专利名称：一种重组鸭α -干扰素的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种重组鸭α -干扰素的制备方法。
背景技术：
养鸭业在我国有着悠久的历史，无论是鸭的品种资源，还是生产数量均名列世界 前茅。随着养鸭业的迅速发展，鸭产品的大规模流通，鸭瘟、鸭病毒性肝炎、番鸭细小病毒 病、鸭流感、番鸭呼肠孤病毒及新型鸭病毒性肝炎等新老疫病快速传播，其中，病毒病已成 为我国养鸭业的主要疫病，严重威胁养鸭业的健康发展。对于病毒性疫病，目前尚无高效的 治疗药物，采用疫苗免疫、高免血清被动免疫仍然是防治病毒性疾病的主要手段。但随着疫 苗的长期应用使一些病毒出现了变异，导致了超强毒力株和非典型毒株的出现，致使一些 传统疫苗的保护率出现下降趋势甚至无保护作用，而高免血清还潜在携带传播其他疾病的 危险。因些，养鸭生产上迫切希望能提供一些广谱、价廉的抗病毒新药。干扰素是在特定的诱生剂作用下，由细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋 白，根据其理化和生物学特性分为α、β和Υ三类，其中α-干扰素以其突出的抗病毒作 用而备受人们重视，现已被广泛用于人医临床。α “干扰素除具广谱抗病毒活性外，还能抑 制肿瘤细胞增殖和参与调节免疫应答，具作用迅速、安全有效、无毒副作用、在体内存留时 间短、无药物残留等特点，且对病毒性疾病具有预防和治疗的双重效果，是一种绿色、环保 的抗病毒制剂，具有广阔的应用前景。然而有关禽类干扰素的研究却比较滞后，1994年鸡α -干扰素基因才得以克隆和 鉴定，随后Schultz等克隆了鸭α-干扰素基因，并展开了鸭基因工程干扰素抗病毒的研 究。近年来国内禽类α-干扰素的研究也取得了一定的进展，如鸡、北京鸭等α-干扰素基 因相继被克隆及表达，重组鸡α-干扰素已有用于抗病毒治疗的报道；但重组鸭α-干扰 素由于存在复性率低下等原因至今尚未见有用于临床的报道；而采用传统方法生产的干扰 素，存在产量低，成本高，成品价格极其昂贵等问题，根本无法在动物的疾病治疗中推广应 用。
发明内容
本发明目的是，针对鸭病毒性疾病防治中由于常规疫苗长期使用已出现变异株， 致使保护率下降甚至无保护作用，而高免血清的使用潜在有携带传播其他疾病危险等问 题；提出一种价格低廉，安全有效，无毒副作用，在体内存留时间短，无药物残留，对鸭病毒 性疾病，尤其是对鸭病毒性肝炎具有预防和治疗双重效果高复性率的重组鸭α-干扰素的 制备方法。本发明目的通过以下技术方案来实现。—种重组鸭α -干扰素的制备方法，该方法按以下步骤进行(1)鸭α -干扰素基因合成将Genebank公布编号为Χ84764的鸭α -干扰素基 因序列进行合成；
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(2)引物的设计和合成根据鸭α -干扰素基因序列设计用于扩增鸭干扰素成 熟蛋白基因的引物，该上、下游引物的5、端分别加上BamHI和EcoRI酶切位点，该引物对的 序列为上游引物Pl 5“ -ATTAGGATCCTGCAGCCCCCTGCGCCTC-3“
下游引物 P2 5~ -GAAGAATTCTTAGCGCATGGTGCGGGTG-3~(3)表达载体的构建以合成的鸭α-干扰素基因为模板，用P1、P2引物扩增出鸭 a-干扰素成熟蛋白基因，经BamHI和EcoRI双酶切插入表达载体PET_28a (+) BamHI和EcoRI 的酶切位点，再转化入受体菌E. coli BL21-plsS，筛选出高效表达的阳性克隆菌，经测序验 证正确后作为工程菌保存；(4)工程菌的诱导表达将阳性克隆菌接种含50ug/ml卡那的LB培养液，37°C培 养过夜，次日将该菌液按2%的接种量接种与上述相同LB培养基中，37°C培养至0D_值为 0. 6 0. 7 ；加入最终浓度为Immol的IPTG诱导剂诱导培养4h ；取菌液4000转离心IOmin 收集菌体，置-70°C冰箱保存，备用；(5)表达产物的提取、纯化、复性将菌体与由50mM磷酸缓冲液、300mMNaCl、IOmM β -巯基乙醇配制，ρΗ7. 8的裂解buffer按重量1 4比例重悬；用高压均质机在650帕 压力下，重复裂解两次，13000转离心20分钟，得沉淀物即提取的包涵体；将包涵体与由6M 盐酸胍、IOOmM NaH2PO4UOmM Tris-HClUOmM β -巯基乙醇配制，ρΗ 8. 0 的溶解 buffer 按 重量1 10比例用超声波重悬，室温下作用90min，10000转离心30min后，取上清液过镍 柱纯化，得带有组氨酸标签的纯度达90%以上的目的蛋白；将纯化后的目的蛋白装入透析 袋，先在由2M尿素、50mM醋酸缓冲液、IOmM β-巯基乙醇、50mM NaCl配制，ρΗ 3. 6的缓冲 液1中透析复性24小时，IOOOOg离心lOmin，取上清液；再在由50mM醋酸缓冲液、50mM NaCl 配制，PH 3.6的缓冲液2中透析复性48小时，期间换液一次，过滤除菌后即为粗制鸭α-干 扰素；(6)生物学活性的测定采用微量细胞病变抑制法，在鸭胚成纤维细胞系上用水 泡性口炎病毒VSV检测粗制重组鸭α “干扰素的生物学活性，其生物学活性为每毫升细胞 半数保护量达IO5U以上，即为重组鸭α -干扰素成品。重组鸭α _干扰素在防治鸭病毒性肝炎中的应用准对鸭病毒性肝炎发病急、死 亡快的特点，一旦发现患有该病的病鸭，应尽快将整群鸭肌注重组鸭α-干扰素，剂量为 IOOOu IOOOOu/只，每天一次连用3天，相对治愈率达到93%以上。本发明的有益效果是一、本发明将鸭α-干扰素成熟蛋白基因插入表达载体PET_28a(+) BamHI和EcoRI 酶切位点，这样表达出的鸭α-干扰素带有组氨酸标签，其组氨酸可与镍柱上的镍离子进 行螯合作用，经咪唑含量不同的缓冲液洗涤及洗脱，即可分离到纯度较高的带有组氨酸标 签的重组鸭α-干扰素。二、本发明采用高压均质机裂解表达的工程菌，达到快速、高效的破碎效果，较常 规裂解技术需加溶菌酶、去氧胆酸盐、DNA酶等共需作用1个半小时，既有利于大量生产、简 化了菌体裂解工艺，又明显降低了生产成本，为工业化生产奠定了基础。三、本发明采用的在醋酸缓冲液中进行透析复性的工艺，既在透析过程中使残留 的杂蛋白析出，使表达的鸭α-干扰素纯度达90%以上，又达到了极佳的复性效果，其生物
4学活性为每毫升细胞半数保护量达到IO5U以上，比常规复性液的复性效果提高1000多倍， 实现了用于临床防治的要求。 四、本发明用制备的重组鸭α-干扰素进行了鸭病毒性肝炎的治疗试验，结果显 示具有非常有效的治疗效果，与不用干扰素治疗的对照组相比，其相对治愈率达到93%以 上，为鸭病毒性肝炎的治疗提供了一种安全有效，无毒副作用的新制剂(见实施例4)。
具体实施例方式通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但应该理解这并非是对本发明的 任何限制。对所涉材料的说明载体 PET_28a (+)购自 Navagen ；BamHI 酶购自 Termanas ；EcoRI 酶购自 Termanas ；受体菌 E. coli BL21-plsS 购自 Tranagen ；IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)购自北京北实纵横科技发展有限公司；镍柱购自Invitrogen ；(洗涤液及洗脱液按说明书配方)鸭胚成纤维细胞系购自ATCC，编号CCL_141 ；水泡性口炎病毒VSV 购自中国药品生物制品检定所；高压均质机AH100B，ATSEngineering Inc 公司产品；超声波细胞粉碎机JY92-II，宁波新芝科器研究所生产；实施例1 (鸭α -干扰素基因的合成及表达载体的构建)(1)鸭α -干扰素基因合成将Genebank公布(编号为Χ84764)的鸭α -干扰素 基因序列送上海博亚生物技术有限公司合成。合成的鸭α-干扰素基因已除去信号肽基因 为成熟的鸭α-干扰素蛋白基因，其序列如下tgcagccccctgcgcctccacgacagcgccttcgcctgggacagcctccagctcctccgcaacatggctcccagccccacacagccctgcccgcagcaacacgcgccttgctccttcccggacaccctcctggacaccaacgacacgcagcaagccgcacacaccgccctccacctcctccaacacctcttcgacaccctcagcagccccagcacccccgcgcactggctccacaccgcacgccacgacctcctcaaccagcttcagcaccacatccaccaccttgagcgctgcttcccagccgacgccgcgcgcctccacaggcgagggccccgcaaccttcacctcagcatcaacaagtacttcggctgcatccaacacttcctccagaaccacacctacagcccctgcgcatgggaccacgtccgcctcgaggctcacgcctgcttccagcgcatccaccgcctcacccgcaccatgcgctaa(2)引物的设计和合成根据上述鸭α-干扰素基因序列设计用于扩增鸭a-干扰 素成熟蛋白基因的引物，该上、下游引物的5、端分别加上BamHI和EcoRI酶切位点，该引物 对的序列为上游引物P 1 :5、-ATTAGGATCCTGCAGCCCCCTGCGCCTC-3、下游引物P2 :5、-GAAGAATTCTTAGCGCATGGTGCGGGTG-3、上述引物由上海博亚生物技术有限公司合成；(3)表达载体的构建以合成的鸭α-干扰素基因为模板，用P1、P2这对引物扩增鸭α “干扰素成熟蛋白基因，PCR反应体系及条件如下在PCR反应管内依次加入5 μ 1 10XPCR Buffer, 5 μ 1 2mmol/L dNTP,3y 1 25mmol/LmgCl2, 2. 5 μ 1 5ymol/L Ρ1，2·5μ1 5ymol/L P2，1 μ 1 模板，0. 5 μ ITaq DNA 聚合酶及水 30. 5 μ 1。95°C变性 5min 后，进行 35 个DNA扩增循环，循环的反应程序如下95°C变性lmin，58°C退火40s，72°C延伸40s，最后 一个循环72°C延伸IOmin。取5 μ 1扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，可见有500bp的特 异性条带；PCR产物经BamHI和EcoRI双酶切插入原核表达载体PET_28a (+) BamHI和EcoRI 酶切位点，转化受体菌E. coli BL21-plsS，涂浦于含50ug/ml卡那的LB平板上，37°C培养过 夜；挑取长出的转化菌落于Iml含50ug/ml卡那的LB培养基上培养过夜，取菌种接种Iml 含卡那LB培养基继续培养2小时后加IPTG诱导表达4小时，取样经SDS-PAGA电泳筛选出 高效表达的阳性克隆菌株，并提取其质粒，经BamHI和EcoRI双酶切后电泳验证，并将双酶 切鉴定阳性的克隆菌株送上海博亚生物技术有限公司测序；验证正确后作为工程菌保存。实施例2 (工程菌诱导表达、包涵体提取、蛋白纯化和复性)(1)工程菌的诱导表达将实施例1工程菌接种含50ug/ml卡那的LB培养液37°C 培养过夜，次日将菌液按2%的接种量接种与上述相同LB培养基中，37°C培养至0D_值为 0. 6 0. 7，加入最终浓度为Immol的IPTG诱导剂诱导培养4h ；取菌液4000转离心IOmin 收集菌体，置-70°C冰箱保存备用；(2)包涵体提取将收集的菌体与由50mM磷酸缓冲液、300mM NaCl、10mM β -巯基 乙醇配制，ρΗ7. 8的裂解buffer按重量1 4比例重悬；用高压均质机在650帕压力下，重 复裂解两次，13000转、离心20分钟，得沉淀物即为提取的包涵体；(3)包涵体溶解及目的蛋白的纯化将提取的包涵体用溶解buffer (6M盐酸胍、 IOOmM NaH2PO4UOmM Tris-HClUOmM β-巯基乙醇、pH 8. 0)按 1 10 比例用超声波细胞 粉碎机400W、5秒、工作3次重悬，室温作用90min，10000转离心30min后；取上清液过镍 柱纯化，先用洗涤 Buffer (8M 尿素、100mMNaH2P04、0. 5M NaClUOmM Tris-HClUOmM β-巯 基乙醇、40mM 咪唑、ρΗ8. 0)洗涤，然后用洗脱 Buffer (8Μ 尿素、IOOmM NaH2PO4、0. 5M NaCl, IOmMTris-HClUOmM β -巯基乙醇、250mM咪唑、pH 8.0)洗脱，获得带有组氨酸标签的纯度 达90%以上的目的蛋白；(4)透析复性表达蛋白将经镍柱纯化的目的蛋白装入透析袋内，先在(2M尿素、 50mM醋酸缓冲液、IOmM β -巯基乙醇、50mM NaCUpH 3. 6)的缓冲液1中透析复性24小时； 10000转离心lOmin，取上清液置透析袋再在(50mM醋酸缓冲液、50mM NaCl、pH 3.6)缓冲 液2中透析复性48小时，期间换液一次，过滤除菌后即为粗制鸭α -干扰素。实施例3 (粗制鸭α -干扰素生物学活性的测定)应用微量细胞病变抑制法，在鸭胚成纤维细胞系上用水泡性口炎病毒VSV检测 表达产物活性首先将实施例2表达产物用MEM细胞培养液10倍稀释至1000倍后作倍 比稀释至64000倍，加入在96孔细胞培养板上长满单层的鸭胚成纤维细胞(DEFs)中，每 孔20ul，每稀释度5孔，再加MEM维持液160ul，37°C培养24小时后倒掉培养液，接种100 个TCID5ciVSV (每孔20ul)，加MEM维持液160ul后，继续培养至96h ；结果发现接种100个 TCID5ciVSV后，经复性液(50mM醋酸缓冲液、50mM NaCUpH 7.0)处理的对照组1及不经任何 处理的对照组2过24h就出现细胞圆缩、脱落等病变，而经实施例2复性表达产物处理的细 胞培养至96h，仍未出现病变的最高稀释度在8000至16000倍之间，经计算细胞半数保护量
6为46. 25万个。实施例4 (重组鸭α -干扰素在鸭病毒性肝炎防治中的试验与应用)(1)重组鸭α干扰素不同剂量对鸭病毒性肝炎的保护效果试验；从各试验组的死亡情况(见表1)看可得到以下几个结果1)鸭病毒性肝炎具有潜伏期短、发病急、死亡快等特点，死亡时间集中在攻毒后的 24-48小时，干扰素的使用与攻毒同时进行具有较好的攻毒保护率，而在攻毒前或后24h注 射干扰素，则攻毒保护效果较差。2)干扰素使用剂量为每只1000U或10000U，各实验组的攻毒保护率差异不显著， 其中与攻毒同时应用者均具有良好的效果，比攻毒对照组的死亡率分别下降40%或50%。3)攻毒剂量为10-3 7ELD5Q(即种毒10稀释，0. 2ml)比较适宜，死亡率达到80 % (8/10)，而接种 10_2· 7ELD5tl (即种毒 100 稀释，0. 2ml)，死亡率仅仅 30% (3/10)。表1不同剂量重组鸭α干扰素对鸭病毒性肝炎的攻毒保护试验
\ hpi 组别\处理方法24h48h72h96h死亡率A攻毒前24h注射10000U DuIFN α/5//50%B攻毒前24h注射1000U DuIFNa16//70%C攻毒同时注射10000U DuIFNa/3//30%D攻毒同时注射1000U DuIFNa13//40%E攻毒后24h注射10000U DuIFNa/71/80%F攻毒后24h注射1000U DuIFN a/4//40%G攻毒对照组/8//80%H种毒100倍稀释攻毒0. 2ml/3//30%I生理盐水注射对照////0(2)重组鸭α干扰素不同使用方案对鸭病毒性肝炎的保护效果试验；从各试验组的死亡情况(见表2)看可得到以下几个结果1)各组鸭α干扰素应用10000U的剂量，均能抵抗强毒的攻击，各治疗组未出现死 亡或者死亡1/10 ；2)鸭病毒性肝炎卵黄抗体对于鸭病毒性肝炎变异株治疗效果较差，死亡率 (50% )和攻毒对照组(60% )接近，对攻毒的强毒没有保护效果；应用干扰素可以取得良
7好的效果；3)干扰素安全性好干扰素对照组，使用防治剂量的10倍，即100000U/只，和注 射生理盐水对照组比较，未见在采食、饮水、精神状态方面的差异，试验观察5天后，扑杀试 验鸭，注射部位未见异常，表明重组鸭α干扰素注射剂量不高于10万单位/只对雏鸭是安 全的。表2重组鸭α干扰素使用方案对鸭病毒性肝炎的攻毒保护试验
\ Hpi 组别\处理方法24h48h72h96h死亡率1攻毒前和同时各注射DuIFN α 1次/1//10%2攻毒同时注射DuIFN α 1次////03攻毒同时注射DuIFN α 2次////04攻毒同时注射DuIFN α 3次////05鸭病毒性肝炎卵黄抗体/5//506攻毒对照组231/60%7空白对照组//0/08干扰素对照组，10万U/只////0(3)重组鸭α干扰素临床防治鸭病毒性肝炎的应用效果治疗组与对照组均以临床发生鸭病毒性肝炎的3日龄绍兴麻鸭为试材，其中，未 治疗对照组共100只，发病后的3-4天为死亡高峰期，整个发病过程持续了 6-7天，共死亡 42只，死亡率达到42% ；而注射干扰素的治疗组共1380只，治疗后的24小时内为死亡高 峰期，共死亡36只，死亡率为2. 6%，即临床相对治愈率达到93. 8%，具有良好的应用效果 (见表3)。表3重组鸭α干扰素临床应用防治结果
组别雏鸭数Id2d3d4d5d6d7d死亡数死亡率治疗组13802781////362. 6%对照组10031020423/4242%
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根据以上1、2的试验结果和3的临床应用效果，及鸭病毒性肝炎潜伏期短，从感染 到死亡快的只有24小时，大部分集中在48小时左右的特征，制定了鸭α干扰素临床防治 鸭病毒性肝炎的治疗方案为一旦发现有该病的病鸭，应尽快将整群鸭肌注鸭α-干扰素， 使用剂量为1万个细胞半数保护量，用药途径为肌肉注射0. 5ml/只，每天一次连用3天，相 对治愈率达到93%以上。
权利要求
一种重组鸭α 干扰素的制备方法，该方法按以下步骤进行(1)鸭α 干扰素基因合成将Genebank公布编号为X84764的鸭α 干扰素基因序列进行合成；(2)引物的设计和合成根据鸭α 干扰素基因序列设计用于扩增鸭a 干扰素成熟蛋白基因的引物，该上、下游引物的5`端分别加上BamHI和EcoRI酶切位点，该引物对的序列为上游引物P15` ATTAGGATCCTGCAGCCCCCTGCGCCTC 3`下游引物P25` GAAGAATTCTTAGCGCATGGTGCGGGTG 3`(3)表达载体的构建以合成的鸭α 干扰素基因为模板，用P1、P2引物扩增出鸭a 干扰素成熟蛋白基因，经BamHI和EcoRI双酶切插入表达载体PET 28a(+)BamHI和EcoRI的酶切位点，再转化入受体菌E.coliBL21 plsS，筛选出高效表达的阳性克隆菌，经测序验证正确后作为工程菌保存；(4)工程菌的诱导表达将阳性克隆菌接种含50ug/ml卡那的LB培养液，37℃培养过夜，次日将该菌液按2％的接种量接种与上述相同LB培养基中，37℃培养至OD600值为0.6～0.7；加入最终浓度为1mmol的IPTG诱导剂诱导培养4h；取菌液4000转离心10min收集菌体，置 70℃冰箱保存，备用；(5)表达产物的提取、纯化、复性将菌体与由50mM磷酸缓冲液、300mMNaCl、10mM β 巯基乙醇配制，pH7.8的裂解buffer按重量1∶4比例重悬；用高压均质机在650帕压力下，重复裂解两次，13000转、离心20分钟，得沉淀物即提取的包涵体；将包涵体与由6M盐酸胍、100mM NaH2PO4、10mM Tris HCl、10mM β 巯基乙醇配制，pH 8.0的溶解buffer按重量1∶10比例用超声波重悬，室温下作用90min，10000转离心30min后，取上清液过镍柱纯化，得带有组氨酸标签的纯度达90％以上的目的蛋白；将纯化后的目的蛋白装入透析袋，先在由2M尿素、50mM醋酸缓冲液、10mM β 巯基乙醇、50mM NaCl配制，pH 3.6的缓冲液1中透析复性24小时，10000转离心10min，取上清液；再在由50mM醋酸缓冲液、50mM NaCl配制，pH 3.6的缓冲液2中透析复性48小时，期间换液一次，过滤除菌后即为粗制鸭α 干扰素；(6)生物学活性的测定采用微量细胞病变抑制法，在鸭胚成纤维细胞系上用水泡性口炎病毒VSV检测粗制重组鸭α 干扰素的生物学活性，其生物学活性为每毫升细胞半数保护量达105u以上，即为重组鸭α 干扰素成品。
全文摘要
本发明公开了一种重组鸭α-干扰素的制备方法，属于生物制药技术领域。该方法包括(1)鸭α-干扰素基因合成；(2)引物的设计和合成；(3)表达载体的构建；(4)工程菌的诱导表达；(5)表达产物的提取、纯化、复性；(6)生物学活性测定等步骤组成。本发明重组鸭α-干扰素制剂纯度达90％以上，每毫升细胞半数保护量达105u以上，经临床应用其相对治愈率达93％以上，且其价格低廉，为鸭病毒性肝炎治疗提供了一种安全有效，无毒副作用的新药剂，具有良好的社会效益和应用前景。本发明可在鸭养殖场和禽用制药企业推广应用。
文档编号C07K1/14GK101899446SQ201010107059
公开日2010年12月1日 申请日期2010年2月8日 优先权日2010年2月8日
发明者刘蔓雯, 叶伟成, 张存, 张燕 申请人:浙江省农业科学院