁性纳米材料对谷胱甘肽吸附的高度专一性，并结合磁性纳米材 料容易被分离的特性，制备高品质、高含量的谷胱甘肽的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为
一种从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法，其特征在于该方法包 括以下步骤
(1) 发酵液离心将下罐后的发酵液离心，离心转速为3000 5000rpm，时间 为5 10min，得到湿酵母细胞菌体；
(2) 热水抽提以6 10份沸腾去离子水与1份湿酵母细胞菌体的比例，将水 和湿酵母细胞菌体混合加入抽提罐后，在沸水浴中进行抽提，同时搅拌抽提液， 搅拌转速为300 350rpm，当抽提液温度达到85 95。C时，保温10min 15min后， 停止抽提，将抽提液倒出，水浴降温至室温；
(3) 磁性纳米材料吸附GSH:按照抽提液中GSH量计算，在抽提液中加入相当 于GSH 1 2倍质量的磁性纳米材料，边加边搅拌，使之充分均匀，搅拌转速为 100 200rpm，加入磁性纳米材料继续搅拌20min后，用电磁场沉降吸附有GSH的 磁性纳米材料；
(4) 解吸附将吸附了GSH的磁性纳米材料在解吸附罐中用O. 1 0.6mol/L的 酸解析，每克磁性纳米材料中加入20 30mL的解析液，使GSH从磁性纳米材料上脱离，用电磁场沉降磁性纳米材料，得到富含GSH的解析液；
(5) 电渗调解析液的pH值至1 6，对解析液进行电渗处理，收集富含GSH的 溶液；
(6) 减压浓縮减压浓縮电渗后的GSH溶液，按照下列条件进行真空度 -0. 07 -0. 098Mpa，旋转速度40rpm,温度50 60°C ，浓缩至GSH浓度250mg/ ml 以上，得到GSH浓縮液；
(7) 冷冻干燥将谷胱甘肽浓縮液冷冻干燥24 36小时，得到谷胱甘肽成品， 成品性状为白色粉末。
上述步骤(l)中所述的发酵液，其发酵水平至少应达到1650mg/L。 上述步骤(3)中所述的磁性纳米材料是表面包覆有功能基团亚氨基二乙酸的
纳米级&304磁性微粒，可以和谷胱甘肽的巯基发生专一性吸附，从而有效直接
的吸附谷胱甘肽。
上述步骤(4)中解析所用的酸选用硫酸、盐酸、醋酸或硝酸。
本发明提供的上述从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法，与现有 技术相比，具有以下有益效果
(1)磁性纳米材料对GSH具有高度专一的选择性吸附，几乎完全把GSH从 谷胱甘肽抽提液中吸附到磁性纳米材料上，避免了为得到高纯度GSH而除去抽 提液中其他杂质的烦琐工序，提取收率达到98%以上，降低能耗80 90%，工作 量为原来的十分之一，并为后续纯化提供了良好条件。
(2)加入0. 1 0. 6mol/L的酸进行解析，GSH和少量含-SH的物质能够完全 从磁性纳米材料上被解析，调节溶液PH值为1 6后电渗处理，得到富含GSH 的溶液。整个过程容易集成控制，避开了层析法带来的放大效应、操作复杂、 生产周期长、投资大等不利于工业化的因素。该法操作简单，縮短工时，减少 人力、物力消耗，节约能源，环境污染小，大大提高GSH提取收率及纯度。
具体实施方式
实施例1:
取发酵水平为1650mg/L的发酵液5L，用转速为3000rpm的离心机离心 10min，得到湿酵母细胞1500g。湿酵母细胞中GSH含量为5. 50g/kg。将1500g 湿酵母细胞加入9L沸水中，同时搅拌抽提液，搅拌转速为300rpm。当抽提液温 度达到95'C时，保温15分钟后，停止抽提。将抽提液流水冷却，降温至室温。 抽提液中加入磁性纳米材料8.25g，边加边搅拌，使之充分混匀，搅拌转速为 100rpm。磁性纳米材料完全加入后继续搅拌20分钟，用电磁场沉降吸附了 GSH 的磁性纳米材料。弃去上清液，解析罐中加入O. 1M的盐酸溶液165ml解析，使 GSH从磁性纳米材料上脱离，用电磁场沉降磁性纳米材料，得到富含GSH的解析 液。用等量去离子水洗磁性纳米材料，洗液与解析液合并为电渗处理液。调电 渗处理液pH值1.0后，进行电渗处理，收集富含GSH的溶液。减压浓縮电渗后 的GSH溶液，真空度-0. 098MPa，温度50。C，得到纯的谷胱甘肽浓縮液。将谷胱 甘肽浓縮液冷冻干燥24小时，得到纯谷胱甘肽5. 80g。提取收率为70. 3%，得 到纯度大于98. 5%的白色疏松粉末。
实施例2:
取发酵水平为1650mg/L的发酵液5L，用转速为5000rpm的离心机离心5min， 得到湿酵母细胞1500g。湿酵母细胞中GSH含量为5. 50g/kg。将1500g湿酵母 细胞加入15L沸水中，同时搅拌抽提液，搅拌转速为350rpm。当抽提液温度达 到85'C时，保温10分钟后，停止抽提。将抽提液流水冷却，降温至室温。抽提 液中加入磁性纳米材料16. 5g,边加边搅拌，使之充分混匀，搅拌转速为200rpm。 磁性纳米材料完全加入后继续搅拌20分钟，用电磁场沉降吸附了 GSH的磁性纳 米材料。弃去上清液，解析罐中加入0.6M的硝酸溶液495ml解析，使GSH从磁 性纳米材料上脱离，用电磁场沉降磁性纳米材料，得到富含GSH的解析液。用 等量去离子水洗磁性纳米材料，洗液与解析液合并为电渗处理液。调电渗处理液pH值6.0后，进行电渗处理，收集富含GSH的溶液。减压浓縮电渗后的GSH 溶液，真空度-0.08MPa，温度6(TC，得到纯的谷胱甘肽浓縮液。将谷胱甘肽浓 縮液冷冻干燥36小时，得到纯谷胱甘肽5. 92g。提取收率为71.8%，得到纯度 大于98%的白色疏松粉末。 实施例3:
取发酵水平为1650mg/L的发酵液5L，用转速为4500rpm的离心机离心8min， 得到湿酵母细胞1500g。湿酵母细胞中GSH含量为5. 50g/kg。将1500g湿酵母 细胞加入10L沸水中，同时搅拌抽提液，搅拌转速为320rpm。当抽提液温度达 到9CTC时，保温13分钟后，停止抽提。将抽提液流水冷却，降温至室温。抽提 液中加入磁性纳米材料10g，边加边搅拌，使之充分混匀，搅拌转速为180rpm。 磁性纳米材料完全加入后继续搅拌20分钟，用电磁场沉降吸附了 GSH的磁性纳 米材料。弃去上清液，解析罐中加入0.3M的硫酸溶液250ml解析，使GSH从磁 性纳米材料上脱离，用电磁场沉降磁性纳米材料，得到富含GSH的解析液。用 等量去离子水洗磁性纳米材料，洗液与解析液合并为电渗处理液。调电渗处理 液pH值5.0后，进行电渗处理，收集富含GSH的溶液。减压浓縮电渗后的GSH 溶液，真空度-0.07MPa，温度55"C，得到纯的谷胱甘肽浓縮液。将谷胱甘肽浓 縮液冷冻干燥30小时，得到纯谷胱甘肽5. 84g。提取收率为70.8%，得到纯度 大于98%的白色疏松粉末。
对比实施例l:
取发酵水平为1650mg/L的发酵液5L，用转速为2000rpm的离心机离心3min， 其他条件依照实施例l，结果由于离心转速太低，时间短，没能使酵母细胞充分 沉降而导致收率降低，最终仅得到谷胱甘肽4.63g，收率为56.1%。
对比实施例2:
改变抽提液温度达到82t:，保温8min，其它操作同实施例1，结果由于抽提温度低，保温时间短，使细胞破壁不彻底，仅得到谷胱甘肽4.81g，提取收率
为58. 3%。
对比实施例3:
依照实施例l得到抽提液后，在抽提液中加入磁性纳米材料6g，其它操作同 实施例l，结果由于加入的磁性纳米材料太少，没能将抽提液中的谷胱甘肽完全 吸附，导致收率降低，仅得到谷胱甘肽4.35g，收率为52.7%。
对比实施例4:
改变解析罐中加入的解析液为0. 06M的硝酸溶液，其它操作同实施例l，结 果由于解析酸浓度过低，解析不彻底，仅得到谷胱甘肽4. 98g，提取收率为60. 3%， 纯度为89. 5%。
对比实施例5:
依照实施例l，待电磁场沉降吸附了GSH的磁性纳米材料，弃去上清液，在 解析罐中加入0.1M的盐酸溶液120ml解析，使GSH从磁性纳米材料上脱离，用电 磁场沉降磁性纳米材料，得到富含GSH的解析液。用等量去离子水洗磁性纳米 材料，洗液与解析液合并为电渗处理液。调电渗处理液pH值7.0后，进行电渗处 理，其他依照实施例l。结果由于解析液用量太少(小于20ml/g磁材料)，使得谷 胱甘肽没有完全被解析下来，以及电渗pH值过高，导致谷胱甘肽收率降低，纯 度降低。最终仅得到谷胱甘肽3.86g，纯度88.5%，收率46.8%。
对比实施例6:
依照实施例l，电渗后得到富含谷胱甘肽的溶液。减压浓縮电渗后的谷胱甘 肽溶液，真空度-0.06MPa，温度70"C，结果由于真空度过低，浓度过高，再浓 縮过程中谷胱甘肽被氧化，仅得到谷胱甘肽4.36g，纯度95.3%的白色疏松粉末， 提取收率为52.8%。
权利要求
1. 一种从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)发酵液离心将下罐后的发酵液离心，离心转速为3000～5000rpm，时间为5～10min，得到湿酵母细胞菌体；(2)热水抽提以6～10份沸腾去离子水与1份湿酵母细胞菌体的比例，将水和湿酵母细胞菌体混合加入抽提罐后，在沸水浴中进行抽提，同时搅拌抽提液，搅拌转速为300～350rpm，当抽提液温度达到85～95℃时，保温10min～15min后，停止抽提，将抽提液倒出，水浴降温至室温；(3)磁性纳米材料吸附GSH按照抽提液中GSH量计算，在抽提液中加入相当于GSH1～2倍质量的磁性纳米材料，边加边搅拌，使之充分均匀，搅拌转速为100～200rpm，加入磁性纳米材料继续搅拌20min后，用电磁场沉降吸附有GSH的磁性纳米材料；(4)解吸附将吸附了GSH的磁性纳米材料在解吸附罐中用0.1～0.6mol/L的酸解析，每克磁性纳米材料中加入20～30mL的解析液，使GSH从磁性纳米材料上脱离，用电磁场沉降磁性纳米材料，得到富含GSH的解析液；(5)电渗调解析液的pH值至1～6，对解析液进行电渗处理，收集富含GSH的溶液；(6)减压浓缩减压浓缩电渗后的GSH溶液，按照下列条件进行真空度-0.07～-0.098Mpa，旋转速度40rpm，温度50～60℃，浓缩至GSH浓度250mg/ml以上，得到GSH浓缩液；(7)冷冻干燥将谷胱甘肽浓缩液冷冻干燥24～36小时，得到谷胱甘肽成品，成品性状为白色粉末。
2. 根据权利要求1所述的从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法， 其特征在于该方法步骤(l)中所述的发酵液，其发酵水平至少应达到1650mg/L。
3. 根据权利要求1所述的从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法， 其特征在于该方法歩骤(3)中所述的磁性纳米材料，是表面包覆有功能基团亚氨基二乙酸的纳米级FeA磁性微粒。
4. 根据权利要求1所述的从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法， 其特征在于该方法步骤(4)中解析所用的酸，选用硫酸、盐酸、醋酸或硝酸。
全文摘要
本发明提供了一种从谷胱甘肽发酵液中提取分离谷胱甘肽的方法，它包括以下步骤发酵液离心、热水抽提、磁性纳米材料吸附GSH、解吸附、电渗、减压浓缩及冷冻干燥。该方法利用磁性纳米材料对谷胱甘肽吸附的高度专一性，并结合磁性纳米材料容易被分离的特性，避免了为得到高纯度GSH而除去抽提液中其他杂质的烦琐工序，提取收率达到98％以上，降低能耗80～90％，工作量仅为原来的十分之一，并为后续纯化提供了良好条件。该方法操作简单，减小成本，环境污染小，大大提高GSH提取收率及纯度。
文档编号C07K5/037GK101429228SQ20081023383
公开日2009年5月13日 申请日期2008年12月14日 优先权日2008年12月14日
发明者孙永龙, 曲国臣, 肖泽民 申请人:甘肃正生生物科技有限公司