专利名称：用于治疗hiv的抗cxcr4抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够特异性结合于趋化因子受体(CXCR)的新抗体，特别是嵌合和人源化的小鼠单克隆抗体，以及编码此抗体的氨基酸和核酸序列。从一方面讲，本发明涉及能够特异性结合于CXCR4并具有对抗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的强活性的新抗体、功能性片段或衍生物。本发明还包括此抗体、功能性片段或衍生物作为预防和/或治疗HIV感染的药剂的用途。
背景技术：
趋化因子是小的分泌肽，其控制着(特别是免疫反应期间)白细胞沿配体化学梯度(被称为趋化因子梯度)的迁移(Zlotnick A.等，2000)。基于其NH2-端半胱氨酸残基的位置、及与G蛋白偶联受体(其两个主要亚家族被命名为CCR和CXCR)的结合，人们将趋化因子分为两个主要的亚家族，CC和CXC。到目前为止人们已发现了超过50个人趋化因子和18个趋化因子受体。趋化因子受体家族的若干成员作为主要受体⑶4的共受体发挥作用，使得HIV 1 型的不同株能够进入细胞，主要的共受体是CCR5和CXCR4。T细胞向性X4 HIV-I使用⑶4 和CXCR4进入细胞，而巨噬细胞向性R5HIV-1使用⑶4和CCR5。双向性的毒株能使用CXCR4 和CCR5作为共受体。其他趋化因子受体中的CCR3、CCR2、CCR8、CXCR6、CXCR7、CX3CR1能作为更限制亚群的HIV株的共受体发挥作用。SDF-I (CXCR4 的天然配体)以及 CCR5 的 CCL3、CCL4、CCL4_L1 和 CCL5 配体能够抑制不同株HIV-I引起的细胞融合和感染。这些发现促进了针对趋化因子受体的抗HIV治疗的发展，导致CCR5小分子拮抗剂马拉维诺(maraviroc) (CELSENTRI )获准与其他抗 HIV-I试剂组合用于CCR5向性HIV-I感染的患者。然而，马拉维诺不能用于被双向性HIV-I 感染的患者或者被CXCR4向性HIV-I感染的患者(VIDAL 2009)。因此，对于通过鉴定能抑制X4-向性HIV复制的CXCR4拮抗剂在X4-向性和双向性HIV感染的患者中扩展此类治疗有明确的医学需求。趋化因子受体4 (也被称为融合素、CD184、LESTR或HUMSTR)以包括352个或360 个氨基酸的两种异构体形式存在。残基Asnll被糖基化，残基Tyr21被加入硫酸盐基团所修饰，而Cysl09和186在受体的细胞外部分以二硫键桥相结合(Juarez J.等，2004)。不同种正常组织、幼稚、非记忆性T细胞、调节性T细胞、B细胞、中性粒细胞、内皮细胞、原发性单核细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、CD34+造血干细胞均表达此受体，而且在心脏、结肠、肝、肾和脑中有低水平表达。CXCR4在白细胞运输、B细胞淋巴细胞生成和髓细胞生成中起关键作用。到目前为止所描述的CXCR4受体的唯一配体是间质细胞衍生因子I(SDF-I)或 CXCL12。SDF-I在淋巴结、骨髓、肝脏、肺中大量分泌，而肾、脑和皮肤分泌相对较少。CXCR4 还被拮抗性趋化因子人单纯疱疹病毒III型所编码的病毒巨噬细胞炎症蛋白II(VMIP-II) 所识别。
如前面所提及的，CXCR4受体是T细胞向性HIV-I隔离群(X4病毒)的主要共受体。干扰此受体将以很有效的方式抑制X4病毒复制。
发明内容
本发明的一个发明性方面是生成抑制HIV复制的小鼠单克隆抗体(Mab)。本发明包括能结合于CXCR4同源二聚体并具有抵抗HIV感染的强活性的CXCR4Mab 515H7 (或其片段)。发明还包括能结合于C)(CR4同源二聚体并具有抵抗HIV感染的强活性的CXCR4 Mab 301aE5(或其片段)。令人吃惊的是，发明者已设法生成单克隆抗体，该抗体能够结合于CXCR4，并且能够诱导CXCR4同源二聚体的构象变化，而且能抑制原发隔离群X4-HIV-1在PBMC中的复制。 更特别的是，本发明的抗体还能够抑制原发隔离群X4/R5-HIV-1在PBMC中的复制。优选地，CXCR4化合物是人CXCR4的两个异构体之一，选自由下列构成的群-趋化因子(C-X-C基序)受体4异构体b智人，具有Genbank登录号NP_003458 所描绘的序列 SEQ ID No. 27 :MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFLPTIYSIIFLTG IVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIYTVNLYSSVLILAF ISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKWYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRFYPNDLWVWFQFQHIMV GLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFILLEIIKQGCEFENTVHKff ISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS ；-趋化因子(C-X-C基序)受体4异构体a智人，具有Genbank登录号 ΝΡ_001008540 所描绘的序列 SEQ ID No. 28 :MSIPLPLLQIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENAN FNKIFLPTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLLFVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAV HVIYTVNLYSSVLILAFISLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKVVYVGVWIPALLLTIPDFIFANVSEADDRYICDRF YPNDLWVVVFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFIL LEIIKQGCEFENTVHKffISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTE SESSSFHSS ；-可选的转录拼接变体或其天然变体，其与具有SEQID No. 27or 28的这些b或a 异构体的一个具有至少95%的同源性 ’及-其片段，其能够被它的天然配体间质细胞衍生因子I(SDF-I)所特异性识别，并且具有优选至少100、150和200个氨基酸长度。CXCR2选自由下列构成的群-白介素8受体β智人，具有Genbank登录号ΝΡ_001548所描绘的序列SEQID No. 29 :MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNSLVML VILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAI VHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLL IMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEIL GILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL ；-可选的转录拼接变体或其天然变体，与具有SEQID NoJ9的此白介素8受体β 具有至少95%的同源性；及-其片段，能够为IL-8所特异性识别，并且具有优选至少100、150和200个氨基酸长度。发明还包括用于选择具抗HIV活性的化合物的方法或能用于制备治疗HIV感染用的组合物的方法，特征在于所述方法包括步骤首先一方面，本发明的主题是用于生成和选择根据发明所述的抗体的方法。更特别的是，本发明涉及用于选择能够抑制HIV复制的抗CXCR4抗体或其功能性片段或衍生物的一个的方法，包括下列步骤i)筛选生成的抗体及选择能特异结合于CXCR4的抗体；ii)检验步骤i)所选的抗体并选择能结合外周血单核细胞(PBMC)的抗体，iii)检验步骤ii)所选的抗体并选择能结合于CXCR4同源二聚体的抗体，并且随后iv)检验步骤iii)所选的抗体并选择能抑制PBMC中原发隔离群X4-向性HIV-I 复制的抗体。在另一实施方案中，发明涉及用于选择能抑制HIV复制的抗CXCR4抗体或其功能性片段或衍生物的一个的方法，包括下列步骤i)筛选生成的抗体及选择能特异结合于CXCR4的抗体；ii)检验步骤i)所选的抗体并选择能结合外周血单核细胞(PBMC)的抗体，iii) 检验步骤ii)所选的抗体并选择能结合于CXCR4同源二聚体的抗体，并且随后iv)检验步骤iii)所选的抗体并选择能抑制PBMC中原发隔离群X4-向性HIV-I复制和/或能抑制 PBMC中原发隔离群X4/R5-向性HIV-I复制的抗体。抗体的生成可以通过本领域技术人员所知的任意方法实现，例如，将骨髓瘤细胞与来自免疫小鼠或与所选骨髓瘤细胞兼容的其他种群的脾细胞相融合Kohler&Milstein， 1975, Nature, 256 :495-497。免疫动物可包括带有人类免疫球蛋白座位从而直接生产人类抗体的转基因小鼠。另一可能的实施方案在于使用噬菌体展示技术来筛选文库。筛选步骤i)和ii)可以通过本领域技术人员所知的任意方法或过程来实现。作为非限制性例子，可以提到ELISA、BIAcore、免疫组化、使用CXCR4表达细胞膜抽提物或纯化CXCR4的蛋白印迹分析、FACS分析及功能筛选。优选的方法在于以FACS分析CXCR4转染物(步骤1)和至少PBMC(步骤2~)以确定生产的抗体也能识别靶标细胞表面的天然CXCR4 受体构象来进行筛选。此方法在下列实施例中有更精确的描述。筛选步骤iii)可以通过本领域技术人员所知的任意方法或过程来实现。作为非限制性但优选的例子，可以提及在CXCR4转染细胞或PBMC的膜抽提物上使用相关抗体的蛋白印迹和/或免疫沉淀技术。筛选步骤iv)可以通过本领域技术人员所知的任意方法或过程来实现。作为非限制性但优选的例子，可以提及筛选抗体的方法，通过使用Holl等所述的步骤 (J. Immunol. 2004，173，6274-83)筛选有抑制 X4 原发性 HIV-I 和 / 或 X4/R5 原发性 HIV-I 隔离群在PBMC中复制能力的抗体。在本发明方法的优选步骤iii)的优选实施方案中，所述步骤iii)在于通过BRET 分析表达CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP的细胞来评估抗体并且选择能抑制至少40 %、优选45 %、 50%,55%和最优选60%的BRET信号的抗体。BRET技术是被称为蛋白质二聚体化的代表的技术Angers等，PNAS，2000，97 3684-89]o在方法的步骤iii)中所用的BRET技术，为本领域技术人员所熟知，并在下列实施例中有详细描述。更特别的是，BRET(生物荧光共振能量转移)是在生物荧光供体(海肾荧光素酶(Rluc))和荧光受体GFP(绿色荧光蛋白)或YFP(黄色荧光蛋白))突变间发生的非辐射性能量转移。在本案例中使用EYFP(增强型黄色荧光蛋白)。转移效率取决于供体和受体之间的方向和距离。因而，只有当两个分子靠近(I-IOnm)时才能发生能量转移。 此性质被用于生成蛋白质-蛋白质相互作用分析。事实上，为了研究两个配偶体间的相互作用，一般第一个融合于海肾荧光素酶而第二个融合于GFP的黄色突变体。融合蛋白一般 (但不一定)表达于哺乳动物细胞。在其膜渗透性底物(腔肠素(coelenterazine))存在时，Rluc发射蓝光。如果GFP突变体距离IUuc不足lOnm，会发生能量转移并能检测到额外的黄色信号。BRET信号被测定为受体所发出的光与供体所发的光的比例。因此，当两个融合蛋白被拉近或构象变化使得IUuc和GFP突变体更靠近的时候，BRET信号将会增强。如果在优选实施方案中包括BRET分析，可以使用本领域技术人员所知的任意方法测定CXCR4 二聚体的构象变化。可提及下列技术，不做限制FRET (荧光共振能量转移)、 HTRF(同质时间分辨荧光)、FLIM(荧光寿命成像显微镜)或SW-FCCS单波长荧光交叉相关光谱)。也可使用其他经典技术，如共免疫沉淀、α筛选、化学交联、双杂交、亲和层析、 ELISA或Far蛋白印迹。在根据发明所述方法的特殊方面，步骤iii)在于以BRET分析表达CXCR4_RLuc/ CXCR4-YFP两者的细胞来评估抗体并且选择能抑制至少40%的BRET信号的抗体。第二方面，本发明的主题是通过所述方法获得分离的抗体或其功能性片段或衍生物的一个。所述抗体或其所述片段或衍生物的一个，能够特异结合于人CXCR4，所述抗体也能诱导CXCR4同源二聚体构象变化。 从文献中可知CXCR4Mabs之类(例如克隆A120)能够抑制HIV-I实验株 (X4HIV-1NL4_3)进入 PBMC(Tanaka R.等，J. Virol. 2001，75，11534-11543)。而且，也知道 CXCR4Mabs能抑制HIV-1X4原发隔离群进入表达CXCR4的细胞系。反过来而言，从未公布过能抑制在其自然环境中的此类病毒(即不只是实验室病毒或细胞系)的抗体。然而本发明的新颖且非显而易见的方面是CXCR4 Mabs能抑制HIV-1X4原发隔离群进入PBMC。表达“功能性片段及衍生物”将随后在本说明中详细定义。此处应理解的是本发明不涉及天然形式的抗体，那就是说抗体并不在其天然环境中，但能够通过自天然来源纯化而将其分离或获得，或者另外通过基因重组、或者通过化学合成获得，并且因此抗体能包含进一步所描述的非天然氨基酸。更特别的是，根据发明的另一方面，要求保护分离的抗体或其功能性片段或衍生物的一个，所述抗体特征在于它们包括至少一个互补决定域⑶R，该⑶R选自包括如IMGT 编号系统所定义的氨基酸序列SEQ ID No. 1至6和30至33的⑶R。根据第一方面，本发明涉及分离的抗体或其功能性片段或衍生物，包括选自根据 IMGT编号系统所定义的序列SEQ ID No. 1至6的⑶R的至少一个⑶R，或者其序列与序列 SEQ ID No. 1至6进行最佳比对后具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同源性的至少一个CDR。
根据第二方面，本发明涉及分离的抗体或其功能性片段或衍生物，包括选自根据 IMGT编号系统所定义的序列SEQ ID No. 1,2和30至33的⑶R的至少一个⑶R，或者其序列与序列SEQ ID No. 1、2和30至33进行最佳比对后具有至少80%、优选85%、90%、95% 和98%同源性的至少一个⑶R。抗体的“功能性片段”意指(特别是)抗体片段，如片段Fv、SCFv(SC =单链)、Fab、 F(ab' )2,Fab\scFv-Fc或双特异抗体、或其半衰期被延长的任意片段。此功能性片段将在随后的本说明中详细描述。抗体的“衍生化合物”或“衍生物”意指(特别是)为保持其识别CXCR4的活性、 由肽支架和最初抗体的至少一个CDR构成的结合蛋白质。此衍生化合物，为本领域技术人员所熟知，将在随后的本说明中更详细描述。更优选的是，根据本发明所述，本发明包括通过基因重组或化学合成获得的特别是嵌合型或人源化的抗体、其衍生化合物或其功能性片段。根据优选的实施方案，根据本发明所述的抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于它由单克隆抗体组成。应了解“单克隆抗体”意指来自于几乎同源抗体群的抗体。更特别指，群中的单独抗体(除一些可能以最小比例发现的天然产生突变以外)是相同的。换句话说，单克隆抗体由来自于单个细胞克隆(例如杂交瘤、以编码同源抗体的DNA分子转染的真核宿主细胞、 以编码同源抗体的DNA分子转染的原核宿主细胞等)生长的同源抗体构成，并且一般以一类且仅一类和亚类的重链、及仅一个类型的轻链为特征。单克隆抗体是高度特异的并定向针对单个抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇或表位的不同抗体的多克隆抗体制备物相对比，每个单克隆抗体是针对单一的抗原表位。更特别的是，根据发明的第一优选实施方案，抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于其包括含有选自⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3的至少一个⑶R的轻链，其中-CDR-Ll 包括氨基酸序列 SEQ ID No. 1，-CDR-L2 包括氨基酸序列 SEQ ID No. 2。-CDR-L3 包括氨基酸序列 SEQ ID No. 3。根据另一实施方案，发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段的一个，特征在于其包括含有序列SEQ ID No. 1、2或3的三个⑶R的至少一个、或在与序列SEQ ID No. 1,2 或3进行最佳比对后具有至少80 %、优选85 %、90 %、95 %或98 %同源性的至少一个序列的轻链。发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征还在于其包括含有⑶R-L1、 ⑶R-L2和⑶R-L3的轻链，其中⑶R-Ll包括氨基酸序列SEQ ID No. 1，⑶R-L2包括氨基酸序列SEQ ID No. 2而且CDR-L3包括氨基酸序列SEQ IDNo. 3。在另一实施方案中，本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 7或在与序列SEQ ID No. 7进行最佳比对后具有至少80%、 优选85 %、90 %、95 %或98 %同源性的至少一个序列的轻链序列。根据发明的第二个优选实施方案，抗体、或其衍生化合物或功能性片段，特征在于其包括含有选自⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3的至少一个⑶R的轻链，其中-CDR-Ll 包括氨基酸序列 SEQ ID No. 1，
-CDR-L2 包括氨基酸序列 SEQ ID No. 2，-CDR-L3 包括氨基酸序列 SEQ ID No. 30。根据另一实施方案，发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段的一个，特征在于它们包括含有序列SEQ ID No. 1、2或30的三个⑶R的至少一个、或在与序列SEQ ID No. 1、 2或30进行最佳比对后具有至少80 %、优选85 %、90 %、95 %或98 %同源性的至少一个序列的轻链。本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征还在于其包括含有⑶R-L1、 ⑶R-L2和⑶R-L3的轻链，其中⑶R-Ll包括氨基酸序列SEQ ID No. 1，⑶R-L2包括氨基酸序列SEQ ID No. 2而且CDR-L3包括氨基酸序列SEQ IDNo. 30。在另一实施方案中，发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 34或在与序列SEQ ID No. ；34进行最佳比对后具有至少80%、 优选85 %、90 %、95 %或98 %同源性的至少一个序列的轻链序列。更特别的是，本发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段的一个，特征在于其包括含有选自CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3的至少一个CDR的重链，其中-CDR-Hl 包括氨基酸序列 SEQ ID No. 4，-CDR-H2 包括氨基酸序列 SEQ ID No. 5，-CDR-H3 包括氨基酸序列 SEQ ID No. 6。根据另一实施方案，本发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段的一个，特征在于其包括含有序列SEQ ID No. 4、5或6的三个⑶R的至少一个、或在与序列SEQ ID No. 4、 5或6进行最佳比对后具有至少80 %、优选85 %、90 %、95 %或98 %同源性的至少一个序列的重链。根据另一特别的实施方案，抗体、或其衍生化合物或功能性片段的一个，特征在于其包括含有CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3的重链，其中CDR-Hl包括氨基酸序列SEQ ID No. 4， ⑶R-H2包括氨基酸序列SEQ ID No. 5而且⑶R-H3包括氨基酸序列SEQ ID No. 6。在另一实施方案中，本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 8、或在与序列SEQ ID No. 8进行最佳比对后具有至少 80 %、优选85 %、90 %、95 %或98 %同源性的至少一个序列的重链。更特别的是，本发明的抗体、其衍生化合物或功能性片段的一个，特征在于其包括含有选自CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3的至少一个CDR的重链，其中-CDR-Hl 包括氨基酸序列 SEQ ID No. 31，-CDR-H2 包括氨基酸序列 SEQ ID No. 32，-CDR-H3 包括氨基酸序列 SEQ ID No. 33。根据另一实施方案，本发明的抗体、或其衍生化合物或功能性片段的一个，特征在于其包括含有序列SEQ ID No. 31、32或33三个⑶R的至少一个、或在与序列SEQ ID No. 31、 32或33进行最佳比对后具有至少80 %、优选85 %、90 %、95 %或98 %同源性的至少一个序列的重链。根据另一特别实施方案，抗体、其衍生化合物或功能性片段的一个，特征在于其包括含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的重链，其中CDR-Hl包括氨基酸序列SEQ ID No. 31， ⑶R-H2包括氨基酸序列SEQ ID No. 32而且⑶R-H3包括氨基酸序列SEQ ID No. 33。
在另一实施方案中，本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 35、或在与序列SEQ ID No. 35进行最佳比对后具有至少 80 %、优选85 %、90 %、95 %或98 %同源性的至少一个序列的重链序列。发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征在于其包括一条轻链(该轻链包括分别含有氨基酸序列SEQ ID No. 1、2和3的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-U)和一条重链 (该重链包括分别含有氨基酸序列SEQ ID No. 4、5和6的⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3)。最后，发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征还在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 7的轻链和含有氨基酸序列SEQ ID No. 8的重链。本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征在于其包括一条轻链(该轻链包括分别含有氨基酸序列SEQ ID No. 1、2和30的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3)和一条重链(该重链包括分别含有氨基酸序列SEQ ID No. 31、32*33&CDR-H1、CDR-H2*CDR-H3)。最后，本发明的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，特征还在于其包括含有氨基酸序列SEQ ID No. 34的轻链和含有氨基酸序列SEQ ID No. 35的重链。在本说明书中，术语“多肽”、“多肽序列”、“肽”和“连接于抗体化合物或其序列的蛋白质”可互换。在此必须理解本发明不涉及天然形式的抗体，即抗体并不自其天然环境中得来， 但能够通过从天然来源纯化而将其分离或获得，或者通过基因重组或化学合成获得，并且因此抗体能携带下面所描述的非天然氨基酸。在第一个实施方案中，互补决定区或⑶R，意指Kabat等所定义的免疫球蛋白的重链禾口轻链的高可变区(Kabat 等，Sequences of proteins of immunologicalinterest,第五编，U. S. D印artment of Health and Human Services，NIH，1991，及以后的版本)。有三个重链⑶R和三个轻链⑶R。此处，取决于情况，术语“⑶R”和“⑶Rs”用于指示一个或多个、或甚至全部的包含多数决定对其识别的抗原或表位的抗体结合亲和性的氨基酸残基的区域。在第二个实施方案中，通过⑶R区域或⑶R(S)，意为指示如IMGT所定义的免疫球蛋白重链和轻链的高可变区。IMGT唯一编号被规定用于比较任何抗原受体、链类型或种类的可变区Lefranc Μ. -P. , Immunology Today 18, 509 (1997)/Lefranc Μ.-P. , TheImmunoIogist, 7, 132-136(1999)/Lefranc, Μ. -P. , Pommie, C. , Ruiz, Μ. , Giudicelli, V. , Foulquier, Ε, Truong, L. , Thouvenin-Contet, V.禾口 Lefranc, Dev. Comp. Immunol. ,27,55-77(2003)。 在IMGT唯一编号中，保守氨基酸通常具有同样位点，例如半胱氨酸23(第一 CYS)、色氨酸 41 (保守的-TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104(第二 CYQ、苯丙氨酸或色氨酸118(J_PHE 或J-TRP)。IMGT唯一编号提供了框架区域(FR1-IMGT :1至洸位，FR2-IMGT 39至55 位，FR3-IMGT 66 至 104 位和 FR4-IMGT :118 至 128 位)和互补决定区(CDR1-IMGT 27 至38，CDR2-IMGT :56至65和CDR3-IMGT :105至117)的标准化划界。因为空隙代表空置的位点，CDR-IMGT长度(显示在括号之间并以点分开，例如8. 8. 13)成为重要的信息。IMGT唯一编号被用于2D图呈现，指定为IMGT Colliers de PerlesRuiz, Μ.禾口 Lefranc，Μ. -P.，Immunogenetics, 53,857-883 (2002) /Kaas, Q.禾口 Lefranc，Μ. -P.， CurrentBioinformatics, 2, 21-30 (2007)，及 IMGT/3D 结构-DB 的 3D 结构中Kaas，Q.，Ruiz, Μ.禾口 Lefranc, Μ·-P. , T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res.，32，D208-D210(2004)。存在三个重链⑶R和三个轻链⑶R。根据情况，在此使用的术语⑶R或⑶R目的在于指示这些区域的一个或这些区域的几个、或甚至全部，其包含决定抗体对于其识别的抗原或表位的亲和性结合的多数氨基酸残基。为了更清晰，应该理解下列说明中及更特别在表2和3中，以IMGT编号系统和 Kabat编号系统定义CDR。根据如上定义的IMGT系统，以IMGT编号系统定义⑶R，而根据如上定义的Kabat 系统，以Kabat编号系统定义⑶R。更特别的是，关于被指作515H7的抗体，⑶R-Ll由IMGT编号系统中的SEQ ID No. 1 和Kabat编号系统中的SEQ ID No. 9构成。关于⑶R-L2，它由IMGT编号系统中的SEQ ID No. 2和Kabat编号系统中的SEQ ID No. 10构成。⑶R-L3由两种编号系统中的每个的SEQ ID No. 3构成。对于重链，⑶R-Hl由IMGT编号系统中的SEQ ID No. 4和Kabat编号系统中的SEQ ID No. 11构成。CDR-H2由IMGT编号系统中的SEQ ID No. 5和Kabat编号系统中的 SEQ ID No. 12构成。最后，CDR-H3存在于IMGT编号系统中的SEQ ID No. 6，而其由Kabat 编号系统中的SEQ ID No. 13构成。然后，关于被指作301aE5的抗体，⑶R-Ll由IMGT编号系统中的SEQ IDNo. 1和 Kabat编号系统中的SEQ ID No. 9构成。关于CDR-L2，它由IMGT编号系统中的SEQ ID No. 2 和Kabat编号系统中的SEQ ID No. 36构成。CDR-L3由IMGT编号系统中的SEQ ID No. 30 和Kabat编号系统中的SEQ ID No. 37构成。对于重链，⑶R-Hl由IMGT编号系统中的SEQ ID No. 31和Kabat编号系统中的SEQ ID No. 38构成。CDR-H2由IMGT编号系统中的SEQ ID No. 32和Kabat编号系统中的SEQ ID No. 39构成。最后，⑶R-H3存在于IMGT编号系统中的SEQID No. 33，而其由Kabat编号系统中的SEQ ID No. 40构成。在本发明的含义中，两个核酸或氨基酸序列之间的“百分比同源性”意指待比较的两条序列间相同核苷酸或氨基酸残基的百分数，其在最佳比对后获得，此百分数是纯粹的统计，而两条序列间的差异沿其长度随机分布。两条核酸或氨基酸序列的比较传统上通过在对其最佳比对后比较序列来进行，所述比较能通过分部或通过使用“对比窗口，，来执行。除了手动比较之外，用Smith和Waterman的本地同源性算法(1981) [Ad. App. Math. 2 482]、用 Neddleman 和 Wunsch 的本地同源性算法(1970) [J Mol. Biol. 48 :443]、用 Pearson 和Lipman的相似性搜索法(1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :2444]或用使用这些算法 (Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算组，575kience Dr.，麦迪逊，威斯康辛州，或通过比较软件BLAST NR或BLAST P)的计算机软件可以执行比较的序列的最佳比对。通过比较两个最佳比对的序列确定两个核酸或氨基酸序列之间的百分比同源性， 其中在最佳比对的两个序列中待比较的核酸或氨基酸序列相对于参照序列可以有插入或删除。通过确定两条序列间(优选两条完整序列间)氨基酸核苷酸或残基相同的位点的数目计算百分比同源性，将相同位点数除以比对窗口的总位点数并将结果乘以100以获得两条序列间的百分比同源性。例如，可以用缺省参数使用(特别是参数“开放空隙罚分” :5，和“延伸空隙罚分”
112 ；所选矩阵是例如程序提出的“BLOSUM 62”矩阵)在网页http//www. ncbi. nlm. nih. gov/ gorf/bl2.html 上可用的 BLAST 程序，"BLAST 2 序列”(Tatusova 等，"Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein andnucleotide sequences，，，FEMS Microbiol. , 1999, Lett. 174 :247-250)；直接用程序计算待比较的两条序列的百分比同源性。对于显示出与参照氨基酸序列有至少80 %、优选85 %、90 %、95 %和98 %同源性的氨基酸序列，优选的例子包括包含参比序列、某些修改(特别是删除、插入或替换至少一个氨基酸、截短或延长)的那些。在一个或多个连续或不连续的氨基酸被替换的情况下，优选在替换中所换的氨基酸为“等价”氨基酸所代替。在此，表达“等价氨基酸”意指可能替代一个结构氨基酸、然而不改变相应抗体和下面定义的那些特定实施例的抗体的生物学活性的任意氨基酸。基于其与它们所替代的氨基酸的结构同源性、或者基于可能生成的不同抗体间生物活性比较检验的结果来确定等价氨基酸。作为非限制性例子，下面表1总结了可能执行而不导致相应修改抗体的生物活性显著变化的可能的替代；在同一条件下自然可以做相反的替代。表 1
起始残基[W
Ala(A)Val, Gly, Pro
Arg(R)Lys, His
Asn(N)Glii
Asp(D)Glu
Cys(C)Ser
Gln(Q)Asii
Glu(G)Asp
Gly(G)Ala
His(H)Arg
lie (I)Leu
Leu(L)He, Val, Met
Lys(K)Arg
Met (M)Leu
权利要求
1.一个分离的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，其特征在于它包括至少一个互补决定区⑶R，其选自包括IMGT编号系统所定义的氨基酸序列SEQ ID No. 1至6和30至 33 的 CDR。
2.根据权利要求1所述的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，其特征在于它包括一条轻链，其包括分别包括氨基酸序列SEQ ID No. 1、2和3的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ； 和一条重链，其包括分别包括氨基酸序列SEQ IDNo. 4、5和6的⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3。
3.根据权利要求2所述的抗体、或衍生的化合物、或其功能片段，其特征在于它包括包括氨基酸序列SEQ ID No. 7的轻链和包括氨基酸序列SEQ ID No. 8的重链。
4.根据权利要求2所述的抗体、或衍生的化合物、或其功能片段，其特征在于它是嵌合抗体，而且它包括选自SEQ ID No. 56,57或58的重链序列，及轻链序列SEQ ID No. 59。
5.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于它是人源化抗体，而且它包括由SEQID No. 64组成的重链可变区序列，及选自SEQ ID No. 65、66、82或83的轻链可变区序列。
6.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于它是人源化抗体，而且它包括人源化抗体、或衍生的化合物或其功能性片段，其包括选自SEQ ID No.67、68或69的重链序列，及选自SEQ ID No. 70、71、84或85的轻链序列。
7.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于所述功能性片段由片段Fv、scFv,Fab, F(ab' )2、Fab’、SCFv-FC、双特异性抗体、或其半衰期由于化学修饰而增长的任意片段组成。
8.根据权利要求7所述的抗体，其特征在于它是包括氨基酸序列SEQIDNo. 54的 ScFv0
9.根据权利要求1所述的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，其特征在于它包括一条轻链，其包括分别包括氨基酸序列SEQ ID No. 1、2和30的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3 ； 和一条重链，其包括分别包括氨基酸序列SEQ IDNo. 31、32和33的CDR-Hl、CDR-H2禾口 CDR-H3。
10.根据权利要求9所述的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，其特征在于它包括一条包括氨基酸序列SEQ ID No. ；34的轻链和一条包括氨基酸序列SEQ ID No. 35的重链。
11.一条分离的核酸，其特征在于它选自下列核酸a)如权利要求1至10中所述的一条核酸，DNA或RNA，其编码一个抗体或其功能性片段或衍生物的一个；b)一条包括DNA序列的核酸，该DNA序列选自由SEQ ID No. 14至19和41至45组成的⑶R序列；c)一条包括DNA序列的核酸，该DNA序列选自由SEQ ID No. 20、21、46、47、72、73、74、 86和87组成的重链和轻链可变区序列；d)一条包括DNA序列的核酸，该DNA序列选自由SEQ ID No. 60至63、75至79、88和 89组成的重链和轻链序列；e)一条包括由SEQ ID No. 55组成的DNA序列的核酸；f)如b)、c)、d)或e)中所限定的核酸的相应RNA核酸；g)如a)、b)、c)、d)和e)中所限定的核酸的互补核酸；及h)一条至少18个核苷酸的核酸，其能够在高严谨度条件下与SEQ ID No. 14至19和 41至45序列的⑶R至少一个杂交。
12.—个载体，其包括如权利要求11所要求的核酸。
13.一个宿主细胞，其包括如权利要求12所要求的载体。
14.一个除人以外的转基因动物，其包括至少一个以权利要求12所要求的载体转化的细胞。
15.一种用于生产如权利要求1至10的任一个所要求的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个的方法，其特征在于它包括下列步骤a)在培养基中及合适的培养条件下培养如权利要求13所要求的细胞；及b)从起始培养基或所述培养细胞回收所述抗体、或其功能性片段或衍生物的一个。
16.以权利要求15所要求的方法可获得的或已获得的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个。
17.作为药剂的根据权利要求1至10和16所述的抗体。
18.根据权利要求1至10或16至17所述的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，其特征在于它抑制HIV-1K0N原发隔离群在PBMC中的复制，其IC9tl为至少5 μ g/ml，优选至少 10 μ g/ml。
19.一种组合物，其包括由如权利要求1至10和16至18的任一项所要求的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个组成的化合物作为活性成分。
20.作为药剂的如权利要求19所要求的组合物。
21.根据权利要求19和20所要求的组合物，用于预防或用于治疗HIV感染。
22.根据权利要求21所要求的组合物，特征在于所述HIV感染是X4向性HIV感染。
23.根据权利要求21所要求的组合物，特征在于所述HIV感染是X4/R5向性HIV感染。
24.根据权利要求19至23所述的组合物，其特征在于它包括至少第二个抗HIV化合物，该化合物选自能特异性抑制HIV进入和/或复制的化合物。
25.根据权利要求M所述的组合物，其特征在于所述至少第二个抗HIV化合物选自抗逆转录病毒药物如HIV蛋白酶抑制剂(PI)、核苷/核苷酸HIV逆转录酶抑制剂 NRTI/ NtRTI)、非核苷HIV逆转录酶抑制剂(NNRTI)、HIV进入抑制剂、HIV整合酶抑制剂。
26.根据权利要求M或25所述的组合物，其特征在于所述至少第二个抗HIV化合物是马拉维诺。
27.用于筛选和/或鉴定作为CXCR4拮抗剂抗病毒试剂的分子的方法，包括步骤a)选择表达CXCR4的细胞，b)孵育所述细胞和权利要求1至10或16至18所述的抗体、或其功能性片段或衍生物的一个，及c)评估检验的分子对于抗体、或其功能性片段或衍生物的一个和CXCR4之间结合的潜在抑制，及d)选择能够产生所述抑制的分子。
全文摘要
本发明涉及新分离的抗体，或衍生的化合物或其功能性片段，能够结合于CXCR4及诱导CXCR4同型二聚体的构象变化，并且能够抑制HIV-1在PBMC中的原发隔离群复制。更特别的是，本发明涉及特异于CXCR4蛋白质的515H7和301aE5单克隆抗体，以及其治疗HIV感染的用途。本发明还涵盖了由此抗体构成的药物组合物及用于选择此抗体的方法。
文档编号C07K16/28GK102459343SQ201080028221
公开日2012年5月16日 申请日期2010年4月29日 优先权日2009年4月29日
发明者C·克林格-汉默 申请人:皮埃尔法布雷医药公司