专利名称：一种用超声波辅助半仿生法提取野柿子树叶单宁的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取野柿子树叶单宁的方法，特别是一种用超声波辅助半仿生法提取野柿子树叶单宁的方法。
背景技术：
单宁(Tarmins)，也称单宁酸，鞣酸，是一种存在于植物中的水溶性、具有多酚羟基结构的物质，具有较强的生物活性、优异的抗氧化以及清除自由基等作用，能与金属离子螯合，并能与蛋白质、生物碱、多糖等发生反应，从而表现很强的抗氧化能力，优异的抗菌、抗病毒活性以及抑制致癌物及肿瘤活性。在预防和治疗自由基所引起的疾病、抑制脂质及其他物质的过氧化作用、抗爱滋病等方面显示出独特的优越性，广泛用于医药、食品、皮革及印染工业。目前，植物单宁的提取主要来自于黑荆树皮、松树等树种(参见东北林业大学学报，2009，37 (8): 67-70.) [U1]。野柿子树在湖南省的湘西地区分布广泛，野柿青果和树叶中均含有丰富的柿子单宁(参见Journal of Ethno pharmacology, 2007, 109 177-206.)。现已有关于利用野柿青果提取单宁的研究，但有关超声波辅助半仿生法提取野柿子树叶单宁还未见报道。随着精细化工的发展，超声波辅助提取技术在许多方面发挥着其独特的优势，同时，半仿生提取法(SBE)则是为生物制药所设计的一种新型的植物提取工艺，采用活性指导下的导向分离方法而保证被提取物的生物活性(参见海峡药学，2010，22 ): 12-14.)。为了充分利用野柿树资源，本发明以野柿子树叶为原料，采用半仿生提取法 (SBE)，运用超声波辅助技术，以获取高活性柿子单宁。中国是柿子的原产国和主产国，分布于23个省市自治区。目前，柿单宁的提取主要是以青柿子果为原料。以下为近年来国内外以柿子果为研究对象的一系列研究进展状况
国内研究现状有
顾海峰等探讨了柿子果肉中总酚和缩合单宁的提取工艺，采用Folin-Denis法、改良的香草醛和盐酸法分别进行总酚和缩合单宁含量的测定，确定了含1%盐酸的无水甲醇是最佳提取溶剂(参见食品科技，2007，2: 133-136 ；农业工程学报，2007，23(5): 241-245.)；杨文锟等人对柿子单宁纯化工艺及其抗过敏活性进行了研究发现当柿子单宁的浓度达到5mg/mL时，其对透明质酸酶的抑制率能达到95%(参见山地农业生物学报， 2010, 29(1): 48-51.)；陈美红等对柿子不同部位单宁提取物清除自由基作用的比较进行了研究，发现柿皮、柿肉、柿蒂及柿核单宁提取物对二苯代苦味酰自由基(DPPH)、羟基自由基(0H)、2，2’_联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基(ABTS+)的清除效果明显(参见食品科技，2009，34(8): 120-123.)；张宝善等人以甜柿为对照观察了牛心柿在生长、脱涩和返涩中单宁细胞的形态变化，指明涩柿单宁细胞在生长期体积不断增大、数量不断增多、涩味加强(参见陕西师范大学学报(自然科学版)，2008，36(1) 99-105.)；杨勇等在总结前人成果的基础上对柿果单宁细胞的形态做了比较全面的描述，总结了 6种柿果单宁细胞的形状(参见西北农林科技大学学报，2003，31(6): 93-99 ；西北植物学报， 2007，27(8) 1524-1530.)。此外，张继澍等对各种方法脱涩后柿子中单宁与柿子硬度的研究表明，柿子中可溶性单宁含量的变化与柿子硬度变化类似(参见西北植物学报，干果研究进展，2001， 23(2) 283-287.)；张海生等人在研究柿饼加工的返涩机理时认为柿子中的单宁在乙醇脱氢酶的作用下，加工产品不会返涩，但是在高温处理后的产品中，柿子单宁形成复合态是可逆的(参见食品工业科技，2003，24(12): 39-40.)。董新海等学者也对柿果单宁组成及其生物学特性进行了概括与总结。国外研究现状有
1923年日本学者Komatsu和Matsunami就对柿果单宁进行了初步研究，从未成熟的涩柿汁中提取出一种酚类物质，并推测出单宁中可能含有根皮酚和没食子酸单体(参见 NATURE, 1958，11:1371·)。Ito和Oshima在1962年研究柿果单宁分子式时发现，其主要成分被命名为柿果素(diospyrin)，具有一个邻苯二酚和一个邻苯三酚，而邻苯二酚和邻苯三酚的邻位酚羟基很容易被氧化，从而能消耗环境中的氧，并且能吸收活性氧等自由基(参见园试报，1962， B(I): 1-16.)。同时，Katsube T.等的研究发现涩柿的70%乙醇溶液提取物具有很强的抗 LDL 氧化能力(参见 Agric Food Chem, 2004，52(8) 2391-2396.)。Satoshi Taira等人在1997至1998年间，研究了柿果脱涩过程中柿果可溶性果胶和冷冻速率对柿果脱涩的影响，发现在混合溶液中，柿果中可溶性果胶质比清蛋白更容易与柿果单宁形成稳定复合物，利于柿果的脱涩(参见Postharvest Biology and Technology, 1998, 14 (3): 317-324 ；Postharvest Biology and Technology, 1997, 12(3) : 265-271·)。Salvador研究柿果细胞结构时发现，未脱涩细胞呈不规则形，结合紧密，脱涩的细胞膜和壁逐渐降解、松散。表明单宁含量与细胞的形状有一定的关系(参见Postharvest Biology and Technology, 2007，(12): 12-16.)。另外，除了上述有关柿子单宁的研究之外，许多学者也对其它的植物单宁进行了研究，如李敏等学者对不同品种茶叶单宁进行了研究(参见食品科学，2009，30(2): 149-153.)；湛年勇等对桉树皮单宁进行了分析(参见生物质化学工程，2009，43(5): 39-41.)；张建等学者将超声波应用于提取葡萄梗中单宁；陈晓娟和李立等开展了利用半仿生法提取杜仲叶中绿原酸和黄芩苷的研究(参见精细化工，2006，23(3): 35-38;中成药， 2007，29(10):1527-1529.)。综上所述，国内外学者和科研单位已经认识到了从生物质材料中提取高生物活性的植物单宁的重要意义，并对此展开了一些研究，但从植物叶子中提取单宁的研究报道并不多，而且有关“超声波辅助半仿生法提取野柿子树叶单宁工艺的研究”还没有相关的报道，本研究将以此为切入点进行这方面的探讨，为从树叶中提取植物有效成分提供一个研究方向。目前制备柿子单宁的主要方法是水浴回流法，即采取不同的有机溶剂将原料中的单宁进行溶解，再将溶解液浓缩而制成。
水浴回流法在提取柿子单宁时主要存在以下不足工艺复杂，单宁得率低；提取时间长，需要经过多次提取，提取成本高；产品中副产物多，分离复杂；单宁的活性较低，不宜制成生物制剂，影响了在生物制药方面的用途；由于使用了大量的有机溶剂，容易造成 VOC的污染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用超声波辅助半仿生法从野柿子树叶中提取单宁的方法。本发明的技术方案是一种用超声波辅助半仿生法提取野柿子树叶单宁的方法， 其特征在于包括以下步骤
①将杀青后的野柿子树叶干燥、粉碎至30目，用乙醇与水按1:1.5 — 1:3的比例混合后作为提取溶剂，模拟胃肠道的PH值，分别调节pH值为2. 0 — 2. 2、7. 0 — 7. 5,8. 0-8.3, 在50 — 60 ° C温度下回流提取3次，每次提取30 - 40分钟；
②在步骤①的提取条件下，在提取的过程中采用超声波进行辅助处理，处理时间为 15-20分钟；
③将3次提取所得提取液合并，用4500r/min离心30min，除出残渣，将得到的分离液经过真空浓缩后在50-60 ° C温度下干燥，即得到野柿子树叶单宁。本发明所述的回流提取3次的pH值分别调节为2. 0,7. 2,8. 0。本发明所述的回流提取3次的pH值分别调节为2. 1,7. 4,8. 1。本发明所述的回流提取3次的pH值分别调节为2. 2,7. 5,8. 2。本发明所述的超声波的功率为200 - 300 W、频率为沈一 32 kHz。本发明所述的乙醇和水提取溶剂的使用量与整体用量的比例控制在30% - 40%。本发明技术方案的显著特点是在半仿生法提取过程中采用超声波辅助提取，利用超声波的空化、机械振动、微射流及微声流等多级物理效能，促使野柿子树叶细胞组织破壁或变形来提高单宁的得率、减少提取时间，并保持单宁的活性。本发明中公开了优选的提取溶剂——乙醇与水的比例1:1. 5 - 1:3，以及提取液的PH值。本发明还公开了半仿生法提取过程中超声波的功率、频率与作用时间。超声波辅助半仿生法提取野柿子树叶单宁，采用1 1. 5 — 1 3的乙醇和水为提取溶剂，提取3次，3次的PH值分别为2. 0、7. 2、8. 0或2. 1,7. 4,8. 1或2. 2、7. 5、8. 2 ；同时，超声波的功率为200 — 300 W、频率为洸-32 kHz、处理时间为15 — 20 min，将所得到的提取液经过4500 r/min 离心30 min处理分离残渣后再经过真空浓缩，并在50 — 60 ° C的低温下干燥，即得到野柿子树叶单宁。野柿子树叶单宁的含量等基本参数按照中华人民共和国林业行业标准《LY/ T1642 — 2005》和《LY/T1300 — 2005》检测。本发明将单次提取时间控制在30 - 40分钟，乙醇和水提取溶剂的使用量与整体用量的比例控制在25% - 40%以内，在提取过程中缩短了提取时间、减少了提取溶剂的使用、保持了单宁的活性。由于柿子单宁的成分比较复杂，在提取过程中容易受到加热、光照等外部条件的影响而发生氧化、异构等变化而影响产品质量。采用半仿生法工艺可以降低提取温度，防止高温下单宁的氧化，但如果低温提取的时间太长同样也会因长时间与空气接触而造成氧化。使用超声波辅助提取，则可以缩短提取时间，不会对其分子结构与理化性质产生过大的影响，能够更好的保持单宁的生理活性，具有较好的应用前景。同时，超声波的使用，还可以提高单宁的得率，因此可以降低成本。此外，提取溶剂中适当的使用乙醇，可以提高单宁的溶解度而有利于提取，且乙醇在后期单宁的浓缩与干燥过程中能够通过蒸馏回收，所以整个提取过程中没有环境污染， 而且操作简单。使用本发明提供的方法所得到的单宁用紫外分光光度计进行检测，其中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素组成，总含量达 95. 6%，可直接用于食品、医药等领域使用。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。本发明实施例所用主要设备与仪器有
JY92- II D型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);722型紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);SHZ-82数显水浴恒温振荡器(江苏科兴);FW117中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；TDL-40B离心机(美国Anke公司)。实施例1
本实例采用3次提取，然后将提取液混合并浓缩干燥。第一次提取准确称取杀青后干燥并粉碎成30目的野柿子树叶粉末100g，加入 300g提取溶剂(乙醇与水的质量比为1:1. 5)，用乙酸调节pH值为2.0，水浴加热到50° C， 保温提取40分钟，期间每间隔5分钟使用一次功率为200W、频率为沈kHz的超声波来辅助半仿生法提取，每次使用时间为5分钟，共计20分钟。过滤后得到含有单宁的提取液。第二次提取在上述过滤后的野柿子树叶残渣中加入200g提取溶剂(乙醇与水的质量比为1:2)，用碳酸钠调节pH值为7. 2，水浴加热到50° C开始保温提取40分钟，期间每间隔5分钟使用一次功率为200W、频率为沈kHz的超声波来辅助半仿生法提取，时间为 5分钟，共计20分钟。过滤后得到含有单宁的提取液。第三次提取在第二次提取过滤后的野柿子树叶残渣中加入200g提取溶剂(乙醇与水的质量比为1:3)，用碳酸钠调节pH值为8. 0，水浴加热到50° C开始保温提取30分钟，期间每间隔5分钟使用一次功率为200W、频率为沈kHz的超声波来辅助半仿生法提取， 时间为5分钟，共计15分钟。过滤后得到含有单宁的过滤提取液。将上述3次得到的提取液混合，在经过4500 r/min离心30 min处理后，将得到的分离液在50 ° C温度下真空浓缩、干燥后即得到野柿子树叶单宁。实施例2
本实例采用3次提取，然后将提取液混合并浓缩干燥。第一次提取准确称取杀青后干燥并粉碎成30目的野柿子树叶粉末100g，加入 300g提取溶剂(乙醇与水的质量比为1:1.5)，用乙酸调节pH值为2. 1，水浴加热到55 ° C， 保温提取40分钟，期间每间隔10分钟使用一次功率为250W、频率为四kHz的超声波来辅助半仿生法提取，每次使用时间为10分钟，共计20分钟。过滤后得到含有单宁的提取液。第二次提取在上述过滤后的野柿子树叶残渣中加入200g提取溶剂(乙醇与水的质量比为1:2)，用碳酸钠调节pH值为7. 4，水浴加热到55 ° C开始保温提取40分钟，期间每间隔10分钟使用一次功率为250W、频率为四kHz的超声波来辅助半仿生法提取，时间为 5分钟，共计15分钟。过滤后得到含有单宁的提取液。第三次提取在第二次提取过滤后的野柿子树叶残渣中加入200g提取溶剂(乙醇与水的质量比为1:3)，用碳酸钠调节pH值为8.1，水浴加热到55 ° C开始保温提取30分钟，期间每间隔5分钟使用一次功率为250W、频率为四kHz的超声波来辅助半仿生法提取， 时间为5分钟，共计15分钟。过滤后得到含有单宁的提取液。将上述3次得到的提取液混合，在经过4500 r/min离心30 min处理后，将得到的分离液在60 ° C温度下真空浓缩、干燥后即得到野柿子树叶单宁。实施例3
本实例采用3次提取，然后将提取液混合并浓缩干燥。第一次提取准确称取杀青后干燥并粉碎成30目的野柿子树叶粉末100g，加入 300g提取溶剂(乙醇与水的质量比为1:3)，用乙酸调节pH值为2.2，水浴加热到60 ° C，保温提取40分钟，期间每间隔10分钟使用一次功率为300W、频率为32 kHz的超声波来辅助半仿生法提取，每次使用时间为10分钟，共计20分钟。过滤后得到含有单宁的提取液。第二次提取在上述过滤后的野柿子树叶残渣中加入200g提取溶剂(乙醇与水的质量比为1:2)，用碳酸钠调节pH值为7.5，水浴加热到60 ° C开始保温提取40分钟，期间每间隔10分钟使用一次功率为300 W、频率为32 kHz的超声波来辅助半仿生法提取，时间为10分钟，共计20分钟。过滤后得到含有单宁的提取液。第三次提取在第二次提取过滤后的野柿子树叶残渣中加入200g提取溶剂(乙醇与水的质量比为1:3)，用碳酸钠调节pH值为8. 2，水浴加热到60 ° C开始保温提取30分钟，期间每间隔5分钟使用一次功率为300W、频率为32 kHz的超声波来辅助半仿生法提取， 时间为5分钟，共计15分钟。过滤后得到含有单宁的提取液。将上述3次得到的提取液混合，在经过4500 r/min离心30 min处理后，将得到的分离液在60 ° C温度下真空浓缩、干燥后即得到野柿子树叶单宁。
权利要求
1.一种用超声波辅助半仿生法提取野柿子树叶单宁的方法，其特征在于包括以下步骤①将杀青后的野柿子树叶干燥、粉碎至30目，用乙醇与水按1:1.5 — 1:3的比例作为提取溶剂，模拟胃肠道的PH值，分别调节pH值为2.0-2. 2,7. 0 — 7. 5,8. 0 — 8. 3，在50 — 60 ° C温度下回流提取3次，每次提取30 - 40分钟；②在步骤①的提取条件下，在提取的过程中采用超声波进行辅助处理，处理时间为 15 — 20分钟；③将3次提取所得提取液合并，用4500r/min离心30min，除出残渣，将得到的分离液经过真空浓缩后在50 — 60 ° C温度下干燥，即得到野柿子树叶单宁。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于回流提取3次的pH值分别调节为2.0、 7. 2、8. O0
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于回流提取3次的pH值分别调节为2.1、 7. 4,8. 1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于回流提取3次的pH值分别调节为2.2、 7. 5、8· 2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于超声波的功率为200— 300 W、频率为 26 - 32 kHz。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于乙醇和水提取溶剂的使用量与整体用量的比例控制在30% - 40%。
全文摘要
本发明涉及一种用超声波辅助半仿生法从野柿子树叶中提取单宁的方法。主要特征在于将杀青后的野柿子树叶干燥、粉碎，乙醇与水作为提取溶剂，模拟胃肠道的pH值，在50－60°C温度下回流提取3次；在每次提取的过程中，采用超声波进行辅助处理；并将3次提取液合并，经离心处理后将所得提取液在50－60°C的温度下真空浓缩干燥即得野柿子树叶单宁。本发明在半仿生法提取过程中采用超声波辅助提取，促使野柿子树叶细胞组织破壁或变形来提高单宁的得率、缩短提取时间，并保持单宁的活性。
文档编号C07H13/08GK102344470SQ20111021470
公开日2012年2月8日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者余先纯, 孙德林, 李湘苏 申请人:余先纯