专利名称：甘草酸的酶解生产方法
技术领域：
本发明属于中药制药或原料加工领域，具体涉及一种复合酶法提取甘草酸的生产方法。
背景技术：
甘草是一种用途极广的中药材，临床及药理研究表明甘草酸具有明显的抗炎、抗病毒、免疫调节、降血脂和抗动脉粥硬化的作用，近年来还发现甘草酸在食品、医药和化妆品工业中有广泛的用途，因此对甘草酸提取分离的研究越来越引起世人的关注。目前采用的水提法和溶剂法提取甘草酸是较为成熟的工艺技术，提取及精制的生产方法尚比较落后。这些常规方法存在着明显的不足之处，如使用有机溶剂，易造成环境污染，且产品中杂质多，品质不好。在水提法和加热回流法提取过程中，由于操作温度高，甘草中的甘草酸易发生分解；渗辘法和冷浸法提取过程中，虽然避免了高温带来的影响，但要达到较高的萃取效率需时间较长。新发展的技术如超声波提取、微波提取、高压提取和超临界萃取等方法，不但设备成本高，新工艺也尚不成熟。现有的专利中对甘草酸的提取分离，如中国专利申请CNlO 1759757A公开的一种甘草酸的制备方法，以水提取，大孔吸附树脂纯化，最后加入醋酸重结晶。中国专利 CN1036960记载的甘草酸的分离精制方法是采用甘草或甘草提取物为原料，经水提，酸析， 醇提，浓缩后溶于水，用DA-201型大孔树脂吸附，纯度可达90%以上。中国专利CN85104970 记载的高纯度甘草酸结晶的分离精制法是用甘草抽出物制成的单铵附在粉状聚酰胺上，用极性溶剂洗脱，然后通过阳离子交换树脂脱铵，得到高纯度甘晶。发明人通过大量实验，提出了一种甘草酸的酶法提取方法，该方法经济、环保、低能耗，且能最大程度地提取出甘草中的有效物质，并能应用于工业化生产。本发明的制备甘草酸的新方法，在国内外尚未见报道。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种简单易行、成本低廉、适于大规模生产的甘草酸提取工艺。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案
一种甘草酸的酶解生产方法，所述方法是利用复合酶将甘草药材酶解，采用10体积％ 乙醇提取甘草酸，再采用大孔吸附树脂进行分离、提纯，以10体积％乙醇为洗脱液洗脱，得到甘草酸；所述复合酶为果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的混合物。如上所述的生产方法，所述方法的步骤如下
a.称取甘草药材，粉碎至10-20目；
b.将粉碎后的甘草药材加入蒸馏水中，浸泡30min，每500g甘草药材加入纤维素酶 1-3. 2g，果胶酶0. 5-2g，木聚糖酶8-15mg及β -葡聚糖酶8_15mg ；
c.用HCl调pH至5.0-6. 0后，在40-60°C温度下酶解1. 5_5h，后煮沸2-4min使酶失活；
d.将酶灭活后，加入乙醇，使乙醇终浓度达到10体积％；
e.加热至70-8(TC提取，持续l_2h，重复加热3次，合并3次提取液，将提取液过滤，离心，取上清液；
f.将上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水溶解，用氨水调PH至6.2-6. 5 ；
g.将上述浸膏溶液滴加到大孔吸附树脂柱，加样至柱体1/3处；
h.以4倍柱床体积的10体积％乙醇作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏，即得甘草酸。如上所述的生产方法，其中优选地，所述各酶的比活力为纤维素酶60万U/g、果胶酶80万U/g、木聚糖酶4. 2万U/g、β -葡聚糖酶1. 7万U/g。如上所述的生产方法，其中优选地，步骤b中，每500g甘草药材加入纤维素酶 1.68，果胶酶0.88，木聚糖酶IOmg及β-葡聚糖酶IOmg;步骤c中，用HCl调节ρΗ至 5. 0-6. 0后，在50°C的温度下酶解2h，后煮沸2min使酶失活。如上所述的生产方法，其中优选地，步骤b中，所加蒸馏水重量为甘草药材重量的 2-3 倍。如上所述的生产方法，其中，所述甘草药材为双子叶植物豆科Leguminosae中的 ^^ Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草 infla ta Bat.或光果甘草 G. glabra L.的根及根茎。如上所述的生产方法，其中，所述大孔吸附树脂为型号为D-101、AB-8、X-5、BS_75、 LX-60、LX-Il和DM-130的树脂中的一种。本发明的有益效果为
1、甘草酸具有明显的抗炎、抗病毒、免疫调节、降血脂和抗动脉粥硬化的作用，用于制药、食品保健品行业，用途广泛，本发明提供了一种提取制备甘草酸的新方法。2、本发明的提取方法采用复合酶对原料进行酶解处理，成本低、对环境友好、产量高、纯度高，适宜工业化生产。本发明可富集药材中9%以上的甘草酸，高效液相色谱分析本发明所得浸膏中的甘草酸的含量可达95%以上。3、本发明的提取方法操作简便，避免了反复重结晶带来的耗时。4、本发明方法中未使用氨水等碱化措施，提取液澄清，粘度低，产品杂质少，后续处理方便。5、本发明方法使用的大孔吸附树脂可反复使用，成本低。
图1为甘草酸标准品的HPLC图谱。图2为甘草药材未加酶且采用10体积％乙醇洗脱的HPLC图谱。图3为甘草药材加复合酶且采用10体积％乙醇洗脱的HPLC图谱。图4为甘草药材未加酶且采用90体积％乙醇洗脱的HPLC图谱。图5为甘草药材加复合酶且采用90体积％乙醇洗脱的HPLC图谱。
具体实施方式
实施例1
(1)取甘草uralensis Fisch.)药材 500g，粉碎，过 10-20 目筛。(2)加入2倍于甘草药材重量的蒸馏水浸泡，每500g药材加入纤维素酶1. 6g、果胶酶0. Sg、木聚糖酶10mg、β -葡聚糖酶10mg。(3) HCl调pH至5. 0-6. 0，温度为50°C酶解2h，而后煮沸2min，使酶失活，加乙醇使乙醇终浓度达10% (此处及下文出现的乙醇浓度均为体积百分比)。(4)10%乙醇的提取条件为加热至80°C提取，持续2h，重复加热3次，合并3次提取液，将提取液过滤，离心，取上清液。(5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加少量水溶解，稀氨水调pH至6. 2-6. 5。(6)将上述浸膏缓慢滴加到大孔吸附树脂柱，加样至柱体1/3处。(7)分别以4倍柱体积的10%和95%的乙醇作为洗脱液进行洗脱，分别收集洗脱液，减压浓缩，得到甘草酸浸膏。实施例2
(1)取胀果甘草W inflate. Bat.)药材500g，粉碎，过10-20目筛。(2)加入3倍于甘草药材重量的蒸馏水浸泡，每500g药材加入纤维素酶2g、果胶酶0. 8g、木聚糖酶10mg、β -葡聚糖酶10mg。(3) HCl调pH至5. 0-6. 0，温度为50°C酶解3h，而后煮沸2min，使酶失活，加乙醇使乙醇终浓度达到10%。(4)10%乙醇的提取条件为加热至80°C提取，持续2h，重复加热3次，合并3次提取液。提取液过滤，离心，取上清液。(5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加少量水溶解，稀氨水调pH至6. 2-6. 5。(6)将上述浸膏缓慢滴加到大孔吸附树脂柱，加样至柱体1/3处。(7)分别以4倍柱体积的10%和95%的乙醇作为洗脱液进行洗脱，分别收集洗脱液，减压浓缩，得到甘草酸浸膏。实施例3
(1)取光果甘草W glabra. L.)药材500g，粉碎，过10-20目筛。(2)加入2倍于甘草药材重量的蒸馏水浸泡，每500g药材加入纤维素酶1. 6g、果胶酶lg、木聚糖酶10mg、β -葡聚糖酶10mg。(3) HCl调pH至5. 0-6. 0，温度为50°C酶解4h，而后煮沸2min，使酶失活，加乙醇使乙醇终浓度达10%。(4)10%乙醇的提取条件为加热至80°C提取，持续2h，重复加热3次，合并3次提取液。提取液过滤，离心，取上清液。(5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加少量水溶解，稀氨水调pH至6. 2-6. 5。(6)将上述浸膏缓慢滴加到大孔吸附树脂柱，加样至柱体1/3处。(7)分别以4倍柱体积的10%和95%的乙醇作为洗脱液进行洗脱，分别收集洗脱液，减压浓缩，得到甘草酸浸膏。实施例4
(1)取光果甘草药材500g，粉碎，过10-20目筛。(2)加入3倍于甘草药材重量的蒸馏水浸泡，每500g药材加入纤维素酶2g、果胶酶lg、木聚糖酶10mg、β -葡聚糖酶10mg。(3)HC1调pH至5. 5，温度为50°C酶解5h，而后煮沸3min，酶失活，加乙醇使乙醇终浓度达10%。(4)10%乙醇的提取条件为加热至70°C提取，持续lh，重复加热3次，合并3次提取液。提取液过滤，离心，取上清液。(5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加少量水溶解，稀氨水调pH至6. 5。(6)将上述浸膏缓慢滴加到大孔吸附树脂，加样至柱体1/3处。(7)分别以4倍柱体积的10%和90%的乙醇作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，得到甘草酸浸膏。实施例5
(1)取光果甘草药材500g，粉碎，过10-20目筛。(2)加入2倍于甘草药材重量的蒸馏水浸泡，每500g药材加入纤维素酶1. 6g、果胶酶0. Sg、木聚糖酶10mg、β -葡聚糖酶10mg。(3) HCl调pH至5. 7，温度55°C酶解1. 5h，而后煮沸2min，使酶失活，加乙醇使乙醇终浓度达10%。(4)10%乙醇的提取条件为加热至75°C提取，持续1. 5h，重复加热3次，合并3次提取液。提取液过滤，离心，取上清液。(5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加少量水溶解，稀氨水调pH至6. 3。(6)将上述浸膏缓慢滴加到大孔吸附树脂，加样至柱体1/3处。(7)分别以4倍柱体积的10%和90%的乙醇作为洗脱液进行洗脱，分别收集洗脱液，减压浓缩，得到甘草酸浸膏。实施例6
(1)取甘草药材500g，粉碎，过10-20目筛。(2)加入2倍于甘草药材重量的蒸馏水浸泡，每500g药材加入纤维素酶3g、果胶酶1. 5g、木聚糖酶10mg、β -葡聚糖酶10mg。(3) HCl调pH至5. 3，温度50°C酶解4h，而后煮沸4min，使酶失活，加乙醇使乙醇终浓度达10%。(4)10%乙醇的提取条件为加热至78°C提取，持续2h，重复加热3次，合并3次提取液。提取液过滤，离心，取上清液。(5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加少量水溶解，稀氨水调pH至6. 3。(6)将上述浸膏缓慢滴加到大孔吸附树脂，加样至柱体1/3处。(7)分别以4倍柱体积的10%和80%的乙醇作为洗脱液进行洗脱，分别收集洗脱液，减压浓缩，得到甘草酸浸膏。实施例7
(1)取甘草药材500g，粉碎，过10-20目筛。(2)加入2倍于甘草药材重量的蒸馏水浸泡，每500g药材加入纤维素酶2. 5g、果胶酶lg、木聚糖酶15mg、β -葡聚糖酶8mg。(3) HCl调pH至5. 3，温度为50°C酶解3. 5h，而后煮沸3min，使酶失活，加乙醇使乙醇终浓度达10%。
(4)10%乙醇的提取条件为加热至70°C提取，持续lh，重复加热3次，合并3次提取液。提取液过滤，离心，取上清液。(5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加少量水溶解，稀氨水调pH至6. 5。(6)将上述浸膏缓慢滴加到大孔吸附树脂，加样至柱体1/3处。(7)分别选用4倍柱体积的10%和80%的乙醇作为洗脱液进行洗脱，分别收集洗脱液，减压浓缩，得到甘草酸浸膏。实施例8
(1)取甘草药材500g，粉碎，过10-20目筛。(2)加入3倍于甘草药材重量的蒸馏水浸泡，每500g药材加入纤维素酶3g、果胶酶2g、木聚糖酶12mg、β -葡聚糖酶12mg。(3)HC1调pH至5. 6，温度为50°C酶解2. 5h，而后煮沸3min，使酶失活，加乙醇，使乙醇终浓度达10%。(4)10%乙醇的提取条件为加热至77°C提取，持续lh，重复加热3次，合并3次提取液。提取液过滤，离心，取上清液。(5)上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加少量水溶解，稀氨水调pH至6. 3。(6)将上述浸膏缓慢滴加到大孔吸附树脂，加样至柱体1/3处。(7)分别选用4倍柱体积的10%和80%的乙醇作为洗脱液进行洗脱，分别收集洗脱液，减压浓缩，得到甘草酸浸膏。甘草酸的含量检测
(1)称取甘草酸标准品4. 6mg，用80%乙醇定容。采用高效液相色谱(HPLC)法检测，流动相为体积比67 33 1的甲醇-0. 2mol/L乙酸铵-乙酸混合液，柱温35°C，流速1. OmL/min, 在254nm处测定峰面积，HPLC图谱见图1 (出峰时间T=12. 190min)。(2)甘草药材未加酶，采用10%乙醇提取，10%乙醇洗脱品的HPLC图谱见图2。(3)甘草药材加复合酶酶解，采用10%乙醇提取，10%乙醇洗脱品的HPLC图谱见图 3。(4)甘草药材未加酶，采用10%乙醇提取，90%乙醇洗脱品的HPLC图谱见图4。(5)甘草药材加复合酶酶解，采用10%乙醇提取，90%乙醇洗脱品的HPLC图谱见图 5。其中，甘草药材未加酶，采取乙醇提取法的洗脱结果参见表1。表1乙醇提取法的洗脱结果
权利要求
1.一种甘草酸的酶解生产方法，其特征在于，所述方法是利用复合酶将甘草药材酶解，采用10体积％乙醇提取甘草酸，再采用大孔吸附树脂进行分离、提纯，以10体积％乙醇为洗脱液洗脱，得到甘草酸；所述复合酶为果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的混合物。
2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述方法的步骤如下a.称取甘草药材，粉碎至10-20目；b.将粉碎后的甘草药材加入蒸馏水中，浸泡30min，每500g甘草药材加入纤维素酶 1-3. 2g，果胶酶0. 5-2g，木聚糖酶8-15mg及β -葡聚糖酶8_15mg ；c.用HCl调pH至5.0-6. 0后，在40-60°C温度下酶解1. 5_5h，后煮沸2-4min使酶失活；d.将酶灭活后，加入乙醇，使乙醇终浓度达到10体积％；e.加热至70-8(TC提取，持续l_2h，重复加热3次，合并3次提取液，将提取液过滤，离心，取上清液；f.将上清液减压浓缩，得浸膏，浸膏加水溶解，用氨水调PH至6.2-6. 5 ；g.将上述浸膏溶液滴加到大孔吸附树脂柱，加样至柱体1/3处；h.以4倍柱床体积的10体积％乙醇作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏，即得甘草酸。
3.如权利要求2所述的生产方法，其特征在于，步骤b中，每500g甘草药材加入纤维素酶1. 6g，果胶酶0. Sg,木聚糖酶IOmg及β -葡聚糖酶IOmg ；步骤c中，用HCl调节pH至 5. 0-6. 0后，在50°C的温度下酶解2h，后煮沸2min使酶失活。
4.如权利要求2或3所述的生产方法，其特征在于，步骤b中，所加蒸馏水重量为甘草药材重量的2-3倍。
5.如权利要求1至3中任意一项所述的生产方法，其特征在于，所述甘草药材为双子叶植物豆科中的甘草、胀果甘草或光果甘草的根及根茎。
6.如权利要求1至3中任意一项所述的生产方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂为型号为 D-IOl、AB-8、X-5、BS-75、LX-60、LX-Il 和 DM-130 的树脂中的一种。
全文摘要
本发明提供一种甘草酸的酶解生产方法，其是利用复合酶将甘草药材酶解，采用10体积%乙醇提取甘草酸，再采用大孔吸附树脂进行分离、提纯，以10体积%乙醇为洗脱液洗脱，得到甘草酸；所述复合酶为果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的混合物。本发明的提取方法成本低、操作简便、对环境友好、产量高、纯度高，适宜工业化生产。
文档编号C07J63/00GK102219824SQ20111016060
公开日2011年10月19日 申请日期2011年6月15日 优先权日2011年6月15日
发明者姜楠, 林强, 田平芳, 葛喜珍 申请人:北京联合大学生物化学工程学院