专利名称：类人弹性蛋白及其生产方法
技术领域：
本发明涉及一种类人弹性蛋白及使用基因工程技术生产类人弹性蛋白的方法，属于生物医药技术领域。
背景技术：
人弹性蛋白是一种水溶性较低、无定形、疏水性强且广泛交联的细胞外基质蛋白， 其在皮肤、肺脏、韧带和血管等组织中含量较高，并在维持组织弹性中发挥着重要作用。人弹性蛋白基因是定位于第7号染色体的单拷贝基因，其外显子交替编码疏水重复序列和含有赖氨酸的蛋白序列。人弹性蛋白原全长有760个氨基酸残基，分子量约为70kDa。弹性蛋白原的翻译后修饰包括信号肽切除和部分脯氨酸残基的羟化。尽管弹性蛋白疏水性极强， 然而其可被高度水化，而且仅在水分子存在的条件下，弹性蛋白才具有弹性。在大多数组织，弹性蛋白的合成开始于妊娠中期，在出生时和新生儿期达到峰值， 此后其表达水平迅速降低，成年后几乎完全消失。弹性蛋白的表达调控主要集中在转录水平和转录后水平。例如，TNF-α和bFGF下调弹性蛋白基因表达，而糖皮质激素、IL-1、IL-10 和IGF-I等则促进其表达。TGF-β 1则通过提高弹性蛋白mRNA稳定性来促进弹性蛋白的沉积。弹性蛋白基因转录产物存在多种剪接变异体，从而翻译产生多种弹性蛋白原。然而每一种剪接变异体均由编码高度疏水和高度亲水多肽的外显子交替排列。弹性蛋白的疏水区含有大量的脂肪族氨基酸重复序列，该独特序列的基本结构为GX、PX、GGX和PGX，其中X为 G、A、V、L和I中的任意一种。富含赖氨酸的区域是弹性蛋白中主要的交联功能域。在正常生理条件下，弹性蛋白几乎不被降解。然而，在某些病理条件下，弹性蛋白可被降解产生大量的弹性蛋白肽，该降解过程主要由MMP-2、MMP-9、MMP-7和MMP-12完成。 此外，在炎症条件下，白细胞释放的弹性蛋白酶可使弹性蛋白网络完全崩解。弹性蛋白肽并非简单的弹性蛋白降解产物，其能通过受体依赖方式作用于组织细胞，包括成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞等，产生重要的生物学效应。knior等发现弹性蛋白原和弹性蛋白降解片段可对人白细胞和成纤维细胞产生特异性趋化效应，由此提出细胞表面存在弹性蛋白肽膜受体。此后，Wrenn等发现125I标记的弹性蛋白原能够以受体介导方式与动脉韧带成纤维细胞结合。现已表明，弹性蛋白受体存在于多种细胞表面，其由3个亚基组成，其中分子量为67kDa的亚基(elastin binding protein，EBP)介导与弹性蛋白结合。EBP不仅与VGVAPG序列高亲和性结合，而且其具有半乳糖凝集素特性，可与半乳糖和乳糖结合，此后证实EBP是β半乳糖苷酶的一种剪接变异体。除了 VGVAPG等弹性蛋白肽以外，EBP尚可通过识别Bl层粘连蛋白中的LGTIPG序列而与之结合。弹性蛋白及弹性蛋白肽的主要生物学效应是趋化细胞和促进细胞增殖。首先，弹性蛋白和弹性蛋白肽可以通过增加细胞内cAMP、cGMP和钙离子水平趋化单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞。其次，弹性蛋白和弹性蛋白肽可以促进成纤维细胞和平滑肌细胞增殖，其机制涉及开放L型钙离子通道、激活百日咳毒素敏感的G蛋白，同时c-Src、Ras/Raf/MEK/ ERK信号转导通路和PDGF受体也参与细胞增殖过程。由此可见，弹性蛋白肽在创面愈合过程中也发挥着重要作用。近年来，随着对弹性蛋白研究逐渐深入，使用弹性蛋白中具有生物学活性的部分功能模块制备组织工程支架和靶向给药系统的报道日益增多。这些研究多使用由VPGXG串联重复序列(其中X为V、A或G等非P氨基酸)构成的重组蛋白分子，即弹性蛋白样蛋白 (elastin-like protein, ELP)，结果表明ELP具有非常好的生物相容性、极低的免疫原性、 良好的药代动力学。此外，ELP可以作为融合标签，使得原核表达的重组蛋白纯化过程变得非常简单。1) 生物相容性ELP没有细胞毒性和急性系统毒性，没有皮肤刺激性和系统免疫原性。此外，ELP不会改变出凝血时间也不会诱导红细胞裂解。ELP具有生物降解特性， 由其制备的支架材料移植至体内2周后即被全部降解。2) 低免疫原性ELP免疫原性极低，仅在与福氏完全佐剂存在时皮下注射ELP才可诱导产生微量的抗体反应。Cappello等对由蚕丝肽与ELP融合构成的 [(GVGVP) 8 (GAGAGS) 2] 18的免疫原性进行了细致研究。在不使用佐剂时，皮下注射IOmg蛋白并分别于6周和8周时进行增强免疫，第9周时使用ELISA法检测抗(VPGVG) 8抗体发现抗体滴度均小于2，表明没有诱导出针对ELP的抗体。然而，在福氏完全佐剂的存在下，分别于第0、2、3、5和7周时皮下注射IOmg蛋白可诱导抗ELP抗体产生，其滴度为480。3)药代动力学作为融合蛋白载体，ELP具有非常好的药代动力学特性，其在裸鼠的循环半衰期为8 12小时。在设计大分子药物载体时，载体分子量超过肾脏过滤截留值有益于提高循环半衰期。使用mC标记分子量为59kDa的ELP进行分析发现，静脉注射后， ELP表现为两相药代动力学，其分布半衰期为7. 3min，代谢半衰期为8. 4h，初始分布容积为 1. 4mL，血浆清除率为0. 32mL/h。4)易于纯化ELP具有温度依赖的聚集性，即当温度大于临界值(Tt)时，ELP出现聚集，而在温度低于Tt值时，ELP重新溶解，其中Tt值与ELP疏水性、ELP链长和溶液中盐离子强度密切相关。根据该特性，在纯化特定组成的ELP融合蛋白时，仅需调整温度和盐离子浓度使得融合蛋白凝聚-溶解即可实现对ELP融合蛋白的纯化。有文献报道，使用该方法进行3个循环的凝聚-溶解过程即可使融合蛋白纯度达到95%以上。尽管弹性蛋白在医学、美容、化妆品和保健品等领域有广泛的应用前景，但是动物体内弹性蛋白因发生交联，水溶性很差，难于再加工。因此，目前国外通常使用基因工程方法表达VPGXG串联重复序列以获取ELP，然而其表达量均较低，尚未形成商业化产品，尤其是针对能够促进细胞增殖的、由VAPGVG单元构成的类人弹性蛋白的研究鲜见报道。
发明内容
本发明目的在于公开一种含有一个或多个VAPGVGVAPGVGVAPGVGS基本单元的类人弹性蛋白，其结构和功能均优于动物体内弹性蛋白。本发明的目的还在于公开编码本发明蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列，并提供一种含有该序列的DNA或含有该DNA的载体或质粒。类人弹性蛋白基本单元的氨基酸序列见序列表中的SEQ ID NO. :1 (下文简称“序
4列 1”)。类人弹性蛋白基本单元的cDNA核苷酸序列见序列表中的SEQ ID NO. :2 (下文简称“序列2”)。类人弹性蛋白(VAPGVGVAPGVGVAPGVGS ^2的氨基酸序列见序列表中的SEQ ID NO. :3 (下文简称“序列3”)。本申请文本中所用术语“类人弹性蛋白”是指一种含有一个或多个序列1所示氨基酸序列的蛋白质。在本申请文本所用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur J Biochem. 1984;138:9-37)。本发明公开的类人弹性蛋白含有一个或多个VAPGVGVAPGVGVAPGVGS基本单元。本发明公开的类人弹性蛋白能够以非融合蛋白、融合蛋白、前体蛋白、蛋白原和前体蛋白原等形式存在。本发明公开的类人弹性蛋白的融合蛋白形式中，与之融合的多肽序列可位于类人弹性蛋白的氨基末端、序列中段和羧基末端。本发明的再一个目的在于公开本发明类人弹性蛋白的生产方法。为了实现这一目的，本发明采用以下技术方案将一个或多个编码 VAPGVGVAPGVGVAPGVGS基本单元的基因序列克隆至原核表达载体后构建工程菌，工程菌发酵并诱导表达，收获菌体，经裂解菌体、亲和层析和脱盐等步骤获得重组类人弹性蛋白。具体而言，首先根据人弹性蛋白的特有序列VAPGVG设计类人弹性蛋白基本单元， 并根据大肠杆菌偏爱密码子将其反翻译成核苷酸序列。在此基础上设计两条引物，使这两条引物退火后分别在上游和下游形成BglII和BioI粘端，进而克隆至pSP73的相应酶切位点之间。然后，利用BamHI和BglII酶切可产生相同粘端，构建pSP73-ELPn(n为自然数)。将 ELPn以BglII和XhoI双酶切后亚克隆至pET28a或pTAT后获得原核表达载体pET28a_ELPn 和pTAT-ELPn，转化至大肠杆菌中获得能够表达类人弹性蛋白的工程菌。将工程菌在含有明胶或明胶水解物的发酵培养液中培养并诱导表达后，离心收获菌体，经均质或超声裂解菌体后使用亲和层析、脱盐等方法精制获得高纯度重组类人弹性蛋白。
图1显示类人弹性蛋白基本单元示意图，大写字母为引物ELPA和ELPB形成的、编码VAPGVGVAPGVGVAPGVGS基本单元的基因序列，小写字母为载体经BamHI和BioI酶切后形成的粘端。图2显示pTAT示意图，使用图中NcoI和BioI之间序列替换pET28a中相应酶切位点之中的序列即为原核表达载体PTAT。图3显示pSP73-ELPn构建示意图。将引物退火形成的编码VAPGVGVAPGVGVAPGVGS 基本单元的基因序列克隆至PSP73的BglII和XhoI之间获得pSP73-ELPl。利用BamHI 和BglII酶切可产生相同粘端，重复将基本单元编码序列克隆至BamHI和B10I之间，获得 pSP73-ELPn0图4显示使用T7 promoter引物对pSP73_ELP32进行DNA测序的结果。图5显示使用T7 promoter引物对pET28a_ELP32进行正向DNA测序的结果。图6显示使用T7 terminator引物pET28a_ELP32进行反向DNA测序的结果。
图7显示使用T7 promoter引物对pTAT_ELP32进行正向DNA测序的结果。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步说明，本发明不受下述具体文字描述的限制。 本发明可在权利要求所概括的范围内做各种改变，这些改变均在本发明的范围之内。实施例中未注明具体条件者，按常规或制造商建议的条件进行。本发明中所述载体、宿主菌等可由商业途径得到，如pSP73购自Promega公司， pET28a和pET32a购自Novagen公司，ER2566购自NEB公司。pTAT结构如图2所示。实施例1.构建表达类人弹性蛋白的工程菌
化学合成引物 ELPA (SEQ ID NO. :4)和 ELPB (SEQ ID NO. 5)，并溶解于 10mmol/L Tris-HCl缓冲液(ρΗ8. 0)，将二者等摩尔混和后进行退火反应，条件为99°C水浴lOmin， 72°C水浴30min，37°C水浴lOmin，将退火产物保存于_20°C备用。将退火产物克隆至pSP73 的BglII和XhoI之间，获得pSP73-ELPl。利用BglII和BamHI酶切可以产生相同的粘端，而且两个酶切产生的粘端连接后即不能被BglII切开也不能被BamHI切开(如图1所示)，将退火产物克隆至PSP73-ELP1的BamHI和XhoI之间，获得pSP73_ELP2。使用BglII 和XhoI将ELP2从pSP73-ELP2切下，电泳并回收后克隆至pSP73_ELP2的BamHI和XhoI 之间，获得PSP73-ELP4。使用BglII和XhoI将ELP4从pSP73_ELP4切下，电泳并回收后克隆至pSP73-ELP4的BamHI和BioI之间，获得pSP73_ELP8。重复使用上述步骤，获得 PSP73-ELP32。使用BglII和XhoI将ELP32从pSP73_ELP32切下，电泳并回收后克隆至原核表达载体pET32a和pTAT的BamHI和XhoI之间，分别获得pET32a_ELP32和pTAT_ELP32。 使用NcoI和BioI将ELP32从pET3h-ELP32切下，电泳并回收后克隆至原核表达载体 pET28a 的 NcoI 和 XhoI 之间，分别获得 pET28a_ELP32。将 pSP73_ELP32、pET28a_ELP32 和 PTAT-ELP32进行DNA测序，结果如图4、5、6和7所示。采用上述方法(如图3所示)，可以构建pET28a-ELPn和pTAT-ELPn (η为自然数)。使用pET28a_ELP32转化ER2566感受态细胞，获得可以非融合表达类人弹性蛋白ELP32的工程菌；使用pTAT-ELP32转化ER2566感受态细胞，获得可以融合表达类人弹性蛋白ELP32的工程菌。类人弹性蛋白ELP32含有32个 VAPGVGVAPGVGVAPGVGS 基本单元，理论分子量 48. 9kDa。实施例2.工程菌的发酵培养和诱导表达
种子培养将携带PTAT-ELP32质粒的ER2566工程菌划线接种于含30 μ g/mL卡纳霉素的LB琼脂培养板上，37°C、饱和湿度条件下培养16h，挑取生长状态良好的单个菌落，接种于500mL含30 μ g/mL卡纳霉素和5. Og/L葡萄糖的LB培养液中，37°C振荡培养过夜。发酵培养条件为培养温度37°C，pH6. 8 7. 0，溶氧30%，空气流量为1 4VVM，搅拌转速30(Tl000rpm，接种量5%。流加策略控制葡萄糖浓度为1. 0%，溶氧30%，pH6. 8 7. O。诱导方法当菌液OD值达到50. O时，加入IPTG至终浓度0. 5mM诱导表达Mi后离心收获菌体。发酵培养液成份为胰蛋白胨1.0 10.0g/L，酵母提取物10.0 50. Og/L， 葡萄糖 10. O 50. Og/L, NaCl 1. 0 10· Og/L, K2HPO4 5. 0 15· Og/L, NaH2PO4 2. 5 6· Og/ L，(NH4)2SO4 3. 6^8. 8g/L，明胶(明胶水解物)1. O 50. Og/L, MgSO4. 7H20 1. 5^5. Og/L,
6EDTA 0. 5 2. Og/L, FeCl3. 6H20 50. 0 200· Omg/L, MnSO4. 4H20 10. 0 30· Omg/L, ZnSO4 5. (TlO. Omg/L, H3BO3 1. 0 5· Omg/L, Na2MoO4. 2H20 1. 0 5· Omg/L, CoCl2. 6H20 1. 0 5. Omg/L, CuCl2. 2H20 1. 0 5. Omg/L。发酵培养液的最佳方案为胰蛋白胨1. Og/L，酵母提取物20. Og/L，葡萄糖30. Og/ L, NaCl 2. Og/L, K2HPO4 8. 7g/L, NaH2PO4 4. 2g/L, (NH4)2SO4 5. 6g/L，明胶(明胶水解物) 10. Og/L, MgSO4. 7H20 2. 5g/L, EDTA 1. Og/L, FeCl3. 6H20 100. Omg/L, MnSO4. 4H20 20. Omg/ L, ZnSO4 8. Omg/L, H3BO3 2. 5mg/L, Na2MoO4. 2H20 2. 5mg/L, CoCl2. 6H20 2. 5mg/L, CuCl2. 2H20 2. 5mg/L。发酵结束后取发酵液lmL，8000g离心lOmin，弃上清，收获菌体。每管加入500 μ L 双蒸水重悬菌体，加入2 X SDS Loading Buffer, 100°C水浴lOmin, 12000g离心15min后取上清进行SDS-PAGE。电泳结束后，使用考马斯亮蓝染色、脱色，并对凝胶进行薄层扫描分析， 可见约60kDa处有新生条带，约占菌体总蛋白的42. 5%。实施例3.重组类人弹性蛋白的纯化
将发酵后收获的菌体以1:5 (W/V)比例重悬于TE缓冲液(pH8.0，50mmol/L Tris-HCl, IOmM EDTA)中，超声或均质破碎菌体，4°C条件下以5000g离心30min，收获上清，经亲和层析、脱盐后精制分装保存备用。本发明利用人弹性蛋白特有VAPGVG序列设计并制备了具有促进细胞增殖能力的重组类人弹性蛋白，并通过适量添加丝氨酸增加了其水溶性，使得重组类人弹性蛋白同时具有低免疫原性、高水溶性、高稳定性、促细胞增殖活性，在制备皮肤创面敷料、药物转运载体、功能性化妆品等领域有着广阔的应用前景。
权利要求
1.一种类人弹性蛋白，其特征在于其氨基酸序列中含有VAPGVGVAPGVGVAPGVGS基本单元。
2.—种核酸分子，其特征在于编码权利要求1中所述蛋白氨基酸序列的核苷酸序列的DNA。
3.一种基因载体，其特征在于含有权利要求2所述核酸分子。
4.根据权利要求1所述的类人弹性蛋白的生产方法，其特征在于包括类人弹性蛋白的工程菌的构建，工程菌的发酵培养，类人弹性蛋白的诱导表达和类人弹性蛋白的纯化。
5.根据权利要求4所述的类人弹性蛋白的生产方法，其特征在于所述类人弹性蛋白的工程菌的构建如下使用大肠杆菌偏爱密码子反翻译人弹性蛋白中的特定氨基酸序列并制备串联重复序列，然后亚克隆至原核表达载体中获得类人弹性蛋白原核表达载体；将类人弹性蛋白原核表达载体转化至大肠杆菌获得工程菌。
6.根据权利要求4所述的类人弹性蛋白的生产方法，其特征在于所述工程菌的发酵培养基为胰蛋白胨1. 0 10. Og/L，酵母提取物10. 0 50. Og/L，葡萄糖10. 0 50. Og/ L, NaCl 1. 0 10· Og/L, K2HPO4 5. 0 15· Og/L, NaH2PO4 2. 5 6. Og/L, (NH4)2SO4 3. 6 8. 8g/L,明胶(明胶水解物)1. 0 30. 0g/L, MgSO4. 7H20 1. 5 5. 0g/L, EDTA 0. 5 2. 0g/L, FeCl3. 6H20 50. 0 200· 0mg/L, MnSO4. 4Η20 10. 0 30· 0mg/L, ZnSO4 5. 0 10· 0mg/L, H3BO3 1. 0 5· 0mg/L, Na2MoO4. 2Η20 1. 0 5· 0mg/L, CoCl2. 6Η20 1. 0 5· 0mg/L, CuCl2. 2Η20 1. 0 5· 0mg/L。
7.根据权利要求4所述的类人弹性蛋白的生产方法，其特征在于所述工程菌的发酵培养条件为培养温度37°C，pH 6. 8^7. 0，溶氧15 30%，空气流量为1 4VVM，搅拌转速 30(Tl000rpm，接种量5%，种子培养基为含30mg/L卡那霉素和5. 0g/L葡萄糖的LB。
8.根据权利要求4所述的类人弹性蛋白的生产方法，其特征在于所述类人弹性蛋白的纯化如下离心收集工程菌，裂解菌体，然后用缓冲液抽提，经亲和层析、精制和除热源后获得重组类人弹性蛋白。
全文摘要
本发明公开一种类人弹性蛋白及使用基因工程菌生产类人弹性蛋白的方法，其中类人弹性蛋白的生产方法包括构建能够表达类人弹性蛋白的工程菌、发酵培养工程菌、诱导表达和纯化类人弹性蛋白。该方法获得的工程菌可高效可溶表达重组类人弹性蛋白，同时，重组类人弹性蛋白具有分子量高和免疫原性低等特点，其不仅能够作为药物载体、皮肤敷料和化妆品的添加剂，而且能够用于制备组织工程支架材料。
文档编号C07K7/08GK102241747SQ20111016256
公开日2011年11月16日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者李立文 申请人:李立文