改进的神经营养因子分子的制作方法

专利名称：：改进的神经营养因子分子的制作方法改进的神经营养因子分子相关申请的交叉引用本申请要求2009年10月30日提交的美国临时专利申请号61/256352的权益，所述专利的完整内容通过引用的方式并入。
背景技术：
：本发明涉及开发和使用增强的神经营养因子多肽，其拥有降低的肝素和硫酸乙酰肝素结合亲和力，但是仍保持神经营养活性；编码所述神经营养因子变体和载体的核酸以及表达增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。另外，本发明也包括所述增强的神经营养因子多肽、核酸和宿主细胞在治疗疾病中的用途。神经胶质细胞系源神经营养因子(⑶NF)家族配体(GFLs)是TGF-P超家族的远亲成员，它们是体外强有力的神经营养因子并且对于体内不同神经元群体的发育是重要的(Airaksinen,M.S.等人，(1999)“GDNFfamilyneurotrophicfactorsignalingfourmasters,oneservant(神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)家族神经营养因子信号传导四个主导，一个从属？)"Mol.Cell.Neurosci.13,313-325)。该家族存在具有高度序列相似性的四个已知成员GDNF、neurturin(NRTN)、artemin(ARTN)和persephin(PSPN)。这些因子均通过转染期间重排(RET)的跨膜受体酪氨酸激酶的活化发挥功能，所述活化激活多条信号传导途径。(Knowles,PP.(2006)“StructureandchemicalinhibitionoftheRETtyrosinekinasedomain(RET酪氨酸激酶结构域的结构和化学抑制)”，J.Biol.Chem.28133577-33587)。受体复合物中包括高亲和力糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的细胞表面蛋白，名为GFRa(⑶NF家族受体a)，虽然每种GFL存在一种GFRa，但是交叉信号传导在受体复合物之间出现(Airaksinen等人，ibid)。多种GFLs还共有针对肝素的亲和力，PSPN例外，它似乎具有低亲和力或无亲和力(MaximM.Bespalov博士论文，18.12.2009，赫尔辛基大学)。肝素是一种主要限于肥大细胞的硫酸化多糖。然而，高度相关的硫酸乙酰肝素(HS)更为普遍存在，其位于在细胞表面和胞外基质上。已经表明，⑶NF和肝素/HS之间的相互作用显示对2-0-硫酸盐存在的高依赖性(Rickard等人，(2003)“Thebindingofhumanglialcellline-derivedneurotrophicfactor(GDNF)toheparinandheparansulfateimportanceof2-0-sulfategroupsandeffectsonitsinteractionwithitsreceptorGFRaI(人神经胶质细胞系源神经营养因子(⑶NF)与肝素和硫酸乙酰肝素的结合2-0-硫酸盐基团的重要性及对与其受体GFRaI相互作用的影响).”Glycobiology13,419-426)。由于它们的神经营养性质，GFLs是用于治疗中枢和外周神经系统疾病和损伤的新出现候选物。GFLs如神经营养因子的治疗性用途的核心在于这些分子能够刺激广泛类型的神经元的存活和生长，包括例如多巴胺能神经元、交感神经元、副交感神经元、感觉神经元和脊髓运动神经元。(Bespalov,MM和Saarma,M.(2007)“⑶NFfamilyreceptorcomplexesareemergingdrugtargets(GDNF家族受体复合物是新出现的药物靶).”TrendsinPharm.Sci.28(2)68-74)。例如GDNF蛋白和基因治疗载体中的NRTN均已经在治疗帕金森病的临床试验中施用至患者，并且已经显示刺激动物模型中的多巴胺反转。(Hadaczek等人,(2010)“Pharmacokineticsandbioactivityofglialcellline-derivedfactor(GDNF)andneurturin(NTN)infusedintoratbrain(输注至大鼠脑中的神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)和神经营养因子(NTN)的药物代谢动力学和生物活性).”Neuropharm.581114-1121)。另外，疾病如阿尔茨海默、ALS、癫痫、成瘾性、慢性疼痛和中风也可以得益于基于神经营养因子能够促进神经元存活和生长的神经营养因子疗法。另夕卜，对于下述概念存在增加的支持神经营养因子疗法可以用于治疗糖尿病(Rossi等人，(2005)Diabetes54(5)1324-30；Mwangi等人，(2008)Gastroenterology134(3)727-37;Mwangi等人，(2010)AmJPhysiol.GastrointestLiverPhysiol.299(I)G283-92);勃起障碍(Laurikainen等人，(2000)Cell.Tissue.Res.302(3)321-9，Laurikainen等人，(2000)J.Neurobiol.43(2)198-205,May等人，(2008)Eur.Urol.54(5)1179-87;Kato等人，(2009)GeneTherapy16⑴26-33)；脱发(Botchkareva等人，(2000)Am.J.Pathol.156(3)1041-53,Adly等人,(2008)J.Am.Acad.Dermatol.58(2)238-50);听力下降(Ylikoski等人，(1998)HearRes.124(1-2)17-26，Stover等人，(2001)HearRes.155(1-2)143-51,Stover等人，(2000)BrainResMolBrainRes.76(I)25-35;先天性巨结肠(Hirschsprung，sdisease)(Taraviras等人，(1999)Development126(12)2785-97，Roberts等人，(2008)AmJPhysiol.Gastrointest.LiverPhysiol.294(4)G996-G1008);神经病理性疼痛(Adler等人，(2009)Pain.Med.10(7)1229-36)和视网膜病变(Igarahi等人，(2000)Cell.Struct.Funct.25(4)237-41，Nishikiori等人，(2007)56(5)1333-40)。在一项最近的II期临床试验中，使用病毒载体(CERE-120)，将NRTN施用至帕金森病患者。通过立体定位注射法递送CERE-120至脑的硬膜区，从而以高度定向的方式提供稳定的、长时间持续的NRTN表达。然而，双盲对照的试验的结果表明，用CERE-120治疗的患者与对照组中的那些患者之间不存在可觉察的差异。相对于在基线的大约39点的平均值，两个组均在方案定义的主要端点方面显示大约7点的改善(在12个月后进行统一帕金森病评定量表(UPDRS)运动评分(UnifiedParkinson’sDiseaseRatingScale-motoroffscore)0两个组有相当数目的患者显示出基于基线具有临床意义的改善。CERE-120似乎是安全和良好耐受的。在CERE-120试验法的18个月随访中，相对于安慰剂，观察到适中的临床益处。试验失败的原因尚不完全明了。一种假设是，尽管直接注射至脑的受影响区域，但是神经营养因子对硫酸乙酰肝素的高亲和力阻止该分子充分扩散至宽广到足以产生效力的区域。在这种假设的支持下，对神经营养因子在两位治疗过的患者的脑中分布的分析以及动物研究表明，在输注至脑内后，神经营养因子未能均匀分布((Hadaczek等人，(2010)“Pharmacokineticsandbioactivityofglialcellline-derivedfactor(GDNF)andneurturin(NTN)infusedintoratbrain(输注至大鼠脑中的神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)和神经营养因子(NTN)的药物代谢动力学和生物活性)”Neuropharm.581114-1121;2009年5月27日CeregenePressRelease),从而再次表明更宽的生物分布可能是有利的。另外，新近的动物研究包括将肝素连同神经营养因子共输注至帕金森病的猕猴模型的脑中(Grodin等人，“IntraputamenalinfusionofexogenousneurturinproteinrestoresmotoranddopaminergicfunctionintheglobuspallidusofMPTP-Iesionedrhesusmonkeys(外源神经营养因子蛋白质的壳核内输注恢复了MPTP受损猕猴的苍白球中的运动和多巴胺能功能)”CellTransplantation17:373_381，2008)。理论上，共输注的肝素将阻止神经营养因子与胞外基质结合，同时仍允许与靶细胞上的RET/GFRa受体复合物结合。因此，共注射的神经营养因子可能扩散至更广泛的面积。另一种改善神经营养因子的功效和生物分布的方法将是改变该分子的肝素结合亲和力，而不影响影响其神经营养性能。然而，在本申请人的发现之前，神经营养因子中参与介导肝素结合作用的实际氨基酸的位置和身份是未知的。另外，不知道肝素结合结构域的突变是否会破坏该蛋白质的折叠和/或三维结构，并且导致突变分子丧失生物学功能丧失，并且更具体地丧失神经营养活性。因此，对改进的神经营养因子多肽仍存在需要，所述多肽显示出改进的生物分布，同时保留高的生物学活性。尽管这种方法富有吸引力，但是已经调研过神经营养因子和⑶NF家族其他成员的肝素结合特征其功能性影响的先前研究，提供了杂乱和矛盾的结果。(Rider，CC，(2006)Biochem.Soc.Trans.34(3)458-460；RickardSM等人，(2003)Glycobiology13(6)419-26，DaviesJA等人，(2003)GrowthFactors21(3-4)109-19,RiderCC,(2003)Biochem.Soc.Trans.31(2)337-9,TanakaM等人，(2002)Neuroreport13(15)1913-1916,HamiltonJF等人(2001)Exp.Neurol.168(1)155-61，AiX等人，(2007)Developmentl34(18)3327-38)。例如，虽然先前研究已经显示，基序“BBXB”或“BBBXXB”，其中“B”是一个碱性氨基酸并且“X”是任何氨基酸，对于肝素结合是重要的，然而其他研究显示，不含有这种基序的蛋白质也可以结合肝素和HS(Delacoux等人“UnravelingtheaminoacidsequencecrucialforheparinbindingtocollagenV(揭不对于肝素与胶原蛋白V结合至关重要的氨基酸序列)."J-Biol.Chem.2000275(38):29377-82)。另外，缺少神经营养因子的详细三维结构阻碍了以下详细分析神经营养因子中任何带正电荷的相应残基是否实际上在成熟蛋白中表面暴露和取向，从而它们的侧链是正确对齐以与肝素相互作用。另外，采用其他GFL成员的研究已经显示，肝素结合作用可能主要源自这个蛋白质家族的N末端区域之内或跨越几个区域分布。(Alfano等人(“Themajordeterminantoftheheparinbindingofglialcell-linederivedneurotrophicfactorisneartheN-terminusandisdispensableforreceptorbinding(神经胶质细胞系源神经营养因子的肝素结合作用的主要决定因素位于N-端附近并且对于受体结合作用是可替代的)”Biochem.J.404:131-140,2007);Silvian等人，(“Artemincrystalstructurerevealsinsightsintoheparansulfatebinding(Artemin晶体结构揭不硫酸乙酉先月干素结合的内情)”Biochemistry45:6801-6812,2006))。Silvian等人探索了ARTN的肝素结合特征并且表明，前_a-螺旋区内的一系列精氨酸残基接触晶体结构中的硫酸盐原子。他们发现在该晶体中无序的ARTN氨基端区域(第1-9位氨基酸)负责一些HS结合活性。此外，他们通过用谷氨酸残基取代方式，将ARTN的前-a-螺旋区中的三个精氨酸(Arg48，Arg49和Arg51)进行了诱变。谷氨酸的掺入导致对肝素分子的亲和力降低，这表明这个前螺旋区域可能在硫酸乙酰肝素相互作用中发挥作用。然而，ARTN的这个前螺旋区域在神经营养因子中不是充分保守的，表明神经营养因子中这个区域的功能可以得不到保留。在Alfano等人报道的研究中，缺失⑶NF的N端区域导致肝素结合作用的明显降低。另外，Alfano等人对GDNF中含有多个碱性氨基酸的区域中的成对带正电荷的氨基酸(K81A/K84A和R88A/R90A)，实施了丙氨酸扫描诱变，所述碱性氨基酸位于成熟GDNF蛋白的a螺旋区的一个面上。Alfano等人发现无论单个或组合地，双氨基酸变化均未能显著地降低GDNF对肝素的结合亲和力。虽然⑶NF、ARTN和NRTN是同源的并且包含总体上相似的结构，但是成熟蛋白的N端区域和理论性肝素结合序列周围的区域均不是充分保守的。因此，就这些蛋白质结构域在NRTN中作用的精确预测，不能从源于GDNF或ARTN的研究中精确推断。本发明部分地基于发现神经营养因子中这样的氨基酸，其包括第51至63位氨基酸(以成熟的人神经营养因子进行编号)，它们在介导神经营养因子与肝素相互作用方面发挥重要作用。另外，本申请人已经意外地发现，这个区域内氨基酸的突变导致增强的神经营养因子多肽，其显示出降低的肝素亲和力并且仍保留有神经营养活性，特别地，其保留有与GFRaI或GFRa2相互作用以诱导RET磷酸化和诱导细胞效应的能力。因而，本发明提供了具有改进生物学活性的新的神经营养因子多肽，编码此类多肽的多核苷酸，和表达此类多肽的细胞以及它们用于治疗和预防疾病的方法。
发明内容本发明部分地基于发现这样的神经营养因子分子，其具有降低的肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合能力，但仍保留一旦与受体复合物结合就诱导RET蛋白磷酸化的能力。因此，在一个实施方案中，本发明包括纯化的神经营养因子多肽，其包括拥有诱导RET磷酸化并且拥有降低的肝素结合活性能力的神经营养因子变体。在另一个实施方案中，纯化的神经营养因子多肽变体包含在第51、52、54、55、56、57、58、60、61、62或63位氨基酸处的一个或多个置换。在另一个实施方案中，含神经营养因子变体的纯化多肽包含SEQIDNO:1、2、3和4。在另一个实施方式中，本发明包括一种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽与成熟野生型神经营养因子(SEQIDN05)的差异是，在所述成熟野生型神经营养因子第51至第63氨基酸的包含区域内具有至少一个带正电荷氨基酸的突变；并且其中与成熟野生型神经营养因子相比，所述神经营养因子多肽具有降低的肝素亲和力。在一个方面，以100ng/ml的浓度在37°C添加至成纤维细胞持续10分钟时，所述神经营养因子多肽具有诱导RET磷酸化的能力，其中所述成纤维细胞表达RET和GFRaI或GFRa2。在一个方面，所述神经营养因子多肽可以在小于IMNaCl的NaCl浓度在pH7.2下从肝素亲和柱洗脱。在一个方面，所述神经营养因子多肽具有在选自R52、R54、R56、R58、R61和R63的位置处的至少一个突变。在一个方面，所述神经营养因子多肽具有在选自R51、R54、Q55、R56、R57、R58、R60、R61和E62的位置处的至少一个突变。在一个方面，该突变导入至少一个中性、两性或带负电荷的脂族氨基酸。在另一个方面，该突变导入至少一个独立地选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸。在一个方面，所述神经营养因子多肽包含突变R52A、R56A和R58A。在一个方面，所述神经营养因子多肽包含突变R54A、R61A和R63A。在一个方面，所述神经营养因子多肽包含突变R52A、R54A、R56A、R58A和R61A。在一个方面，所述神经营养因子多肽包含突变R51A、R54Q、Q55G、R56Q、R57G、R58A、R60V、R61G、和E62S。在一个方面，所述神经营养因子多肽包含由ARLQGQGALVGS序列对第51至第62位氨基酸的替换。在这些神经营养因子多肽中任一者的另一个方面，所述多肽是增强的神经营养因子多肽。在这些神经营养因子多肽中任一者的另一个方面，所述多肽是增强的人神经营养因子多肽。在这些神经营养因子多肽中任一者的另一个方面，所述神经营养因子多肽与(SEQIDNO5)在成熟野生型神经营养因子的所述氨基酸序列范围内基本上同源或基本上相似，但成熟人神经营养因子的第51至第63位残基所包括的13个氨基酸除外。在一个方面，所述神经营养因子多肽包含SEQIDN0:1。在权利要求7多肽的一个方面，所述神经营养因子多肽包含SEQIDN0:2。在一个方面，所述神经营养因子多肽包含SEQIDN0:3。在一个方面，所述神经营养因子多肽包含SEQIDNO:4。在这些神经营养因子多肽中任一者的另一个方面，所述神经营养因子多肽是与另一种蛋白质融合的融合蛋白。在另一个实施方案中，本发明包括一种治疗细胞变性或减少的方法，包括施用治疗有效量的前述神经营养因子多肽中任一者至需要这种治疗的患者。在一个方面，该患者患有选自周围神经病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、缺血性卒中、急性脑损伤、急性脊髓损伤、神经病理性疼痛、糖尿病、勃起障碍、脱发、先天性巨结肠(Hirschsprung’sdisease)、神经系统肿瘤、多发性硬化、听力下降、视网膜病变和感染中的疾病或病症。在一个方面，所述细胞变性或减少包括造血细胞变性或减少，其选自由嗜酸粒细胞减少、嗜碱粒细胞减少、淋巴细胞减少、单核细胞减少、嗜中性粒细胞减少、贫血、血小板减少和干细胞减少。在这些方法中任一者的一个方面，所述神经营养因子多肽通过全身性施用法施用。在另一个方面，所述神经营养因子多肽通过鞘内施用法施用。在另一个方面，所述神经营养因子多肽通过鼻内施用法施用。在另一个方面，所述神经营养因子多肽通过脑实质内施用法施用。在另一个方面，所述神经营养因子多肽通过持续释放组合物或装置施用。在另一个实施方案中，本发明包括一种药物组合物，其包含前述神经营养因子肽的任一者和药学上可接受载体。在另一个实施方案中，本发明包括分离的编码神经营养因子多肽的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽与成熟野生型神经营养因子(SEQIDNO:5)，区别在于所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63氨基酸的区域内至少一个带正电荷的氨基酸突变；并且其中与成熟野生型神经营养因子相比，所述神经营养因子多肽具有降低的肝素亲和力。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中以100ng/ml的浓度在37°C添加至成纤维细胞持续10分钟时，所述神经营养因子多肽具有诱导RET磷酸化的能力，其中所述成纤维细胞表达RET和GFRaI或GFRa2。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽可以在小于IMNaCl的NaCl浓度在pH7.2下从肝素亲和柱洗脱。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽具有在选自R52、R54、R56、R58、R61和R63的位置处的至少一个突变。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽具有在选自R51、R54、Q55、R56、R57、R58、R60、R61和E62的位置处的至少一个突变。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中突变导入至少一个中性、两性或带负电荷的脂族氨基酸。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中突变导入至少一个氨基酸，其独立地选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述多肽包含突变R52A、R56A和R58A。在一个方面,该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽,其中所述神经营养因子多肽包含突变R54A、R61A和R63A。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽包含突变R52A、R54A、R56A、R58A和R61A。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽包含突变R51A、R54Q、Q55G、R56Q、R57G、R58A、R60V、R61G和E62S。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述多肽包含由ARLQGQGALVGS序列对第51至第62位氨基酸的替换。在要求保护的多核苷酸中任一者的另一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽与(SEQIDN05)在成熟野生型神经营养因子的所述氨基酸序列范围内基本上同源或基本上相似，但成熟人神经营养因子的第51至第63位残基所包括的13个氨基酸除外。在一个方面,所述多核苷酸包含SEQIDNO:6。在一个方面,所述多核苷酸包含SEQIDN0:7。在一个方面，所述多核苷酸包含SEQIDNO:8。在一个方面，所述多核苷酸包含SEQIDNO:9。在另一个实施方案中，本发明包括一种重组载体，其包含前述多核苷酸。在一个方面，该重组载体还包含与所述多核苷酸有效连接的表达控制序列。在一个方面，该重组载体是病毒载体。在另一个实施方案中，本发明包括一种治疗细胞变性或减少的方法，包括施用治疗有效量的前述重组载体中任一者至需要这种治疗的患者。在这种方法的一个方面，该患者患有选自周围神经病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、缺血性卒中、急性脑损伤、急性脊髓损伤、神经病理性疼痛、糖尿病、勃起障碍、脱发、先天性巨结肠、神经系统肿瘤、多发性硬化、听力下降、视网膜病变和感染中的疾病或病症。在这种方法的另一方面，所述细胞变性或减少包括造血细胞变性或减少，其选自嗜酸粒细胞减少、嗜碱粒细胞减少、淋巴细胞减少、单核细胞减少、嗜中性粒细胞减少、贫血、血小板减少和干细胞减少。在一个方面，该重组载体通过全身性施用法施用。在一个方面，该重组载体通过鞘内施用法施用。在一个方面，该重组载体通过鼻内施用法施用。在一个方面，该重组载体通过脑实质内施用法施用。在一个方面，该重组载体通过持续释放组合物或装置施用。在另一个实施方案中，本发明包括一种药物组合物，其包含任一的前述重组载体和药学上可接受载体。在另一个实施方案中，本发明包括一种宿主细胞,其包含根据权利要求26至43中任一项所述的多核苷酸。在一个方面，该宿主已经用前述重组载体的任一者转化或转染。在一个方面，该宿主细胞分泌前述神经营养因子多肽的任一者。在另一个实施方案中，本发明包括一种治疗细胞变性或减少的方法，包括施用治疗有效量的前述宿主细胞的任一者至需要这种治疗的患者。在一个方面，该患者患有选自周围神经病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、缺血性卒中、急性脑损伤、急性脊髓损伤、神经病理性疼痛、糖尿病、勃起障碍、脱发、先天性巨结肠、神经系统肿瘤、多发性硬化、听力下降、视网膜病变和感染中的疾病或病症。在一个方面,所述细胞变性或减少包括造血细胞变性或减少,其选自嗜酸粒细胞减少、嗜碱粒细胞减少、淋巴细胞减少、单核细胞减少、嗜中性粒细胞减少、贫血、血小板减少和干细胞减少。在一个方面,该宿主细胞通过全身性施用法施用。在一个方面，该宿主细胞通过鞘内施用法施用。在一个方面，该宿主细胞通过鼻内施用法施用。在一个方面，该宿主细胞通过脑实质内施用法施用。在一个方面，该宿主细胞通过持续释放组合物或装置施用。在另一个实施方案中，本发明包括一种药物组合物，其包含前述宿主细胞的任一者和药学上可接受载体。在另一个实施方案中，本发明包括一种药物递送系统，其包含鞘内泵和前述任一多肽。图I.纯化的增强的神经营养因子变体的样品以及市售批次的神经营养因子利用15%SDS-PAGE在非还原条件下进行分析，并且经考马斯染色法显现。图2.将纯化的神经营养因子变体1、2、3、4制备物(NI至N4)、成熟野生型神经营养因子和神经营养因子商业制备物(2ug)施加至HiTrap肝素柱并用连续NaCl梯度洗脱(用IOmMHepes开始,逐步增加NaCl至2M)。通过214nm处的蛋白质吸收(在左侧轴上显示)监测蛋白质的洗脱。基于导电性(由虚线和所述图的右侧轴指示)测定含有洗脱蛋白质组分的确切盐浓度。图2A显示商业神经营养因子制备物的洗脱图，图2B显示使用与神经营养因子变体相同的方法所产生的野生型神经营养因子制备物的洗脱图，图2C显示NI的洗脱图，图2D显示N2的洗脱图，图2E显示N3的洗脱图，并且图2F显示N4的洗脱图。图3显示RET-磷酸化测定的蛋白质印迹分析结果。稳定表达RET的细胞用GFRa2瞬时转染，并且在用所示神经营养因子变体刺激后，将细胞裂解并且通过通过免疫沉淀法分离RET。样品通过用抗磷酸酪氨酸抗体(A)探测来分析。为证实相等的载量，所述样品随后用抗RET抗体⑶再探测。图4显示RET-磷酸化测定的蛋白质印迹分析结果。稳定表达RET的细胞用GFRaI瞬时转染，并且在用所示神经营养因子变体刺激后，将细胞裂解并且通过免疫沉淀法分离RET。样品通过用抗磷酸酪氨酸抗体(A)探测来分析。为证实相等的载量，所述样品随后用抗RET抗体⑶再探测。具体实施例方式定义为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。额外的定义遍及发明详述各处描述。如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数称谓，除非上下文另外清楚地指出。因而，例如，对“一个分子”的指称包括一个或多个此类分子，对“一种试剂”的指称包括一种或多种此类不同的试剂，对“一种抗体”的指称包括一种或多种此类不同的抗体，并且对“该方法”的指称包括指称本领域普通技术人员已知的同等步骤和方法，所述同等步骤和方法可以被修改或替换本文所述的方法。在提供一个值范围的情况下，应当理解，其也具体地披露了该范围上限与下限之间的每一个中间值，直至该下限值的十分之一个单位，除非上下文有明确的其他说明。所述范围内任一所述值或中间值与这个范围内任一其他所述值或中间值之间的每一较小范围，其包括在本发明的范围内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在该范围内或排除在外，并且在所述较小范围包括上下限值二者之一、上下限值二者均排除、或者上下限值二者均包括——这些情形下的每一范围也包括在本发明中，其受所述范围中任何具体排除的界限约束。在所述的范围包括所述界限之一者或两者的情况下，本发明中也包括排除所包括的这些界限的任一者或两者的范围。术语“约”或“大约”意指本领域普通技术人员所测定特定值的可接受的误差范围，这将部分地取决于怎样度量或测定该值，即，测量系统的界限值。例如，“约”可以意指处于距均值的I或2个标准偏差范围内。或者，“约”可以意指加上或减去至多到20%、优选地至多到10%、更优选地至多到5%的范围。如本文所用，术语“细胞”、“多个细胞”、“细胞系”、“宿主细胞”、和“多个宿主细胞”互换地使用，并且包括动物细胞，并且包括无脊椎动物细胞、非哺乳脊椎动物细胞和哺乳动物细胞。全部此类名称均包括细胞群体和子代。因而，术语“转化体”和“转染子”包括原代个体细胞和源自其中的细胞系，无论传代次数是多少。示例性非哺乳脊椎动物细胞包括例如鸟类细胞、爬行类细胞和两栖类细胞。示例性无脊椎动物细胞包括，但不限于昆虫细胞，例如毛虫(草地夜蛾(Spodopterafrugiperda))细胞、蚊(埃及伊蚊(Aedesaegypti))细胞、果蚬(黑腹果蚬(Drosophilamelanogaster))细胞、Schneider细胞和家蚕(Bombyxmori)细胞。参见,例如，Luckow等人，Bio/Technology6:47-55(1988)。细胞可以是分化的、部分分化的或未分化的，例如，干细胞，包括胚胎干细胞和多能干细胞。另外，可以根据本发明使用源自器官或器官系统的组织样品。示例性哺乳动物细胞包括，例如源自人、非人灵长类、猫、犬、羊、山羊、牛、马、猪、兔、包括小鼠、仓鼠、大鼠和豚鼠的啮齿类动物及其任何衍生物和子代的细胞。术语“细胞培养物”或“组织培养物”指在如转瓶、组织培养瓶、皿、多孔平板等的容器中悬浮或贴附于多种表面或基材所培育的细胞。术语“细胞疗法”指包括将细胞注射、移植或其他方式置入哺乳动物身体中用于治疗的疗法。在不同的方面，细胞可以是自体的，细胞可以产生蛋白质，细胞可以是再生性的，细胞可以是修饰的，细胞可以是基因修饰的，细胞可以是体细胞、前体细胞或干细胞。短语“保守性氨基酸置换”或“保守性突变”指一个氨基酸由具有共同特性的另一个氨基酸置换。限定各个氨基酸之间共同特性的功能性方式是分析同源生物的相应蛋白质之间氨基酸变化的归一化频率(Schulz,G.E.和R.H.Schirmer,PrinciplesofProteinStructure,Springer-Verlag)。根据此类分析,可以定义氨基酸的组,其中组内的氨基酸优先交换彼此，并且因此在它们影响总体蛋白质结构方面彼此最相似(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer,PrinciplesofProteinStructure,Springer-Verlag)。以这种方式定义的氨基酸组的实例包括“由Glu、Asp、Asn、Gin、Lys、Arg和His组成的带电荷/极性组；由Pro、Phe、Tyr和Trp组成的“芳香族或环状组”;和由Gly、Ala、Val>Leu;Ile、Met、Ser、Thr和Cys组成的“脂族组”。在每个组内部，也可以鉴定出亚组，例如，带电荷/极性氨基酸组可以进一步划分成由Lys、Arg和His组成的“带正电荷亚组”；由Glu和Asp组成的“带负电荷亚组”和由Asn和Gln组成的“极性亚组”。芳香族或环状组可以进一步划成由以下亚组组成的亚组由Pro、His和Trp组成的“氮环亚组”和由Phe和Tyr组成的“苯基亚组”。脂族组可以进一步划成由以下亚组组成的亚组由Val、Leu和Ile组成的“大脂族非极性亚组”、由Met、Ser,Thr和Cys组成的“脂族轻微极性亚组”和由Gly和Ala组成的“小残基亚组”。保守性突变的实例包括置换以上亚组内部的氨基酸，例如，Lys替换Arg并且反之亦然，从而可以维持正电荷；Glu替换Asp并且反之亦然，从而可以维持负电荷；Ser替换Thr，从而可以维持游离-OH；Gln替换Asn，从而可以维持游离-NH2。如本文所用，术语“减少”或相关的术语“减少的”、“降低”或“降低的”指统计显著的减少。为避免怀疑，所述术语通常指所给出参数的至少10%减少，并且可以包括至少20%减少、30%减少、40%减少、50%减少、60%减少、70%减少、80%减少、90%减少、95%减少、97%减少、99%或甚至100%减少(即,测量的参数是处于零)。术语“表位标签”指与目的蛋白编码区融合以使检测或纯化目的蛋白成为可能的任何抗原决定簇或任何生物学结构或序列。此类融合蛋白可以鉴定和纯化，例如通过使用表位标签特异性抗体。表位标签的代表性实例包括而不限于His标签(6-组氨酸)、HA标签(血凝素)、V5-标签、c-Myc标签、GST标签和FLAG标签(DYKDDDDK)。术语“被囊的”在表述“被囊细胞”的语境下指已经用人工膜包被各个细胞或细胞群外部的细胞。如本文所用的术语“表达”指核苷酸序列在宿主细胞内部的转录和/或翻译。宿主细胞中所需产物的表达水平可以基于细胞中存在的相应mRNA的量或由选择的序列编码的所需多肽的量确定。例如，从选择的序列中转录的mRNA可以通过RNA印迹杂交、核糖核酸酶RNA保护法、与细胞RNA原位杂交或通过PCR定量。由选择的序列编码的蛋白质可以由多种方法定量，所述方法包括，但不限于例如ELISA、蛋白质印迹法、放射免疫测定、免疫沉淀测定、蛋白质生物学活性分析、或者FACS分析后再蛋白免疫染色。“表达控制序列”是引起编码序列在宿主细胞中表达的DNA调节序列，如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等。示例性表达控制序列在Goeddel,GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中描述。术语“异源DNA”指已经导入细胞中的DNA，或源自另一来源或来自相同来源但处于不同(即非固有)环境下的核酸序列。术语“同源性”描述基于数学的序列相似比较结果，其用来鉴定具有相似功能或基序的基因或蛋白质。本发明的核酸和蛋白质序列可以用作“查询序列”以针对公共数据库执行进行检索，以例如鉴定其他家族成员、相关序列或同源物。此类检索可以使用Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)(Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10)进行。BLAST核苷酸搜索可以在采用NBLAST程序，评分=100、字长度=12的情况下执行，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序、评分=50、字长度=3进行BLAST蛋白质搜索，以获得同源于本发明蛋白质分子的氨基酸序列。为了出于比较目的获得空位比对结果，可以使用空位BLASTJnAltschul等人，(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中所述。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和BLAST)的默认参数。术语“同源的”指拥有“共同进化起源”的两个蛋白质之间的关系，所述蛋白质包括相同动物物种中来自超家族的蛋白质(例如，免疫球蛋白超家族)，以及来自不同动物物种的同源蛋白(例如，肌球蛋白轻链多肽等；见Reeck等人，Cell，50:667，1987)。无论根据同一性百分数还是根据存在特定的残基或基序和保守位置，如其序列相似性所反映的，此类蛋白质(和它们的编码核酸)具有序列同源性。如本文所用，术语“增加”或相关的术语“增加的”、“增强”或“增强的”指统计显著的增加。为避免怀疑，所述术语通常指所给出参数的至少10%增加，并且可以包括超过对照值的至少20%增力口、30%增力口、40%增力口、50%增力口、60%增力口、70%增力口、80%增力口、90%增力口、95%增力口、97%增力口、99%或甚至100%增加。术语“分离的”，当用来描述神经营养因子多肽时，意指已经鉴定过并且从其自然环境的组分中分离和/或回收的一种蛋白。其自然环境的杂质组分是一般将干扰该蛋白质的研究、诊断性或治疗性用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，蛋白质将被纯化到至少95%均匀性，这可通过在非还原性或还原性条件下使用考马斯蓝或优选地银染色法进行SDS-PAGE来评估。分离的蛋白质包括在重组细胞内部在原位的蛋白质，因为目的蛋白的自然环境的至少一种组分将不再存在。然而，一般将通过至少一个纯化步骤制备分离的蛋白质。如本文所用，“同一性”意指当比对两个或更多个序列以使序列匹配最大化、即计入空位和插入时，在所述序列中相应位置处的相同核苷酸或氨基酸残基的百分数。可以通过已知的方法容易计算同一丨I"生，所述方法包括但不限于在(ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.编著，OxfordUniversityPress,NewYork,1988；BiocomputingInformaticsandGenomeProjects,Smith,D.ff.编著，AcademicPress,NewYork,1993；ComputerAnalysisofSequenceData,第I部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编著，HumanaPress,NewJersey,1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987；及SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux,J.编著，MStocktonPress,NewYork,1991;以及Carillo,H.,和Lipman,D.，SIAMJ.AppliedMath.，48:1073(1988)中描述的那些方法。设计确定同一性的方法，以获得所检验序列之间的最大匹配。另外，确定同一性的方法编纂于可公共获得的计算机程序中。确定两个序列之间同一性的计算机程序方法包括，但不限于GCG程序组(Devereux，J.等人，NucleicAcidsRes12(1):387(1984))、BLASTp、BLASTn和FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.215:403-410(1990)和Altschul等人Nuc.AcidsRes.,25:3389-3402(1997))oBLASTX程序是从NCBI和其他来源而可公共获得(BLAST手册·，Altschul,S.等人，NCBINLMNIHBethesda,Md.20894；Altschul,S.等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。公知的SmithWaterman算法也可以用来确定同一性。如本文中可互換使用的术语“有效连接”和“有效连接的”指将两个或更多个核苷酸序列或序列元件，以允许它们按照意图方式发挥作用的方式安置。在一些实施方案中，本发明的核酸分子包括与编码重组蛋白的核苷酸序列有效连接的、能够使染色质开放和/或維持染色质处于开放状态的ー个或多个DNA元件。在其他实施方案中，核酸分子可以额外地包括一个或多个核苷酸序列，其选自(a)能够增加翻译的核苷酸序列；(b)能够增加重组蛋白分泌于细胞外部的核苷酸序列；和(C)能够增加mRNA稳定性的核苷酸序列，其中此类核苷酸序列与编码重组蛋白的核苷酸序列有效连接。通常但不必然地，有效连接的核苷酸序列是连续的，并且根据需要，是符合可读框的。然而，虽然能够使染色质开放和/或维持染色质处于开放状态的有效连接的DNA元件，通常位于编码重组蛋白的核苷酸序列的上游；但是它不必然与该核苷酸序列连续。通过本领域公知的重组方法，例如使用PCR方法，通过在适宜的限制性位点处连接或通过复性，完成多种核苷酸序列的有效连接。如果合适的限制性位点不存在，可以根据常规惯例使用合成性寡核苷酸接头或衔接子。如本文所用，术语“患者”在本发明语境中优选地是ー种哺乳动物。该哺乳动物可以是人、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人之外的哺乳动物可以有利地用作代表特定疾病和病症动物模型的患者。患者可以是雄性或雌性。患者可以是先前已经被诊断或鉴定为存在细胞变性或减少的个体，和任选地已经经历或正在经历干预性治疗的个体。优选地，该患者是人。术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸”在本文中可互換地使用，指任何长度的核苷酸聚合物形式，无论是核糖核苷酸或是脱氧核糖核苷酸。这些术语包括单链、双链或三链的DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体、或者包含嘌呤和嘧啶碱基，或其他天然的、化学的、生物化学修饰的、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的骨架可以包含糖和磷酸酯基团(如一般可以在RNA或DNA中找到)，或修饰或取代的糖或磷酸酯基团。此外，可以通过合成互补链并且在适宜的条件下复性双链，或者通过使用DNA聚合酶以适宜的引物从头合成互补链，而从化学合成的单链多核苷酸产物获得双链多核苷酸。核酸分子可以表现为许多不同的形式，例如基因或基因片段、一个或多个外显子、一个或多个内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，尿嘧啶(uracyl)，其他的糖类和连接基团，如氟代核糖(fluororibose)与硫代酯(thioate),以及分支性核苷酸(nucleotidebranches)。如本文所用，“DNA”或“核苷酸序列”不仅包括碱基A、T、C和G，还包括以下情况的任一者这些碱基的类似物或修饰形式、如甲基化核苷酸，核苷酸间的修饰体，如不带电荷的连接和硫酯键连接、糖类似物的使用、以及使用修饰的和/或替代的骨架结构如聚酰胺。如本文所用，术语“多肽”指包含彼此通过肽键或修饰肽键连接的两个或多个氨基酸残基的任何分子(即肽电子等排体)。“多肽”指短链，常称作肽、寡肽或低聚物，同时也指较长链，通常称作蛋白质。多肽可以含有除20种基因编码氨基酸之外的氨基酸。“多肽”包括通过天然过程如翻译后加工、或通过本领域公知的化学修饰技术，所修饰得到的氨基酸序列。此类修饰在基本教材中和更详细的专著中以及本领域技术人员熟悉的海量研究文献中都有充分描述。修饰可以在多肽中的任何地方出现，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基端或羧基端。可以理解，相同类型的修饰可以在给定多肽中的几个位点处以相同或不同的程度存在。另外，给定的多肽可以含有许多类型的修饰。多肽可以因遍在蛋白化而支化，并且它们可以是存在或不存在支化的环状。环状、分枝和分枝环状多肽可以因翻译后天然过程产生或可以通过合成方法产生。修饰包括例如，こ酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、生物素酰化、黄素的共价结合、血红素部分的共价结合、核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂类或脂类衍生物的共价结合、磷脂酰肌醇的共价结合、交联、环化、ニ硫键形成、去甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、Y-羧化、糖基化、GPl锚形体形成、羟化、碘化、甲基化、肉豆蘧酰化、棕榈酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戍烯化、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫酸盐化、转移RNA介导的添加氨基酸至蛋白质如精氨酰化、和遍在蛋白化(见，例如，Proteins—StructureandMolecularProperties,第2版，T.Ε.Creighton,ff.H.FreemanandCompany,NewYork,1993；ffold,F.,Post-translationalProteinModifications-PerspectivesandProspects(番羽译后蛋白质修饰展望和前景)，1_12,引自Post-translationalCovalentModificationofProteins,B.C.Johnson编著，AcademicPress,NewYork,1983；Seifter等人，“Analysisforproteinmodificationsandnonproteincofactor(蛋白质修饰和非蛋白质辅因子的分析)”，MethEnzymol,182,626-646,1990,和Rattan等人，“ProteinSynthesisPost-translationalModificationsandAging(蛋白质合成翻译后修饰和衰老)”，AnnNYAcadSci，663，48-62，1992)。“启动子”是能够在细胞中结合RNA聚合酶并且启动下游(3’方向)编码序列转录的DNA调节区。如本文所用，启动子序列在其3’末端与转录起始位点相结合并且向上游(5，方向)延伸，以包括可检测水平的高于背景的启动转录所需要的最少数目的碱基或元件。转录起点(用核酸酶SI可以容易定位确定)可以存在于启动子序列，也可以存在于负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域(共有序列)内部。真核启动子可以经常，但是不总是含有“TATA”框和“CAT”框。除-10和-35共有序列之外，原核启动子还含有Shine-Dalgarno序列。本领域公知来自多种不同来源的大量启动子，包括组成型、诱导型和阻遏型启动子。代表性来源包括例如，病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌细胞类型，并且源自这些来源的合适启动子是容易地可获得的，或者可以基于在线公众可获得的序列、或者例如从诸如ATCC以及其他商业或个人来源的保藏物来合成产生。启动子可以是单向的(即，以ー个方向启动转录)或双向的(即，以3’或5’方向启动转录)。启动子的非限制性实例包括例如T7细菌表达系统、pBAD(araA)细菌表达系统、细胞巨化病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子。诱导型启动子包括Tet系统(美国专利5，464，758和5，814，618)、蜕皮激素诱导性系统(No等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)93(8):3346-3351;T-REX系统(InvitrogenCarlsbad,CA),Lac.Switch(Stratagene,(SanDiego,CA))和Cre_ERT他莫西芬诱导性重组酶系统((Indra等人Nuc.Acid.Res.(1999)27(22):4324-4327；Nuc.Acid.Res.(2000)28(23):e99;美国专利7，112，715号；和Kramer和Fussenegger，MethodsMol.Biol.(2005)308=123-144)或本领域已知适于在合乎需要的细胞中表达的任何启动子。如本文所用的术语“纯化”指已经在減少或消除无关物质即杂质存在的条件下所分离的材料，所述杂质包括天然物质、其中所述材料从该天然物质获得。例如，纯化的蛋白质优选地基本上不含在细胞中与该蛋白质结合的其他蛋白质或核酸。用于纯化的方法是本领域公知的。如本文所用，术语“基本上不含”在实践中其在材料的分析測定的语境下被使用。优选地，基本上不含杂质的纯化材料是至少50%纯的；更优选地是至少75%纯的，并且仍更优选地是至少95%纯的。可以通过色谱法、凝胶电泳、免疫測定法、组成分析法、生物学測定法和本领域已知的其他方法来评估纯度。术语“基本上纯的”表示可以使用本领域已知的常规纯化技术可实现的最高程度的纯度。术语“重组蛋白”或“重组多肽”指i)异源DNA部分地或全部编码的蛋白质，或ii)自表达控制序列(如启动子或增强子)表达的蛋白质，其中所述的表达控制序列由异源DNA完整或部分地产生，所述异源DNA激活内源基因的表达。术语“序列相似性”指在可或可不共有共同进化起源的核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应性的程度(见Reeck等人，上文)。然而，在常见用途中和在本申请中，术语“同源的”当用副词如“高度地”修饰时，可以指序列相似性并且可以或可以不涉及共同进化起源。在具体实施方案中，如已知的序列比较算法如BLAST、FASTA、DNAStrider,CLUSTAL等所确定的，当至少约85%和更优选地至少约90%或至少约95%的核苷酸在核酸序列的限定长度范围内匹配吋，则两个核酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。这种序列的实例是本发明特定基因的等位基因或物种变体。也可以通过杂交，例如在诸如相对于这个特定系统所定义的严格条件下在DNA印迹杂交实验中鉴定出基本上同源的序列。类似地，在本发明的特定实施方案中，当多于90%的氨基酸残基相同时，则两个氨基酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。当多于约95%的氨基酸残基相似吋，两个序列是功能上相同的。优选地，通过使用例如GCG(GeneticsComputerGroup,第7版，Madison,ffis.)程序包或使用上述任何程序和算法进行比对，以鉴定出相似或同源的多肽序列。所述程序可以使用Smith和Waterman局部同源性算法，采用默认值空位产生罚分=-(1+1/k)，k是空位延伸数目，平均匹配=I，平均错配=-O.333。如本文定义，术语“持续释放”、“延长的释放”或“贮库制剂”指药物如增强的神经营养因子多肽从持续释放组合物或持续释放装置中被释放，所述释放与直接静脉内或皮下施用单次剂量增强的神经营养因子多肽后本来可获得神经营养因子多肽的时间相比，它在更长的时间范围内发生。在ー个方面，持续释放将是在至少约I周至2周的时间范围内发生的释放。在另ー个方面，持续释放将是在至少约4个月的时间范围内发生的释放。释放的持续性和释放的水平可以受持续释放装置的类型(例如，可编程泵或滲透驱动泵)或所用的持续释放组合物(例如，単体比率、分子量、嵌段组成、和聚合物组成是否多祥性)、多肽载量和/或产生所需作用的赋形剂的选择所影响，如本文中充分描述。术语“转化”或“转染”指将ー个或多个核酸分子转移至宿主细胞或生物中。将核酸分子导入宿主细胞中的方法包括例如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖介导转染法、微量注射法、阳离子脂类介导转染法、电穿孔法、划痕负载法(scrapeloading)、射弹导入法或病毒或其他感染介质感染法。“转化的”、“转导的”或“转基因的”在细胞的语境下，是指已经导入有重组或异源核酸分子(例如，ー个或多个DNA构建体或RNA或siRNA对应物)的宿主细胞或生物。核酸分子可以稳定地表达(即，以有功能的形式在细胞中維持超过约三个月)或以有功能的形式在细胞中非稳定地維持不足三个月，即，瞬时表达。例如，“转化的”、“转化体”、和“转基因”细胞已经经历转化过程并且含有外来核酸分子。术语“未转化的”指未曾经历转化过程的细胞。术语“治疗性”或“治疗”意指至减轻、减缓、延迟、减弱、逆转、改善、控制或防止患者中某病状的至少ー个症状。术语“治疗性”也可以意指停滞、延迟发作(即，在疾病临床表现之前的时间段)和/或降低某病状发展或加重的风险。如本文所用，术语“治疗有效量”、“预防有效量”或“诊断有效量”是为了在施用后产生所需生物学反应所需要的该活性试剂的量，所述活性试剂例如是增强的神经营养因子多肽、包含有编码此类增强的神经营养因子其核苷酸序列的多核苷酸、或表达重组增强的神经营养因子的宿主细胞。术语“变体”指与參比多核苷酸或多肽不相同，但是仍保持ー些其基本性能的多核苷酸或多肽。常见的多肽变体在氨基酸序列上与參比多肽不同。通常，改变是有限的，从而參比多肽和变体的序列是总体相似的，并且在许多区域内是相同的。变体和參比多肽可以因一个或多个置换、插入或缺失，以其任意组合在氨基酸序列上不同。置换或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码所编码的氨基酸残基。术语“野生型神经营养因子”或“前神经营养因子原”指编码氨基酸序列(表D3中的SEQIDNO26)的基因。术语“成熟野生型神经营养因子”或“成熟的人神经营养因子”指编码已经通过移除分泌信号和前蛋白该加工过的氨基酸序列(表D2中的SEQIDN05)的基因。术语“NRTN”指编码野生型神经营养因子的基因。除非另外说明，本发明的实施将采用化学、分子生物学、微生物学和重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术属于本领域普通技术人员的能力范围。文献中解释了此类技术。见例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,1989,MolecularCloningALaboratoryManual,桌2版，ト3卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel,F.M.等人(1995年和定期增补内容；CurrentProtocolsinMolecularBiology,第9、13和6章，Johnffiley&Sons,NewYork,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996,DNAIsolationandSequencingEssentialTechniques,Johnffiley&Sons；J.M.Polak和amesO’D.McGee,1990,InSituHybridization!PrinciplesandPractice；OxfordUniversityPress;M.J.Gait(编者)，1984,OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach,IrlPress；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymologyDNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress；UsingAntibodiesALaboratoryManualPortableProtocolNO.I,编者EdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7)；AntibodiesALaboratoryManual,EdHarlow(编者)，DavidLane(编者)(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-3,4-2),1855.HandbookofDrugScreening,RamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Fernandes编著(2001，NewYork，N.Y.,MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9);和LabRefAHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,JaneRoskams和LindaRodgers编著，2002,ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。这些通用教材的每一部通过引用的方式并入本文。除非另外定义，本文中所用的全部技术术语及科学术语，具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意义。尽管与本文所述相似或等效的任何方法、组合物、试齐U、细胞，都可以用于实施或检验本发明，然而优选的方法和材料是在本文中所描述的。上文所讨论的出版物仅提供在本申请的提交日期之前的相关公开内容。不应解释为本发明因为利用在先发明，而不能被给予对于此类公开具有占先权的权利。将本说明书中引用的全部出版物和參考文献，包括但不限于专利和专利申请，通过引用方式完整并入本文，如同特别地和逐一地指明，将每份単独的出版物或參考文献通过引用方式，如充分所述的那样并入本文。本申请要求优先权的任何专利申请也通过引用的方式，以上述针对出版物和參考文献的方式完整并入本文。概述本发明部分地基于发现这样的增强的神经营养因子分子，其具有降低的肝素和硫酸こ酰肝素结合能力，但意外地仍保留一旦与受体复合物结合就诱导RET蛋白磷酸化的能力。因此，在不同的实施方案中，本发明包括纯化的多肽、编码增强的神经营养因子多肽的多核苷酸、含有所述多核苷酸的重组载体、和表达增强的神经营养因子多肽的宿主，其中所述增强的神经营养因子多肽拥有诱导RET磷酸化的能力和拥有降低的肝素结合亲和力。另夕卜，本发明中包括这些多种实施方案在治疗人类疾病和病症中的用途。I.神经营养因子多肽如本文所用的术语“增强的神经营养因子多肽”或“增强的神经营养因子”或“增强的NRTN”包括全部天然存在形式的和合成形式的神经营养因子，它们与相应的成熟野生型神经营养因子SEQIDNO:5相比区别在于，所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63位氨基酸的区域内，具有至少ー个带正电荷氨基酸的突变，并且与成熟的人神经营养因子相比，显示出降低的肝素亲和力。在另ー个方面，增强的神经营养因子与相应的成熟野生型神经营养因子SEQIDNO5区别在于所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63氨基酸的区域内至少两个带正电荷的氨基酸突变，并且与成熟的人神经营养因子相比，显示出降低的肝素亲和力。在另ー个方面，增强的神经营养因子与相应的成熟野生型神经营养因子SEQIDNO5区别在于，所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63氨基酸的区域内至少三个带正电荷的氨基酸突变，并且与成熟的人神经营养因子相比，显示出降低的肝素亲和力。在另ー个方面，增强的神经营养因子与相应的成熟野生型神经营养因子SEQIDNO5区别在于，所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63氨基酸的区域内至少五个带正电荷的氨基酸突变，并且与成熟的人神经营养因子相比，显示出降低的肝素亲和力。在一个实施方案中，术语“增强的神经营养因子多肽”指一种多肽，该多肽与成熟野生型神经营养因子(SEQIDNO:5)在所述成熟野生型神经营养因子的氨基酸序列范围内至少90%相同，但成熟的人神经营养因子第51至第63位残基所包括的13个氨基酸除外。在另ー个方面，用于任ー种本发明方法中的“增强的人神经营养因子多肽”与(成熟野生型神经营养因子)SEQIDNO:5在所述成熟野生型神经营养因子的氨基酸序列范围内至少95%相同，但将成熟的人神经营养因子的第51至第63位残基所包括的13个氨基酸除外。在一个实施方案中，使用102个氨基酸长的成熟野生型神经营养因子(SEQIDNO5)的编号，与成熟野生型神经营养因子相比，所述增强的神经营养因子多肽包含在第51、52、54、55、56、57、58、60、61、62或63位氨基酸处的一个或多个突变。在本发明的一个方面，增强的神经营养因子在成熟人神经营养因子(SEQIDNO:5)第51至第63位残基所包括的区域内部，含有I个至13个氨基酸突变。在ー个方面，增强的神经营养因子将包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸突变，所述突变在成熟的人神经营养因子(SEQIDN05)第51至第63位残基所包括的区域内部。在又ー个方面，增强的神经营养因子将包含3、5、7、9或11个氨基酸突变，所述突变在成熟的人神经营养因子第51至第63位残基所包括的区域内部。在增强的神经营养因子多肽中任ー种的ー个方面，所述ー个或多个突变导入至少ー个中性、两性或带负电荷的脂族氨基酸至增强的神经营养因子中。在增强的神经营养因子多肽中任一种的另一方面，所述ー个或多个突变导入至少ー个独立地选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸至增强的神经营养因子中。在另ー个方面，增强的神经营养因子多肽包含由ARLQGQGALVGS序列(SEQIDNO25)对第51至第62位氨基酸的替换。在另ー个方面，增强的神经营养因子多肽包含选自SEQIDNO:22至25(表Dl)的序列，其中与成熟的野生型人神经营养因子相比，所述增强的神经营养因子多肽显示出降低的肝素亲和力。表DL当插入成熟野A型神经营养因子中时提供降低的肝素余和力的鉍《_I序列ISEQIDNO:_氨基酸序列_ISEQIDNO:22_RALRQARAISEQIDNO:23_RRLAO腿RLRAEAISEQIDNO:24_1ALAQARALRAJSEQIDNO:25_ARLQGQGALVGSI在本发明的又ー个方面，增强的神经营养因子多肽将包含SEQIDN0:l、2、3或4(表D2)。权利要求1.ー种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽与成熟野生型神经营养因子(SEQIDNO.5)区别在于所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63氨基酸的区域内至少ー个带正电荷的氨基酸突变；并且其中与成熟野生型神经营养因子相比，所述神经营养因子多肽具有降低的肝素亲和力。2.根据权利要求2所述的神经营养因子多肽，其中以100ng/ml的浓度在37°C添加至成纤维细胞持续10分钟时，所述神经营养因子多肽具有诱导RET磷酸化的能力，其中所述成纤维细胞表达RET和GFRαI与GFRα2两者之一。3.根据权利要求I或2所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽在小于IMNaCl的NaCl浓度和pH7.2下从肝素亲和柱洗脱。4.根据权利要求3所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽具有在选自R52、R54、R56、R58、R61和R63位置处的至少ー个突变。5.根据权利要求3所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽具有在选自R51、R54、Q55、R56、R57、R58、R60、R61和E62位置处的至少ー个突变。6.根据权利要求4或5所述的神经营养因子多肽，其中所述突变导入至少ー个中性、两性或带负电荷的脂族氨基酸。7.根据权利要求6所述的神经营养因子多肽，其中所述突变导入至少ー个独立选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸。8.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽包含突变R52A、R56A和R58A。9.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽包含突变R54A、R61A和R63A。10.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽包含突变R52A、R54A、R56A、R58A和R61A。11.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽包含突变R51A、R54Q、Q55G、R56Q、R57G、R58A、R60V、R61G和E62S。12.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽包含由序列ARLQGQGALVGS对第51至第62位氨基酸的替换。13.根据权利要求I至12中任一项所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽与(SEQIDNO.5)在成熟野生型神经营养因子的氨基酸序列范围内基本上同源或基本上相似，但成熟的人神经营养因子第51至第63位残基所包括的13个氨基酸除外。14.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:1。15.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:2。16.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:3。17.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述多肽包含SEQIDNO:4。18.一种治疗细胞变性或減少的方法，包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的根据权利要求I至17中任一项所述的神经营养因子多肽。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述患者患有选自周围神经病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、缺血性卒中、急性脑损伤、急性脊髓损伤、神经病理性疼痛、糖尿病、勃起障碍、脱发、先天性巨结肠、神经系统肿瘤、多发性硬化、听カ下降、视网膜病变和感染中的疾病或病症。20.根据权利要求18所述的方法，其中所述的细胞变性或減少包括造血细胞变性或减少，其选自嗜酸粒细胞减少、嗜碱粒细胞减少、淋巴细胞减少、单核细胞减少、嗜中性粒细胞減少、贫血、血小板减少和干细胞減少。21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述神经营养因子多肽通过全身性施用法施用。22.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述神经营养因子多肽通过鞘内施用法施用。23.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述神经营养因子多肽通过鼻内施用法施用。24.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述神经营养因子多肽通过脑实质内施用法施用。25.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述神经营养因子多肽通过持续释放组合物或装置施用。26.—种药物组合物，其包含根据权利要求I至17中任一项所述的神经营养因子多肽和药学上可接受载体。27.编码神经营养因子多肽的分离的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽与成熟野生型神经营养因子(SEQIDNO.5)区别在于所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63氨基酸的区域内至少ー个带正电荷的氨基酸突变；并且其中与成熟野生型神经营养因子相比，所述神经营养因子多肽具有降低的肝素亲和力。28.据权利要求27所述的多核苷酸，其中以100ng/ml的浓度在37°C添加至成纤维细胞持续10分钟时，所述神经营养因子多肽具有诱导RET磷酸化的能力，其中所述成纤维细胞表达RET和GFRαI与GFRα2二者之一。29.根据权利要求27或28所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽可以在小于IMNaCl的NaCl浓度和pH7.2下从肝素亲和柱洗脱。30.根据权利要求29所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽具有在选自R52、R54、R56、R58、R61和R63位置处的至少ー个突变。31.根据权利要求29所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽具有在选自R51、R54、Q55、R56、R57、R58、R60、R61和E62位置处的至少ー个突变。32.根据权利要求30或31所述的多核苷酸，其中所述突变导入至少ー个中性、两性或带负电荷的脂族氨基酸。33.根据权利要求32所述的多核苷酸，其中所述突变导入至少ー个独立选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸。34.根据权利要求33所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽包含突变R52A、R56A和R58A。35.根据权利要求34所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽包含突变R54A、R61A和R63A。36.根据权利要求35所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽包含突变R52A、R54A、R56A、R58A和R61A。37.根据权利要求33所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽包含突变R51A、R54Q、Q55G、R56Q、R57G、R58A、R60V、R61G和E62S。38.根据权利要求33所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽包含由序列ARLQGQGALVGS对第51至第62位氨基酸的替换。39.根据权利要求27至38中任一项所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽与(SEQIDNO.5)在成熟野生型神经营养因子的所述氨基酸序列范围内基本上同源或基本上相似，但成熟的人神经营养因子第51至第63位残基所包括的13个氨基酸除外。40.根据权利要求所述33的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含SEQIDNO:6。41.根据权利要求所述33的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含SEQIDNO:7。42.根据权利要求所述33的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含SEQIDNO:8。43.根据权利要求所述33的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含SEQIDNO:9。44.ー种重组载体，其包含根据权利要求27至43中任一项所述的多核苷酸。45.根据权利要求44所述的重组载体，还包含与所述多核苷酸有效连接的表达控制序列。46.根据权利要求44或45所述的重组载体，其中所述载体是病毒载体。47.一种治疗细胞变性或減少的方法，包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的根据权利要求44至46中任一项所述的重组载体。48.根据权利要求47所述的方法，其中所述患者患有选自周围神经病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、缺血性卒中、急性脑损伤、急性脊髓损伤、神经病理性疼痛、糖尿病、勃起障碍、脱发、先天性巨结肠、神经系统肿瘤、多发性硬化、听カ下降、视网膜病变和感染中的疾病或病症。49.根据权利要求47所述的方法，其中所述的细胞变性或減少包括造血细胞变性或减少，其选自嗜酸粒细胞减少、嗜碱粒细胞减少、淋巴细胞减少、单核细胞减少、嗜中性粒细胞減少、贫血、血小板减少和干细胞減少。50.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述重组载体通过全身性施用法施用。51.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述重组载体通过鞘内施用法施用。52.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述重组载体通过鼻内施用法施用。53.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述重组载体通过脑实质内施用法施用。54.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述重组载体通过持续释放组合物或装置施用。55.ー种药物组合物，其包含根据权利要求44至46中任一项所述的重组载体和药学上可接受载体。56.—种宿主细胞,其包含根据权利要求26至43中任一项所述的多核苷酸。57.根据权利要求56所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞已经用根据权利要求44至46所述的重组载体转化或转染。58.根据权利要求56或57所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞分泌根据权利要求I至17中任一项所述的多肽。59.一种治疗细胞变性或減少的方法，包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的权利要求56-58的宿主细胞。60.根据权利要求59所述的方法，其中所述患者患有选自周围神经病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、缺血性卒中、急性脑损伤、急性脊髓损伤、神经病理性疼痛、糖尿病、勃起障碍、脱发、先天性巨结肠、神经系统肿瘤、多发性硬化、听カ下降、视网膜病变和感染中的疾病或病症。61.根据权利要求60所述的方法，其中所述的细胞变性或減少包括造血细胞变性或减少，其选自嗜酸粒细胞减少、嗜碱粒细胞减少、淋巴细胞减少、单核细胞减少、嗜中性粒细胞減少、贫血、血小板减少和干细胞減少。62.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞通过全身性施用法施用。63.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞通过鞘内施用法施用。64.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞通过鼻内施用法施用。65.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞通过脑实质内施用法施用。66.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞通过持续释放组合物或装置施用。67.ー种药物组合物，其包含根据权利要求58至61中任一项所述的宿主细胞和药学上可接受载体。68.—种药物递送系统,其包含鞘内泵和权利要求1-17中任一项所述的多肽。69.根据权利要求I至17中任一项所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽与另ー个蛋白质或多肽序列融合。全文摘要本发明公开了拥有降低的肝素和硫酸乙酰肝素结合亲和力、但是仍保持神经营养活性的神经营养因子多肽，编码所述神经营养因子变体的核酸，以及表达增强的神经营养因子多肽的载体和宿主细胞。也公开了所述增强的神经营养因子多肽、核酸和宿主细胞在治疗或预防疾病中的用途。文档编号C07K14/47GK102695723SQ201080054301公开日2012年9月26日申请日期2010年10月28日优先权日2009年10月30日发明者理查德·佩恩,皮亚·鲁内贝里-鲁斯,马克西姆·别斯帕洛夫,马特·萨玛申请人:中枢神经系统治疗学公司