专利名称：2",2"-二甲基-吡喃-[5",6":7,8]黄酮的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种从含有2〃，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 7，8]黄酮的植物中 提取纯化化学成分的方法，具体涉及2"，2" - 二甲基-吡喃-[5"，6" :7，8]黄酮的提取 纯化方法。
背景技术：
2〃，2〃 - 二甲基-吡喃-[5"，6" :7，8]黄酮是一种黄酮类成分，该成分在豆科 崖豆藤属植物疏叶崖豆〔Millettia pulchra kurz var. Iaxior (Dunn) Ζ. Wei〕属于首次发 现。在本发明之前没有如何提取纯化该成分的方法收载与文献之中。本发明旨在提供一种 科学合理，稳定可靠的2〃，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 7，8]黄酮提取方法，获得纯度 高于98%的2"，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 7，8]黄酮，该物质可以用于药物质量控制 方法的对照品。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种从含有该成分的植物中提取纯化2"， 2" - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 7，8]黄酮的方法，获得的2〃，2〃 _ 二甲基_吡喃-[5"， 6" :7，8]黄酮，尤其是获得高纯度的2〃，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 7，8]黄酮。所述的提取方法包括以下步骤1、将500重量份含有该成分的植物制成粗粉，用相当于该粗粉4 8倍重量的 70% 95%乙醇提取两次，每次1 2小时。合并提取液，浓缩回收乙醇至比重1. 10 1.30。将浓缩好的稠膏与硅藻土以1 1 1 2的重量比拌样，干燥，然后装柱。以每分 钟0. 6 2重量份的速度，用正己烷洗脱，收集洗脱液，直到洗脱液无色时为止，将洗脱液浓 缩成比重为1. 05 1. 15的清膏a。2、将清膏a与60 180目柱层析硅胶以1 1. 5 1 2. 5的重量比拌样，样品 干燥后装入硅胶柱中。先用体积比为5 1 6 1的正己烷丙酮，以每分钟0. 3 1. 1 重量份的速度进行洗脱，洗脱至洗脱液无色为止。然后用体积比为1 1 3 1的正己 烷丙酮，以每分钟0. 3 1. 1重量份的速度进行洗脱，收集洗脱液，以10 20重量份为 单位进行收集，每一份洗脱液回收溶剂至干，用0. 5 0. 8重量份的氯仿溶解转移至适合的 容器中，然后对该氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有2"，2" - 二甲基-吡喃-[5"， 6" :7，8]黄酮的氯仿液合并，得到氯仿液b。3、将氯仿液b在10 20°C下放置12 M小时，过滤，收集析出结晶，然后在氯 仿液的滤液中加入相当于氯仿液b 0. 3 0. 7倍重量的甲醇，在10 20°C下放置M 48 小时，过滤，收集结晶，将这两部分结晶合并，进行薄层检测，观察杂质点，如有一个杂质点 则进行第5步的操作，如果有多于两个的杂质点，则进行第4步的操作。4、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，甲醇溶解液与120-160目的柱层析硅 胶以1 1.5 1 2. 5的比例拌样，装柱，然后用体积比为3 1的正己烷丙酮，以每分钟0. 2 0. 6重量份的速度进行洗脱，以5 15重量份为单位收集洗脱液，每份回收溶 剂至干，然后用0. 5 0. 8重量份的氯仿溶解转移至适合的容器中，分别将所收集的氯仿液 进行薄层检测，将薄层检测出含有2"，2" - 二甲基-吡喃-[5"，6" :7，8]黄酮的氯仿液 合并，在10 20°C下放置12 M小时，过滤，收集析出结晶，薄层检测是否还有杂质点，如 无杂质点，则进行第6步操作，如果还有杂质点，则进行第5步操作。5、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，然后通过反向硅胶柱，用体积比为 75 25的甲醇水，以每分钟0. 1 0. 3重量份的速度进行洗脱，以2 7重量份为单位 收集洗脱液，浓缩，回收溶剂，直至洗脱液变成0. 4 0. 6重量份的浓缩液为止，将浓缩液转 移至适合的容器中，并用0. 4 0. 6重量份的甲醇润洗原浓缩液容器，转移至适合的容器中 与浓缩液混合，静置12 M小时，过滤，收集析出结晶。6、取第四步纯化后符合要求的结晶或第五步获得的结晶，精密称定，加甲醇制成 每Iml含20 40 μ g的溶液作为供试品溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积 比为85 15的甲醇水为流动相，检测波长为270nm，采用DAD检测器或ELSD检测器中的 一种或两种进行检测，检测除了溶剂峰外，样品峰纯度是否以面积归一化法计算主峰含量 大于总峰面积98. 5%，如检测结果符合该条件，则该化学成分提取纯化完毕，如果不符合该 条件，则继续重复第5项的操作，直至符合为止。所述制备方法中步骤2 4中薄层鉴别方法为以体积比3 1的正己烷丙酮 为展开剂，其中，2〃，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 7，8]黄酮的斑点在365nm紫外灯下观 察荧光显黄绿色，在254nm紫外灯下无斑点；其余斑点为杂质斑点。所述提取方法的优选方法包括以下步骤1、将500重量份含有该成分的植物制成粗粉，用相当于该粗粉6倍重量的70% 95%乙醇提取两次，每次1.5小时。合并提取液，浓缩回收乙醇至比重1.23。将浓缩好的稠 膏与硅藻土以1 1的重量比拌样，干燥，然后装柱。以每分钟1.5重量份的速度，用正己 烷洗脱，收集洗脱液，直到洗脱液无色时为止，将洗脱液浓缩成比重为1. 1的清膏a。2、将清膏a与80 120目柱层析硅胶以1 2的重量比拌样，样品干燥后装入 硅胶柱中。用体积比为5 1的正己烷丙酮，先以每分钟0.7重量份的速度进行洗脱， 洗脱至洗脱液无色为止。然后以每分钟0.7重量份的速度，用体积比为3 1的正己烷 丙酮进行洗脱，收集洗脱液，以15重量份为单位进行收集，每一份洗脱液回收溶剂至干，用 0. 7重量份的氯仿溶解转移至适合的容器中，然后对该氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出 含有2"，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 7，8]黄酮的氯仿液合并，得到氯仿液b。3、将氯仿液b在10 20°C下放置18小时，过滤，收集析出结晶，然后在氯仿液的 滤液中加入相当于氯仿液b 0. 5倍重量的甲醇，在10 20°C下放置M小时，过滤，收集结 晶，将这两部分结晶合并，进行薄层检测，观察杂质点，如有一个杂质点则进行第5步的操 作，如果有多于两个的杂质点，则进行第4步的操作。4、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，甲醇溶解液与120 160目的柱层析硅 胶以1 2的比例拌样，装柱，然后用体积比为3 1的正己烷丙酮，以每分钟0.4重量 份的速度进行洗脱，以10重量份为单位收集洗脱液，每份回收溶剂至干，然后用0. 7重量份 的氯仿溶解转移至适合的容器中，分别将所收集的氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含 有2"，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 :7，8]黄酮的氯仿液合并，在10 20°C下放置18小时，过滤，收集析出结晶，薄层检测是否还有杂质点，如无杂质点，则进行第6步操作，如果 还有杂质点，则进行第5步操作。5、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，然后通过反向硅胶柱，用体积比为 75 25的甲醇水，以每分钟0.2重量份的速度进行洗脱，以5重量份为单位收集洗脱 液，浓缩，回收溶剂，直至洗脱液变成0. 5重量份的浓缩液为止，将浓缩液转移至适合的容 器中，并用0. 5重量份的甲醇润洗原浓缩液容器，转移至适合的容器中与浓缩液混合，静置 18小时，过滤，收集析出结晶。6、取第四步纯化后符合要求的结晶或第五步获得的结晶，精密称定，加甲醇制成 每Iml含30 μ g的溶液作为供试品溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为 85 15的甲醇水为流动相，检测波长为270nm，采用DAD检测器或ELSD检测器中的一 种或两种进行检测，检测除了溶剂峰外，样品峰纯度是否以面积归一化法计算主峰含量大 于总峰面积98. 5%，如检测结果符合该条件，则该化学成分提取纯化完毕，如果不符合该条 件，则继续重复第5项的操作，直至符合为止。所述制备方法中步骤2 4中薄层鉴别方法为以体积比3 1的正己烷丙酮 为展开剂，其中，2〃，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 7，8]黄酮的斑点在365nm紫外灯下观 察荧光显黄绿色，在254nm紫外灯下无斑点；其余斑点为杂质斑点。所述的含有2"，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6" :7，8]黄酮的提取纯化方法适用 于同样含有该成分的其他植物。本发明制备得到的2〃，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 7，8]黄酮结构式如下
权利要求
1.一种从植物中提取纯化2"，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 7，8]黄酮的方法，其特 征在于包括以下步骤(1)、将500重量份含有该成分的植物制成粗粉，用相当于该粗粉4 8倍重量的 70% 95%乙醇提取两次，每次1 2小时。合并提取液，浓缩回收乙醇至比重1. 10 1.30。将浓缩好的稠膏与硅藻土以1 1 1 2的重量比拌样，干燥，然后装柱。以每分 钟0. 6 2重量份的速度，用正己烷洗脱，收集洗脱液，直到洗脱液无色时为止，将洗脱液浓 缩成比重为1. 05 1. 15的清膏a。O)、将清膏a与60 180目柱层析硅胶以1 1.5 1 2. 5的重量比拌样，样品干 燥后装入硅胶柱中。先用体积比为5 1 6 1的正己烷丙酮，以每分钟0.3 1. 1 重量份的速度进行洗脱，洗脱至洗脱液无色为止。然后用体积比为1 1 3 1的正己 烷丙酮，以每分钟0. 3 1. 1重量份的速度进行洗脱，收集洗脱液，以10 20重量份为 单位进行收集，每一份洗脱液回收溶剂至干，用0. 5 0. 8重量份的氯仿溶解转移至适合的 容器中，然后对该氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有2"，2" - 二甲基-吡喃-[5"， 6" :7，8]黄酮的氯仿液合并，得到氯仿液b。(3)、将氯仿液b在10 20°C下放置12 M小时，过滤，收集析出结晶，然后在氯仿 液的滤液中加入相当于氯仿液b 0. 3 0. 7倍重量的甲醇，在10 20°C下放置M 48小 时，过滤，收集结晶，将这两部分结晶合并，即得到2〃，2〃 - 二甲基-吡喃-[5"，6〃 7,8] 黄酮粗结晶。
2.根据权利要求1所述的提取纯化2"，2〃- 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 7，8]黄酮的 方法，其特征在于所述制备方法中步骤2中薄层鉴别方法为以体积比3 1的正己烷丙 酮为展开剂，其中2"，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 :7，8]黄酮的斑点在365nm紫外灯下 观察荧光显黄绿色，在254nm紫外灯下无斑点。
3.根据权利要求1所述的提取纯化2"，2〃- 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 7，8]黄酮的 方法，其特征在于包括以下步骤(1)、将500重量份含有该成分的植物制成粗粉，用相当于该粗粉4 8倍重量的 70% 95%乙醇提取两次，每次1 2小时。合并提取液，浓缩回收乙醇至比重1. 10 1.30。将浓缩好的稠膏与硅藻土以1 1 1 2的重量比拌样，干燥，然后装柱。以每分 钟0. 6 2重量份的速度，用正己烷洗脱，收集洗脱液，直到洗脱液无色时为止，将洗脱液浓 缩成比重为1. 05 1. 15的清膏a。O)、将清膏a与60 180目柱层析硅胶以1 1.5 1 2. 5的重量比拌样，样品干 燥后装入硅胶柱中。先用体积比为5 1 6 1的正己烷丙酮，以每分钟0.3 1. 1 重量份的速度进行洗脱，洗脱至洗脱液无色为止。然后用体积比为1 1 3 1的正己 烷丙酮，以每分钟0. 3 1. 1重量份的速度进行洗脱，收集洗脱液，以10 20重量份为 单位进行收集，每一份洗脱液回收溶剂至干，用0. 5 0. 8重量份的氯仿溶解转移至适合的 容器中，然后对该氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有2"，2" - 二甲基-吡喃-[5"， 6" :7，8]黄酮的氯仿液合并，得到氯仿液b。(3)、将氯仿液b在10 20°C下放置12 M小时，过滤，收集析出结晶，然后在氯仿 液的滤液中加入相当于氯仿液b 0. 3 0. 7倍重量的甲醇，在10 20°C下放置M 48小 时，过滤，收集结晶，将这两部分结晶合并，即得到2〃，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 7,8]黄酮粗结晶，进行薄层检测，观察杂质点，如有一个杂质点则进行第5步的操作，如果有 多于两个的杂质点，则进行第4步的操作。G)、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，甲醇溶解液与120-160目的柱层析硅胶 以1 1.5 1 2. 5的比例拌样，装柱，然后用体积比为3 1的正己烷丙酮，以每分 钟0. 2 0. 6重量份的速度进行洗脱，以5 15重量份为单位收集洗脱液，每份回收溶剂 至干，然后用0. 5 0. 8重量份的氯仿溶解转移至适合的容器中，分别将所收集的氯仿液进 行薄层检测，将薄层检测出含有2"，2" - 二甲基-吡喃-[5"，6" :7，8]黄酮的氯仿液合 并，在10 20°C下放置12 M小时，过滤，收集析出结晶，薄层检测是否还有杂质点，如无 杂质点，则进行第6步操作，如果还有杂质点，则进行第5步操作。(5)、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，然后通过反向硅胶柱，用体积比为 75 25的甲醇水，以每分钟0. 1 0. 3重量份的速度进行洗脱，以2 7重量份为单位 收集洗脱液，浓缩，回收溶剂，直至洗脱液变成0. 4 0. 6重量份的浓缩液为止，将浓缩液转 移至适合的容器中，并用0. 4 0. 6重量份的甲醇润洗原浓缩液容器，转移至适合的容器中 与浓缩液混合，静置12 M小时，过滤，收集析出结晶。(6)、取第四步纯化后符合要求的结晶或第五步获得的结晶，精密称定，加甲醇制成每 Iml含20 40 μ g的溶液作为供试品溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比 为85 15的甲醇水为流动相，检测波长为270nm，采用DAD检测器或ELSD检测器中的一 种或两种进行检测，检测除了溶剂峰外，样品峰纯度是否以面积归一化法计算主峰含量大 于总峰面积98. 5%，如检测结果符合该条件，则该化学成分提取纯化完毕，如果不符合该条 件，则继续重复第5项的操作，直至符合为止。
4.根据权利要求3所述的提取纯化2"，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 7，8]黄酮的 方法，其特征在于包括以下步骤(1)、将500重量份含有该成分的植物制成粗粉，用相当于该粗粉6倍重量的70% 95%乙醇提取两次，每次1.5小时。合并提取液，浓缩回收乙醇至比重1.23。将浓缩好的稠 膏与硅藻土以1 1的重量比拌样，干燥，然后装柱。以每分钟1.5重量份的速度，用正己 烷洗脱，收集洗脱液，直到洗脱液无色时为止，将洗脱液浓缩成比重为1. 1的清膏a。O)、将清膏a与80 120目柱层析硅胶以1 2的重量比拌样，样品干燥后装入硅胶 柱中。用体积比为5 1的正己烷丙酮，先以每分钟0.7重量份的速度进行洗脱，洗脱至 洗脱液无色为止。然后以每分钟0.7重量份的速度，用体积比为3 1的正己烷丙酮进 行洗脱，收集洗脱液，以15重量份为单位进行收集，每一份洗脱液回收溶剂至干，用0. 7重 量份的氯仿溶解转移至适合的容器中，然后对该氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有 2"，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 7，8]黄酮的氯仿液合并，得到氯仿液b。(3)、将氯仿液b在10 20°C下放置18小时，过滤，收集析出结晶，然后在氯仿液的滤 液中加入相当于氯仿液b 0. 5倍重量的甲醇，在10 20°C下放置M小时，过滤，收集结晶， 将这两部分结晶合并，进行薄层检测，观察杂质点，如有一个杂质点则进行第5步的操作， 如果有多于两个的杂质点，则进行第4步的操作。G)、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，甲醇溶解液与120 160目的柱层析硅胶 以1 2的比例拌样，装柱，然后用体积比为3 1的正己烷丙酮，以每分钟0.4重量份 的速度进行洗脱，以10重量份为单位收集洗脱液，每份回收溶剂至干，然后用0. 7重量份的氯仿溶解转移至适合的容器中，分别将所收集的氯仿液进行薄层检测，将薄层检测出含有 2"，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 :7，8]黄酮的氯仿液合并，在10 20°C下放置18小时， 过滤，收集析出结晶，薄层检测是否还有杂质点，如无杂质点，则进行第6步操作，如果还有 杂质点，则进行第5步操作。(5)、向结晶中加入甲醇，直至结晶完全溶解，然后通过反向硅胶柱，用体积比为 75 25的甲醇水，以每分钟0.2重量份的速度进行洗脱，以5重量份为单位收集洗脱 液，浓缩，回收溶剂，直至洗脱液变成0. 5重量份的浓缩液为止，将浓缩液转移至适合的容 器中，并用0. 5重量份的甲醇润洗原浓缩液容器，转移至适合的容器中与浓缩液混合，静置 18小时，过滤，收集析出结晶。(6)、取第四步纯化后符合要求的结晶或第五步获得的结晶，精密称定，加甲醇制成 每Iml含30 μ g的溶液作为供试品溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为 85 15的甲醇水为流动相，检测波长为270nm，采用DAD检测器或ELSD检测器中的一 种或两种进行检测，检测除了溶剂峰外，样品峰纯度是否以面积归一化法计算主峰含量大 于总峰面积98. 5%，如检测结果符合该条件，则该化学成分提取纯化完毕，如果不符合该条 件，则继续重复第5项的操作，直至符合为止。
5.根据权利要求3和权利要求4所述的提取纯化2"，2〃 - 二甲基-吡喃-[5"，6〃 7,8]黄酮的方法，其特征在于所述制备方法中步骤2 4中薄层鉴别方法为以体积比 3 1的正己烷丙酮为展开剂，其中，2〃，2〃 - 二甲基-吡喃-[5〃，6〃 7，8]黄酮的斑 点在365nm紫外灯下观察荧光显黄绿色，在254nm紫外灯下无斑点；其余斑点为杂质斑点。
全文摘要
本发明公开了一种从豆科崖豆藤属植物疏叶崖豆〔Millettia pulchra kurz var.laxior(Dunn)Z.Wei〕及其他含有2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″7，8]黄酮的植物中提取纯化化学成分的工艺方法，本发明采用乙醇提取，通过硅藻土柱和硅胶柱分离纯化，最终获得纯度在95％以上的化学单体成分2″，2″-二甲基-吡喃-[5″，6″7，8]黄酮。该提取方法科学合理，稳定可靠，具有很高的实用价值。
文档编号C07D493/04GK102115477SQ200910266509
公开日2011年7月6日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者刘春明, 斯建勇 申请人:广西壮族自治区花红药业股份有限公司