专利名称：西地那非及其衍生物的人工合成抗原的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种西地那非及其衍生物的人工合成抗原的工艺。
背景技术：
西地那非(Sildenafil)，又译昔多芬，是一种研发治疗心血管疾病药物时意外发 明出的治疗男性勃起功能障碍药物，一般以其商业用名Viagra(中国大陆注册名万艾可， 台湾和香港注册名威而钢)广为人知。不过相对于商品名西地那非在中国的俗名“伟哥”使 用的更广泛，影响也更大。目前，在国内好多中成药或保健品中非法添加西地那非以达到临 床的疗效，作为患者，在长期不知情的情况下服用含有西地那非的中成药或保健品会引起 严重的副作用，检测中成药或保健品中是否含有伟哥成分时，采用的是传统的检验方法，须 将提取的样品带回实验室进行分析，或是使用大型的试验车，这样都很不方便，而且反应时 间长，实验耗资较大。
发明内容
本发明的目的是为了克服以上的不足，提供一种操作方便的西地那非及其衍生物 的人工合成抗原的工艺。本发明的目的通过以下技术方案来实现一种西地那非及其衍生物的人工合成抗 原的工艺，包括以下步骤A、生成水溶性碳化二亚胺(EDC)(1)、烷基化往反应瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及那非类原料或拉非类 原料，并通队保护，在室温下进行搅拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快速称取浓度 为60%的氢化钠(NaH)，并将其加入所述反应瓶中，搅拌50-70分钟，直至溶液无气泡产生， 然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反应瓶中，注入完毕后，在室温下搅拌11-13 小时，之后将反应液倾入水中分散，以氯仿进行提取，合并提取液，以无水Na2S04进行干燥， 之后过滤，再经过减压浓缩后得到固体，加入无水乙醚打浆洗涤所述固体，之后进行过滤， 最后真空干燥得到新的固体，此固体为烷基化物；(2)、水解将无水乙醇和上述步骤所得的烷基化物加入新的反应瓶中，进行搅拌 分散，再加入NaOH溶液，加热回流反应2小时，停止加热稍冷却后，将反应液转入单口瓶中， 减压浓缩得糊状物，再加入水，以盐酸调节至PH值为7-9的液体，以氯仿进行提取，合并提 取液，再用饱和食盐水洗一次，以无水Na2S04干燥，过滤，减压浓缩得白色固体，用甲醇重结 晶，得白色粉状固体，此固体为水溶性碳化二亚胺(EDC)；B、生成人工合成抗原(1)、将上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺(EDC)、N_羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二 甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室温；(2)、取上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原 化合物，三者的摩尔比为半抗原化合物水溶性碳化二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺=
41 8-12 13-16，将其置入圆底烧瓶，然后加入上述步骤中所得的二甲基甲酰胺溶解，为 保证反应完全，在室温避光的条件下进行搅拌，最后生成的溶液记为二号反应液；(3)、当水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物在二甲基甲酰胺中 反应完全后，现配载体蛋白溶液(BSA/KLH)，将载体蛋白与硼酸缓冲液按1 0.15-0. 2的量 溶解于另一容器中的硼酸缓冲液，然后转入另一圆底烧瓶中，此溶液记为三号反应液；(4)、将二号反应液按每10秒1滴的速度滴入三号反应液中，直至将二号的反应液 加完后，先在室温避光的条件下进行搅拌，之后在3-5 °C条件下避光搅拌，待反应完全后，生 成溶液，并将生成的溶液记为四号反应液，四号反应液中载体蛋白与半抗原化合物比例为 1 15-25 ；(5)、等所有反应结束后，将四号反应液置于20000-30000分子截留透析袋中，透 析袋中还装有0. 01-0. 02M磷酸盐缓冲液，pH值为7. 0-7. 5，将透析袋在3_5°C的条件下进 行透析，每隔3-5小时换一次磷酸盐缓冲液；(6)、经上述透析步骤最终所得的产品，经冷冻干燥为白色絮状产品，即为人工合 成抗原。本发明的进一步改进在于步骤B(2)中，三者的摩尔比的最佳比值为半抗原化 合物水溶性碳化二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺=1 10 15，且在室温避光的条件下搅 拌三者的混合液22-26个小时。本发明的进一步改进在于步骤B(4)中，先在室温避光的条件下搅拌1-3小时，之 后再在3-5°C条件下避光搅拌46-50小时。本发明的进一步改进在于步骤B(5)中，将四号反应液置于20000分子截留透析 袋中，透析袋中还装有0. 01M磷酸盐缓冲液将透析袋在3-5°C的条件下透析46-50小时。本发明的进一步改进在于步骤a(l)中，那非类原料为西地那非(c22h3(ln604s)、 豪莫西地那非(c23H32N6o4s)、羟基豪莫西地那非(c23h32n6o5s)、那莫西地那非(C22H29N504S)、 硫代艾地那非(c23H32N6O3S2)、红地那非(C25H34N6O3)、那红地那非(C24H32n6O3)、伐地那非 (c23h32n6o4s)、伪伐地那非(c22h29n5o4s)，拉非类原料为他达拉非(c22h19n3o4)、氨基他达拉非 (C21H18N4O4)。本发明与现有技术相比具有以下优点水溶性碳化二亚胺(EDC)是一种水溶性碳化二亚胺，通常以盐酸盐的形式存在。 反应最适pH为4.0-6.0。水溶性碳化二亚胺(EDC)是一种羧基基活化试剂，与一号羧酸 反应生成更易取代的二号中间产物。二号中间产物可以相对羧基更易被伯胺化合物亲核取 代，同时生成水溶性碳化二亚胺(EDC)；也可以被羧基亲核取代生成五号酸酐和同时生成 水溶性碳化二亚胺(EDC)，形成的酸酐化合物也很容易被伯胺化合物取代。水溶性碳化二亚 胺(EDC)联合N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使用，会提高反应产率和更加稳定的中间产物。水 溶性碳化二亚胺(EDC)法人工合成抗原的机理为水溶性碳化二亚胺(EDC)与含有羧基的 化合物反应，生成活泼的二号中间产物。然后载体蛋白在某一 PH时，一般是大于其等电点， 使蛋白中的氨基暴露出来，从而成为提供伯胺的底物，然后亲核进攻活性中间产物，从而达 到小分子化合物偶联到载体蛋白的目的。此方法获得的人工合成抗原可做成胶体金，从而 可以进一步做成胶体金试纸，此胶体金试纸可以随时检测样品中是否含有西地那非，不需 要专业人士操作，检测方便，现场快速检测，准确性高。
具体实施例方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，该实施例 仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。本发明西地那非及其衍生物的人工合成抗原的工艺的一种
具体实施例方式
A、生成水溶性碳化二亚胺(EDC)设计合成西地那非(Viagra)的羧酸衍生物，其化学结构如下 西地那非(Viagra)的另一种含羧酸衍生物，其化学结构如下
西地那非生成西地那非的含羧酸衍生物的反应式如下
具体步骤如下(1)、烷基化往反应瓶中加入20ml干燥的二甲基甲酰胺(DMF) 及1.708g、3.6X10_3mol的那非类原料或拉非类原料，并通N2保护，在室温下进行搅拌，待 二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快速称取0. 173g、4. 32X10_3mol、浓度为60%的氢化钠 (NaH)，并将其加入所述反应瓶中，搅拌50-70分钟，直至溶液无气泡产生，然后用1ml注射 器吸取1. 202g、7. 2X10_3mol的溴乙酸乙酯慢慢注入所述反应瓶中，注入完毕后，在室温下 搅拌11-13小时，之后将反应液倾入60ml水中分散，以20ml X 3的氯仿进行提取，合并提取 液，以无水Na2S04进行干燥，之后过滤，再经过减压浓缩后得到固体，加入6ml无水乙醚打浆 洗涤所述固体，之后进行过滤，最后真空干燥得到1.7228新的固体，收率85.31%，此固体 为烷基化物； (2)、水解将15ml无水乙醇和上述步骤所得的1. 682g、3. OX 10_3mol的烷基化物加入新的反应瓶中，进行搅拌分散，再加入10ml、lmol/L的NaOH溶液，加热回流反应2小 时，停止加热稍冷却后，将反应液转入单口瓶中，减压浓缩得糊状物，再加入20ml水，以3N 盐酸调节至PH值为7-9的液体，以15ml X 3的氯仿进行提取，合并提取液，再用饱和食盐水 洗一次，以无水Na2S04干燥，过滤，减压浓缩得白色固体，用甲醇重结晶，得1.222g白色粉状 固体，收率76. 47%，此固体为水溶性碳化二亚胺(EDC)；B、生成人工合成抗原(1)、将上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺(EDC)、N_羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二 甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室温；(2)、取水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物，三者的摩尔比为 半抗原化合物水溶性碳化二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺=1 8-12 13-16，最佳比值 为1 10 15，将其置入预先洗干净的圆底烧瓶，加入上述步骤中所得的适量的二甲基 甲酰胺溶解，一般根据上述混合液体的多少加入二甲基甲酰胺，二甲基甲酰胺的加入量对 反应影响不大，一般加入2-4ml 二甲基甲酰胺，能溶解样品即可，太多对下一步反应中的蛋 白载体有影响，为保证反应完全，在室温避光的条件下搅拌22-26个小时，最佳搅拌时间为 24h，最后生成的溶液记为二号反应液。其中烧瓶中不能有水残留，用前需烘干并预冷至室 温，以免影响反应物、产物的稳定性，影响反应效率；(3)、当水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物在二甲基反应完全 后，现配载体蛋白溶液(BSA/KLH，其中BSA为牛血清白蛋白，KLH为人血蓝蛋白)，将载体蛋 白与硼酸缓冲液按1 0. 15-0. 2(100mg溶解在15-20ml硼酸缓冲液)的量溶解于另一干 净容器中的硼酸缓冲液，然后转入另一干净圆底烧瓶中，此溶液记为三号反应液，其中硼酸 缓冲液和载体蛋白反应液必须现配现用，硼酸缓冲液为9. 0的硼酸缓冲液；(4)、将二号反应液按每10秒1滴的速度滴入三号反应液中，直至将二号的反应液 加完后，先在室温避光的条件下搅拌2小时，之后在3-5°C条件下避光搅拌，最佳的搅拌时 间为48小时，其中载体蛋白与半抗原化合物比例为1 15-25，载体蛋白与半抗原化合物 的比例根据不同的蛋白和半抗原而定，一般半抗原化合物与载体蛋白的偶联比例在10-20 之间，所反应得到的抗原，对下一步免疫动物或通过其他途径获得抗体具有较高的特异性 和高效性，所以载体蛋白与半抗原化合物的摩尔反应比例在20左右较佳；(5)、等所有反应结束后，将样品置于20000分子截留透析袋中，透析袋中还装有 0. 01M磷酸盐缓冲液，pH值为7. 0-7. 5，将透析袋在3-5°C的条件下进行透析，每隔3_5小时 换一次磷酸盐缓冲液；(6)、透析上述步骤中所得的样品，经冷冻干燥为白色絮状产品，即为人工合成抗原。上述步骤A (1)中，那非类原料为西地那非(C22H3QN604S)，其结构式如下
豪莫西地那非(c23H32N6o4s)，其结构式如下
羟基豪莫西地那非(c23H32N6o5s)，其结构式如下
那莫西地那非(c22H29N5o4s)，其结构式如下 硫代艾地那非(C23H32N603S2)，其结构式如下
红地那非(c25H34N6o3)，其结构式如下
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那红地那非(C24H32N6O3)，其结构式如下
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伐地那非(c23H32N6o4s)，其结构式如下
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伪伐地那非(c22H29N5o4s)，其结构式如下
拉非类原料为他达拉非(C22H19N304)，其结构式如下 氨基他达拉非(C21H18N4O4)，其结构式如下 上述人工合成抗原的反应机理为 人工合成抗原的检测方法如下分别取10ug/ml，50ug/ml，100ug/ml, 250ug/ml, 500ug/ml, 750ug/ml, lmg/ml 梯度浓度的
半抗原化合物，载体蛋白，全抗原。分别对其进行全波长扫描，以确定最佳全波长扫描浓度。
图1为10ug/mlN-乙酸西地那非全波长扫描图谱； 图2为30ug/mlN-乙酸西地那非全波长扫描图谱； 图3为lOOug/mlN-乙酸西地那非全波长扫描图谱； 图4为lmg/mlN-乙酸西地那非全波长扫描图谱；从图1至图4中可看出，lOOug/ml浓度为N-乙酸西地那非较好的全波长扫描浓 度。当浓度太小时，由于吸收值过低，不能体现样品的最大吸收波长；浓度达到lmg/ml时， 由于样品浓度太高，会掩盖N-乙酸西地那非的最佳吸收波长。偶联比例计算以N-乙酸西地那非-BSA完全抗原举例 图5为100ug/ml N-乙酸西地那非紫外全波长吸收图谱； 图6为N-乙酸西地那非-BSA全波长扫描图谱。从图5、6可知，N-乙酸西地那非，N-乙酸西地那非-BSA均在280nm处有吸收峰。 100ug/ml N-乙酸西地那非在280nm处吸收值大于0.7。吸收值太大，引起的偏差太大，故 稀释十倍，浓度为10mg/ml，测得紫外吸收值为0. 280，符合测N-乙酸西地那非摩尔吸光值 的要求。E = A/cl = 0. 28/ (IOug X l(T7ml/532. 6) = 14912 (532. 6 为 N-乙酸西地那非
的摩尔质量)；对BSA和N-乙酸西地那非-BSA (以下简称S-BSA)分别在lmg/ml的浓度下测其 280nm处紫外吸光值，数据如下lmg/ml BSA 在 280nm 处的吸收值0. 595
lmg/ml S-BSA 在 280nm 处的吸收值2. 717则产物中N-乙酸西地那非的吸收值2. 717-0. 595 = 2. 122则产物中N-乙酸西地那非的摩尔浓度2. 122/14912 = 1. 423X 10_4mol/L则产物中N-乙酸西地那非的质量浓度1. 423 X IO^4X 532. 6 = 0. 075g/L产物中BSA 的质量浓度1-0. 0758 = 0. 9242产物中BSA 的摩尔浓度0. 9242/67000 = 1. 379X 10_5mol/L(67000 为 BSA 的摩
尔质量)。则偶联比为1.423X 10-4mol/L/l. 379 X 10_5mol/L = 10。
权利要求
一种西地那非及其衍生物的人工合成抗原的工艺，其特征在于包括以下步骤A、生成水溶性碳化二亚胺(EDC)(1)、烷基化往反应瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及那非类原料或拉非类原料，并通N2保护，在室温下进行搅拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快速称取浓度为60％的氢化钠(NaH)，并将其加入所述反应瓶中，搅拌50 70分钟，直至溶液无气泡产生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反应瓶中，注入完毕后，在室温下搅拌11 13小时，之后将反应液倾入水中分散，以氯仿进行提取，合并提取液，以无水Na2SO4进行干燥，之后过滤，再经过减压浓缩后得到固体，加入无水乙醚打浆洗涤所述固体，之后进行过滤，最后真空干燥得到新的固体，此固体为烷基化物；(2)、水解将无水乙醇和上述步骤所得的烷基化物加入新的反应瓶中，进行搅拌分散，再加入NaOH溶液，加热回流反应2小时，停止加热稍冷却后，将反应液转入单口瓶中，减压浓缩得糊状物，再加入水，以盐酸调节至pH值为7 9的液体，以氯仿进行提取，合并提取液，再用饱和食盐水洗一次，以无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩得白色固体，用甲醇重结晶，得白色粉状固体，此固体为水溶性碳化二亚胺(EDC)；B、生成人工合成抗原(1)、将上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺(EDC)、N 羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室温；(2)、取上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺、N 羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物，三者的摩尔比为半抗原化合物∶水溶性碳化二亚胺∶N 羟基琥珀酰亚胺＝1∶8 12∶13 16，将其置入圆底烧瓶，然后加入上述步骤中所得的二甲基甲酰胺溶解，为保证反应完全，在室温避光的条件下进行搅拌，最后生成的溶液记为二号反应液；(3)、当所述水溶性碳化二亚胺、N 羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物在二甲基甲酰胺中反应完全后，现配载体蛋白溶液(BSA/KLH)，将载体蛋白与硼酸缓冲液按1∶0.15 0.2的量溶解于另一容器中的硼酸缓冲液，然后转入另一圆底烧瓶中，此溶液记为三号反应液；(4)、将二号反应液按每10秒1滴的速度滴入三号反应液中，直至将二号的反应液加完后，先在室温避光的条件下进行搅拌，之后在3 5℃条件下避光搅拌，待反应完全后，生成溶液，并将生成的溶液记为四号反应液，四号反应液中载体蛋白与半抗原化合物比例为1∶15 25；(5)、等所有反应结束后，将四号反应液置于20000 30000分子截留透析袋中，透析袋中还装有0.01 0.02M磷酸盐缓冲液，pH值为7.0 7.5，将透析袋在3 5℃的条件下进行透析，每隔3 5小时换一次磷酸盐缓冲液；(6)、经上述透析步骤最终所得的产品，经冷冻干燥为白色絮状产品，即为人工合成抗原。
2.根据权利要求1所述西地那非及其衍生物的人工合成抗原的工艺，其特征在于所 述步骤B(2)中，三者的摩尔比的最佳比值为半抗原化合物水溶性碳化二亚胺N-羟基 琥珀酰亚胺=1 10 15，且在室温避光的条件下搅拌三者的混合液22-26个小时。
3.根据权利要求1或2所述西地那非及其衍生物的人工合成抗原的工艺，其特征在于 所述步骤B(4)中，先在室温避光的条件下搅拌1-3小时，之后再在3-5°C条件下避光搅拌 46-50小时。
4.根据权利要求3所述西地那非及其衍生物的人工合成抗原的工艺，其特征在于所 述步骤B(5)中，将四号反应液置于20000分子截留透析袋中，透析袋中还装有0. OlM磷酸 盐缓冲液将透析袋在3-5°C的条件下透析46-50小时。
5.根据权利要求4所述西地那非及其衍生物的人工合成抗原的工艺，其特征在于所 述步骤A(I)中，那非类原料为西地那非(C22H3tlN6O4S)、豪莫西地那非(C23H32N6O4S)、羟基豪 莫西地那非(C23H32N6O5S)、那莫西地那非(C22H29N5O4S)、硫代艾地那非(C23H32N6O3S2)、红地那 非(C25H34N6O3)、那红地那非(C24H32N6O3)、伐地那非(C23H32N6O4S)、伪伐地那非(C22H29N5O4S)Ji 非类原料为他达拉非(C22H19N3O4)、氨基他达拉非(C21H18N4O4)。
全文摘要
本发明公开了一种西地那非及其衍生物的人工合成抗原的工艺，包括以下步骤先生成水溶性碳化二亚胺(EDC)，再将水溶性碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室温；取水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物，称好上述样品加入预先洗干净的圆底烧瓶，加入二甲基甲酰胺溶解，最后生成的溶液记为二号反应液；将载体蛋白按1∶0.15-0.2的量溶解于硼酸缓冲液的另一干净容器中，然后转入另一干净圆底烧瓶中，此溶液记为三号反应液；将二号反应液滴入三号反应液中；等所有反应结束后，透析上述步骤中所得的样品，经冷冻干燥为白色絮状产品，即为人工合成抗原。
文档编号C07K14/795GK101914155SQ20101024846
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月9日 优先权日2010年8月9日
发明者吴迪宏 申请人:江苏省南通药品检验所