专利名称：一种苄嘧磺隆人工免疫原be-bsa及其制备和用途的制作方法
技术领域：
本发明属苄嘧磺隆的多克隆抗体领域，特别是涉及一种苄嘧磺隆人工免疫原 BE-BSA及其制备和用途。
背景技术：
节嘧磺隆是20世纪80年代中期由美国杜邦公司开发的一种新型的磺酰脲类除草 剂，是目前广泛用于稻田杂草防治的主要除草剂之一。苄嘧磺隆属于内吸性除草剂，对一年 生及多年生阔叶杂草和莎草科杂草都有很好的防除效果。如鸭舌草、眼子草、节节菜、陌上 菜、矮慈姑等及莎草科杂草如牛毛草、异型莎草、水莎草、碎米莎草、萤蔺等。对禾本科杂草 防效差，高剂量下对稗草有一定的抑制作用。 苄嘧磺隆使用方法灵活，可用药肥、药土、药砂、喷雾、浇灌等方法，用量20-30g/ hm、可与丁草胺、杀草丹、优克稗、禾大壮、甲磺隆、乙草胺等剂混用，是我国水稻田中使用 面广、时间长、量大的 一种除草剂。 但是，苄嘧磺隆在土壤中的残留可能会对后茬作物油菜等形成药害，所以研究苄 嘧磺隆在土壤中的残留很有必要。国内外检测苄嘧磺隆残留的方法是以仪器分析法为主， 但是仪器分析法前处理过程复杂、操作繁琐、效率低，难以进行快速的测定和现场监测。因 此，建立操作便捷、高灵敏度并适应现场测定的免疫分析方法对检测苄嘧磺隆残留具有重 要的意义。 合格的苄嘧磺隆抗原是免疫得到合格苄嘧磺隆抗体的前提，合格的苄嘧磺隆抗体 是建立苄嘧磺隆免疫分析法的关键。目前，关于苄嘧磺隆抗原抗体的制备，国外已有相关研 究，但国内尚无相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种苄嘧磺隆人工免疫原BE-BSA及其制备和用
途，以克服现有检测技术中对苄嘧磺隆样品预处理复杂、耗时、且需要大量有机溶剂萃取，
以及在检测过程中要用到精密昂贵的仪器而不适于推广使用和不利于当环境污染事故发
生在野外时的现场快速检测等缺点。 技术方案为
—种苄嘧磺隆人工免疫原BE-BSA，结构式如下
<formula>formula see original document page 4</formula><formula>formula see original document page 4</formula>
其中BSA是牛血清蛋白，该物
质的合成方法见权利要求2。
本发明采用活化酯法合成嘧磺隆人工免疫原BE-BSA，其反应方程式如下
<formula>formula see original document page 5</formula> 本发明一种节嘧磺隆人工免疫原BE-BSA的制备方法，步骤如下 (1)苄嘧磺隆半抗原的合成将苄嘧磺隆溶解在NaOH溶液中，在室温下搅拌5
7天。用氯仿萃取分液，水层用盐酸酸化至pH2 3，减压过滤，真空干燥，得到白色固体，在
甲醇_乙醚中重结晶获得白色晶体状的苄嘧磺隆半抗原BE，干燥后得纯品。 (2)节嘧磺隆人工免疫原的合成将节嘧磺隆半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺
(NHS)和N， N' -二环己基碳酰亚胺(DCC)溶于有机溶剂中，室温下磁力搅拌5 6h，然
后在4t:下继续反应12 15h，离心取上清液；将上清液加入到溶有蛋白质的硼酸盐缓
冲溶液(pH8)中，室温反应20 30h，其中所述的半抗原、NHS、DCC、蛋白质的摩尔比为
i : 0.1-0.2 : l-2 : 0.003-0.005 :反应完毕，将溶液装入透析袋，用磷酸盐缓冲溶液
透析。透析后分离出上清液，即得苄嘧磺隆人工免疫原BE-BSA偶联物，分装免疫原，并 于-2(TC下保存。 所述步骤(1)中的节嘧磺隆的分子结构式为
<formula>formula see original document page 5</formula> 所述步骤(1)中节嘧磺隆半抗原的化学名称为节嘧磺隆酸，分子j
结构式如下
:为396. 4，分子<formula>formula see original document page 6</formula> 所述步骤(2)中的有机溶剂是N，N'- 二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亚砜(DMSO)。
本发明的一种苄嘧磺隆人工免疫原BE-BSA的用途，通过免疫动物制备特异性抗 体，能与苄嘧磺隆发生特异性免疫反应的免疫球蛋白IgG，用于检测水体、土壤中痕量的苄 嘧磺隆，便于进行现场检测。 由于苄嘧磺隆是小分子物质，只具有免疫反应性而不具有免疫原性，而且该分子
上没有能与蛋白质直接结合的氨基、羟基、羧基等基团，故本发明用水解的方法使苄嘧磺隆
分子带上一个羧基，然后用活性酯法将含有羧基的半抗原与蛋白质偶联制备出苄嘧磺隆的
人工免疫原。再利用此人工免疫原对新西兰大白兔免疫，获得高效价、高特异性的苄嘧磺隆
多克隆抗体，此抗体应用于建立免疫分析法以检测环境中苄嘧磺隆。 有益效果 本发明所制备的苄嘧磺隆特异性抗体具有如下优点 (1)实用性强苄嘧磺隆多克隆抗体的制备技术具有重要的使用价值和实际意 义，制备的抗体特异性好、效价高，以抗原抗体免疫学反应为基础可用于样品测定；此抗体 及其制备方法为免疫分析法测定环境中痕量的苄嘧磺隆提供保障，也为磺酰脲类除草剂快 速检测试剂盒的研制解决了一大技术难点。
(2)稳定性好本发明制备的苄嘧磺隆抗体具有较好的稳定性。 (3)抗体制备技术简便可行抗体整个制备过程无需特殊仪器设备，成本低廉，容 易工业化规模生产。
图1是节嘧磺隆人工免疫原BE-BSA的紫外光谱图； 其中1为蛋白质BSA， 2为苄嘧磺隆人工免疫原BE-BSA， 3为苄嘧磺隆BE。
具体实施例方式
下面结合具体实例对本发明作进一步阐述，应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可对本发明作各种改动或修改，这些等价同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。 实施例1 (1)苄嘧磺隆半抗原的合成 称取0. 5g苄嘧磺隆溶解于60mL0. lmol/L NaOH溶液中，在室温下搅拌150h。用 2 X 25mL氯仿萃取，水层用盐酸酸化至pH2，减压过滤，真空干燥，得到白色固体，在甲醇-乙 醚中重结晶获得白色晶体状的苄嘧磺隆半抗原。
(2)苄嘧磺隆半抗原的鉴定 取上述合成的苄嘧磺隆半抗原少许，用溴化钾压片后红外扫描，结果如下 [v (cm—1) ] :3423 (s， N_H) ， 3300—2500 (w， 0_H) ， 1722 (s， C = 0) ， 1610， 1580， 1500， 1452 (s， C =C) ， 1365， 1153 (s， S = 0) ， 1200 (s， C_0)。与文献报道的节嘧磺隆的红外光谱比较，半抗 原的红外光谱图中有明显的羧基(-C00H)吸收峰，说明苄嘧磺隆分子上已经引入了羧基， 可以与蛋白质偶联。 将节嘧磺隆半抗原用二甲亚砜溶解(DMSO)，测定样品的核磁共振谱CHNMR)， 结果如下(S，DMSO) :13.20(s，lH， COOH—H) ， 12. 05 (s， 1H， NH—H) ， 10. 64 (s， 1H， NH—H)， 7. 90-7. 36 (m， 4H， Ar_H) ， 5. 92 (s， 1H， pyrimidine-H) ， 5. 35 (s， 2H， CH2_H) ， 3. 73 (s， 6H，
CH3-H)。氢谱鉴定的结果表示在苄嘧磺隆分子上成功引入了羧基，可以与蛋白质偶联合成 免疫原。 (3)苄嘧磺隆免疫原的合成 称取步骤(1)中合成的节嘧磺隆半抗原0. 159g(0. 39mmol)、 NHSO. 046g(0. 06mmol)和DCCO. 091g(0. 44mmol)溶解于2mL无水DMF中，室温磁力搅拌5h， 然后在4t:下继续反应12h，离心取上清液，得到活性酯2mL。称取O. lg BSA溶于lOmL硼酸 盐缓冲溶液(pH 8)。在强烈搅拌下将2mL活性酯缓慢(lh)加入BSA溶液中，室温反应24h。 用磷酸盐缓冲溶液(PH 7. 4)透析5d所得混合液。前2d每天透析5次，后3d每天透析3 次。离心分出上清液，即得到苄嘧磺隆人工全抗原BE-BSA。分装所得免疫原，并于-2(TC下 保存。 (4)苄嘧磺隆免疫原的鉴定 常用的鉴定人工免疫原结合比的方法是紫外光谱法。按常规来说，只要人工免疫 原的紫外光谱图与原蛋白载体和半抗原的紫外图谱相比发生了变化，即可间接说明人工免 疫原制备成功。 由紫外光谱图可知，节嘧磺隆半抗原BE在242nm处有特征吸收峰，蛋白质BSA在 278nm处有最大吸收峰，而节嘧磺隆人工免疫原BE-BSA偶联物的特征吸收峰在258nm处，与 蛋白质和半抗原比较都发生了移动，偶联物具有半抗原和蛋白质的吸收特征，说明已经成 功制备苄嘧磺隆人工免疫原。 根据朗伯-比尔定律，波长一定时混合物的紫外吸收具有加合性。采用全波长紫 外分光光度计对半抗原、载体蛋白及偶联物进行扫描，根据吸收峰可确定偶联是否成功。结 合比计算公式如下
根据在242nm处测得的人工免疫原、蛋白质和半抗原溶液的摩尔吸光系数e ，计 算半抗原与载体蛋白的结合比为31，该结合比值在文献所建议的范围内，证明合成的苄嘧
磺隆免疫原比较理想。
实施例2 (1)苄嘧磺隆抗血清的制备 选取2只健康的雄性新西兰大白兔(约2. 8kg)，饲养于标准实验动物房(由江苏
7省农业科学研究院动物房饲养)，每只兔子单笼饲养，观察一周后免疫。 将实施例1中所合成的苄嘧磺隆免疫原慢慢解冻，用0. 9 %生理盐水或PBS稀释至 lmg/mL，按免疫剂量吸入5mL消毒注射器中。首次免疫加入等量弗氏完全佐剂(CFA)，用聚 氟乙烯塑料管连接另一支5mL消毒注射器，对推至充分乳化，形成油包水(W/0)状态，按免 疫方案注射免疫。 首次注射免疫采用由等量弗氏完全佐剂乳化的免疫原，进行背部皮下多点注射 (40点左右)。首次注射免疫后，间隔四周，以后每隔两周用弗氏完不全佐剂乳化的免疫原 于皮下多点注射加强免疫，免疫剂量为每公斤兔lmg。从第二次开始，每次免疫后7天，于 兔耳缘静脉采血2mL，分离血清，测定抗体效价。当达到一定效价后，采全血。本实验采用 兔心脏采血法，每只兔可采血50mL左右。采血后，置于37t:温箱中1小时，待血液凝固后， 将分离出来的血清吸到离心管中，于4t:冰箱中保存；再将未分离的血液置于4t:冰箱中过 夜，待血块收縮后，再将分离出来的血清吸到离心管中，以4000rmp离心20min，分离出血 清，于-201:冻存。I号兔得血清16mL， II号兔得血清18mL。
(2)苄嘧磺隆抗体效价的测定 将免疫原按制定的方案免疫2只兔子，从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第 七天于兔耳缘静脉采血2mL，血清经适当稀释后，用间接非竞争ELISA法测定效价。检测时 用免疫前的兔血清作阴性对照，血清按10倍连续稀释。兔1和兔2最终抗血清的效价分别 是1 : 2. 5X1()4禾卩1 : 2. 5X105。
权利要求
一种苄嘧磺隆人工免疫原BE-BSA，结构式如下其中BSA是牛血清蛋白。F200910234686XC00011.tif
2. —种苄嘧磺隆人工免疫原BE-BSA的制备方法，其步骤如下(1) 苄嘧磺隆半抗原BE的合成将苄嘧磺隆溶解在NaOH溶液中，搅拌；用氯仿萃取分 液，水层用盐酸酸化，减压过滤，真空干燥，得到白色固体，在甲醇-乙醚中重结晶获得白色 晶体状的苄嘧磺隆半抗原BE，干燥后得纯品；(2) 节嘧磺隆人工免疫原BE-BSA的合成将节嘧磺隆半抗原J-羟基琥珀酰亚胺和N， N' - 二环己基碳酰亚胺溶于有机溶剂中，磁力搅拌5 6h，然后在4t:下继续反应12 15h， 离心取上清液，得到活性酯；将牛血清蛋白溶于硼酸盐缓冲溶液；在强烈搅拌下将活性酯 缓慢加入蛋白质溶液中，反应20 30h ;所得混合液用磷酸盐缓冲溶液透析5天；分装所得 免疫原，并于-2(TC下保存。
3. 根据权利要求2所述的一种苄嘧磺隆人工免疫原BE-BSA的制备方法，其特征在于， 所述步骤(1)中的苄嘧磺隆的分子结构式为<formula>formula see original document page 2</formula>
4.根据权利要求2所述的一种苄嘧磺隆人工免疫原BE-BSA的制备方法，其特征在于， 所述步骤(1)中的苄嘧磺隆半抗原的化学名称为苄嘧磺隆酸，分子量为396.4，分子结构式 如下<formula>formula see original document page 2</formula>
5. 根据权利要求2所述的一种苄嘧磺隆人工免疫原BE-BSA的制备方法，其特征在于， 所述步骤(2)中的有机溶剂是N，N' -二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
6. 根据权利要求2所述的一种苄嘧磺隆人工免疫原BE-BSA的制备方法，其特征在于， 所述步骤(2)中的半抗原、NHS、DCC、蛋白质的摩尔比为1 : 0.1-0.2 : 1-2 : 0.003-0. 005c
7. —种苄嘧磺隆人工免疫原BE-BSA的应用，通过免疫动物制备成苄嘧磺特异性抗体，用于现场检测。
全文摘要
本发明涉及一种苄嘧磺隆人工免疫原BE-BSA及其制备和用途，结构式制备(1)将苄嘧磺隆溶解在NaOH溶液中反应，用氯仿萃取分液，将水层酸化，减压过滤，真空干燥后得纯品；(2)将苄嘧磺隆半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N，N’-二环己基碳酰亚胺(DCC)溶于有机溶剂中，搅拌反应，离心取上清液，得到活性酯。将牛血清蛋白(BSA)溶于硼酸盐缓冲溶液(pH8)，在强烈搅拌下将活性酯加入蛋白质溶液中，反应后透析，分装，并于-20℃下保存；本发明制备简便，成本低，容易工业化生产；苄嘧磺隆人工免疫原BE-BSA通过免疫动物制备成苄嘧磺特异性抗体，用于现场检测水体、土壤中痕量的苄嘧磺隆。
文档编号C07K16/44GK101717443SQ20091023468
公开日2010年6月2日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者夏金云, 岳娟, 李方实, 陆锤 申请人:南京工业大学