专利名称：纯化重组促卵泡激素的方法
纯化重组促卵泡激素的方法本发明涉及纯化重组促卵泡激素(FSH)或者重组FSH变体的方法。该方法包括将含有重组FSH或者重组FSH变体的液体进行阴离子交换层析、疏水作用层析和染料亲和层析，其中这些层析可以以任意顺序进行，并且其中该方法既不包括弱的阴离子交换层析又不包括反相层析。此纯化的方法得到高产量的重组促卵泡激素，其具有期望程度的纯度。得到的促卵泡激素在预防和治疗病症和医学适应症中尤其有用，在所述病症和医学适应症中认为促卵泡激素制剂是有用的药物。促卵泡激素(FSH)由垂体前叶的促性腺激素细胞产生并被释放到循环系统中。促卵泡激素与黄体生成素(LH)在控制雌性中卵母细胞的成熟和雄性中的精子发生中一起作用。促卵泡激素与黄体生成素都属于异源二聚体的糖蛋白家族，其由分离的基因编码的两条非共价键连接的α链和β链组成。α链和β链都被糖基化。α亚基由92个氨基酸残基组成，而β亚基由111个氨基酸残基组成，每条亚基都含有两个潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点。人促卵泡激素用于治疗不能排卵的妇女，用于刺激多卵泡的发育(超排卵)和如 IVF, ICSLGIFT或者CIFT等的协助受孕的准备。此外，人促卵泡激素用于在具有低的或者没有促卵泡激素产生的妇女中刺激卵泡的成熟，并且在少精液症男性中刺激精子发生。在诱导排卵的典型的治疗方案中，患者在大约6至大约12天中每天注射ras或者其变体(每天大约75-450IU FSH)。在受控的卵巢过度刺激的典型治疗方案中，患者在大约 6至大约12天中每天注射FSH或者其变体(大约每天150-600IU FSH)。为了刺激精子发生，一种方案将每周三次150IU FSH和每周两次2. 500IU hCG联合使用，此方案已经在患有低促性腺激素性性腺功能减退的男性中成功的实现了精子数量的增加。直到20世纪80年代，人促卵泡激素主要的来源是从育龄妇女的尿液中分离出来的尿源促卵泡激素。在20世纪90年代引进了高纯度的尿源促卵泡激素的进一步纯化类型，并且从1998年以来最终开发了重组的促卵泡激素并被广泛使用。随着重组DNA技术的到来，在转染了编码α链和β链的核酸序列的细胞培养物中产生人促卵泡激素变得可能。 例如在WO 88/10270，WO 86/04589和EP 0 735 139中公布了编码α链和β链的DNA序列和生产重组促卵泡激素的方法。目前，在德国市场上有两种商业的重组人促卵泡激素产品，GONAL-f^* !!!·^^!
，这两种产品都是通过在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达编码人野生型的α链和β链的 DNA序列生产的。由于促卵泡激素在治疗生育病症中的重要性，提供高纯度和高比活性的重组促卵泡激素是所希望的。促卵泡激素治疗需要重复注射。高度纯化的促卵泡激素制剂可以通过皮下施用，其允许患者自己施用，因此增加了患者的便利和依从性。Ares Trading S. A的国际专利申请WO 2006/051070 Al描述了一种纯化重组促卵泡激素的方法，其包括以下步骤1)染料亲和层析，2)疏水作用层析；和3)反相层析。WO 2006/051070 Al进一步公开了一种纯化促卵泡激素的方法，其包括将促卵泡激素进行1)阴离子交换层析，2)染料亲和层析，3)疏水作用层析，4)反相层析和5)阴离子交换层析的步骤。Ares Trading S. A的国际专利申请WO 2005/063811 Al涉及一种纯化重组促卵泡激素的方法，其包括(1)离子交换层析；(2)固定化的金属离子层析；和(3)疏水作用层析 (HIC)的步骤。Ares Trading S. A的WO 2007/065918 A2描述了一种纯化促卵泡激素的方法，其包括层析步骤染料亲和层析，弱的阴离子交换层析，疏水作用层析以及强的阴离子交换层析，这些层析可以以任意顺序进行。持续需要纯化重组促卵泡激素以及其变体的新方法。特别地，需要避免使用反相层析步骤的纯化方法。进一步的，不依赖于免疫亲和层析但是可以在没有这种成本密集型的步骤的情况下进行的纯化方法是所希望的。按照本发明，通过主权利要求的特征解决了这些和进一步的问题。在从属权利要求中限定了有利的实施方案。本发明的目的是提供一种纯化重组促卵泡激素或者重组促卵泡激素变体的有利的新方法。一方面，本发明提供一种从含有粗制的促卵泡激素的溶液中纯化重组人促卵泡激素或者其变体的方法，其包括以下步骤-阴离子交换层析，-疏水作用层析，和-染料亲和层析，这些层析可以以任意顺序进行，其中所述方法避免任何弱的阴离子交换层析以及任何反相层析。在另一个实施方案中，不同的层析步骤按照以下顺序进行(1)阴离子交换层析， (2)疏水作用层析，和(3)染料亲和层析。阴离子交换层析(AEC)依赖于样品中蛋白质和固定在树脂上电荷之间的电荷-电荷相互作用。在阴离子交换层析中，蛋白质的结合离子是带负电，而固定的官能团是带正电。通常使用的阴离子交换树脂是Q-树脂，季铵和DEAE树脂(二乙基氨基乙烷)。然而，一般阴离子交换层析步骤可以使用所有的通常商业上可得到的阴离子交换树脂或者膜进行。阴离子交换树脂可以以预装柱的形式使用。备选地，可以自己准备层析柱。与其他普通的层析注相比，这种层析柱没有容积和形状的具体限制。本领域技术人员知道使用的阴离子交换树脂的量取决于捕获步骤中应用于层析柱的细胞培养液或者其它液体，例如，前面层析步骤的洗脱液中的总体蛋白质含量。可用于本发明的目的的典型的强阴离子交换柱树脂包括官能团如季铵基乙基 (QAE)部分，树脂包括例如 iToyopearl QAE (从 iTosoh Bioscience，德国购买)，Selectacel QAE(纤维素的一种季铵基乙基衍生物，从Polysciences Inc.，美国宾夕法尼亚州购买) 和其他的；季铵(Q)部分，树脂包括例如，Q Sepharose XL, Q Sepharose FF, Q Sepharose HP(从GE Healthcare,德国购买)，Resource Q(从GE Healthcare,德国购买)，Macro Prep High Q (从 Bio-Rad，美国加利福尼亚州购买)，Toyopearl SuperQ (从 Tosoh Bioscience, 德国获得)，UNOsphere Q(从Bio-Rad，美国加利福尼亚州购买)，和三甲基铵乙基(TMAE) 基团，树脂包括例如，FractogelEMD TMAE (从Merck，德国购买)。
阴离子交换层析优选地是强阴离子交换层析，其使用具有N+(CH3)3官能团的强阴离子交换树脂或者具有类似特征的树脂进行。可用于本发明目的的强阴离子交换树脂优选的实例是季铵强阴离子交换树脂，其在本领域已知为UNOsphere Q，Q Sepharose HP和其他的具有季铵(Q)部分的树脂。强阴离子交换树脂UNOsphere Q的特征如下
官能团-N+(CH3)3
总离子容量12(^eq/ml
动态结合能力
150 cm/hr180 mg/ml
600 cm/hr125 mg/ml
运输抗衡离子cr
中值粒径120μηι
推荐的线性流速范围50-1200 cm/hr
化学稳定性
1.0M NaOH(20°C)长达 2000 hr 1.0 M HCl (20"C)长达 200 hr
体积变化
pH 4-10<5%
0.01-1.0 M NaCl<5%
pH稳定性1-14强阴离子交换树脂Q Sepharose HP的特征如下离子容量动态能力建议流速
操作中填充床的最大压力 HiLoad ^MM 压力限制平均粒径
排阻限(Mr ) 基盾
pH稳定性
化学稳定性
0.14-0.20 mmol Cl /ml 70 mg BSA/ml 介盾 30-150 cm/h 3 巴(42 psi, 0.3 MPa)
5 巴(73 psi, 0.5 MPa) 34μιη
约4*106球蛋白交联琼脂糖，6% 2-12 (工作和长期)， 1-14 (短期)
在所有常用的缓冲液中稳定优选的避免使用弱的阴离子交换树脂，如基于二乙基氨基乙基(DEAE)或者二甲基氨基乙基(DMAE)作为官能团的那些树脂。阴离子交换层析步骤优选的使用具有弱碱性ρΗ，例如约pH 7. O至约9. 0，或者约 7. 5至约8. 5的缓冲液进行。合适的缓冲液包括，例如，硼酸盐缓冲液，三乙醇胺/亚氨基二乙酸Tris,乙酸铵，tricine，N- 二 (羟乙基)甘氨酸，TES, HEPES, TAPS。优选地使用Tris 缓冲液。通常通过加入盐，优选氯化钠增加流动相的电导率完成从阴离子交换树脂上的洗脱。本发明方法的疏水作用层析(HIC)可以使用HIC树脂进行，其具有相对温和的疏水表面(与反相树脂更强的疏水表面相比)。具有疏水表面性质的蛋白质被吸引到这些通常具有醚，苯基，丁基，或己基的树脂上。HIC可以使用所有常见的通过商业途径可获得的HIC树脂进行。为本发明的目的使用的HIC树脂包含基质如丁基、苯基、丙基或者辛基琼脂糖，SOURCE 15(都可以从GE Healthcare，德国购买)，Macro-Pr印 Methyl 或者叔丁基 HIC 支持体(Bio-I ad，Germany)， 或者具有丙基或苯基配体的Fractogel EMD (Merck AG, Germany), Toyopearl HIC树脂，如 Toyopearl Butyl 650M 和类似的 HIC 树脂 CTosoh Bioscience)。在优选的实施方案中，疏水作用层析使用由用苯基、丁基或者辛基衍生的交联琼脂糖珠组成的树脂或者具有类似特征的树脂进行。Wienyl Sepharose 6FF(从GE Healthcare购买)的特征如下
7配体密度
Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(低 sub) Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (高 sub)
结合能力
Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (低 sub)
Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (高 sub)
25μιηο1/ιη1 基质 40μιηοΙ/ιη1 基质
压力/流量规格
ρH稳定性
10 mg IgG/ml 基质 24 mg HSA/ml 基质 30 mg IgG/ml 基盾 36 mg HSA/ml 基质 L巴XK 50/60层析柱, 柱床高25 cm 14 (短期)，3-13 (长期)
200-400 cm/h,
化学稳定性在常用的溶液，离液剂，去垢剂，
极性有机溶剂中稳定
平均粒径90μηι
20%乙醇
M温度4。C -30。C在HIC树脂上的结合在高导电性的溶液中完成，其通过加入盐(例如NaCl， (NH4)2SO4或者Na2SO4)得到。通常HIC步骤中的洗脱通过减少流动相的导电性进行(例如降低盐浓度)，使用PH值约5至约9，更优选的约6至约8，最优选的约7至约8的缓冲液。平衡、洗涤、洗脱缓冲液可以包含通常用于HIC的所有缓冲液类型。因此，缓冲试剂包含磷酸钠，乙酸钠，Tris/HCl，HEPES或者其他缓冲试剂。此外，依据缓冲液是用于平衡、 洗涤或者洗脱，缓冲液可含有0. 5mM至3mM的NaCl，KCl或者其他合适的盐。平衡和洗涤缓冲溶液比洗脱缓冲液含有更高浓度的前述盐。在HIC步骤中特别优选的缓冲液是包含有NaCl的Tris/HCl缓冲液。本发明方法的染料亲和层析可以使用本领域技术人员众所周知的具有固定的配体染料化合物的树脂，即Cikicron Blue F3G-A进行。本领域技术人员完全理解术语“固定的”，并且其指配体化学连接到树脂的意义上，配体是经衍生的。在优选的实施方案中，染料亲和层析以Cibacron Blue F3G-A作为配体进行的， 该配体共价偶联到任何基质上，如琼脂糖基质。优选地，染料亲和层析使用已知称作Blue Sepharose FF(可以从GE Healthcare，德国购买)的树脂进行。Blue Sepharose FF的技
术特征如下给出配体Cibacron Blue F3G-A
配体偶联方法三療偶联
结合能力> 18 mg人血清白蛋白/ml介质
配体密度~ 7μιηο1 Cibacron Blue /ml 介质
基质高度交联的琼脂糖，6%
平均粒径90μιη
ρΗ稳定性4-12 (长期)，3-13 (短期)
保存20%乙醇，0.1Μ磷酸鉀缓冲液，ρΗ8·0
保存温度4°C-30°C
化学稳定性在70%乙醇，6M盐酸胍，8M尿素中
40 °C下稳定7天可理解本发明方法中染料亲和层析可以用具有类似特征的备选树脂进行。备选树脂实例包括 Joyopearl AF-blue-HC-650M (Tosoh Biosciences), Blue Cellthru BigBead(Sterogene) , SwelIGel Blue (Pierce), Cibachrome blue 3GA_agraose 100(Sigma), Affi-Gel Blue (Bio-Rad),Econo-Pac blue cartridges (Bio-Rad), Cibacron Blue 3GA(Sigma)。固定的染料亲和层析步骤中的洗脱优选地使用Tris/HCl缓冲液或者磷酸盐缓冲液进行。最优选的是含有氯化钠的Tris/HCl缓冲液。洗脱剂的ρΗ值优选的是约7至约9， 最优选的PH值是7至8。在另一方面，按照本发明纯化重组的促卵泡激素或者促卵泡激素变体的方法包括将含有所述促卵泡激素或者其变体的液体进行-阴离子交换层析，-疏水作用层析，-染料亲和层析，和进一步的阳离子交换层析的步骤，这些层析可以以任意顺序进行，其中所述方法避免任何弱的阴离子交换层析以及任何反相层析。在一个实施方案中，按照以下顺序进行步骤(1)阴离子交换层析，(2)疏水作用层析，(3)染料亲和层析，和阳离子交换层析。阳离子交换层析(CEC)依赖于样品中的蛋白质和固定在树脂上的电荷之间的电荷-电荷相互作用。在阳离子交换层析中，蛋白质的结合离子是带正电的，固定的官能团是带负电的。通常使用的阳离子交换树脂是S-树脂、硫酸衍生物和CM(羧甲基)树脂、羧化衍生的离子。然而，通常阳离子交换层析步骤可以用所有常用的通过商业途径可得到的阳离子交换树脂或者膜进行。阳离子交换树脂可以以预装柱或者膜的形式使用，其上固定有官能团例如磺酸。备选地，可以自己制备层析柱。至于层析柱的容积和形状，与其他普通的层析
9柱相比没有特别的限制。本领域的技术人员了解使用的阳离子交换树脂的量取决于细胞培养液或者其它液体(例如，在前的层析步骤的洗脱液)中的总体蛋白质含量。可用于本发明目的的典型的阳离子交换树脂可以从GE Healthcare和其他的离子层析配件和层析柱的制造商中购买。通常，使用PH值4至7的缓冲液进行阳离子交换层析。在一个优选的实施方案中，本发明的方法的阳离子交换步骤以膜阳离子交换进行。优选地，阳离子交换步骤用固定在膜上的强酸性阳离子交换剂磺酸或者具有类似特征的交换剂进行。本发明的阳离子交换步骤中使用的合适的膜吸附剂是众所周知的并且可以从一些供应商购买。例如，本发明方法的阳离子交换层析方法可以使用从再生纤维素制成的膜进行，并且其具有在纤维素骨架上形成的磺酸的层析基质。一种有用的膜吸附剂的实例是 Sartorius出售的Sartobind S膜吸附剂。Sartobind S膜吸附剂的技术数据给出如下Sartobind SingerSep (强酸阳离子交换剂S) 磺酸(R-CH2 SO3 )
>0.8 mg/cm2(29 mg/ml)，用牛血清白蛋白和鸡蛋溶菌酶测定 4-6peq/cm2
稳定的增强纤维素 275μιη > 3μιη
圓柱，标称层数15 4 mm
聚丙烯(FD A) 0.4MPa(4 巴，58 psi) 3-14 (短期) 一次性使用
在层析所有常用的使用缓冲液中都稳定， 1 M NaOH(20 °C 时 30-60min), 8M 尿素， 8M盐酸胍，乙醇，丙酮和100%乙腈。 避免氧化剂。阳离子交换层析步骤可以按照制造商的方案进行。例如，可以使用PH7.0的 Tris-HCl缓冲液。发现阳离子交换层析，优选的阳离子膜吸收剂步骤清除所有分子大小的宿主细胞蛋白质而保持短的处理时间。产量约95%是非常有利的，因为在pH 7. O时促卵泡激素不与吸附剂结合。一般来说，发现层析膜形式的阳离子交换层析在纯化重组促卵泡激素或者促卵泡激素变体中非常有用。因此，另一方面，本发明涉及阳离子膜吸附剂在纯化FSH或者FSH变体方法中的用途。在一个优选的实施方案中，阳离子膜吸附剂是阳离子交换吸附剂，优选的强阳离子交换吸附剂，其由再生纤维素制成，并且具有在纤维素骨架上形成的磺酸的层析基质。在另一方面，按照本发明纯化重组促卵泡激素或者促卵泡激素变体的方法包括将
名称配体
静态结合能力
离子容量膜
基本材料膜厚度标称孔径胶嚢设计
柱床高度材料胶嚢最大压力 ρH稳定性
化学稳定性
1含有所述促卵泡激素或者促卵泡激素变体的液体进行-阴离子交换层析，-疏水作用层析，-染料亲和层析，-任选的阳离子交换层析，和进一步额外的阴离子交换层析步骤，这些层析可以以任意顺序进行，其中所述方法避免弱的阴离子交换层析以及反相层析。在一种实施方案中，步骤按照以下顺序进行第一次阴离子交换层析、疏水作用层析、染料亲和层析、任选的阳离子交换层析、和第二次阴离子交换层析。第二次阴离子交换层析可以使用上面提到的与第一次阴离子交换层析相联系的典型的阴离子交换树脂进行。第二次阴离子交换层析优选地是强阴离子交换层析，其使用具有-N+(CH3)3官能团的强阴离子交换树脂或者具有类似特征的树脂进行。可用于本发明目的的强阴离子交换树脂的优选的实例是季铵强阴离子交换树脂，其在本领域已知为UNOsphere Q，Q Sepharose HP和其他的具有季铵(Q)部分的树脂。强阴离子交换剂 UNOsphere Q和Q Sepharose HP的特征在上面在第一次阴离子交换层析方面给出。在第二次阴离子交换层析步骤中，也优选的避免使用弱的阴离子交换树脂，如基于以二乙基氨基乙基(DEAE)或者二甲基氨基乙基(DMAE)作为官能团的那些树脂。阴离子交换层析步骤优选的使用弱碱性pH，例如约pH 7. O至约9. 0，或者约7. 5 至约8. 5的缓冲液进行。合适的溶液包括，例如，硼酸盐缓冲液，三乙醇胺/亚氨基二乙酸， Tris,乙酸铵，tricine，N- 二 (羟乙基)甘氨酸，TES, HEPES, TAPS。优选地使用Tris缓冲液。通常通过加盐，优选的氯化钠增加流动相的电导率实现从阴离子交换树脂上的洗脱。在一个实施方案中，第二次阴离子交换层析使用pH 7. 0至9. 0的Tris-HCl/NaCl 缓冲液作为洗脱剂进行。在另一方面，按照本发明纯化重组促卵泡激素或者促卵泡激素变体的方法包括将含有所述FSH或FSH变体的液体进行步骤-阴离子交换层析，-疏水作用层析，和染料亲和层析，所述步骤可以以任意顺序进行，其中该方法避免了弱的阴离子交换层析以及反相层析，并且其中该方法进一步包括大小排阻层析。在另一方面，按照本发明纯化重组促卵泡激素或者促卵泡激素变体的方法包括将含有所述促卵泡激素或者促卵泡激素变体的液体进行步骤-阴离子交换层析，-疏水作用层析，-染料亲和层析，任选的阳离子交换层析，任选的进一步的阴离子交换层析，和大小排阻层析，
12
这些层析可以以任意顺序进行，其中所述方法避免弱的阴离子交换层析以及反相层析。在一个实施方案中，步骤按照以下顺序进行阴离子交换层析，疏水作用层析，染料亲和层析，任选的阳离子交换层析，任选的进一步的阴离子交换层析和大小排阻层析。在一个优选的实施方案中，本发明包括以下顺序的以下步骤第一次阴离子交换层析，疏水作用层析，染料亲和层析，任选的阳离子交换层析，任选的第二次阴离子交换层析和大小排阻层析。大小排阻层析(SEC)，也已知为凝胶过滤层析，是一种层析方法，其中颗粒例如蛋白质和其他的生物分子基于它们的大小分开。SEC典型的凝聚介质是聚丙烯酰胺，葡聚糖， 琼脂糖或者其混合物。SEC基质可以从许多层析配件和层析柱制造商中购买，例如从Tosoh Bioscience LLC 或者 GE Healthcare 购买。大小排阻层析优选的使用交联琼脂糖和葡聚糖的球形复合材料的基质进行。大小排阻层析基质的有用的实例是现有技术中已知为Superdex 75pg，例如可以从GE Healthcare购买的基质。Superdex 75pg柱允许根据大小高分辨率分离蛋白质，多肽和其他的生物分子。一般，大小排阻柱在纯化程序中是理想的精制步骤。Superdex 75pg基质的技术细节如下
权利要求
1.纯化重组促卵泡激素或者重组促卵泡激素变体的方法，其包括将含有所述重组促卵泡激素或者重组促卵泡激素变体的液体进行-阴离子交换层析， -疏水作用层析，和 -染料亲和层析， 这些步骤以任意顺序进行，其中所述方法既不包括弱的阴离子交换层析又不包括反相层析。
2.权利要求1的方法，其中所述步骤按照以下顺序进行a)阴离子交换层析，b)疏水作用层析，和c)染料亲和层析。
3.权利要求1或2的方法，其中所述阴离子交换层析使用具有-N+(CH3)3官能团的强阴离子交换树脂或者具有类似特征的树脂进行。
4.前述权利要求任一项的方法，其中所述疏水作用层析使用以苯基或者丁基衍生的交联琼脂糖珠组成的树脂或者具有类似特征的树脂进行。
5.前述权利要求任一项的方法，其中所述染料亲和层析使用CibacronBlue3G作为配体共价的偶联到任何基质进行。
6.前述权利要求任一项的方法，其中所述层析使用pH在7.0至9.0范围内的 Tris-HCl/氯化钠缓冲液作为洗脱剂进行。
7.前述权利要求任一项的方法，所述方法进一步包括阳离子交换层析。
8.权利要求7的方法，其中所述膜阳离子交换层析用固定在膜上的强酸性阳离子交换剂磺酸或者有类似特征的交换剂进行。
9.权利要求7或者8的方法，其中所述步骤按照以下顺序进行a)阴离子交换层析，b)疏水作用层析，c)染料亲和层析，和d)阳离子交换层析。
10.权利要求1至6任一项的方法，进一步包括另一阴离子交换层析。
11.权利要求10的方法，其中所述阴离子交换层析使用具有-N+(CH3)3官能团的强阴离子交换树脂或者具有类似特征的树脂进行。
12.权利要求10或11的方法，其中所述阴离子交换层析使用pH在7.0至9. 0范围内的Tris-HCl/氯化钠缓冲液作为洗脱剂进行。
13.权利要求10至12任一项的方法，其中所述步骤按照以下顺序进行a)第一次阴离子交换层析，b)疏水作用层析，c)染料亲和层析，d)任选的阳离子交换层析，和e)第二次阴离子交换层析。
14.权利要求1至6任一项的方法，所述方法进一步包括大小排阻层析。
15.权利要求14的方法，其中所述大小排阻层析使用交联琼脂糖和葡聚糖的球形复合材料的基质进行。
16.权利要求14或者15的方法，其中所述步骤按照以下顺序进行a)第一次阴离子交换层析，b)疏水作用层析，c)染料亲和层析，d)任选的阳离子交换层析，e)任选的第二次阴离子交换层析，和f)大小排阻层析。
17.前述权利要求任一项的方法，其包括以下顺序的以下步骤a)第一次阴离子交换层析，b)疏水作用层析，c)染料亲和层析，d)膜阳离子交换，e)第二次阴离子交换层析，和f)大小排阻层析。
18.前述权利要求任一项的方法，其进一步包括一个或多个超滤和/或纳米过滤步骤。
19.前述权利要求任一项的方法，其中不进行金属离子亲和层析。
20.前述权利要求任一项的方法，其中不进行免疫亲和层析。
21.纯化重组促卵泡激素或者重组促卵泡激素变体的方法，其包括将含有所述促卵泡激素或者促卵泡激素变体的液体进行膜阳离子交换剂的步骤。
22.权利要求21的方法，其进一步包括疏水作用层析。
23.权利要求21或者22的方法，其中所述膜阳离子交换剂是强酸性阳离子交换剂磺酸，或者具有类似特征的交换剂。
24.前述权利要求任一项的方法，其中所述促卵泡激素具有根据SEQID No. 1的α亚基和根据SEQ ID No. 2的β亚基。
25.前述权利要求任一项的方法得到的促卵泡激素或者促卵泡激素变体。
26.药物组合物，其包含根据权利要求25的促卵泡激素或者促卵泡激素变体以及可药用赋形剂。
27.根据权利要求25的促卵泡激素或者促卵泡激素变体或者根据权利要求沈的药物组合物用于治疗生育病症的用途。
全文摘要
本发明涉及纯化重组促卵泡激素(FSH)或者重组FSH变体的方法。该方法包括将含有重组FSH或者重组FSH变体的液体进行阴离子交换层析、疏水作用层析和染料亲和层析，其中这些层析可以以任意顺序进行，并且其中该方法既不包括弱的阴离子交换层析又不包括反相层析。此纯化的方法得到高产量的重组促卵泡激素，其具有期望程度的纯度。得到的促卵泡激素在预防和治疗病症和医学适应症中尤其有用，在所述病症和医学适应症中认为促卵泡激素制剂是有用的药物。
文档编号C07K14/59GK102448979SQ201080022681
公开日2012年5月9日 申请日期2010年4月1日 优先权日2009年4月1日
发明者C·谢克曼, D·艾兴格, S·阿诺德 申请人:拜奥吉耐里克斯股份公司