专利名称：由废弃的灵芝太空包中分离灵芝酸的方法
技术领域：
本发明大致是关于一种分离灵芝酸的方法，特别是关于一种从废弃的灵芝太空包 中分离出灵芝酸的方法。
背景技术：
食药用真菌被广泛作为保健食品，其中又以灵芝为大宗。一般所说的灵芝，泛指赤 芝与紫芝两种。依据分类学，赤芝(Ganoderma lucidum)包含松杉灵芝(Ganoderma tsugae) 等伞菌盖呈红褐色的灵芝。至于紫芝则以中国灵芝(G.sinense)为代表，其菌伞盖呈紫黑 色或深褐色。由于灵芝含有多种活性成分，因此在东南亚地区，经常以灵芝子实体入药。这 些活性成分包括灵芝三萜类、多糖体、蛋白质、核酸、多肽及植物固醇化合物等。灵芝三萜类 是灵芝最重要的活性成分，包括灵芝酸、灵芝醇、灵芝醛及羊毛固烷类化合物，通称为灵芝 三萜类。迄今已有许多文献陆续证明这些活性成分具有抗肿瘤、增强免疫力(参见美国专 利第4，051，314号、第6，613，754B1号)及抗氧化等功效。同时，也有许多分离灵芝活性成 分的方法被提出，这些方法大半都是以极性溶剂萃取灵芝子实体，进而分离出上述的灵芝 活性成分。以灵芝酸T为例，已知灵芝酸T具有抗癌效果，其有效剂量低，约10-25m g/Kg， 且没有不良副作用，因此是一种极具开发潜力的抗癌药物。然而，如果依照目前公知方式， 以灵芝菌丝体发酵后进行萃取，每1000公斤发酵液至少需时50天才能制得干菌丝约1公 斤，接着再由此1公斤的干菌丝中分离出灵芝酸T，所得灵芝酸T含量极低，少于1公克。因 此，以目前方式分离灵芝酸T并不符合产业的需求。有鉴于此，需要提出一种改良方法，其可大量制得具有活性的灵芝酸T化合物。
发明内容
为解决上述问题，本发明人发现废弃的灵芝太空包内的灵芝菌丝体含有灵芝活性 成分，特别是灵芝酸。因此，提出一种以废弃的灵芝太空包为原料来分离灵芝活性成分的方法。因此，本发明目的之一在于提供一种自废弃的灵芝太空包中分离出灵芝酸的方 法。所揭示方法特征在于包含以下步骤(a)在40°C至70°C的温度下，以一第一极性溶液萃取该废弃的灵芝太空包中的灵 芝菌丝体至少约4小时，其中该第一极性溶液与该灵芝菌丝体的用量比例(重量比)约为 6 1至10 1间；及(b)在一制备级液相色谱层析柱中，以浓度介于20% 90% (体积％ )间的一第 二极性溶液，冲提步骤(a)所得的萃出液，藉以自该萃出液中分离出灵芝酸。该灵芝菌丝体取自松杉灵芝(Ganoderma tsugae)、赤芝(Ganoderma lucidum)或 其混合物。在一特定实例中，该第一极性溶液包含70% (体积％ )的乙醇；且步骤(a)是在 约70°C的温度下，以70% (体积％ )的乙醇溶液萃取约6小时。
在一实施方式中，本发明方法还包含在执行上述步骤(b)之前，执行以下步骤(a 1)将步骤(a)所得的该萃出液浓缩后，取其沉淀物；及(a2)以浓度约30 70 % (体积％ )的乙醇溶液将该沉淀物溶解。依照本发明方法萃出的该灵芝酸为灵芝酸T、灵芝酸S或灵芝酸R。在一特定实例 中，该灵芝酸为灵芝酸T。在一实施方式中，本发明方法萃取灵芝酸T、灵芝酸S及灵芝酸R的萃取率分别约 达 0. 08%、0· 01% 及 0. 01% (重量 ％)。本发明的另一目的在于提供一种灵芝活性成分，特别是以所述方法分离出的灵芝 酸T化合物。
图1为依据本发明实施例1的方法所分离出来的灵芝酸T的I R光谱图；图2为依据本发明实施例1的方法所分离出来的灵芝酸T的N M R光谱图；图3为依据本发明实施例1的方法所分离出来的灵芝酸T的质谱图；及图4为以实施例1所分离出来的灵芝酸T抑制多种肺癌细胞株生长的曲线图。
具体实施例方式目前灵芝多半是以太空包种植而成，在采收后，估计每年最少产生两百万包的废 弃太空包，需以废弃物的处理程序处理。以每包0.5公斤估计，总废包重量在1000公吨以 上。而由于灵芝废包质地坚韧，比其它菌类废包更难处理，因此近年来相关资源回收厂商皆 不太愿意回收灵芝废包，也使得各灵芝栽培农场都面临相同的废弃物处理问题。有鉴于此，本发明人特为提出一种可有效利用这些废弃的灵芝太空包的方法，除 了有助于解决目前棘手的废弃物处理问题外，还可通过一种简易的分离程序，自废弃太空 包中的灵芝菌丝体获得大量的灵芝酸活性成分，特别是灵芝酸T，供后续医药用途。因此，依据本发明，提供一种可自废弃的灵芝太空包中分离出高量活性化合物的 方法；以及以此方法所分离出来的干燥灵芝酸粉末，特别是灵芝酸T粉末。依据本发明的一种实施方式，提供一种自废弃的灵芝太空包中分离出灵芝酸化合 物的方法，包含以下步骤(a)在40°C至70°C的温度下，以一第一极性溶液萃取该废弃的灵芝太空包中的灵 芝菌丝体，其中该第一极性溶液与该灵芝菌丝体的用量比例(重量比)约为6 1至10 1 间；及(b)在一制备级液相色谱层析柱中，以浓度介于20% 90% (体积％ )间的一第 二极性溶液，冲提步骤(a)所得的一萃出液，藉以自该萃出液中分离出该灵芝酸。适合用于本发明方法的废弃太空包，可为一般用来种植松杉灵芝(Ganoderma tsugae)或赤芝(Ganoderma lucidum)或其组合的太空包。此太空包内容物一般包含木屑、 米糠、玉米粉、石灰(或碳酸钙)及水等，经过植菌栽种灵芝约60 120天，待灵芝采收后， 整个太空包即变成废弃物。依据本发明的一种实施方式，使用一种第一极性溶液来萃取这类废弃太空包内的 灵芝菌丝体，接着，利用制备级液相色谱层析法，自该萃取液中分离出具活性的灵芝化合物。操作时，首先在一适当的温度下，以重量比约6 1至约10 1的比例，混合第一 极性溶液与废弃太空包内的灵芝菌丝体，并进行萃取至少约4小时，以获得一粗萃液。适合混合第一极性溶液与废弃太空包内的灵芝菌丝体的温度范围约在40°C至 70°C间，例如约40、45、50、55、60、65或70°C。在一特定实例中，此混合温度为70°C。适合作为粗萃溶剂的第一极性溶液包括，但不限于，水或醇类，例如乙醇、丙醇、异 丙醇、正-丁醇、异-丁醇等。在一实例中，第一极性溶液是70% (体积％)的乙醇。第一极性溶液与废弃太空包内的灵芝菌丝体的混合比例，以重量计，约在6 1至 10 1间，例如约6 1、7 1、8 1、9 1或10 1的比例，混合后实施萃取的时间至 少需为4小时，例如4、5或6小时。在一特定实例中，于70°C的温度下，以每一公斤废包内的灵芝菌丝体，混合约6公 斤的70% (体积％)的乙醇来进行粗萃，且粗萃时间为6小时，藉此可得一粗萃液。接着，将此粗萃液过滤、浓缩，使其重量成为原来第一极性溶液用量的至少1/5，更 佳是至少1/6。然后，静置隔夜，取浓缩液中的沉淀物，加入少量第一极性溶液将该沉淀物回 溶成为一萃出液。第一极性溶液可为20%至70% (体积％)的乙醇溶液，并且可以任何公 知的方式来执行此过滤、浓缩的步骤。接着，便将此萃出液加载至一制备级液相色谱层析柱中，在约80 220毫升/分 钟的流速下(较佳是约80、90、100、110、120、130、140、150、160、170或180毫升/分钟，更 佳是约100、110、120、130、140或150毫升/分钟)，以浓度在20 % 90 %间，例如约20 %、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75% 或 80%，更佳是约 35%、40%、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或 90%的第二极性溶液进行冲提，并收 集所得冲提液。适合用来冲提管柱的第二极性溶液包括，但不限于水或醇类，包括甲醇、乙 醇、丙醇、异丙醇、正-丁醇、异-丁醇等。在一特定实例中，此第二极性溶液是70% (体 积％ )的乙醇溶液。在另一实例中，此冲提处理可分成两阶段进行首先，在约100毫升/分钟的流速 下，以约20 40% (体积％)的乙醇溶液进行第一次冲提；接着，以浓度介于50 90% (体积％ )的乙醇溶液进行第二次冲提。将两次冲提后的冲提液收集在一起，并经减压浓缩 及冷冻干燥后，可获得所需的灵芝酸化合物，包括灵芝酸T、灵芝酸S或灵芝酸R。在一特定 实例中，所冲提出来的灵芝酸化合物经NMR、顶及质谱分析后，确认其为灵芝酸T。本发明 方法的产率约在0.7%至2%间(此百分比为灵芝酸T重量/菌丝干重)。此外，可以任何 公知的方式来将产物浓缩、干燥。在一实例中，在一减压环境下，例如压力约0. 1托(torr) 的环境下，将冲提液浓缩，待冲提液中的固形物含量达20 %时，即停止此浓缩处理。接着，将 浓缩物干燥，例如，在_30°C -50°C下冷冻干燥。依据本发明的一个特定实例，可从1公斤废包中的灵芝菌丝体分离出约850毫克 的灵芝酸T、90毫克的灵芝酸S及约120毫克的灵芝酸R。以下，将通过实施例来阐述本发明的较佳实施方式。实施例1从废弃的灵芝太空包中分离灵芝酸秤取约1公斤左右的废包菌丝，置入一容器中，并加入约6公斤70% (体积％ )的 乙醇使混合均勻。将容器加热到约70°C，并保持温度约6小时，以萃出菌丝中的灵芝化合物。接着，利用抽气过滤，收集滤液并去除残渣，同时以70% (体积％)的乙醇清洗残渣，将 滤液集中。将所收集的滤液浓缩至约1公斤左右，冷却并静置隔夜。接着，倒掉上清液部分， 取其沉淀物。分批逐次加入少量的70% (体积％)乙醇至沉淀物中，促使其溶解，直到所有 沉淀都回溶为止。接着，将此回溶液加载至一制备级液相色谱层析柱中(Biotage，C-ISFlash column)在约120毫升/分钟的流速下，以浓度在20% 90%间的乙醇溶液进行冲提，并收 集所得冲提液。利用NMR、IR及质谱分析来鉴别不同时间收集的冲提液中的灵芝酸化合物的结构 与含量，结果分别示于图1-3中；其中图1、2及3分别示出以制备级液相色谱层析分离出的 灵芝酸T的IRjH NMR及质谱分析结果。所获得的灵芝酸T化合物的结构与相关数据如下所示
权利要求
1.一种从废弃的灵芝太空包中分离灵芝酸的方法，包含(a)在40°C至70°C的温度下，以一第一极性溶液萃取该废弃的灵芝太空包中的灵芝菌 丝体至少约4小时，其中该第一极性溶液与该灵芝菌丝体的用量比例(重量比)约为6 1 至10 1间；及(b)在一制备级液相色谱层析柱中，以浓度介于20% 90%(体积％)间的一第二极 性溶液，冲提步骤(a)所得的萃出液，藉以自该萃出液中分离出该灵芝酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中该灵芝菌丝体取自松杉灵芝(Ganodermatsugae)、 赤芝(Ganoderma lucidum)或其混合物。
3.如权利要求1所述的方法，其中该第一极性溶液包含70%(体积％)的乙醇。
4.如权利要求1所述的方法，其中该以第一极性溶液萃取该灵芝菌丝体的步骤实施了 约6小时。
5.如权利要求1所述的方法，还包含在执行步骤(b)之前，执行以下步骤 (al)将步骤(a)所得的萃出液浓缩后，取其沉淀物；及(a2)以浓度约30 70% (体积％)的乙醇溶液将该沉淀物溶解。
6.如权利要求1所述的方法，其中该第二极性溶液包含70%(体积％)的乙醇。
7.如权利要求1所述的方法，其中该灵芝酸为灵芝酸T、灵芝酸S或灵芝酸R。
8.如权利要求6所述的方法，其中该灵芝酸为灵芝酸T。
9.如权利要求1所述的方法，其中该方法萃取灵芝酸T的萃取率约为0.7-2%。
全文摘要
本发明揭示一种由废弃的灵芝太空包中分离出灵芝酸的方法。所揭示方法特征在于在40-70℃的温度下，以重量比约6∶1的比例混合一种极性溶液与取自废弃的灵芝太空包中的灵芝菌丝体，萃取至少6小时；接着，再以制备级液相色谱层析柱自上述萃出液中分离出灵芝活性成分，特别是具有抗癌活性的灵芝酸T化合物。
文档编号C07J9/00GK102127138SQ201010002878
公开日2011年7月20日 申请日期2010年1月18日 优先权日2010年1月18日
发明者许国忠, 陈光地, 陈孟堂, 陈登海 申请人:勇健工业股份有限公司