专利名称：西地那非单克隆抗体及用于检测西地那非的胶体金层析试纸条的制作方法
技术领域：
本发明属于药品检验领域，涉及西地那非单克隆抗体及用于检测西地那非的胶体金层析试纸条。
背景技术：
西地那非(Sildenafil)，又译昔多芬，是一种研发治疗心血管疾病药物时意外发明出的治疗男性勃起功能障碍药物，一股以其商业用名Viagra(中国大陆注册名万艾可， 台湾和香港注册名威而钢)广为人知。不过相对于商品名西地那非在中国的俗名“伟哥” 使用的更广泛，影响也更大。目前，在国内好多中成药或保健品中非法添加西地那非以达到临床的疗效，作为患者，在长期不知情的情况下服用含有西地那非的中成药或保健品会引起严重的副作用。目前，检测中成药或保健品中是否含有伟哥成分，采用的是传统的检验方法，须将提取的样品带回实验室进行分析，或是使用大型的试验车，这样都很不方便，而且反应时间长，实验耗资较大。西地那非属于分子量小于1000的小分子化合物，本身不具备反应性和免疫原性， 为了实现西地那非的免疫检测，不仅需要合成具备高效价的西地那非抗原，而且还需要筛选特异性强、敏感度高的西地那非单克隆抗体。但是目前尚没有有关西地那非单克隆抗体的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株分泌西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本发明的另一目的是提供该杂交瘤分泌的西地那非单克隆抗体及其应用。本发明的有一目的是提供一种用于检测西地那非的胶体金层析试纸条。本发明的目的可通过如下技术方案实现一株分泌西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞系，保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏号为CCTCC No. C2010123，保藏日期为2010年11月30曰。一种西地那非单克隆抗体，由保藏号为CCTCC No. C2010123的杂交瘤细胞系产生。本发明利用人工合成抗原N-乙酸西地那非-BSA为免疫原，经过Balb/c小白鼠皮下免疫，加强免疫后取小白鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞做细胞融合、筛选及克隆化，建立了稳定分泌西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞株CCTCC No. C2010123。经ELISA、Western Blot、 胶体金免疫层析方法的鉴定，该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体能特异识别西地那非。本发明所述的西地那非单克隆抗体在制备西地那非胶体金检测试剂中的应用。所述的西地那非检测试剂为西地那非检测用胶体金层析试纸条。一种用于检测西地那非的胶体金层析试纸条，包含衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，金标结合垫为吸附西地那非金标抗体的聚酯纤维
4毡，在包被膜上有N-乙酸西地那非-BSA抗原溶液包被的直线式检测线T线，和用羊抗鼠 IgG溶液包被的直线式对照线C线，两条线竖向平行排列，所述的西地那非金标抗体是本发明所述的西地那非单克隆抗体的胶体金标记物。所述的西地那非抗原为西地那非人工合成抗原。所述的西地那非人工合成抗原为
权利要求
1.一株分泌西地那非单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H5B12C3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO :C2010123o
2.一种西地那非单克隆抗体，其特征在于由权利要求1所述的保藏号为CCTCCN0 C2010123的杂交瘤细胞株产生。
3.权利要求2所述的西地那非单克隆抗体在制备西地那非检测试剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的西地那非检测试剂为西地那非检测用胶体金层析试纸条。
5.一种用于检测西地那非的胶体金层析试纸条，包含衬板(7)和在衬板(7)上依次衔接的样品垫(1)、金标结合垫O)、包被膜(3)和吸水垫(6)组成，金标结合垫(2)为吸附西地那非单克隆抗体胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体胶体金标记物的聚酯纤维毡，在包被膜(3)上有用西地那非抗原溶液包被直线式检测线T线G)，和用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线(5)，两条线竖向平行排列，其特征在于所述的西地那非单克隆抗体胶体金标记物是权利要求2所述的西地那非单克隆抗体的胶体金标记物。
6.根据权利要求5所述的用于检测西地那非的胶体金层析试纸条，其特征在于所述的西地那非抗原为西地那非人工合成抗原。
7.根据权利要求6所述的用于检测西地那非的胶体金层析试纸条，其特征在于所述的西地那非人工合成抗原为
8.根据权利要求7所述的用于检测西地那非的胶体金层析试纸条，其特征在于所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或人血蓝蛋白，优选牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白，进一步优选牛血清白蛋白。
9.权利要求5所述的用于检测西地那非的胶体金层析试纸条的制备方法，其特征在于包含如下步骤(1)制备式(1)所示的西地那非人工合成抗原；(2)制备西地那非单克隆抗体；(3)制备含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液；(4)利用步骤C3)所述的含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液制备西地那非单克隆抗体的金标结合垫；(5)在包被膜上用所述的西地那非人工合成抗原溶液包被直线式检测线T线，用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线，两条线竖向平行排列；(6)组装试纸条。
10.根据权利要求9所述的胶体金层析试纸条的制备方法，其特征在于a、步骤C3)所述的含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液通过如下方法制备用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成 20nm-40nm的胶体金溶液；用0. lmol/LK2C03调节所述的胶体金溶液至最适pH 8. 5-9. 0，将纯化的本发明西地那非单克隆抗体纯水透析后，按3μ g/ml量加入胶体金溶液中，室温电磁搅拌15-30min，然后按5μ g/ml的量加入鼠IgG单克隆抗体，室温电磁搅拌15-30min， 逐滴加入络蛋白溶液，使终浓度为0. 1%，持续搅拌5min，4°C下15000rpm离心lOmin， 弃去上清，将沉淀物用重悬液重新恢复至原体积混勻，再次离心一次，用重悬溶液将沉淀物混悬至原体积1/20，4°C保存备用，即获得所述的含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液，其中所述重悬液为含5%海藻的 0. 02Tris-HCL 缓冲液；b、步骤(4)所述的制备西地那非单克隆抗体的金标结合垫的方法为将1 20-1 10 稀释的含抗西地那非单克隆抗体的胶体金标记物和鼠IgG单克隆抗体的胶体金标记物的混合溶液喷涂吸附于聚酯纤维毡中，27°C保温干燥；c、步骤(6)所述的组装试纸条的方法为将样品垫、金标组合垫、包被膜和吸水垫依次粘附在衬板上，样品垫置于衬板的一端，吸水垫置于衬板的另一端，包被膜置于衬板的中间，金标结合垫置于样品垫和包被膜之间，即得到用于免疫检测的西地那非胶体金层析检测试验纸大板，将大板按顾客要求分切成2. 5mm-7. Omm宽度规格的试纸条，密封干燥保存。
全文摘要
本发明属于药品检验领域，公开了西地那非单克隆抗体及用于检测西地那非的胶体金层析试纸条。本发明西地那非单克隆抗体，由保藏号为CCTCC No.C2010123的杂交瘤细胞系产生。本发明所述的西地那非单克隆抗体理化特性高度均一、生物活性单一、与抗原西地那非结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，可在制备西地那非检测用胶体金层析试纸条中应用。一种用于检测西地那非的胶体金层析试纸条，其金标结合垫上包被的金标抗体是本发明所述的西地那非单克隆抗体的胶体金标记物。使用本发明胶体金层析检测试纸条，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，将样品用提取液混合后，取上清液进行检测，在5-10min即可判定检测结果简便、快速、时效性强。
文档编号C07K16/44GK102174474SQ20111000472
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月11日 优先权日2011年1月11日
发明者吴迪宏, 欧卫军, 王蕾, 蒋澄 申请人:南通市伊士生物技术有限责任公司