专利名称：分离和去除TNFR-Fc融合蛋白中寡聚体的方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质分离与纯化，特别涉及一种分离和去除TNFR-Fc融合蛋白中寡聚体的方法。
背景技术：
TNFR-Fc融合蛋白(重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白)是一种利用基因工程技术重组人类肿瘤坏死因子受体与免疫球蛋白Fc段形成的蛋白多肽，即是Kanerc印t，中文名为益赛普。它能阻止关节变形，治疗中、重度类风湿关节炎，同时也能够治疗强直性脊柱炎和重度银屑病。通过特异性地与人体内的肿瘤坏死因子(TNF)结合，对TNF的活性起负调节作用，从而抑制人体骨关节内的炎症反应。中国专利申请公布说明书CN1417334A公开了构建与制备肿瘤坏死因子受体可溶部分的重组基因，及融合蛋白基因与产物的技术方案，仅仅提及制备纯化过程中选用蛋白A-kpharose进行亲和层析，可获得纯度90%以上的融合蛋白。然而纯化TNFR-Fc融合蛋白的一个重要问题是如何分离和去除TNFR-Fc融合蛋白中的寡聚体。寡聚体形成的原因一部分是在细胞培养分泌表达产物的时候自动形成的，一部分是由于盐或者PH诱导的蛋白变性使得溶剂可接近表面的疏水区域暴露导致蛋白质形成凝聚体。这些寡聚体的存在使病人在使用药品后会发生过敏性，引起人体强烈的副反应，所以在纯化过程中必须要去除。传统去除寡聚体的方法为分子筛层析(排阻层析SEC)，但是分子筛层析是纯化的瓶颈，有很多缺点一是分子筛层析分离效果不彻底，对于分子量差别不是特别大的蛋白，分离效果不是很好；二是分子筛层析与其他层析技术相比，要求标本高度浓缩，上样量只能在柱体积的0. 5% 4%之间，柱子要细而长才能得到好的分离效果，需要大量的处理时间，需要很大的柱体积，材料昂贵并且上样量低，不利于放大生产。中国专利申请公布说明书CN189^66A公开了使用羟磷灰石去除高分子量寡聚体的技术方案，该方案是一种从含有高分子量寡聚体的抗体制剂纯化至少一种抗体的方法，其包括a)使所述抗体制剂接触羟磷灰石树脂并用包含1至20mM磷酸钠和0. 2至2. 5M氯化钠的至少一种洗脱缓冲液从树脂洗脱纯化的抗体；或b)使所述羟磷灰石树脂接触溶于包含1至20mM磷酸钠和0. 2至2. 5M氯化钠的加样缓冲液中的抗体制剂并允许纯化的抗体流过所述柱。该方案在羟磷灰石层析之前还包含使抗体制剂经受A蛋白亲和层析和离子交换层析两个步骤，从而除掉大部分聚集体，达到纯化蛋白的目的。中国专利申请公布说明书CN1703421B公开了降低PEG化蛋白的聚集体水平的技术方案，包括以下步骤a)提供所述PEG化生长激素拮抗剂或同工型；b)将包括任何杂质和任何聚集体的所述PEG化生长激素拮抗剂或其同工型到阴离子交换树脂上，其中上样在电导率小于或等于lOmS/cm，pH为5-10，蛋白浓度为小于或等于10g/L填充床体积的条件下进行；以及c)通过阴离子交换层析分离所述PEG化生长激素拮抗剂或其同工型；其进一步包括合并步骤d)合并个别量的所述PEG化生长激素拮抗剂同工型，以通过选自下列的技术生成合并的PEG化生长激素拮抗剂毛细管电泳，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，离子交换层析，疏水作用层析，阴离子交换层析，阳离子交换层析，反相高压液相层析，大小排阻高压液相层析，亲和层析及其组合，从而降低形成的寡聚体水平。疏水作用层析用柠檬酸钠、乙酸钠作为缓冲盐以及通过反相盐梯度而达到除去某些游离PEG、未PEG化蛋白和聚集体。但是亲和作用层析和疏水作用层析在去除寡聚体方面，由于蛋白浓度增加或洗脱过程中所需要缓冲盐浓度或PH的改变，可以诱导寡聚体形成。
发明内容
寡聚体的存在使病人使用药品后会发生过敏性，引起人体强烈的副反应，所以在纯化过程中必须要去除。为此发明人经过反复试验，克服以上技术困难，提供了一种使用亲和层析后用疏水层析，选用适合的层析分离条件，将含有TNFR-Fc融合蛋白的动物细胞培养上清液中的寡聚体大规模去除的方法。为实现上述目的，本发明的方案包括以下步骤第一、从动物细胞培养上清液中通过蛋白A亲和层析回收TNFR-Fc融合蛋白，收集TNFR-Fc融合蛋白；第二、将收集的TNFR-Fc融合蛋白通过疏水作用层析分离和去除寡聚体。本发明的纯化方案具体包括以下步骤第一、蛋白A亲和层析首先，用浓度为0.01 0. lmol/LTris缓冲液(含浓度为0. 1 0. 5mol/L氯化钠，PH为6. 0 8. 0)平衡蛋白A亲和层析柱，缓冲液用量为2 10个柱体积，直至流出液与平衡液电导及PH值一致；其次，将含有TNFR-Fc融合蛋白的上清液，用浓度为3mol/LTris溶液调节pH且与上述Tris缓冲液的pH相同，以20ml/min的流速上样，直至上清液全部流过亲和层析柱，后用浓度为0. 01 0. lmol/LTris洗涤液(含浓度为0. 1 0. 5mol/L氯化钠，同时也含浓度为0. 5 3. Omol/L尿素，pH为6. 0 8. 0)冲洗层析柱，洗涤液用量为2 10个柱体积，然后用浓度为0. 1 0. 2mol/L柠檬酸洗脱液(含有浓度为0. 5 2. Omol/L尿素，pH为3. 2 3. 8)以10 50ml/min的流速洗脱吸附在层析柱上的TNFR-Fc融合蛋白，根据^Onm波长下蛋白吸收值，收集TNFR-Fc融合蛋白洗脱液；再次，将收集的TNFR-Fc融合蛋白洗脱液，用浓度为3mol/L Tris溶液中和至pH为6. 0 8. 0，并用浓度为0. lmol/L柠檬酸缓冲液(pH为2. 0 3. 0)清洗层析柱，缓冲液用量为2 10个柱体积；第二、疏水作用层析首先，用浓度为0. 01 0. 05mol/LTris-HCl缓冲液(含浓度为0. 8 1. 5mol/L硫酸铵，pH为6. 0 8. 0)平衡疏水作用层析柱，缓冲液用量为2 10个柱体积；然后，将蛋白A亲和层析收集的TNFR-Fc融合蛋白，用浓度为3mol/LTris溶液调节pH与上述Tris-HCl缓冲液的pH相同，并与浓度为0. 01 0. 05mol/LTris_HCl缓冲液(含浓度为1. 6 3. 0mol/L硫酸铵，pH为6. 0 8. 0)以体积比为1 1的比例混勻后上样疏水层析柱，流速控制为10 lOOml/min，然后用浓度为0. 01 0. 05mol/LTris-HCl洗涤液(含浓度为0. 7 0. 9mol/L硫酸铵，pH为6. 0 8. 0)洗涤，洗涤液用量为2. 5 3个柱体积，再用浓度为0. 01 0. 05mol/LTris-HCl洗脱液(含浓度为0. 1 0. 5mol/L硫酸铵，pH为6. 0 8. 0)洗脱吸附在疏水作用层析柱上的TNFR-Fc融合蛋白，根据^Onm波长下蛋白吸收值，收集TNFR-Fc融合蛋白洗脱液，得到低寡聚体含量的TNFR-Fc融合蛋白。本发明对平衡亲和层析柱的Tris缓冲液进行了优选，优选地，上述平衡亲和层析柱所用的iTris缓冲液浓度为0. 02mol/L(含浓度为0. 2mol/L氯化钠，pH为7. 0)。本发明还对亲和层析的洗涤液进行了优选，优选地，上述亲和层析的洗涤液是浓度为0. 02mol/LTris缓冲液(含浓度为0. 2mol/L氯化钠，同时也含浓度为1. 5mol/L尿素，pH 为 7. 0)。本发明还对亲和层析的洗脱液进行了优选，优选地，上述亲和层析洗脱液是浓度为0. lmol/L柠檬酸(含浓度为1. 5mol/L尿素，pH为3. 5)。本发明还对亲和层析洗涤液的流速进行了优选，优选地，上述亲和层析所用的浓度为0. lmol/L柠檬酸(含浓度为1. 5mol/L尿素，pH为3. 5)的流速为30ml/min。本发明还对亲和层析收集的TNFR-Fc融合蛋白洗脱液的pH调节进行了优选，优选地，上述亲和层析收集的TNFR-Fc融合蛋白洗脱液用浓度为3mol/L Tris溶液调节pH为7. 5。本发明还对清洗亲和层析柱的缓冲液进行了优选，优选地，上述清洗亲和层析柱所用浓度为0. lmol/L柠檬酸缓冲液的pH为2. 8。本发明对疏水作用层析的介质进行了优选，优选地，上述疏水作用层析所用的介质为 Phenyl Sepharose 6 fast flow 或 Butyl Sepharose 4 fast flow。本发明还对平衡疏水作用层析柱的缓冲液进行了优选，优选地，上述平衡疏水作用层析柱所用的Tris-HCl缓冲液浓度为0. 02mol/L(含浓度为l.Omol/L硫酸铵，pH为7. 5)。本发明还对与TNFR-Fc融合蛋白等体积混合的Tris-HCl缓冲液进行了优选，优选地，上述与TNFR-Fc融合蛋白等体积混合的Tris-HCl缓冲液浓度为0. 02mol/L(含浓度为2. 0mol/L 硫酸铵，pH 为 7. 5)。本发明还对疏水作用层析的上样流速进行了优选，优选地，上述疏水作用层析的上样流速为50ml/min。本发明还对疏水作用层析的洗涤液进行了优选，优选地，上述疏水作用层析的洗涤液是浓度为0. 02mol/LTris-HCl洗涤液(含浓度为0. 8mol/L硫酸铵，pH为7. 5的)。本发明还对疏水作用层析洗脱液进行了优选，优选地，上述疏水作用层析的Tris-HCl洗脱液浓度为0. 02mol/L (含浓度为0. 4mol/L硫酸铵，pH为7. 5)。本发明与现有技术相比具有如下突出的优点采用亲和层析，选取rProtein A亲和凝胶，该亲和凝胶能与TNFR-Fc融合蛋白中的Fc段蛋白特异性结合，大大的减少了纯化步骤，可使这一步纯化所得的TNFR-Fc融合蛋白的纯度达到90%以上，同时可除去大部分杂质，为后续的纯化工作带来方便，通过在洗涤液和洗脱液中加入尿素，降低了蛋白质聚集形成寡聚体的可能性。而通过进一步的疏水作用层析，选择硫酸铵作为洗脱液的洗脱方法，低盐浓度洗脱，根据疏水作用的强弱将寡聚体和目的蛋白很好的分离，使目的蛋白的寡聚体含量降至1. 0%以下。本发明经过亲和层析后用熟水作用层析，使目的蛋白的纯度大大提高，减少了寡聚体的含量，纯化操作步骤节省、节约成本、生产工艺技术简单、性能好，解决了现有技术中的缺点，适用于实验室规模、中试规模及工业化大生产中分离去除TNFR-Fc融合蛋白的寡聚体，经该发明方法得到的成品达到了 SFDA对生物制品中寡聚体含量的要求，具有较高的实用价值。
具体实施例方式以下通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。实施例1分离和去除TNFR-Fc融合蛋白中寡聚体的方法第一、蛋白A亲和层析用rProtein A Sepharose FF填料，按说明书装填LC50/600有机玻璃层析柱，胶体积500ml，吸附容量以25mg/ml计。用蒸馏水洗涤层析柱，流速为30ml/min，蒸馏水用量为3个柱体积；用浓度为0. lmol/L Tris-HCl缓冲液(pH为7. 0)预平衡，流速为30ml/min，缓冲液用量为3个柱体积。首先，蛋白A亲和层析柱用浓度为0. 02mol/LTris缓冲液(含浓度为0. 2mol/L氯化钠，PH为7. 0)平衡层析柱，缓冲液用量为2个柱体积；其次，将含有TNFR-Fc融合蛋白且含量为75. 0 %的上清液，用浓度为3mol/LTris溶液调节PH为7. 0，以20ml/min的流速上样，直至上清液全部流过亲和层析柱，随后用浓度为0. 02mol/LTris洗涤液(含浓度为0. 2mol/L氯化钠、浓度为1. 5mol/L尿素，pH为7. 0)洗涤层析柱，洗涤液用量为2个柱体积，然后用浓度为0. lmol/L柠檬酸洗脱液(含浓度为1.5mol/L尿素，pH为3. 5)洗脱吸附在层析柱上的TNFR-Fc融合蛋白，洗脱液流速控制为30ml/min，根据^Onm波长下蛋白吸收值，收集TNFR-Fc融合蛋白洗脱液；再次，将收集TNFR-Fc融合蛋白洗脱液，立即用浓度为3. Omol/LTris溶液调节pH为7. 5，并用浓度为0. lmol/L柠檬酸缓冲液(pH为3. 0)清洗层析柱，缓冲液用量为2个柱体积。对比效果试验上样步骤同上所述，将已上样TNFR-Fc融合蛋白的蛋白A亲和层析柱用浓度为0. 02mol/LTris洗涤液(含浓度为0. 2mol/L氯化钠，pH为7. 0)洗涤层析柱，洗涤液用量为2个柱体积，然后用0. lmol/L柠檬酸洗脱液(pH为3. 5)洗脱吸附在层析柱上的TNFR-Fc融合蛋白，洗脱液流速控制为30ml/min，根据^Onm波长下蛋白吸收值，收集TNFR-Fc融合蛋白洗脱液；将收集TNFR-Fc融合蛋白立即用浓度为3. 0mol/L Tris溶液调节pH为7. 5，并用浓度为0. lmol/L柠檬酸缓冲液(pH为2. 8)清洗层析柱，缓冲液用量为2个柱体积。表1提供了蛋白A亲和层析前后所收集TNFR-Fc融合蛋白的纯度结果比较。通过非还原电泳SDS PAGE、RP HPLC检测分析，该TNFR-Fc融合蛋白上样前纯度为75. 0%,寡聚体含量为23. 1%，选择使用本发明的洗涤液和洗脱液之后所得的TNFR-Fc融合蛋白纯度达到92.3%，寡聚体含量为7. 1 %，对比试验的结果为88. 0 %，寡聚体含量为11.2%。表1融合蛋白纯度结果比较
权利要求
1.一种分离和去除TNFR-Fc融合蛋白中寡聚体的方法，包括以下两个步骤第一、从动物细胞培养上清液中通过蛋白A亲和层析回收TNFR-Fc融合蛋白，收集TNFR-Fc融合蛋白；第二、将收集的TNFR-Fc融合蛋白通过疏水作用层析分离和去除寡聚体，其特征在于所述的蛋白A亲和层析的方法为首先，用浓度为0.01 0. lmol/L含浓度为0. 1 0. 5mol/L氯化钠，且pH为6. 0 8. 0的Tris缓冲液平衡蛋白A亲和层析柱，缓冲液用量为2 10个柱体积，直至流出液与平衡液电导及PH —致；其次，将含有TNFR-Fc融合蛋白的上清液，用浓度为3m0l/LTriS溶液调节pH与上述Tris缓冲液的pH相同，以20ml/min的流速上样，直至上清液全部流过亲和层析柱，后用浓度为0. 01 0. lmol/L含浓度为0. 1 0. 5mol/L氯化钠，同时也含浓度为0. 5 3. Omol/L尿素，且pH为6. 0 8. 0的Tris洗涤液洗涤层析柱，洗涤液用量为2 10个柱体积，然后用浓度为0. 1 0. 2mol/L含浓度为0. 5 2. Omol/L尿素，且pH为3. 2 3. 8的柠檬酸洗脱液以10 50ml/min的流速洗脱吸附在层析柱上的TNFR-Fc融合蛋白，根据^Onm波长下蛋白吸收值，收集TNFR-Fc融合蛋白洗脱液；再次，将收集的TNFR-Fc融合蛋白洗脱液，立即用浓度为3mol/L Tris溶液调节pH为6. 0 8. 0，并用浓度为0. lmol/L柠檬酸，且pH为2. 0 3. 0的缓冲液清洗层析柱，缓冲液用量为2 10个柱体积；所述的疏水作用层析的方法为首先，用浓度为0. 01 0. 05mol/L含浓度为0. 8 1. 5mol/L硫酸铵，且pH为6. 0 8. 0的Tris-HCl缓冲液平衡疏水作用层析柱，缓冲液用量为2 10个柱体积；然后，将蛋白A亲和层析收集的TNFR-Fc融合蛋白，用浓度为3m0l/LTriS溶液调节pH与上述iTris-HCl缓冲液的pH相同，并与浓度为0. 01 0. 05mol/L含浓度为1. 6 3. Omol/L硫酸铵，且pH为6. 0 8. 0的Tris-HCl缓冲液以体积比为1 1的比例混勻后上样疏水层析柱，流速控制为10 lOOml/min，然后用浓度为0. 01 0. 05mol/L含浓度为0. 7 0. 9mol/L硫酸铵，且pH为6. 0 8. 0的Tris-HCl洗涤液洗涤，洗涤液用量为2. 5 3个柱体积，再用浓度为0. 01 0. 05mol/L含浓度为0. 1 0. 5mol/L硫酸铵，且pH为6. 0 8. 0的Tris-HCl洗脱液洗脱吸附在疏水作用层析柱上的TNFR-Fc融合蛋白，根据^Onm波长下蛋白吸收值，收集TNFR-Fc融合蛋白洗脱液，得到低寡聚体含量的TNFR-Fc融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的平衡亲和层析柱所用的Tris缓冲液浓度为0. 02mol/L含浓度为0. 2mol/L氯化钠，且pH为7. 0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的亲和层析的洗涤液是浓度为0. 02mol/L含浓度为0. 2mol/L氯化钠，同时也含浓度为1. 5mol/L尿素，且pH为7. 0的Tris缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的亲和层析洗脱液是浓度为0.lmol/L柠檬酸含浓度为1. 5mol/L尿素，且pH为3. 5。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的亲和层析所用的浓度为0.lmol/L柠檬酸含浓度为1. 5mol/L尿素，且pH为3. 5的洗脱液的流速为30ml/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的蛋白A亲和层析收集的TNFR-Fc融合蛋白洗脱液用浓度为3mol/L Tris溶液调节pH为7. 5。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的清洗亲和层析柱所用的浓度为0. lmol/L柠檬酸缓冲液的pH为2. 8。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的疏水作用层析所用的介质为PhenylSepharose 6 fast flow 或 Butyl Sepharose 4 fast flow。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的平衡疏水作用层析柱所用的Tris-HCl缓冲液浓度为0. 02mol/L含浓度为1. Omol/L硫酸铵，且pH为7. 5。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的与TNFR-Fc融合蛋白等体积混合的Tris-HCl缓冲液浓度为0. 02mol/L含浓度为2. Omol/L硫酸铵，且pH为7. 5。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的疏水作用层析的上样流速为50ml/min0
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的疏水作用层析的洗涤液是浓度为0. 02mol/L含浓度为0. 8mol/L硫酸铵，且pH为7. 5的Tris-HCl洗涤液。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的疏水层析的Tris-HCl洗脱液浓度为0. 02mol/L含浓度为0. 4mol/L硫酸铵，且pH为7. 5。
全文摘要
本发明公开了一种纯化TNFR-Fc融合蛋白的方法，通过免疫亲和层析和疏水作用层析纯化TNFR-Fc融合蛋白，即在使用亲和层析后进行疏水层析，可降低蛋白中寡聚体的含量，满足SFDA对生物产品的质量要求。本发明可以有效分离去除TNFR-Fc融合蛋白中的寡聚体。
文档编号C07K1/20GK102382190SQ20101026840
公开日2012年3月21日 申请日期2010年9月1日 优先权日2010年9月1日
发明者赵丽丽, 赵志全, 隋华芹 申请人:山东新时代药业有限公司