受体、其应用以及小鼠抗体的制作方法

专利名称：：受体、其应用以及小鼠抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及在快速增殖的细胞表面，特别是胃癌细胞表面发现的受体，其应用，以及特异性结合在其上的小鼠抗体的结构。
背景技术：
：采用从杂交瘤产生的单克隆抗体用于临床和科学试验已广为人知。将由B细胞杂种细胞产生的人单克隆抗体用于治疗肿瘤、病毒和微生物感染、抗体生成减少的B细胞免疫缺乏症和其它免疫系统机能障碍大有前途。胃癌是全世界最频繁发生的癌症类型之一。根据Lauren的文章“Thetwohistologicallymaintypesofgastriccarcinoma，，，ActaPath.Microbiol.Scand.64331-49，胃癌细胞在组织学上分为弥散型腺癌细胞和肠腺癌细胞。肠胃癌常伴有慢性B型胃炎，特别是伴有肠化生，其被认为是发育不良病变和胃癌的前兆。这两种类型的区别也表显为患有弥散型癌症的病人通常为A型血，从这一点可以看出遗传因素对发癌率的影响，而环境因素如幽门螺杆菌感染对于肠型癌症的发生的影响也可能很显著。在西方，胃腺癌的发病人数已在不断减少，但在东方发病人数却在日益增多。胃癌的发展是一个多步骤、多因素的过程(Correa，1992，CancerRes.526735-6740)。尽管对其分子作用机制所知甚少，但已经过明确证实如高盐摄入量、酒精、亚硝胺、以及幽门螺杆菌(H.pylori)感染等因素与引发胃癌有关。由于幽门螺杆菌感染与胃炎，发育不良以及胃癌的发展有很大联系，这种细菌已被WHO归类为第1类致癌物质。幽门螺杆菌在粘膜环境下直接导致严重的癌症前期细胞病变，还是造成自身抗体增加的原因，在胃炎和胃癌患者体内经常可观测到这种自身抗体增加(Negrini等，1996，Gastroenterol.Ill:655_665)。这些抗体可导致胃损伤和胃上皮细胞凋亡(Steiniger等，1998，VirchowsArch.43313-18)。抗原的部分性质至今仍是未知的。在胃粘膜或胃癌瘤中经常可发现胃H+/K(+)-ATP酶抗体(Claeys等，1998，Gastroenterology115340-347)，白介素-8(Crabtree等，1993，Scand.J.Immunol.37:65_70；Ma等，1994Scand.J.Gastroenterol.29:961_965)以及路易斯血型抗原(Appelmelk等，1997，Trends.Microbiol.5:70_73)。直到现在，治疗方法还仅限于胃切除术和淋巴结切除术；不过，由于预后能力还很差，就需要有新的伴随疗法。免疫研究表明，即使在免疫系统不能有效抗击恶性细胞的情况下，仍可测量到细胞和体液的活性，但其活性不足以破坏肿瘤细胞。目前有效的方法是分离出由患者的免疫应答产生的抗体，以适当的方法复制该抗体，并用于治疗。这样，例如从患有肺癌、食道癌、和结肠癌的病人中产生的抗体被分离出来，并可从这些抗体衍生出人的单克隆抗体，它们可以，例如，直接影响肿瘤细胞的分化和生长。细胞凋亡是渐进的细胞死亡，是细胞的自毁，通过DNA破碎，细胞萎缩和内质网扩张，随之是细胞破碎和形成膜结合囊泡或凋亡体而完成。凋亡，细胞死亡的生理形式，保证了快速干净地清除不需要的细胞，而不会引发炎症过程或组织创伤，如在坏死的情况下发生的。在病理条件下，细胞凋亡还可用于除去恶性细胞，如癌症前体细胞。它可通过各种不同的刺激引发，如通过细胞毒性T-淋巴细胞或细胞因子，如肿瘤坏死因子、糖皮质激素类以及抗体。凋亡是真核细胞死亡的最经常原因，且在胚胎形成、变态和组织萎缩时发生。细胞表面的凋亡受体，如NGF/TNF族受体，主要在淋巴细胞上表达，但也可在各种其它细胞类型中找到，因此它们不适于治疗癌症。特别是，这些受体的配体和抗体在体内试验中可导致肝损伤。因此，具有凋亡功能的特定肿瘤受体尤其重要。
发明内容在最近的出版物中，我们描述了人抗体103/51，该抗体是从患有弥散型腺癌的胃癌病人中分离得到的，其与幽门螺杆菌和胃癌细胞进行交叉反应(Vollmers等，1994，Cancer74=1525-1532)0在所有的测试中，都用到了已知的胃腺癌细胞系23132，该细胞系保存在DSMZ-德国微生物保藏及细胞培养股份有限公司(DSMZ-GermanCollectionofMicroorganismsandCellCulturesGmbH),MascheronderWeglb,38124Braunschweig,保藏号为ACC201。在低剂量时，该抗体通过结合在一个130kD的膜受体上对胃癌细胞在体外有有丝分裂作用(Hensel等，1999，Int.J.Cancer81:229_235)。对该抗体基因区域的测序识别出抗体103/51是自体抗体。免疫组织化学研究表明该抗体与胃癌细胞和腺胃细胞反应剧烈。单克隆抗体103/51的细胞受体以前是未知的。在产生本发明的实验过程中，我们可以识别出这种细胞受体。不过，这个识别过程很困难。一方面，在蛋白质印记分析中单克隆抗体103/51仅在非常特别的严格条件下才与其受体反应。另一方面，可发现通过人工变性作用其与一系列其它蛋白发生非特异性反应。序列分析表明该受体相应于CFR-I蛋白，但又不与该蛋白相同。此外，本申请要求保护具有一个或多个相应于已知的CFR-I的决定簇(配体)的糖蛋白类化合物。特别是，要求在本申请中定义为对应性的同源性在一级氨基酸序列中至少为80%。因此，该受体与CFR-I是同种型。另外，要求特异性结合在人抗体103/51和/或鼠类抗体58/47-69上。如果在糖蛋白上的特异性结合位点是碳水化合物残基，即糖残基，则其尤其令人感兴趣。在一个特别的实施方案中，CFR-I蛋白具有附件S细胞系23132的氨基酸序列为其决定簇。抗体103/51的细胞受体是CFR-I蛋白的同种型，对肿瘤细胞，特别是胃癌细胞有特异性，而不会对正常组织作用。该同种型的特异性受体的性质是基于经N-联接连接在蛋白质骨架上的特殊糖结构。肿瘤特异性受体可用于识别特异性结合的配偶体的方法中。按照本发明，受体的特异性结合配偶体是选择性地结合在CFR-I的肿瘤特异性糖结构上的化合物，且优选具有诱导凋亡的能力。这些特异性结合配偶体可用于生产治疗肿瘤的药物以及生产诊断剂。所述蛋白化合物通过纯化、测序和转染确定为CFR-I的同种型。对抗原103/51的特异性通过从具有识别反应和功能的纯化分子生产鼠抗体、经免疫组织化学染色、以及对两个CFR-I阴性细胞系的MTT测试而确定。通过人和鼠的抗体而确定的CFR-I分子的同种型定位于上皮细胞的细胞膜且具有不同于以前所述CFR-I的表达方式(Burrus等，1992，Mol.Cell.Biol.12:5600_5609)。CFR-1，从鸡成纤维细胞分离出来的高亲和力FGF-结合蛋白(FGF=成纤维细胞生长因子)(Burrus等，1992，Mol.Cell.Biol.125600-5609)，结合在许多FGFs上且据称在调节细胞增殖方面起作用。在中国仓鼠卵细胞(CHO)中，在高尔基体中发现CFR-I(Burrus等，1992，Mol.Cell.Biol.12:5600_5609)，不过它也可以变异的形式被分泌出来(Zuber等，1997，J.Cell.Physiol.170:217-227)。取决于器官，CFR-I的两种检测到的变体，ESL-1(E-选择蛋白-配体1)和MG-160(膜唾液酸糖蛋白160)具有80%-95%的序列同源性(Burrus等，1992，Mol.Cell.Biol.12:5600_5609；Stieber等，1995，Exp.Cell.Res.219562-570；Steegmaier等，1995，Nature373:615_620；Mourelatos等，1996，DNACellBiol.151121-1128)而且似乎与其它已知的蛋白质不具有任何序列同源性。CFR-I及其同源物的功能和细胞分布相对是未知而且矛盾的。已有报道说MG-160，一种从大鼠大脑中纯化而得的中间高尔基唾液酸糖蛋白，在细胞内FGF运输中起作用(Zuber等，1997，J.Cell.Physiol.170217~227)。近来的发现表明所述蛋白的定位并不限于高尔基体。如果截短C-末端，该蛋白也可定位于质膜和丝足(Gonatas等，1998，J.Cell.Sci.Ill:249_260)。这与下列发现相一致，所述发现是从小鼠嗜中性粒母细胞(32Dcl3)分离出来的第三种同源体ESL-1，其既定位于高尔基体也定位于微绒毛细胞的表面(Steegmaier等，1997，J.Cell.Sci.110687-694，Gonatas等，1998，J.Cell.Sci.Ill249-260)。ESL-I被识别为嗜中性粒细胞中E-选择蛋白的配体，其大约分子量为150kD。与抗ESL-I抗体的免疫沉淀反应表明该蛋白未经定义的同种型可从各种细胞中沉淀出来，包括一些癌细胞系(Steegmaier等，1995，Nature373:615_620)。由于CFR-I主要在癌细胞膜上分布，我们认为所描述的受体是CFR-I的同种型。CFR-I及其同源物的可变的细胞分布可能与所述及的结果有关并且对其它蛋白来说是一种已知的现象(Smalheiser,1996,Mol.Biol.Cell7:1003-1014)。可变的分布可能是恶性细胞中不同的糖基化模式引起的，其可导致向质膜的转运。组织分布表明CFR-I分子与通过用抗体Ki67着色证明的细胞活化和增殖相关(Ramires等，1997，J.Pathol.18262~67)。正常的胃粘膜不会以可测量的量表达该受体，但幽门螺杆菌浸润的上皮细胞和发育不良的上皮细胞具有该抗原。两种组织都增殖且可能是胃癌的前体。为了理解高效性，要提到的重要一点是与在健康细胞中发现的CFR-I的结构相比，所表征的同种型并未在健康细胞中发现，而是全部在快速繁殖的细胞，即快速分化的细胞如在肿瘤生长及其相应前体阶段发现的肿瘤细胞中发现。受体的功能基本上以其被用作细胞摄入养分的能量受体且其尤其在频繁分化的细胞，如癌细胞中具有高含量。特别要提到的是该受体不仅可在胃癌中应用，而且也可应用于所有具有基本相同的反应机制的上皮肿瘤中。除了胃肿瘤，已证明这些受体还存在于下列肿瘤的癌变组织中食道、胃、肠、直肠、肝脏、胆囊、胰腺、肺、支气管、乳房、宫颈、前列腺、胃贲门、Barrett's、卵巢和/或子宫。连接在本发明的受体上的对肿瘤有效的抗体，因此具有在癌细胞(非正常细胞)上的定靶活性。受体结构的糖蛋白可经其大约130kD的分子量进行识别，该分子量可采用已知的方法，如用凝胶电泳来测定。术语“大约”基于以下本领域技术人员可认可的事实，即这些测定大小的类型无论如何都不精确，测定分子大小的方法的变化或差别会导致测量值的差别。应用该受体的最重要的领域是诊断和治疗。在预防性应用中，将受体以药用剂量给病人用药，目的是刺激抗体，以便借助于受体达到接种疫苗的目的。抗体负责除去任何产生的肿瘤细胞。不过，即使已经存在肿瘤细胞，施用受体也是一种可能的治疗方法。施用受体促进并增强了抗体的形成，因此增加了肿瘤细胞的凋亡或补体介导的细胞溶解。由于受体的阻断作用导致生长停止，细胞“饿死”。到目前为止的分析表明该受体经证实尤其适合于治疗肿瘤前体。对于胃的疾病，该受体适于治疗胃粘膜发育异常和/或胃的肠上皮化生，和/或治疗与幽门螺杆菌有关的胃粘膜炎，以及治疗胃管状和管状绒毛(tubulovillfiser)腺瘤。该受体也可用于下列结肠疾病，特别是如结肠管状腺瘤、结肠绒毛腺瘤、以及溃疡性结肠炎的发育异常。该受体还适用于食道Barrett's发育异常和Barrett‘s化生。该受体还适用于治疗下列宫颈疾病宫顼上皮内瘤样病变I、宫颈上皮内瘤样病变II和宫颈上皮内瘤样病变III。最后，上述受体还适用于支气管鳞片状上皮化生和鳞片状上皮发育异常。由于上文所述的作用机制，该受体原则上适用于治疗食道、胃、肠、直肠、肝脏、胆囊、胰腺、肺、支气管、乳房、宫颈、前列腺、胃贲门、Barrett's、卵巢、和/或子宫的肿瘤。将该受体用于诊断目的时利用了由于特异性抗原/抗体相互作用，抗体结合在受体上的能力。以这种方式，相应抗体的存在、定位和/或数量可从其结合受体的能力得到。以同样的反应机制，该结合能力可用于检测受体。特别地，如果抗体是肿瘤抗体，其可用于检测是否存在肿瘤。尤其该受体可能被用作肿瘤标记物。以精制物的形式，该受体可用于生产抗肿瘤药物，其中测定有潜在抗肿瘤活性的化合物特异性结合在该受体上的能力，如果得到阳性结果，即发生了结合，则将该化合物用于药品应用。当然，如通常一样，对于生产市集药物，必需合适的制剂和加入常用的辅料。特别要提到的是不仅考虑到将人抗体借助于上文所述的受体用于生产抗癌药物，还考虑到了用小鼠抗体和/或任何随意种类的人化的抗体。还考虑到了用抗体片段如Fab和F(ab)2*/或Fab’片段，如通过抗体的蛋白水解裂解得到的。还包括单株抗体和/或四聚的和/或二聚的抗体形式和/或双特异性抗体。另外，已知在小鼠中产生免疫性的人肿瘤抗原被用于生产单克隆小鼠抗体而且其能够特异性识别人抗原，并因此适合用于治疗人的疾病。本发明的目的是确定该受体的结构及其应用。然而，重复向人体注入“外来的”抗体和/或小鼠抗体很成问题，因为这会导致不利的过敏性反应和循环抗体的清除率升高，结果抗体不能达到其靶位。由于这些原因，需要重新检验小鼠抗体的治疗适用性。虽然如此，与诊断方法有关的适用性并未加以限制。也存在研制人化的小鼠抗体并将之用于治疗疾病的可能。重要的是不仅已经存在的肿瘤，而且癌前结构都可借助于这些诊断方法进行确定。除了上文所述的受体，也要求保护特异性结合在所述受体上小鼠抗体，其结构由附件A和B定义。没有复制所有抗体都相同的区域；对每一单个抗体的特征区域要求保护并显示其结构。结果是，对受体的结构进行了描述，其被指定为CFR-I的同种型，该受体使得不仅可对肿瘤而且可对癌前结构进行治疗和诊断。另外，还描述了特异性结合在该受体上的小鼠抗体的结构。材料和方法细胞培养和抗体纯化所有的试验都采用已知的胃腺癌细胞系23132(HenSel等，1999，Int.J.Cancer81:229-235)。在补充了10%FCS和青霉素/链霉素(均为)的RPMI-1640(PAA，Vienna,Australia)中培养细胞至80%融合。对于所述试验，将细胞用胰岛素/EDTA分离并在应用前用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次。人杂肿瘤细胞系103/51是按Vollmers等，1994，Cancer74:1525_1532所述方法进行生产和培养的。IgM抗体的纯化如别处所述的方法进行(Vollmers等，1998，Oncol.Rep.5:549_552)。膜萃取物的制备如Hensel等描述的方法(Hensel等，1999，Int.J.Cancer81:229_235)，用细胞系23132从肿瘤细胞分离出膜蛋白。简言之，将融合的肿瘤细胞用PBS洗两次，用刮细胞器收集并离心分离，再重新悬浮于低渗缓冲液中(20mMHEPES,3mMKCl,3mMMgCl2)。在冰上培养1511^11后，随之超声处理51^11，在10，00(^离心分离lOmin，以使胞核以离心饼形式沉出。在外开式转子中在100，OOOg将上清液离心分离30min以使膜以离心饼形式沉出。在用低渗液洗涤离心饼，将其重新悬浮于膜溶解缓冲液中(50mMHEPESpH7.4,0.lmMEDTA,10%甘油，和TritonX-100)。向所有溶液中加入蛋白酶抑制剂(Boehringer,Mannheim，德国)。蛋白质印迹法在其他地方所述的标准条件下通过10%的SDS-PAGE凝胶分离和进行蛋白质印迹法试验(Hensel等，1999，Int.J.Cancer81:229_235)。简言之，用含有2%低脂奶粉的PBS阻断有印记的硝化纤维膜，随后用10μg/ml纯化的抗体103/51培养1小时。在用PBS+0.05%吐温-20洗涤三次后，培养次级抗体(过氧化物酶偶合兔抗人IgM抗体(Dianova，Hamburg，德国))。借助于来自Pierce(KMF，St.Augustin，德国)的超信号化学发光试剂盒检测该反应。抗原103/51的纯化该抗原的纯化通过应用Pharmazia(Freiburg，德国)FPLC单元经柱色谱而完成。对于尺寸排除色谱，将5mg膜制品装载到PharmaziaSuperdex200柱(XK16/60)上并用缓冲液A(100mMTris/Cl,pH7.5,2mMEDTA,40mMNaCl,1%TritonX-100)洗脱。然后将洗脱液分级，并用蛋白质印迹分析检测其与抗体103/51的反应。用缓冲液A把阳性组分装载IlJMonoQ(5/5)柱上。用缓冲液B(100mMTris/Cl,pH7.5,IMNaCl,2mMEDTA，IMNaCl,1%TritonX-100)线性梯度洗脱结合蛋白，分级并用Coomassie染色的SDS-PAGE和用蛋白质印迹法进行检测。从凝胶上挖出阳性带，进行测序或用于使小鼠免疫。MALDI肽定位图将感兴趣的带切下来并将之割成大约ImmXImm的小块。洗涤凝胶块，用DTT还原，用碘乙酰胺进行S-烷基化，用胰蛋白酶(未修饰的，测序级，Boehringer)如其他地方所述的方法(Shevchenko等，1996，Anal.Chem.68850-858)将凝胶内物质消化。在37°C消化3小时后，除去0.3μ1的消化液，并在配有延迟萃取器(Bruker-Franzen，Bremen,德国)的BrukerReflexMALDI-TOF上进行MALDL肽质谱测定。采用薄膜技术进行样品制备(Jensen等，1996，Rapid.Commun.Mass.Spectrom.10:1371_1378)。对此应用胰蛋白酶肽质量以通过发明人开发的PeptideSearch的软件程序研究探索的非冗余蛋白序列数据库。CFR-I克降反义载体和转染如文献所述分离RNA，合成cDNA，和进行PCR(Hensel等，1999，Int.J.Cancer81229-235)。简言之，为进行第802-1699碱基对的897bp片段的PCR扩增，采用了下列引物CFR-5，GCTTGGAGAAAGGCCTGGTGAA3，，CFR-Rev5，TGGCACTTGCGGTACAGGACAG3，。采用下列循环分布进行扩增95°C，2分钟，随之是94°C，30秒；60°C，30秒；72°C，60秒；以及72°C，4分钟的35次循环。克隆入PCR-ScriptAmpSK(+)载体以及DNA测序如前述文献所述的方法进行(Hensel等，1999，Int.J.Cancer81:229_235)。插入物被亚克隆到pHook-2载体(Invitrogen,Leek,Netherlands)中，而克隆再通过测序进行检测。用pHook-抗CFR-I转染细胞系23132用Primefaktor试剂(PQLab，ErIangen，德国)按照供应者的使用手册完成。简言之，将质粒DNA稀释至10yg/ml，以110的比例将激发因子试剂加入无血清培养基中。将稀释的质粒DNA(450μ1)，稀释的Primefector试剂(90μ1)，和无血清培养基(460μ1)混合并在室温(RT)下培养。60毫升的细胞培养皿(70%融合)用无血清基洗两次，然后逐滴加入Primefector/DNA混合物。将细胞在37°C和7%的CO2中培养18小时，然后用含有10%FCS的生长培养基替代无血清培养基并继续培养细胞24小时，然后研究CFR-I表达。流式细胞测量转染48小时后用胰蛋白酶/EDTA从培养皿中分离出细胞系23132，洗涤并随后在冰上与抗体103/51或与人同型对照抗体(Chromopure人IgM)—起培养15分钟，然后与FITC标记的兔抗人IgM抗体(Dianova)—起在冰上培养15分钟。抗体最优选在含有0.01%叠氮化钠的PBS中稀释。通过流式细胞计(FACScan；BectonDickinson,USA)对细胞进行分析。糖苷酶分析将分离下来并洗过的细胞重新悬浮于含有10%FCS的RPMI-1640中，在冰上培养1小时，然后计数，制备Cytospins。空气干燥后，将Cytospins制品用丙酮固定(10分钟)，洗涤，与20μυ/πι10-糖苷酶或5mU/mlN-糖苷酶(Boehringer)在37°C培养4小时。然后洗涤载玻片并进行免疫组织化学染色。为了膜蛋白的脱糖基化，将膜萃取物与在脱糖基化缓冲液(50mMP00-缓冲液，pH7.4)中稀释的lmU/mlN-糖苷酶一起在37°C培养16小时。作为对照，将萃取物单独与脱糖基化缓冲液一起培养。然后用前文所述的方法通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分离萃取物。鼠单克降抗体的制备17天内用5iig纯化的抗体103/51的抗原对BALB/c小鼠免疫两次，在第二次免疫后4天杀死。将其脾脏机械破碎并与前文述及的1X107个NS0细胞(Vollmers等，1985，Cell40:547-557)融合。经免疫组织化学染色法和蛋白质印迹分析中的反应测定产生抗体的杂交瘤。具有阳性反应活性的克隆58/47-69用作进一步试验。石蜡切片的免疫组织化学染代把嵌入石蜡的具有肿瘤细胞的人胃粘膜切片(5iig)除去石蜡，并用在PBS中稀释的BSA(15mg/ml)阻断30分钟。将该切片用被BSA/PBS(Dako，Hamburg，德国)按115稀释的杂种细胞103/51，或58/47-69，Ki67(Loxo，Dossenhein，德国)或小鼠抗细胞角蛋白8抗体的上清液在加湿的孵化器中培养2小时。然后用Tris/NaCl洗涤三次，随之与按150在含有兔血清(对于抗体103/51)的PBS或含有人AB血浆(对于抗体58/47-69和抗细胞角蛋白)的PBS中稀释的过氧化物酶标记的兔抗人或兔抗小鼠结合物(DakO)—起培养。在用Tris/NaCl洗涤三次和在PBS中培养10分钟后，在室温下用二氨基联苯胺(0.05%)-过氧化氢(0.02%)染色10分钟。在流动的自来水中停止反应，用苏木紫对切片进行复染色。活细胞和丙酮固定的细胞的免疫组织化学染饩为对活细胞进行染色，将细胞分离出来，洗涤并稀释至1X106个细胞/ml。在1500g将1ml细胞悬浮液离心分离5分钟。加入完全用RPMI稀释至40ug/ml的抗体至最终体积为1ml并在冰上培养90分钟。然后在1500g5分钟使细胞离析成饼然后重新悬浮于500iURPMI中。用200iU细胞悬浮液，制得cytopsin制品并空气干燥30分钟。将细胞在丙酮中固定30分钟并用Tris/NaCl洗涤三次。将HRP偶合的兔抗人IgM(DAKO)用PBS/BSA(0.1%)按150稀释并在室温下培养30分钟。三次洗涤后，按上文所述进行染色。为对丙酮固定的细胞进行染色，制备了Cytospins，按上文所述的方法在室温下空气干燥并在丙酮中固定。然后，将Cytospins用PBS/BSA(0.1%)阻断15分钟并与10yg/ml初级抗体培养30分钟，随后洗涤三次。按上文所述的方法与次级抗体一起培养和进行染色。MTT-增殖试验按照已有描述的方法(Vollmers等，1994，Cancer741525-1532)对已知的细胞系23132进行MTT试验。简言之，将受胰蛋白酶作用的细胞生长培养基中稀释至1X106个细胞/ml，然后向96孔板的每一孔中加人50yl细胞悬浮液。然后将用生长培养基稀释至指定浓度的50yl抗体加入孔中，将该板在增湿的孵化器中于37°C培养一或两天。为了测量，向每一孔中加入50illMTT(3(4，5二甲基噻唑)-2，5二苯基四唑溴化物)溶液(5mg/ml))，将所述96孔板培养30分钟。培养后，在800g将培养板离心分离5分钟，除去MTT溶液，将染色的细胞饼溶于150ill二甲基亚砜中，测定其在波长540nm和690nm的吸光度。测定CFR-1序列的方法借助于来自Quiagen的RNeasy试剂盒制备用于cDNA合成的RNA。制备时，用冰冷的PBS将1X106个细胞洗涤两次，并在1000Xg离心5分钟得到细胞饼，按照制造商的说明书制得RNA。将5iig1^八(1-5111溶液)禾口1111寡-(11\5(1118/111)以及2ill任意引物(40uM)混合并用H20添至总体积为8ill。将RNA在65°C变性10分钟，随后将样品在冰上冷却。然后向其中逐滴加入17iUMastermix，其由5.2ylDEPC-H20,5u15X逆转9CN101812133A说明书8/28页录酶缓冲液，2.5u1dNTPs(各10mM),2.5u1DTT(250mM),0.8u1RNasin(400U)，禾口1ii1M-MLV逆转录酶(200U)组成。cDNA的合成在37°C进行了70分钟，随后通过加热至95°C5分钟终止反应。将1-5u1cDNA与PCRMastermix混合并添加水直至总体积为25yl。PCRMastermix包括2.5ii110XTaq-聚合酶缓冲液，0.5ii110mM的NTPs，1.5-2ii125mM的MgCl2，各0.5iU20pM的3’和5’引物，以及0.2illTaq聚合酶(1U)。各种PCR产物的放大条件列于下表中。用于放大各种cDNAs应用的PCR程序列表产物退火温度MgCl2延伸时间循环数产品大小[°C][mM][sec][bp]片段1551，754540691片段2601,54540898CFR片段3552，04540739片段4552，04540941片段5552，04540750引物序列用于PCR的;寡核苷酸的序列CFRCFR-Forl5‘0GCAGCTTCAGGAGCAACAGCA3'CFR-Revl5‘CAGCTCAGCCACCCGGAGAATG3'CFR-For25‘GCTTGGAGAAAGGCCTGGTGAA3'CFR-Rev25‘TGGCACTTGCGGTACAGGACAG3'CFR-For35‘GAACACCGTCTCTTAGAGCTGC3'CFR-Rev35‘GCTTCCTGCAGAGTGTCATTGC3'CFR-For45‘GGAGGACGTGTTGAAGCTTTGC3'CFR-Rev45‘CCAGGGCACAAGCAGTATGAAG3'CFR-For55‘CAACAGCAGACAGGTCAGGTGG3'CFR-Rev55‘CCGGAAGTTCTGTTGGTATGAG3'用AppliedBiosystems公司的自动化序列分析仪进行测序。下列寡肽用于对克隆的PCR产品进行测序T35'ATT‘TAACCCTCACTAAAGGG3/T75'GTA,TACGACTCACTATAGGGC3/将如2、4、15所述分离的3iil质粒DNA和ly.1引物(3.2pM)、lliil7jC禾口5iilAbiprismSequencingKit的反应混合物混和，并采用下列参数在温度循环器中循环25次变性退火延长_95°C，30秒52°C，15秒60°C，4分钟为了除去低寡和dNTPs，把反应混合物用S印hadexG_50柱进行纯化。为了达到纯化的目的，用柱填充材料填充一个100u1的移液管头直至其上沿并在2000xg离心3分钟，随后将样品上到小柱加载再把该柱进行离心。然后把DNA用2iU的醋酸钠(pH5.2)和50iU100%的乙醇沉淀出来并在13，000xg离心15分钟得到离析饼。经干燥，将DNA加到3iU甲酰胺/25mMEDTA(51)中的，在自动化测序器中进行了测序。序列测定分析在所有克隆中至少对5个克隆进行了序列测定。为了排除在用Taq-聚合酶进行扩增和/或序列测定时产生的错误，借助于Windows软件DNAsis将克隆的PCR片段的序列相互之间进行比较，从两个读序方向建立了所有克隆的共同序列。通过将DNA序列重新写入氨基酸序列，就可以确定沉默突变和氨基酸置换突变的数量。由NCBI数据库绘出了MG160和CFR的序列并用Windows软件DNAsis与PCR产物的排序进行了比较。图1识别抗体103/51的抗原a)从胃癌细胞系23132的膜萃取物中得到的抗原的蛋白纯化。将膜组分进行色谱法纯化，而对整个膜组分(泳道2)或纯化蛋白(泳道3)用Coomassie(泳道1:10kDa序列梯)进行染色。用抗体103/51在细胞系23132的膜组分上进行的蛋白质印迹法分析表明与分子量为大约130kD的蛋白(泳道4)反应。所纯化的膜萃取物的特异性用103/51(泳道5)通过蛋白质印迹法控制。从制备用凝胶上切下由箭头指示的蛋白质带并将之用于MALDI质以及小鼠免疫。b)用高分辨MALDI肽质来识别130kDa的凝胶分离蛋白。标记有‘*，的峰以高于50ppm的质量准确度符合U28811人富含半胱氨酸的成纤维细胞生长因子受体(CFR-1)的胰蛋白酶的肽的计算质量。标记有‘T’的峰相应于胰蛋白酶自溶产物。插块表示在m/z1707.818时峰的高分辨质量(m/Am=9000)。图2:CFR-1反义转染对抗体103/51染色和活细胞染色(放大倍数200x)的作用a)用对照载体对细胞系23132瞬间转染并且丙酮固定化表现出与抗体103/51增强的染色。b)在用CFR-1反义载体转染的细胞中可看到染色减弱。c)为了减弱免疫组织化学染色的背景染色，对细胞系23132的活细胞进行染色。可见到清晰的膜染色。d)用于对照的细胞系23132的活细胞染色(仅为次级抗体)。e)用抗体103/51在细胞系Colo-699上的阴性活细胞染色表明该细胞系对CFR-1的表达是阴性的。f)在细胞系Colo-699上进行对照活细胞染色(仅为次级抗体)。g)具有Chromopure人IgM(灰色)抗体和抗体103/51的细胞系23132的流式细胞测量。h)在转染后48小时用流式细胞计对用对照载体pHOOK-2转染的细胞进行分析。i)用CFR-1反义载体转染的细胞表现出结合抗体103/51的能力明显降低。图3用抗体103/51染色的去糖基化作用a)用去糖基化缓冲液培养细胞(23132)并用丙酮固定表现出用抗体103/51增强的染色。b)用N-糖基化酶处理随后用丙酮固定的细胞(23132)表现出染色显著减弱。c)去糖基化对细胞系23132的膜萃取物在蛋白质印迹分析中与抗体103/51的反应的影响。用去糖基化缓冲液(Buffer)培养16小时的萃取物在染色时与未经处理的萃取物(对照)相比没有表现出明显差异。用N-糖基化酶培养时则使得在染色时染色明显减弱(N-glyco)。图4用鼠抗体58/47-69和103/51在胃腺癌细胞上进行免疫组织化学染色为了表现抗体103/51和鼠抗体58/47-69相同的特异性，将弥散型胃腺癌细胞用苏木精-曙红(a)，抗体103/51(b)和58/47-69(c)进行染色，以及抗细胞角蛋白18为阳性对照。(c)和(d)的相同染色表明了它们相同的特异性(箭头=肿瘤细胞)。图5抗体103/51在各种胃组织的免疫组织化学染色用HE，抗体Ki67(为了表示增生细胞)和抗体103/51对胃组织的冷冻切片进行染色(放大倍数X100)a)有炎症的胃组织b)幽门螺杆菌诱发的胃炎(插图给出了标记的腺体放大图)c)发育异常d)胃腺癌图6用抗体103/51在各种癌变组织和正常组织的免疫组织化学染色给出了抗体103/51在下列组织的染色结果Vater壶腹部癌变(a)，乳腺癌侵袭性小叶(b)，肠腺瘤和肠的未经染色的正常杯状细胞细胞(c)，肝细胞癌(d)，肾上腺小球带和束状带(e)，高尔基体的肾专一性染色的收集管(箭头)(f)。a_d的箭头表示肿瘤细胞，(c)中的红色箭头=杯状细胞，(f)中的箭头表示高尔基体(放大倍数400x，(g)例外为200x)。图7由比色MTT-法测定的抗体103/51和58/47-69对细胞系的刺激作用a)用纯化的抗体103/51滴定表现出高达4yg/ml的刺激值增加。更高的浓度不会导致更高的刺激(c=对照，未加入抗体)。b)用相同浓度(4ug/ml)的纯化抗体103/51和58/47-69进行MTT-试验表明在一或两天的培养后二者表现出对肿瘤细胞23132的类似的刺激作用。(对照1=Chromopur人IgM，对照2=不相关的小鼠IgM)。c)细胞系23132用对照载体pH00K_2或CFR-1反义载体瞬间转染，培养24小时，进行MTT-试验测定用4yg/ml的纯化抗体103/51在加入24小时后对该细胞系的刺激作用。未转染的细胞也进行培养作为对照(对照=不相关的人IgM)。d)MTT-试验，用相同浓度(4iig/ml)的抗体103/51作用于不同的上皮肿瘤细胞系，表明在加入抗体24小时后仅对CFR-1阳性细胞系23132表现出刺激作用。CFR-1阴性细胞系Colo-699和EPLC-272H没有对抗体103/51作用而表现出任何刺激作用。表1抗体103/51与不同组织的反应模式抗体染色的计分方式如下_=无染色，+=中等程度染色，++=强染色。HCC-肝细胞癌，1增殖区，腺体小凹，2肾小球，束状带(膜的染色)，3内质网集合管。附件A附件B附件S由细胞系23132得到的CFR-1的氨基酸序列和已经公布的CFR-1和MG160的序列的比较这些实验上的比较主要表明从细胞系23132得到的CFR-1蛋白不同于以前已知的CFR-1序列，而是它的一个同种型。除了与以前已知并已公布的CFR-1和MG160的不同外，该氨基酸序列被看作是一般要求保护的受体的一个特别的实施方案，其独特的特征在于第一和特别标明的位点。具体实施例方式抗原103/51的纯化和鉴定用白质印迹法表明抗体103/51结合在胃癌细胞的大约130kD的膜蛋白上。我们用序列尺寸排除法和离子交换色谱法预先对该蛋白进行了纯化(图la)。从Coomassie-染色的制备用SDS-PAGE上割下该蛋白，一部分用于制备小鼠单克隆抗体(详见下文)，另一部分用于通过由Shevchenko等概括的方法(1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9314440-14445)来识别蛋白。用胰蛋白酶进行凝胶内消化3小时后，取出了大约总消化体积并进行高准确度MALDI肽质谱(保留剩余的消化物用于纳米电喷雾分析，以防MALDIMASS不能产生确定的识别结果)。尽管MALDI分析仅用了毫微微摩尔量的蛋白消化物，数据库检索搜索到35个肽与CFR-1序列吻合，质量准确度在50ppm之内。这些肽包括了CFR-1序列的29%，因此确定可以识别计算分子量为大约134kD的蛋白(Burrus等，1992，Mol.Cell.Biol.125600-5609)(图lb)。用CFR反义载体瞬时转染的细胞系23132对抗体103/51染饩和活细胞染饩的影我们用免疫组织化学法和流式细胞测量术研究了胃癌细胞系23132的反义转染效果。为此将碱基对802和1699间区域的CFR的897bpPCR片段按与CMV启动子的反义方向用PH00K载体克隆。洗过的细胞用pH00K-CFR反义载体，pHOOK-lacZ和pHOOK载体在中间步骤转染。用0-半乳糖苷酶测定法控制转染(数据未给出)。转染48小时后，制备了cytospin制剂并用抗体103/51和抗体细胞角蛋白18染色作为对照(数据未给出)。免疫组织化学法显示，与对照细胞比较，用pHOOK-CFR反义载体转染的细胞的染色明显减弱(图2a-b)。这确证了抗体103/51结合在CFR-1上。在两种染色中均可见的轻微细胞质染色可能是由于非特异性结合，这种非特异性结合经常在用人IgM抗体在丙酮固定的细胞上染色时观察到。还用流式细胞法测定了细胞表达和转染的效果(图2g-i)。数据表明在用CFR-1反义载体转染细胞后，与抗体103/51的结合能力下降。不过，未经处理的细胞或用对照载体PH00K-2转染的细胞表现为明显结合在细胞系23132上，说明了CFR-1在细胞膜上的表达。为了研究CFR-1同型物的特异性膜分布，我们用细胞系23132和一些非胃癌细胞系进行活细胞染色。在细胞系23132上我们发现了清晰的染色(图2c，d)而人肺腺瘤细胞系Colo-699(图2e，f)和EPLC_272H(数据未给出)则显然呈负结果。该实验数据表明所述CFR-1同型物并未在所有的癌细胞系中存在，而唯一的23132细胞的膜染色说明CFR-1同型物具有不同于目前已有描述的CFR-1的分布的分布。糖苷酶测定CFR-1是具有5个可能的N-糖基化位点的唾液酸糖蛋白，通过用糖苷酶F处理已表明该分子在这些位点进行糖基化(Steegmaier等，1995，Nature373:615-620)。由于肿瘤反应性抗体通常与碳水化合物残基反应，我们研究了是否抗体103/51也是如此。将细胞系23132的Cytopsin制剂用0-和N-糖苷酶培养4小时，然后用抗体103/51进行免疫组织化学染色。用N-糖苷酶处理的细胞在103/51染色中表现出惊人的减弱(图3b)，而用脱磷酸缓冲液(图3a)或用0-糖苷酶处理(数据未给出)则对抗体103/51与细胞的结合没有影响。这表明抗体103/51结合的特异性必须定位于糖端残基，而不能在初级蛋白序列中。为了进一步核实这种作用，将细胞系23132的膜萃取物脱糖基化16小时，然后进行蛋白质印迹试验并用抗体103/51染色。我们发现与对照裂解产物相比，在用N-糖苷酶培养的裂解产物上反应减少(图3c)。#^鼠类秘禾_胃醜舰t刀片_龍械由于抗CFR-1的抗体不是可商供的，我们用从Coomassie-染色的SDS-凝胶冲洗下来的纯化蛋白对小鼠免疫用以生产单克隆抗体并增强其特异性，而且也进一步表征了CFR-1的表达。通过与heteromyelomaNS0融合使脾细胞永生。用免疫组织化学染色测试了150个克隆。对阳性克隆再进行克隆，克隆58/47-49(IgM)用于进一步表征。为了研究人抗体103/51和鼠类抗体58/47-69的结合性质，我们对15个不同的胃腺癌细胞和一个腺细胞的石蜡切片进行染色，发现正常上皮组织的腺细胞具有同样的染色而癌细胞的染色很强(图4)。简言之，早期癌(n=2)可被两种抗体染色。对于肠癌细胞，两种抗体都对5例中的4例进行了染色，对于弥散型癌组织所有的切片(n=4)都被染了色，而中间型的癌用两种抗体染色的阳性率都是50%(n=4)。这些结果表明CFR-1在大多数胃癌中的高表达。所研究的腺瘤组织表明只是在从正常细胞转换为转化细胞的转变中具有阳性细胞的明确染色模式。用抗体103/51对胃粘膜进行免疫组织化学染饩为了更详细研究抗体103/51在胃粘膜上的反应性，我们在没有炎症、与幽门螺杆菌有关的慢性活动性胃炎、重度发育不良以及胃腺癌的胃组织进行免疫组织化学染色。在没有炎症的胃组织上没有看到任何反应(图5)。不过，在患有幽门螺杆菌胃炎的病人的胃粘膜上我们发现主要在小凹细胞的基础地带发生染色。抗体103/51的染色模式表现出如由Ki67染色表现的活动模式的很强的相关性(Ramires等，1997，J.Pathol.182:62_67)。在胃发育不良部位的增殖区可看到抗体103/51的更强染色，这也与用Ki67染色相吻合。最强的染色可在胃腺癌增殖区看到。抗体103/51和58/47-69在不同组织上的免疫组织化学染饩我们通过用抗体103/51和58/47-69对石蜡切片进行免疫组织化学染色研究了CFR-1在其它癌组织和正常组织中的表达。在15种癌组织中(不同于胃癌)，抗体103/51对其中13种表现出染色作用(图6，表la)。在肺退行性发育的细胞上观察到负的染色作用，印证了用细胞系Colo-699和EPLC-272H进行的免疫组织化学染色和MTT-试验结果。该实验数据表明了CFR-1的过度表达及其在恶性转化细胞的细胞膜上的分布。经过对28种正常14组织的试验，我们发现仅在三种肠器官上的限制表达(表lb)。在胃的腺体小凹和肾上腺小球带和束状带可观察到膜染色，而在肾脏集合管可看到对高尔基体的染色(图5)。这进一步确证了抗原CFR-I的特征，所述特征以前由Burrus等描述过(1992，Mol.CellBiol.125600-5609)。用人和鼠类单克降抗体讲行刺激如以前的出版物中所述的(Vollmers等，1994，Cancer74:1525_1532；Hensel等，1999，Int.J.Cancer81:229_235)，抗体103/51在体外可导致细胞系23132的刺激。我们用线粒体羟化酶测定法(MTT)测定了抗体103/51的刺激，MTT法是测定增殖的标准方法(Carmichael等，1987，CancerRes.47:936_942)。为了进一步研究抗体103/51的刺激性质，我们用不同浓度的纯化抗体培养细胞系23132。发现浓度依赖性刺激在4μg/ml时有最高活性(图7a)。更高的浓度使得刺激有轻微降低。为了试验是否鼠类抗体58/47-69对细胞生长有同样的作用，我们用等量的纯化抗体进行MTT-刺激试验。由图7b可看到，两种抗体都在体外引起对细胞系23132的刺激。这进一步确证了两种抗体相同的特异性。为了确证抗体103/51和鼠类抗体58/47-69的刺激作用是通过结合CFR-I而介导的，我们用对照载体pHOOK-2和CFR-I反义载体转染细胞，并用MTT试验测定转染细胞。作为转染的阳性对照，细胞也用pHOOK-2-lacZ载体转染并随之用β_半乳糖苷酶染色(数据未给出)。由于在未转染的细胞和用对照载体pHOOK-2转染的细胞中观察到的刺激程度相当，可排除两种抗体会受转染方法影响而减弱刺激作用。相反，用CFR-I反义载体转染的细胞明显表现出刺激减弱(图7c)。最后，为了表明由抗体103/51作用的刺激不会被CFR-I之外的其他受体所调节，我们用细胞系23132进行了MTT-刺激试验并将之与CFR-I-负性肺癌细胞系Colo-699和EPLC-272H进行比较。虽然细胞系23132如上文所述受到刺激，但这两种肺癌细胞系没有表现出任何受抗体103/51的刺激作用(图7d)，印证了在免疫组织化学中观察到的结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><213>小鼠<220>抗体NM58-49/69的重链可变区(VH)的序列<221>V区<222>(1)...(288)<400>tcctgcaaggettctggctacaccttcactgactactatataaactgggtgaagcagagg60SerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspTyrTyrlieAsnTrpValLysGlnArg15101520actggacagggccttgagtggattggagagatttatcctggaagtggtaatacttactac120ThrGlyGlnGlyLeuGluTrplieGlyGlulieTyrProGlySerGlyAsnThrTyrTyr25303540aatgagaagttcaagggcaaggccacactgactgcagacaaatcctccageacagcctac180AsnGluLysPheLysGlyLysAlaThrLeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyr45505560atgcagctcageagectgacatctgaggactctgcagtctatttctgtgcaagatcggga240MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCysAlaArgSerGly50556065ttacgaccctatgetatggactactggggtcaaggaaccteagtcacc288LeuArgProTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGlnGlyThrSerValThr707580附件B<110>Prof.Dr.MulIer-Hermelink,HansKonradProf.Dr.VolImers,HeinzDr.Hensel,Frank<112>受体、其应用及小鼠抗体<141)03/09/02<211>315bp<212>DNA<213>小鼠<220>抗体N158-49/69的轻链可变区(VL)的序列<221>V区<222>(1)...(315)<400>ccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatetcttgcagatctagtcag60ProLeuSerLeuProValSerLeuGlyAspGlnAlaSerlieSerCysArgSerSerGln15101520ageattgtacatagtaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccag120SerlieValHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuGluTrpTyrLeuGlnLysProGlyGln25303540tctccaaagctcctgatetacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttc180SerProLysLeuLeulieTyrLysValSerAsnArgPheSerGlyValProAspArgPhe45505560agtggcagtggateagggacagatttcacactcaagateageagagtggaggetgaggat240SerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLyslieSerArgValGluAlaGluAsp65707580ctgggagtttattactgctttcaaggtteacatgttccgtacacgttcggaggggggacc300LeuGlyValTyrTyrCysPheGlnGlySerHisValProTyrThrPheGlyGlyGlyThr859095100aagctggaaataaaa315LysLeuGlulieLys105附件S<110>Prof.Dr.MulIer-Hermelink,HansKonradProf.Dr.Vollmers，HeinzDr.Hensel,Frank<112>受体、其应用及小鼠抗体<141)03/09/02<211>3114<212>DNA<213>人<220>胃癌细胞系23132的富含胱氨酸的FGF受体<221>CDS<222>(450)—(3563)<400>450GATGTGAGGGAGCCTGAAAATGAAATTTCTTCAGACTGCAATCATTTGTTGTGGAATTATAspValArgGluProGluAsnGlulieSerSerAspCysAsnHisLeuLeuTrpAsnTyr143145150155160AAGCTGAACCTAACTACAGATCCCAAATTTGAATCTGTGGCCAGAGAGGTTTGCAAATCTLysLeuAsnLeuThrThrAspProLysPheGluSerValAlaArgGluValCysLysSer165170175180ACTATAACAGAGATTGAAGAATGTGCTGATGAACCGGTTGGAAAAGGTTACATGGTTTCCThrlieThrGlulieGluGluCysAlaAspGluProValGlyLysGlyTyrMetValSer185190195200TGCTTGGTGGATCACCGAGGCAACATCACTGAGTATCAGTGTCACCAGTACATTACCAAGCysLeuValAspHisArgGlyAsnlieThrGluTyrGlnCysHisGlnTyrlieThrLys205210215220ATGACGGCCATCATTTTTAGTGATTACCGTTTAATCTGTGGCTTCATGGATGACTGCAAAMetThrAlalieliePheSerAspTyrArgLeulieCysGlyPheMetAspAspCysLys225230235240AATGACATCAACATTCTGAAATGTGGCAGTATTCGGCTTGGAGAAAAGGATGCACATTCAAsnAsplieAsnlieLeuLysCysGlySerlieArgLeuGlyGluLysAspAlaHisSer245250255260CAAGGTGAGGTGGTATCATGCTTGGAGAAAGGCCTGGTGAAAGAAGCAGAAGAAAGAGAAGlnGlyGluValValSerCysLeuGluLysGlyLeuValLysGluAlaGluGluArgGlu265270275280CCCAAGATTCAAGTTTCTGAACTCTGCAAGAAAGCCATTCTCCGGGTGGCTGAGCTGTCAProLyslieGlnValSerGluLeuCysLysLysAlalieLeuArgValAlaGluLeuSer285290295300TCGGATGACTTTCACTTAGACCGGCATTTATATTTTGCTTGCCGAGATGATCGGGAGCGTSerAspAspPheHisLeuAspArgHisLeuTyrPheAlaCysArgAspAspArgGluArg305310315320TTTTGTGAAAATACACAAGCTGGTGAGGGCAGAGTGTATAAGTGCCTCTTTAACCATAAAPheCysGluAsnThrGlnAlaGlyGluGlyArgValTyrLysCysLeuPheAsnHisLys325330335340TTTGAAGAATCCATGAGTGAAAAGTGTCGAGAAGCACTTACAACCCGCCAAAAGCTGATTPheGluGluSerMetSerGluLysCysArgGluAlaLeuThrThrArgGlnLysLeulie345350355360GCCCAGGATTATAAAGTCAGTTATTCATTGGCCAAATCCTGTAAAAGTGACTTGAAGAAAAlaGlnAspTyrLysValSerTyrSerLeuAlaLysSerCysLysSerAspLeuLysLys365370375380TACCGGTGCAATGTGGAAAACCTTCCGCGATCGCGTGAAGCCAGGCTCTCCTACTTGTTATyrArgCysAsnValGluAsnLeuProArgSerArgGluAlaArgLeuSerTyrLeuLeu385390395400ATGTGCCTGGAGTCAGCTGTACACAGAGGGCGACAAGTCAGCAGTGAGTGCCAGGGGGAGMetCysLeuGluSerAlaValHisArgGlyArgGlnValSerSerGluCysGlnGlyGlu405410415420ATGCTGGATTACCGACGCATGTTGATGGAAGACTTTTCTCTGAGCCCTGAGATCATCCTAMetLeuAspTyrArgArgMetLeuMetGluAspPheSerLeuSerProGlulielieLeu425430435440AGCTGTCGGGGGGAGATTGAACACCATTGTTCCGGATTACATCGAAAAGGGCGGACCCTASerCysArgGlyGlulieGluHisHisCysSerGlyLeuHisArgLysGlyArgThrLeu445450455460CACTGTCTGATGAAAGTAGTTCGAGGGGAGAAGGGGAACCTTGGAATGAACTGCCAGCAGHisCysLeuMetLysValValArgGlyGluLysGlyAsnLeuGlyMe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Q20091016119公开日2010年8月25日申请日期2002年7月23日优先权日2001年7月24日发明者弗兰克·亨瑟尔,汉斯·康拉德·穆勒-赫梅宁克,海因茨·沃尔默斯申请人:德拜奥维森公司