专利名称：一种高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法
技术领域：
本发明涉及药物葡萄糖醛酸结合物技术领域，特别提供了一种高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法。
背景技术：
现有技术中，葡萄糖醛酸结合代谢是ー类重要的药物代谢反应，临床上超过1/3的药物或其I相代谢产物都是尿苷酰ニ磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)的底物，在人及动物体内会生成O-, N-, S-，或C-连接的葡萄糖醒酸结合物(PHarmacol. Ther.2005; 106 (I) :97-132.)。结合物同底物相比，具有更高的溶解度，易于排出体外，从而影响 药物的药效。另外，有些葡萄糖醛酸结合物具有较强的药理活性或者毒性，如吗啡-6-葡萄糖醛酸结合物具有更强的麻酔效果，雌ニ醇-17-葡萄糖醛酸结合物具有诱导胆汁淤积的能力(Lancet. 1988; I (8589) :828, Drug Metab Rev. 1997; 29 (1-2) : 183-203.)。因此，制备药物的葡萄糖醛酸结合物对临床上安全有效用药具有非常重要的意义。制备葡萄糖醛酸结合物的方法主要分为两类化学法和生物法。化学法可以实现较大規模的制备，但是却不是通用的ー类方法，针对不同的底物常常需要开发具体的方法。另外，化学法的制备葡萄糖醛酸代谢产物常常需要强酸强碱等的苛刻的反应条件，有些药物分子在这些条件中不稳定，使得有些药物分子的葡萄糖醛酸结合物无法由化学法制备。传统上，药物分子的葡萄糖醛酸结合物的制备主要从动物的尿液、胆汁中获得，但是这种方法费时费力，很难大量获得高纯度的葡萄糖醛酸结合物。而且，结合物常常伴随生物样品ー起，需要多步分离纯化，才能获得一定量的葡萄糖醛酸结合物，很难对药效和毒效进行进ー步的评价。因此，人们期望获得ー种高效制备葡萄糖醛酸代谢产物的方法。
发明内容
本发明的目的是提供ー种高效制备葡萄糖醛酸代谢产物的方法。本发明ー种高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法，所述制备方法的要求依次是 首先进行生物转化处理通过酶的转化将底物转化为葡萄糖醛酸结合物；所用的酶具
体为重组表达的尿苷酰ニ磷酸葡萄糖醛酸转移酶(即UGT)，或为来源于动物组织的含有UGT酶活性的微粒体或含有微粒体的细胞液(S9)，动物组织优选自肝、肾、肠等强代谢能力的组织；所述底物是含有酚羟基但不含酸性基团的化合物；
其次进行分离纯化处理将上述生物转化过程获得的反应液通过快速色谱柱富集并纯化后获得目标葡萄糖醛酸结合物；
所述快速色谱柱所用填料为含有反相硅胶和阴离子交换树脂的混合填料，两种填料的质量比控制在1-10 ;所用硅胶键合有苯基，C8和C18中的一种碳链，硅胶粒径介于10-100μ m，所用阴离子离子交换树脂中要求含有伯胺基、仲胺基、叔胺基、季氨基中的一种碱性基团。
本发明所述高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法，优选要求保护下述内容
生物转化处理过程中，所用酶要求预先使用聚氧こ烯烷基醚类非离子型表面活性剂
(如鲸蜡醇聚氧こ烯醚)活化，具体要求是微粒体蛋白和活性剂质量之比控制在O. 1-100之间，以便发挥最大催化活性。生物转化过程需要尿苷酰ニ磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)，或为其对应的钠盐、铵盐或钾盐中的ー种，摩尔用量为UGT底物摩尔用量的O. 1-100倍。上述物质g在为生物催化过
程提供葡萄糖醛酸基团。生物转化反应要求在PH值为6-8缓冲盐溶液里进行，并保持30_50°C的转化温度，优选用35-40°C。
所述快速色谱柱的填料中，硅胶键合有不同长度碳链，碳链长度优选CS和C18，粒度优选40-60 μ m。阴离子交换树脂为弱碱性或强碱性离子交换树脂，优选含有伯胺基或仲胺基团的离子交换树脂，树脂粒径为O. 2-1 mm。两种填料的总质量为不低于底物和代谢产物总质量的20倍。所述生物转化样品置于快速色谱柱柱头后，先后经过水淋洗、醇淋洗及酸化醇淋洗的过程，水淋洗g在洗脱反应液里水溶性物质，醇淋洗g在洗脱底物和反应液里其它脂溶性物质，酸化醇淋洗g在洗脱葡萄糖醛酸结合物。所用醇为脂肪醇，具体指甲醇、こ醇、异丙醇；所用酸为低沸点有机酸，具体指甲酸、こ酸，醇中酸的摩尔浓度为O. 01-0. I mol/L。水洗过程中水的用量不低于5倍柱体积；醇具体为甲醇或者こ醇，醇淋洗的节点为洗脱液里不再含有底物；酸化醇的用量为柱体积的3-5倍。所述生物转化样品上柱且依次通过水洗、醇洗、酸化醇洗之后，经高效液相色谱及液相-质谱检测，代谢产物富集于酸化甲醇中；然后经低压蒸发或惰性气体(N2)吹干，即得纯度>95%的代谢产物。葡萄糖醛酸结合代谢是由尿苷酰ニ磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)介导的反应，基于化学法和传统生物法制备葡萄糖醛酸结合物的缺陷，本发明利用高活性的酶，包括重组UGT和源自动物具有强代谢能力组织(肝、肾、肠等)的微粒体或含有微粒体的细胞液(S9)成分，在体外高效制备萄糖醛酸结合物。反应液通过同时含有离子交换树脂和反相填料的快速色谱柱，一次性获得高纯度的葡萄糖醛酸结合物。不仅操作简单，而且可以获得大量的葡萄糖醛酸结合物。本发明同已有葡萄糖醛酸结合物的制备方法相比具有如下优点
O反应条件温和，不需要强酸强碱；
2)操作简便，不需从动物体内富集，也不要多步纯化；
3)具有广泛的适用性，适于所有含有酚羟基但不含有酸性基团的UGT底物的葡萄糖醛酸结合物的制备。
图1，为己烯雌酚葡萄糖醛酸结合物的高效液相色谱及质谱 图2，为厚朴酚葡萄糖醛酸结合物的高效液相色谱及质谱图。
具体实施例方式 实施例I己烯雌酚葡萄糖醛酸结合物的制备，如下所示
权利要求
1.一种高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于所述制备方法的要求依次是: 首先进行生物转化处理通过酶的转化将底物转化为葡萄糖醛酸结合物并获得反应液以便进行下一歩操作；所用的酶具体是下述几种之ー重组表达的尿苷酰ニ磷酸葡萄糖醛酸转移酶即UGT、含有UGT酶活性的动物组织的微粒体或含有微粒体的细胞液；所述底物是含有酚羟基但不含酸性基团的具有一定药理活性且能发生葡萄糖醛酸结合代谢的化合物； 其次进行分离纯化处理将上述生物转化过程获得的反应液通过快速色谱柱富集并纯化后获得目标葡萄糖醛酸结合物； 所述快速色谱柱所用填料为含有反相硅胶和阴离子交换树脂的混合填料，上述两种填料第一种和第二种的质量比比值为O. 1-10 ;所用硅胶键合有如下几种中的一种基团苯基、C8、C18，硅胶粒径为10-100 μ m ;所用阴离子离子交换树脂中含有如下几种中的ー种碱性基团伯胺基、仲胺基、叔胺基、季氨基基团。
2.按照权利要求I所述高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于生物转化处理过程中，所用酶要求预先使用聚氧こ烯烷基醚类非离子型表面活性剂活化，具体要求是微粒体蛋白和活性剂质量比比值控制在O. 1-10之间。
3.按照权利要求I所述高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于 .生物转化过程要求加入尿苷酰ニ磷酸葡萄糖醛酸，或者加入与尿苷酰ニ磷酸葡萄糖醛酸对应的钠盐、铵盐、钾盐中的ー种，尿苷酰ニ磷酸葡萄糖醛酸或其盐的摩尔用量为UGT底物的O.1-100 倍。
4.按照权利要求3所述高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于生物转化反应要求在PH值为6-8的缓冲盐溶液里进行，并保持30-50°C的转化温度。
5.按照权利要求1-4其中之一所述高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于所述快速色谱柱的填料总重量为底物质量的20-100倍。
6.按照权利要求5所述高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于将所述生物转化样品置于快速色谱柱柱头后，要求先后经过水淋洗、醇淋洗及酸化醇淋洗的过程；所用醇为脂肪醇，所用酸为低沸点有机酸； 水淋洗过程所用水量不低于5倍柱体积，醇淋洗过程所用醇量不低于5倍柱体积，酸化醇淋洗过程所用酸化醇的量不低于5倍柱体积。
7.按照权利要求6所述高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于所用脂肪醇为甲醇、こ醇和异丙醇中的ー种；所用低沸点有机酸为甲酸或こ酸。
全文摘要
一种高纯度葡萄糖醛酸结合物的制备方法，其特征在于所述制备方法的要求依次是首先进行生物转化处理通过酶的转化将底物转化为葡萄糖醛酸结合物；其次进行分离纯化处理将上述生物转化过程获得的反应液通过快速色谱柱富集并纯化后获得目标葡萄糖醛酸结合物。本发明同已有葡萄糖醛酸结合物的制备方法相比具有如下优点1)反应条件温和，不需要强酸强碱；2)操作简便，不需从动物体内富集，也不要多步纯化；3)具有广泛的适用性，适于所有含有酚羟基但不含有酸性基团的尿苷酰二磷酸葡萄糖醛酸转移酶底物的葡萄糖醛酸结合物的制备。
文档编号C07H1/06GK102864194SQ20111018825
公开日2013年1月9日 申请日期2011年7月6日 优先权日2011年7月6日
发明者杨凌, 朱亮亮, 葛广波, 张延延 申请人:中国科学院大连化学物理研究所