蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其获得方法

专利名称：蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其获得方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，涉及蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其获得方 法，具体地说，本发明涉及系列蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体或该系列融合体的部分片段 或该系列融合体衍生物、类似物的结构及其制备方法，以及作为镇痛药物和抗肿瘤药物在 医药领域中的应用。
背景技术：
蝎作为传统中药已有2000多年的药用历史，是我国的传统名贵中药，具有较大的开发价值。近年来人们已经发现了多种具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、抗癫痫等药理作用的蝎毒 单组分多肽。天然蝎毒产量极低，因此，采用基因工程方法，用简单的原核或真核生物表达 宿主生产具有药用价值的活性蝎毒多肽的方法显得尤为重要。提高抗肿瘤药物之肿瘤细胞特异选择性的一种方法是优先向肿瘤细胞表面递送 药物。可借助几种方法将药物导向肿瘤细胞。其中方法之一是依赖存在于肿瘤细胞表面上 的特异性受体分子。被称为“导向剂”的分子可以识别这些细胞表面受体并与之特异性结 合。所说的“导向剂”可包括抗体、生长因子或激素等。识别特异性细胞表面受体的“导向 齐U”可将药物导向具有这些表面受体的细胞。功能蛋白融合体是近年来发展起来的具有广泛应用前景的生物治疗新方法，主要 是通过导向部分将药物特异且高效地聚集于病灶部位，从而实现靶向杀伤病变细胞的目 的。一般情况多在导向部分和蛋白药物之间添加一部分柔性连接物序列，可以有效地保持 两端蛋白的各自构型，改善分子的空间柔曲性，以有利融合体蛋白导向部分与相应受体的 结合以及蛋白药物发挥固有的治疗作用。基于此，有人曾利用小鼠白介素3 (mIL-3)作为导向部分与白喉毒素结合，并在 两个部分之间插入一个短肽接头序列Gly4Ser,得到融合蛋白质DAB389-Gly4Ser-mIL-3， 体外和体内实验结果显示，与不带接头序列的融合蛋白DAB389-mIL-3相比，前者对肿瘤 细胞的特异性细胞毒作用提高约5-10倍(参见Domunique. et al，FEBS Letters 406 157-161,1997)。Amotz Nechushtan等首次报道并应用GnRH 10肽作为导向肽构建嵌 合毒素(GnRH-PE66)，经过体内外相关实验研究并探讨了其针对腺癌细胞的靶向杀伤活 性，从而为促黄体生成素释放激素的更广泛应用开阔了思路(Amotz Nechushtan, Shai Yarkoni, IrinaMarianovsky etal.Adenocarcinoma Cel Is Are Targeted by the New GnRH_PE66Chimeric Toxin through Specific Gonadotropin-releasing Hormone BindingSites. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，272 :11597-11063，1997)。最近 也报导了一种基于接头序列的，有假单胞菌外毒素(PE)和促性腺激素释放素(GnRH)组成 的嵌合蛋白(GnRH-L-PE66或GnRH-L-PE40)。体外和体内实验结果表明，GnRH-L-PE对多 种肿瘤细胞系具有细胞毒活性和肿瘤生长抑制活性，并且活性显著高于不带有接头序列的 GnRH-PE0因此，带有柔性连接物的嵌合毒素将会成为一种潜在的肿瘤治疗药物。专利名称为蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽及获得方法(发明专利号ZL01128235. 5)的发明提供了一种具有较好镇痛效果和抗肿瘤的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽及获得方法，而要得 到具有镇痛和抗肿瘤生物活性，同时又对肿瘤细胞实现靶向杀伤功能的系列融合体或该系 列融合体的部分片段或该系列融合体衍生物、类似物及其获得方法却有待于进一步研究。本发明所选择的与蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合的五种小分子癌细胞导向肽， 文献报道其特异性识别受体在肝癌细胞表面高表达而正常细胞几乎不表达或表达量 很低(Schally AV, Srkalovic G, etal. Antitumor effects of analogsof LHRH and somatostatin !experimental and clinical studies. J steroidBiochem Mol Biol,1990, 37 1061-1067 ；Raderer Μ, Hejna ΜΗ, Muller C, etal. Treatment of hepatocellular cancer with the long actingsomatostatin analog lanreotide in vitro and in vivo. Int J oncol, 2000,16(6) :1197_1201 ；周筱梅，陈渊卿。人胰岛素样生长因子受体及其生长 因子在原发性肝癌中同时过量表达。肿瘤，1991，11 :241)，这些研究就为特异性靶向杀伤肝 癌细胞提供了理论基础。同时有报道本发明所选择的癌细胞导向肽的特异性高表达受体不 仅仅局限于肝癌细胞表面，同样存在于如肺癌、前列腺癌等其他癌组织的细胞膜上。

发明内容
本发明的一个目的是提供由蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽和不同癌细胞导向肽两部分组成的融合体蛋白，并且在两者之间插入了适当的接头序列。本发明的另一个目的是构建蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽与不同癌细胞导向肽的融合 体蛋白的载体，该系列融合体蛋白的表达纯化方法及体内外生物活性研究。不同癌细胞导 向肽分别为导向部分，与不同的柔性连接肽连接后，通过柔性连接肽融合在蝎镇痛抗肿瘤 缬精甘肽的N端或C端而构成相应的载体。本发明的另一个目的是提供生产如上限定的嵌合蛋白质的方法，该方法包括(1)提供携带不同癌细胞导向肽、不同的柔性连接肽、蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽的编 码DNA的重组表达载体；(2)用步骤(1)的重组载体转化适当的宿主细胞(原核或真核细胞)；(3)在适合于表达蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体的条件下培养步骤(2)的被转化 的宿主细胞；(4)收获并纯化所得到的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体蛋白质。本发明的再一个目的是提供含有如上限定的融合体蛋白质及一种或多种医药上 可接受的载体或赋形剂的药物组合物。本发明的再一个目的是提供如上限定的融合蛋白质在生产镇痛和抗肿瘤药物中 的应用。本发明提供的系列蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体蛋白或该系列融合体的部分片 段或该系列融合体衍生物、类似物均是从基因工程宿主细胞中分离纯化得到的。可使用盐 析沉淀、超滤、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法从细胞的溶胞产物及培养液 中分离并纯化所需的蛋白质表达产物。在产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺 酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印迹法 (WESTERN)检测产物的存在及相应分子大小。本发明还提供了系列蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体蛋白或该系列融合体的部分片段或该系列融合体衍生物、类似物在生物制药领域的应用，具体地说包括镇痛和抗肿瘤 生物活性。本发明首次利用不同的癌细胞导向肽和蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合以及在两者 之间引入长度不同及氨基酸组成成分不同的柔性连接肽序列。根据本发明的一个优选实施方案，其中连接肽序列是(Gly4Ser)n, η = 1。根据本发明的一个优选实施方案，其中连接肽序列是(Gly4Ser)n, η = 2。
根据本发明的一个优选实施方案，其中连接肽序列是(Gly4Ser)n, η = 3。根据本发明的一个优选实施方案，其中连接肽序列是(Gly4Ser)n, η = 4。根据本发明的一个优选实施方案，其中连接肽序列是(Gly4Ser)n, η = 5。本发明首次进行系列蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体蛋白或该系列融合体的部分 片段或该系列融合体衍生物、类似物的小鼠体内镇痛活性和体外抗肿瘤细胞生物学活性实 验。本发明进一步涉及含有上述融合体蛋白和至少一种医药上可接受的惰性载体 或赋形剂的药物组合物。可按照制药工业领域已知的基本原则和方法制备适于胃肠道 夕卜途径给药的药物组合物(如参见Remington，s PharmaceuticalScience, 15th.，Mack Publishing Company, 1980) 0可通过各种给药途径，特别是静脉内、肌肉内、关节内、腹腔 内、鼻内、皮内、皮下等胃肠道外途径投用本发明的药物组合物。可使用本发明的融合体蛋白或含有该融合体蛋白质的药物组合物作为治疗剂，用 于治疗特定类型人体细胞的各种疾病。一种优选的用途是用于治疗其表面上过度表达促黄 体生成素释放激素受体、胰岛素样生长因子II受体或生长抑素受体之细胞相关的疾病。本 发明的融合体蛋白质或含有该融合体蛋白质的药物组合物的治疗有效剂量一般应根据疾 病的性质、严重程度及对药物的敏感适应性，以及给药途径等诸多因素由临床医生按照个 体化原则来确定。在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的 例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物 细胞等。在本发明中，英文缩写“BmkAGAP”是指蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽。X是指癌细胞 导向肽，Xl 为 Q冊SYGLRPG，X2 为 Q冊SYGWRPG，X3 为 Q冊SYGFRPG，X4 为 EPFRSPDLALETYG， X5 为 PFCFWKTCT。J 是指连接肽，Jl 为 SSHHHHHHSSGLVPRGSHM，J2 为 GGGSGGGS，J3 为 SGGSGGSGGGSGGGSGGGGSGGGGS, J4 为 GSGGGGSGGGGS 和(G4S)n (η = 1 或2或3或4或5)。可使用文献中的各种检测方法对本发明的融合体蛋白质的性质及生物学活性进 行鉴定。具体包括(1)小鼠体内镇痛活性实验该方法是根据融合体蛋白质中的蝎镇痛抗 肿瘤缬精甘肽部分具有明显的镇痛活性，检测其对小鼠醋酸扭体镇痛的抑制率；(2)ΜΤΤ细 胞存活率实验该方法是根据活细胞将MTT转化成兰紫色甲瓒结晶体的能力检测对肿瘤细 胞的影响；(3)受体结合实验该方法是根据融合体蛋白质竞争性置换与靶细胞浆膜结合 125I-GnRH的能力检测其特异性受体结合活性；(4)裸鼠移植瘤生长抑制实验该方法是根 据融合体蛋白质对裸鼠移植瘤生长的抑制能力检测其对肿瘤细胞的靶向杀伤活性。以五种癌细胞导向肽分别为导向的系列蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体或该系列 融合体的部分片段或该系列融合体衍生物、类似物可以导向性地选择作用于肿瘤原发灶及转移灶，同时毒副作用小，并且本发明的系列融合体蛋白亦能起到较好的镇痛作用，治疗疾病的同时还能减轻患者的病痛，因此其应用前景将是非常广阔的。
具体实施例方式下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，而不是以任何方式限 制本发明特批权利要求的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 如分子克隆实验手册。实施例1 Xl-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得1.X1-J1 -BmkAGAP融合体基因的构建本实施例列举描述用于表达本发明Xl-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物基 因的构建策略和基本方法。根据癌细胞导向肽-Xl (QHWSYGLRPG)和蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽(BmkAGAP)的氨 基酸序列，设计相应寡核苷酸上游引物和下游引物，以构建好的pET28a-Tag(ms)-BmkAGAP质 粒为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收，经过限制 性核酸内切酶NcoI和BamHI双酶切后与同样进行双酶切的质粒pSYPU在T4 DNA Iigase 的作用下进行连接，热转化大肠杆菌感受态细胞DH 5 α，经过菌落PCR和限制性核酸内切 酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司进行DNA核酸序列测定。结果 表明，通过基因工程的方法成功构建并获得重组质粒pSYPU-Xl-Jl-BmkAGAP，得到癌细胞导 向肽-QHWSYGLRPG、连接肽-SSHHHHHHSSGLVPRGSHM和蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽的融合基因序 列。2. Xl-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得利用基因工程技术，构建Xl-Jl-BmkAGAP融合体蛋白表达质粒，提取质粒进行测序。该重组表达质粒编码表达产物的结构特征为MGQHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSH MVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGGo经测序确认后按常规方法发酵表达并分离大肠杆菌宿主细胞的表达产物。首先将 阳性重组质粒热转化大肠杆菌BL21 ( λ DE3)，然后从该LB固体平板上挑取单菌落后接种至 3ml LB (含氨苄抗生素，60 μ g/ml)，于37°C，200r/min振荡过夜培养。按照1 %接种量将过 夜培养物接种至400ml含相应抗生素的新鲜LB培养基的三角瓶中，于37°C，200r/min振 荡培养至OD值为0. 6-0. 8，加入终浓度为0. 166mmol/L的诱导物异丙基β _D_硫代半乳糖 苷(IPTG)，培养4h。结束发酵，4°C离心收集菌体。用40ml裂解缓冲液(0. IM PBS, 0. 15M NaCl，50mM咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，超声结束后于12，000g、4°C离心20min，得上清 液，所得沉淀按照上述步骤重复破碎一次，合并两次上清液，直接上样于0. IM PBS (pH 8.0) 预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过两个不同阶段的PH缓冲液分别充分洗涤5个柱床 体积后，使用0. 5M咪唑(pH 9. 0)进行洗脱并收获该洗脱液。所得产物经过15% SDS-PAGE 验证其纯度。由柱层析色谱图和SDS-PAGE图谱说明，重组融合体蛋白质获得高效表达，经 过两步常规柱层析后获得单一目的蛋白条带，达到电泳纯度。按照上述策略和基本方法，Xl-Jl-BmkAGAP融合体衍生物、类似物的结构特征为MGQHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWAGVYGNACW CYKLPDKVPIRVPGKCNGG。利用化学法在M处断裂去除M，从而获得Xl-Jl-BmkAGAP融合体衍生 物、类似物，结构特征为GQHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECK KNGAESGYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG。3. Xl-Jl-BmkAGAP融合体蛋白在酵母中的表达及其纯化将编码Xl-Jl-BmkAGAP或Xl-Jl (_M) -BmkAGAP融合体蛋白基因进行扩增，PCR反 应所使用的5'寡核苷酸引物序列含有EcoRV限制性内切酶的酶切位点和蝎镇痛抗肿瘤缬 精甘肽的N末端区域氨基酸序列的编码序列。3'端引物序列含有EcoR I限制性内切酶的 酶切位点、一个翻译终止密码子和蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽蝎镇痛抗肿瘤活性肽C末端区域 氨基酸序列的编码序列。引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于酵母表达载体pPIC9K上的限制性内切 酶酶切位点(其中EcoRV和SnaB I的内切酶切口为平末端)，该质粒载体编码抗生素抗性 (Amplr和KarO，一个来自2 μ质粒的复制子，一个AOXl启动子，在毕赤酵母中可由甲醇诱导 高效表达，一个α -因子的信号肽序列，一个转录终止信号，一个HIS4选择性标记以及整合 序列。用SnaB I和EcoR I消化pPIC9K载体，用EcoR V和EcoR I消化插入片段，随后 将插入片段连入PPIC9K载体，连接产物热转化E. coli DH 5 α菌株，在含有Amp的LB培养 皿上筛选转化子，在含有Amp (100 μ g/ml)的LB液体培养基中过夜培养含所需构建物的克 隆。抽提质粒，测序验证插入片段正确插入。取质粒线性化后，电转化入酵母细胞，线性化的重组载体通过与宿主基因组的同 源序列发生同源重组产生稳定的酵母转化体。利用G418筛选出高拷贝的整合转化子。 将筛选得到的菌株接种于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28 300C /250 300转/分培养至OD6tltl = 2 6 (16 18h)；室温下3000转/分离心5min，收 集菌体，用1/5到1/10原培养体积的匪、BMM或BMMY重悬菌体(约10 20ml)；将步骤2所 得的菌液置于IOOml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28 30°C /250 300转 /分的摇床上继续生长；每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0. 5 1. 0%;分离样 品的上清液，用截留分子量为3000Da的超滤膜超滤除去色素，用SDS-PAGE、Western-Blot 及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。涉及的表达产物结构特征为1. GQHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQ WAGVYGNACffCYKLPDKVP I RVPGKCNGG。2. QHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQW AGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCNGG。 3. GQHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQW AGVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCNGG。4. QHWSYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAESGYCQWA GVYGNACffCYKLPDKVPIRVPGKCNGG。实施例2 X2-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得
本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。X2-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的结构特征为1. QHWSYGWRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP。2. QHWSYGWRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-BmkAGAP。3. MQHWSYGWRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP。4. MQHWSYGWRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-BmkAGAP。实施例3:X3-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。X3-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的结构特征为1. QHWSYGFRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP。2. QHWSYGFRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-BmkAGAP。3. MQHWSYGFRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP。4. MQHWSYGFRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-BmkAGAP。实施例4 X4-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。X4-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的结构特征为1. MEPFRSPDLALETYGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP。2. MEPFRSPDLALETYGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-BmkAGAP。3. EPFRSPDLALETYGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP。4. EPFRSPDLALETYGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-BmkAGAP。实施例5 X5-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。X5-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的结构特征为
1. MPFCFWKTCTSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP。2. MPFCFWKTCTSSHHHHHHSSGLVPRGSH-BmkAGAP。3. PFCFWKTCTSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP。4. PFCFWKTCTSSHHHHHHSSGLVPRGSH-BmkAGAP。实施例6 以J2为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。在此实施例中，以 J2(GGGSGGGS)为连接肽形成BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物，其结构特征为1. MQHffSYGLRPGGGGSGGGS-BmkAGAP, 2. QHffSYGLRPGGGGSGGGS-BmkAGAP, 3.M-BmkAGAP-GGGSGGGSQHffSYGLRPG,4.BmkAGAP-GGGSGGGSQHffSYGLRPG, 5. MQHffSYGffRPGGGGSGGGS-BmkAGAP,6. QHffSYGffRPGGGGSGGGS-BmkAGAP, 7.M-BmkAGAP-GGGSGGGSQHffSYGffRPG,8.BmkAGAP-GGGSGGGSQHffSYGffRPG, 9.MQHffSYGFRPGGGGSGGGS-BmkAGAP,10.QHffSYGFRPGGGGSGGGS-BmkAGAP,11.M-BmkAGAP-GGGSGGGSQHWSYGFRPG,12. BmkAGAP-GGGSGGGSQHWSYGFRPG,13. MEPFRSPDLALE TYGGGGSGGGS-BmkAGAP，14. EPFRSPDLALETYGGGGSGGGS-BmkAGAP，15. M-BmkAGAP-GGGSGGGSEP FRSPDLALETYG,16. BmkAGAP-GGGSGGGSEPFRSPDLALETYG，17. MPFCFffKTCTGGGSGGGS-BmkAGAP, 18.PFCFffKTCTGGGSGGGS-BmkAGAP,19.M-BmkAGAP-GGGSGGGSPFCFffKTCT, 20. BmkAGAP-GGGSGGGSPFCFWKTCT。实施例7 以J3为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。在此实施例中，以 J3 (SGGSGGSGGGSGGGSGGGGSGGGGS)为连接肽形成BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物，其结 构特征为
1. MQHWSYGLRPG-J3-BmkAGAP,2. QHWSYGLRPG-J3-BmkAGAP, 3. M-BmkAGAP-J3-QHWSYGLRPG,4. BmkAGAP-J3-QHWSYGLRPG,5. MQHffSYGffRPG-J3-BmkAGAP, 6. QHWSYGWRPG-J3-BmkAGAP,7. M-BmkAGAP-J3-QHffSYGffRPG,8. BmkAGAP-J3-QHffSYGffRPG, 9. MQHWSYGFRPG-J3-BmkAGAP,10. QHWSYGFRPG-J3-BmkAGAP,11. M-BmkAGAP-J3-QHWSYGFRPG, 1 2. BmkAGAP-J3-QHffSYGFRPG, 13. MEPFRSPDLALETYG_J3_BmkAGAP， 14.EPFRSPDLALETYG-J3-BmkAGAP,15.M-BmkAGAP-J3-EPFRSPDLALETYG, 1 6. BmkAGAP-J3-EPFRSPDLALETYG, 17. MPFCFWKTCT-J3-BmkAGAP, 18. PFCFffKTCT-J3-BmkAGAP,19. M-BmkAGAP-J3-PFCFWKTCT,20. BmkAGAP-J3_PFCFWKTCT。实施例8 以J4为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。在此实施例中，以 J4(GSGGGGSGGGGS)为连接肽形成BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物，其结构特征为1. MQHWSYGLRPG-J4-BmkAGAP,2. QHWSYGLRPG-J4-BmkAGAP, 3. M-BmkAGAP-J4-QHWSYGLRPG,4. BmkAGAP-J4-QHWSYGLRPG,5. MQHffSYGffRPG-J4-BmkAGAP,
6.QHffSYGffRPG-J4-BmkAGAP,7.M-BmkAGAP-J4-QHWSYGWRPG,8. BmkAGAP-J4-QHWSYGWRPG, 9. MQHWSYGFRPG-J4-BmkAGAP,10. QHWSYGFRPG-J4-BmkAGAP,11. M-BmkAGAP-J4-QHWSYGFRPG,
12.BmkAGAP-J4-QHffSYGFRPG,13.MEPFRSPDLALETYG_J4_BmkAGAP， 14.EPFRSPDLALETYG-J4-BmkAGAP,15.M-BmkAGAP-J4-EPFRSPDLALETYG, 1 6. BmkAGAP-J4-EPFRSPDLALETYG, 1 7. MPFCFWKTCT-J4-BmkAGAP, 18. PFCFffKTCT-J4-BmkAGAP,19. M-BmkAGAP-J4-PFCFWKTCT,20. BmkAGAP-J4-PFCFWKTCT。实施例9 以(G4S)工为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。在此实施例中，以(G4S)1为连 接肽形成BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物，其结构特征为1. MQHffSYGLRPG- (G4S)「BmkAGAP，2. QHffSYGLRPG- (G4S)「BmkAGAP， 3. M-BmkAGAP-(G4S)1-QHWSYGLRPG，4· BmkAGAP-(G4S)「QHWSYGLRPG， 5. MQHffSYGffRPG-(G4S) !-BmkAGAP,6. QHffSYGffRPG-(G4S)1-BmkAGAP,
7.M-BmkAGAP-(G4S)1-QHWSYGWRPG，8· BmkAGAP-(G4S)「QHWSYGWRPG， 9. MQHWSYGFRPG-(G4S) !-BmkAGAP, 10. QHffSYGFRPG-(G4S)1-BmkAGAP,11. M-BmkAGAP- (G4S)「QHWSYGFRPG，12. BmkAGAP- (G4S)「QHWSYGFRPG，13. MEPFRSPDLALE TYG- (G4S)!-BmkAGAP, 14. EPFRSPDLALETYG- (G4S)「BmkAGAP，15. M-BmkAGAP- (G4S)「EPF RSPDLALETYG, 16. BmkAGAP- (G4S)「EPFRSPDLALETYG，17. MPFCFffKTCT- (G4S)「BmkAGAP， 18. PFCFWKTCT -(G Jh-BmkAGAP，19. M-BmkAGAP -(G4S)1-PFCFWKTCT， 20. BmkAGAP- (G4S) fPFCFWKTCT。实施例10 以(G4S) 5为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的获得本实施例的策略、基本方法和基本过程同实施例1。在此实施例中，以(G4S)5为连接肽形成BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物，其结构特征为1. MQHffSYGLRPG- (G4S) 5_BmkAGAP，2. QHffSYGLRPG- (G4S)「BmkAGAP， 3. M-BmkAGAP-(G4S)5-QHWSYGLRPG，4· BmkAGAP-(G4S) 5-QHffSYGLRPG, 5. MQHWSYGWRPG-(G4S) 5-BmkAGAP，6· QHffSYGffRPG-(G4S)5-BmkAGAP, 7. M-BmkAGAP-(G4S) S-QHffSYGffRPG,8. BmkAGAP-(G4S) 5-QHffSYGffRPG, 9. MQHWSYGFRPG-(G4S)5-BmkAGAP，10. QHffSYGFRPG-(G4S)5-BmkAGAP, 11. M-BmkAGAP-(G4S) 5-QHWSYGFRPG,12. BmkAGAP-(G4S) 5-QHWSYGFRPG,13. MEPFRSPDLALE TYG-(G4S) 5-BmkAGAP,14. EPFRSPDLALETYG-(G4S) 5_BmkAGAP，15. M-BmkAGAP-(G4S) 5_EPF RSPDLALETYG,16. BmkAGAP-(G4S)「EPFRSPDLALETYG，17. MPFCFffKTCT-(G4S) 5_BmkAGAP， 18. PFCFWKTCT-(G4S ) [BmkAGAP，19. M-BmkAGAP-(G4S)5-PFCFWKTCT， 20. BmkAGAP- (G4S) 5_PFCFWKTCT。实施例11 系列BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物体内镇痛活性一小鼠醋酸扭体法本实施例通过小鼠体内镇痛模型旨在验证BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的
镇痛活性。小鼠醋酸扭体法镇痛模型将冰醋酸作为化学刺激物注入昆明种小鼠腹腔内，继 而引起深部的、大面积而较持久的疼痛刺激，致使小鼠产生“扭体”反应(腹部内凹、躯干与 后腿伸张、臀部高起)。18-22g昆明种小鼠，雌雄各半，随机分组，每组8只，腹腔注射BmkAGAP融合体及 其衍生物、类似物样品，20min后按0. 2ml/20g腹腔注射0. 6% (ν/ν)醋酸引起内脏痛，5min 后记录小鼠IOmin内的扭体次数。以吗啡为阳性对照，生理盐水为空白对照，按照下述公式 计算各个给药组的扭体反应抑制率。
触I安空白组扭体次数-给药组扭体次数1ΛΛ0/ 抑辭=-空白组扭体次数-χ100%镇痛生物活性实验结果表明1.生理盐水空白组实验动物扭体次数(Mean士SEM)为46. 75士3. 65 ；阳性对照组 实验动物扭体次数(Mean士SEM)为29. 37士 1. 85，扭体抑制率为37. 17%。2.蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽组的实验动物扭体抑制率为55. 6%。3. BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物组(I)Xl-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物组
样品MGQ冊SYGLRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMVRDGYIADDKNCAYFCGRNAYCDDECKKNGAES GYCQWAGVYGNACWCYKLPDKVPIRVPGKCNGG的实验动物扭体抑制率为54. 1%。本组选择上述样 品进行镇痛活性实验，是由于该样品的结构涵盖Xl-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似 物组的结构，因此，其结果足以代表Xl-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物组的镇痛活性。(2) X2-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物组样品MQ冊SYGWRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP的实验动物扭体抑制率为 55.1%。本组选择上述样品进行镇痛活性实验，是由于该样品的结构涵盖X2-Jl-BmkAGAP 融合体及其衍生物、类似物组的结构，因此，其结果足以代表X2-Jl_BmkAGAP融合体及其衍 生物、类似物组的镇痛活性。(3)X3-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物组样品MQ冊SYGFRPGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP的实验动物扭体抑制率为 53.8%。本组选择上述样品进行镇痛活性实验，是由于该样品的结构涵盖X3-Jl-BmkAGAP 融合体及其衍生物、类似物组的结构，因此，其结果足以代表X3-Jl-BmkAGAP融合体及其衍 生物、类似物组的镇痛活性。(4)X4-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物组样品MEPFRSPDLALETYGSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP 的实验动物扭体抑制率为 55.8%。本组选择上述样品进行镇痛活性实验，是由于该样品的结构涵盖X4-Jl-BmkAGAP 融合体及其衍生物、类似物组的结构，因此，其结果足以代表X4-Jl-BmkAGAP融合体及其衍 生物、类似物组的镇痛活性。(5)X5-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物组样品MPFCFWKTCTSSHHHHHHSSGLVPRGSHM-BmkAGAP 的实验动物扭体抑制率为
56.5%。本组选择上述样品进行镇痛活性实验，是由于该样品的结构涵盖X5-Jl-BmkAGAP 融合体及其衍生物、类似物组的结构，因此，其结果足以代表X5-Jl_BmkAGAP融合体及其衍 生物、类似物组的镇痛活性。(6)以J2为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物组样品=MQHffSYGLRPGGGGSGGGS-BmkAGAP,M-BmkAGAP-GGGSGGGSQHffSYGLRPG, M-BmkAGAP-GGGSGGGSQHffSYGffRPG， M-BmkAGAP-GGGSGGGSQHffSYGFRPG， M-BmkAGAP-GGGSGG GSEPFRSPDLALETYG, M-BmkAGAP-GGGSGGGSPFCFffKTCT 的实验动物扭体抑制率均在 52. 5 % 以上。本组选择上述样品进行镇痛活性实验，是由于上述样品的结构涵盖以J2为连接肽 的BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物组的结构，因此，其结果足以代表以J2为连接肽的 BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物组的镇痛活性。(7)以J3为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物组样品MQHff SYGLRPG-J3-BmkAGAP, M-BmkAGAP-J3-QHff SYGLRPG , MEPFRSPDLALETYG-J3-BmkAGAP, M-BmkAGAP-J3-EPFRSPDLALETYG, MPFCFWKTCT-J3-BmkAGAP, M-BmkAGAP-J3-PFCFWKTCT的实验动物扭体抑制率均在57. 5%以上。本组选择上述样品进 行镇痛活性实验，是由于上述样品的结构涵盖以J3为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生 物、类似物组的结构，此外，结合镇痛生物活性实验结果3中的(1)-(6)的实验数据。本组 实验结果足以代表以J3为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物组的镇痛活性。
(8)以J4为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物组样品MQ冊SYGLRPG-J4-BmkAGAP，M-BmkAGAP-J4-QHWSYGLRPG,的实验动物扭体抑 制率均在54. 7%以上。结合镇痛生物活性实验结果3中的(1)-(7)的实验数据，本组实验 结果足以代表以J4为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物组的镇痛活性。(9)以(G4S)n为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物组样品=MQHWSYGLRPG-(G4S)1-BmkAGAP,M-BmkAGAP-(G4S)1-QHWSYGLRPG, MQHffSYGLRPG - (G4S) 5-BmkAGAP, M-BmkAGAP-(G4S)5-QHffSYGLRPG, MEPFRSPDLALETYG-(G4S)「BmkAGAP，M-BmkAGAP-(G4S )「EPFRSPDLALETYG， MEPFRSPDLALETYG-(G4S)「BmkAGAP，M-BmkAGAP-(G4S)「EPFRSPDLALETYG， MPFCFffKTCT- (G4S) ！-BmkAGAP, M-BmkAGAP- (G4S) ！-PFCFffKTCT, MPFCFffKTCT- (G4S) 5_BmkAGAP， M-BmkAGAP-(G4S)5-PFCFWKTCT的实验动物扭体抑制率均在50. 6%以上。结合镇痛生物活性 实验结果3中的(1)-(8)的实验数据，本组实验结果足以代表以(G4S)n(^lsa2sa3sa4sa5)* 连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物组的镇痛活性。实施例12 系列BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物体外抗肿瘤细胞生物活性一MTT法本实施例通过MTT法检测本发明所获得的系列BmkAGAP融合体及其衍生物、类似 物对体外培养肿瘤细胞的细胞毒活性。将对数生长期的细胞消化、离心，制成细胞悬液，吹勻并将密度调至6X IO5个/ml， 以100 μ 1/孔加入96孔微量培养板中，其间不断吹勻细胞，保证每孔的细胞数大致相等。于 37CO2浓度为5%的细胞培养箱中孵育24小时，在倒置显微镜下观察细胞生长情况。生 长情况良好，即可加入不同稀释浓度的样品。样品以RPMI 1640培养基溶解，二倍体积稀释 法稀释为五个浓度梯度，每个浓度设置三个复孔。阴性对照孔加入相同体积的培养液。另 设仅加含相应的培养液(无细胞)为空白调零孔。于37°C，C02浓度为5%的细胞培养箱中 继续培养48小时后弃去培养液，每孔加入100 μ 1 MTT (稀释至终浓度为0. 5mg/ml)，培养4 小时后，吸弃上清，每孔加入150 μ 1 二甲基亚砜，室温置摇床上低速振荡10分钟，充分溶解 后在酶标仪上测定490nm处各孔的吸光度值，根据每个样品的吸光度值计算每组样品对细 胞的生长抑制率，利用SPSS 13.0统计软件计算样品的半数抑制浓度IC50值(即在用药后 存活的细胞数量减少一半时所需的药物浓度)。细胞生长抑制率的计算方法参照如下公式 进行
细舰照组OD值-给药组ODH
抑制率<%} - X 100%
细■照组OD值-空白调㈣OD值系列BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物体外抗肿瘤细胞生物活性实验结果 表明与蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽组比较，Xl-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物和类似物、 X2-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物和类似物、X3-Jl_BmkAGAP融合体及其衍生物和类似物、 X4-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物和类似物、X5-Jl_BmkAGAP融合体及其衍生物和类似物、 以J2为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物和类似物、以J3为连接肽的BmkAGAP融合体及 其衍生物和类似物、以J4为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物和类似物和以(G4S)n为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物与类似物组的体外抗肿瘤细胞生物活性没有明显降低， 有的BmkAGAP融合体及其衍生物与类似物的体外抗肿瘤细胞生物活性则有提高。实施例13 系列BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的靶向特异性试验本实施例借助细胞膜受体结合试验检测本发明的系列BmkAGAP融合体及其衍生 物、类似物的细胞受体结合能力。按照Qaycum，A.等人(Br. J. Cancer 62 =96-99,1990)所 述的方法，检测本发明的系列BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物竞争取代与人乳腺癌细 胞结合的125I-GnRH的能力。将培养的人乳腺癌Mcf-7细胞单层分离到含有IOmM Tris-HCl (pH7. 5) UmMDTT 和lmg/ml牛血清白蛋白的缓冲液中以制备细胞勻浆。低速离心去掉大的细胞碎片后，再 以25，OOOg将上清部分4°C离心30分钟，得到细胞浆膜部分。将浆膜悬液按每孔100 μ 1 的终体积加于24孔培养板孔中，然后再向各孔中加入5 μ M 125I-GnRH并于37°C温浴1小 时。温浴后再向每孔内加入未标记的GnRH或蝎镇 痛抗肿瘤缬精甘肽对照样品或本发明系 列BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物样品(0. 1-100 μ Μ)，并继续保温24小时。保温后用 上述缓冲液洗样品并用Y计数仪检测结合的配体。加入渐增浓度的样品后，可随着浓度的 增加而逐渐取代与Mcf-7细胞膜结合的125I-GnRH。系列BmkAGAP融合体及其衍生物、类似物的靶向特异性试验结果表明与蝎镇痛 抗肿瘤缬精甘肽样品组比较，Xl-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物和类似物、X2-Jl_BmkAGAP 融合体及其衍生物和类似物、X3-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物和类似物、X4-Jl_BmkAGAP 融合体及其衍生物和类似物、X5-Jl-BmkAGAP融合体及其衍生物和类似物、以J2为连接肽 的BmkAGAP融合体及其衍生物和类似物、以J3为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物和类 似物、以J4为连接肽的BmkAGAP融合体及其衍生物和类似物、以(G4S)n为连接肽的BmkAGAP 融合体及其衍生物和类似物组，与靶细胞受体结合能力均得到提高，且这种结合程度随样 品浓度的增加而增加。
权利要求
蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体，其特征在于，蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽通过连接肽与癌细胞导向肽形成系列蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体，融合体既具有蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽原有生物活性，同时也具有癌细胞导向肽的生物活性。
2.根据权利要求1所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体，其特征在于，分别通过蝎镇 痛抗肿瘤缬精甘肽的N端或C端，通过连接肽与癌细胞导向肽形成系列蝎镇痛抗肿瘤缬精 甘肽融合体。
3.根据权利要求1所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体，其特征在于，所述的癌细胞 导向肽包括Q冊SYGLRPG，QHWSYGffRPG, Q冊SYGFRPG，EPFRSPDLALETYG, PFCFWKTCT。
4.根据权利要求1所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体，其特征在于，所述的连接 肽包括SSHHHHHHSSGLVPRGSHM，GGGSGGGS, >SGGSGGSGGGSGGGSGGGGSGGGGS, GSGGGGSGGGGS, GGGGS，(G4S)2, (G4S)3, (G4S)4,和(G4S)go
5.蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体的衍生物或类似物或活性片段，其特征在于，它包含 权利要求1-4任何一项所述的氨基酸序列全序或片段。
6.根据权利要求5所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其衍生物或类似物或活性 片段，可以利用基因工程技术进行表达获得，其特征在于，表达宿主细胞为原核细胞或真核 细胞。
7.蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其衍生物或类似物或活性片段在制备镇痛药物中 的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及 其衍生物或类似物或活性片段可以与药学上可接受的载体混合制备临床上可接受的注射 剂、口服制剂、透皮吸收制剂、粘膜吸收制剂。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合体及其衍生物或类似物或活性片段及其获得方法，具体涉及借助一个简单的短肽接头序列连接的，由作为蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽和作为癌细胞导向肽部分的促黄体生成素释放激素或胰岛素样生长因子II内部部分片段或奥曲肽类似物或上述的类似物组成的嵌合蛋白，以上癌细胞导向肽分别融合于蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽的N端和C端。本发明利用DNA重组技术构建了一系列不同接头序列及癌细胞导向肽的蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽融合蛋白的载体，收获嵌合蛋白后验证其具有体内镇痛活性和体外抗肿瘤细胞生长活性的双重功能，且能够实现对特定肿瘤细胞的靶向杀伤活性。
文档编号C07K19/00GK101880327SQ20101010746
公开日2010年11月10日 申请日期2010年2月9日 优先权日2010年2月9日
发明者刘岩峰, 吴春福, 崔勇, 张景海, 毛英姿, 郭桂丽 申请人:沈阳药科大学