专利名称：一种从红藻角叉菜中提取化合物的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种从红藻角叉菜中提取化合物的提取方法，属药物植物化学提取工艺技术领域。
背景技术：
角叉菜，红藻门，杉藻科，角叉菜属，潮间带海藻，俗称海木耳。《中国海洋药物辞典》记载[2]:角叉菜全体均可食、入药，具有润肠通便、和血消肿、止痛生肌之功效，主治慢性便秘、 骨折、跌打损伤等症。角叉菜中含有多种抗菌和抗病毒的成分，不仅可以预防感冒，而且可以根除大范围的传染病，对B型流感和腮腺炎病毒都有较强的抑制能力。随着对天然产物的药理活性研究的深入，角叉菜多方面的生理活性被发现，已经引起国内外学者和产品研发人员的广泛关注。角叉菜是一种重要的经济海藻，主要用于生产卡拉胶(也称角叉菜胶)。但是到目前为止，对角叉菜活性成分的研究仅限于对基本成分的常规分析以及早期分离得到的一些单一化合物。因此有必要对角叉菜的化学成分进行更深入的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从红藻角叉菜中提取的化合物三磷酸腺苷及提取方法，本发明对角叉菜的化学成分进行进一步的研究，首先比较同一季节不同地点的角叉菜的营养成分的差别，用现代分离手段对角叉菜中的生理活性物质进行提取分离，采用现代波谱技术对提取物进行结构鉴定，并进行抗菌和免疫活性的研究，旨为角叉菜的开发和利用提供一定的依据。本发明是通过以下技术方案实现的
一种从红藻角叉菜中提取的化合物，特殊之处在于该化合物命名为三磷酸腺苷，其具有以下结构的化学式
OHOH
一种从红藻角叉菜中提取三磷酸腺苷的方法，其特殊之处在于包括以下步骤
(I)、将红藻角叉菜粉末置于3-5倍其质量的溶剂中冷浸提取，保证浸泡后的溶剂质量浓度为80%_90%，过滤去除藻渣，合并提取液，减压蒸干溶剂，得深绿色油状浸膏；
(2)、先后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取提取物浓缩液；
(3)、将正丁醇相萃取物采用硅胶柱层析，用氯仿甲醇水=7:3:0.I进行洗脱，利用 TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段，合并Rf和颜色相同的部分，减压浓缩得七种混合物级分C1-C7，取C2备用；
(4)、取C2再次用硅胶柱层析，用氯仿甲醇水=9:2:0.1，得C2-l、C2-2、C2-3、C2-4、 C2-5 ;经过大量的筛选，取C2-4用Sephadex LH-20柱经氯仿甲醇=1:1洗脱，其中C2_4c， 用氯仿反复洗涤，得到白色粉末状物质。根据检测器紫外光谱图，对分离所得的每个色谱峰相同的样品进行收集合并相同成分，得到纯度大于98%的单体物质三磷酸腺苷。上述提取过程的具体步骤如下
(I )、将红藻角叉菜粉末置于3-5倍其质量的溶剂中常温冷浸7-10天，保证浸泡后的溶剂质量浓度为80%-90%，连续换溶剂3-5次，即进行3-5次提取；
所述的溶剂为乙醇；常温一般为20-30°C ；
(2)、步骤I中的提取物过滤去除藻渣，合并上述3-5次的提取液，减压蒸干溶剂，即减压蒸干提取液中的酒精，得深绿色油状浸膏；
(3)、将步骤2得到的深绿色油状浸膏首先加水悬浮，然后用与悬浮液等量的石油醚常温萃取4-8次，合并石油醚相，减压浓缩得到深绿色浸膏；
(4)、步骤3所得的水相再加入与水相等量的乙酸乙酯常温萃取4-8次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩得到棕黄色浸膏；
(5)、步骤4所得的水相再加入与水相等量的正丁醇常温萃取4-8次，合并正丁醇相，减压浓缩得到黄色浸膏；
(6)、取100-200目的硅胶，110°C ±5°C下活化25-35分钟，与石油醚混合，超声去气泡，然后湿法装入层析柱中，柱子尺寸50X600mm，装柱高度400mm，静置60-80小时；
(7)、收集步骤5中的正丁醇相萃取物，用甲醇溶解，用三倍其质量的60-100目硅胶拌样，干法上样，分别以氯仿甲醇水=7 3 :0. I进行梯度洗脱，用50mL试管分段收集，每管收集45mL，利用TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段，合并Rf和颜色相同的部分，减压浓缩得七种混合物级分C1-C7 ；
Cl :第1-6管合并；C2 :第7-19管合并；C3 :第20-34管合并；C4 :第35-47管合并；C5 第48-61管合并；C6 :第62-72管合并；C7 第73-89管合并；
(8)、取硅胶200-300目，按照步骤6的过程活化后湿法装柱，柱子尺寸20X400mm， 装柱高度280mm ；
(9)、取步骤7分离所得的级分C2，用甲醇溶解，用三倍其质量的6(Γ100目硅胶拌样，干法上样，以氯仿甲醇冰=9 2 :0. I进行梯度洗脱，用20mL试管分段收集，每管收集 18mL,利用TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段，合并Rf和颜色相同的部分，减压浓缩得五种混合物级分C2-1、C2-2、C2-3、C2_4、C2-5 ；
C2-1 第1-3管合并；C2-2 第4-12管合并；C2_3 :第13-21管合并；C2_4 :第22-29管合并；C2-5 :第30-39管合并；
(10)、取Sephadex LH-20凝胶装柱,柱子规格15X800mm ;装柱高度700mm,取步骤9分离所得的级分C2-4，用氯仿甲醇=1:1溶解，上样；
经氯仿甲醇=1 :1洗脱，用IOmL试管分段收集，每管收集5mL，利用TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段，合并Rf和颜色相同的部分，其中第10-17管为C2-4c，有白色固体析出，用氯仿反复洗涤，得到白色粉末状物质，经检测为三磷酸腺苷。本发明红藻角叉菜中单体成分的分离制备方法，将角叉菜用乙醇提取，提取物先后用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将正丁醇相萃取物采用硅胶柱层析，用氯仿甲醇水 =7:3:0. I进行洗脱，根据颜色和Rf值进行分段收集、合并相同部分，减压浓缩得七个级分C1-C7。其中C2再次用硅胶柱层析，氯仿甲醇水=9:2:0.1,得五个级分。其中C2-4 用S印hadex LH-20柱经氯仿甲醇=1:1洗脱，得到白色粉末状物质三磷酸腺苷，纯度高于 98%。本发明对角叉菜的化学成分进行进一步的研究，用现代分离手段对角叉菜中的生理活性物质进行提取分离，采用现代波谱技术对提取物进行结构鉴定，并进行抗菌和免疫活性的研究，为角叉菜的开发和利用提供一定的依据。
图I :红藻角叉菜乙醇提取物的溶剂分配示意图2 :红藻角叉菜正丁醇相提取物的分离流程图。
具体实施例方式以下参照附图，给出本发明的具体实施方式
，用来对本发明的构成进行进一步说明。实施例I
(I )、将红藻角叉菜粉末置于3倍其质量的溶剂中常温冷浸10天，保证浸泡后的溶剂质量浓度为85%，连续换溶剂4次，即进行4次提取；
所述的溶剂为乙醇；常温一般为20-30°C ；
(2)、步骤I中的提取物过滤去除藻渣，合并上述4次的提取液，减压蒸干溶剂，即减压蒸干提取液中的酒精，得深绿色油状浸膏；
(3)、将步骤2得到的深绿色油状浸膏首先加水悬浮，然后用与悬浮液等量的石油醚常温萃取6次，合并石油醚相，减压浓缩得到深绿色浸膏；
(4)、步骤3所得的水相再加入与水相等量的乙酸乙酯常温萃取6次，合并乙酸乙酯相， 减压浓缩得到棕黄色浸膏；
(5)、步骤4所得的水相再加入与水相等量的正丁醇常温萃取6次，合并正丁醇相，减压浓缩得到黄色浸膏；
(6)、取100-200目的硅胶，110°C ±5°C下活化30分钟，与石油醚混合，超声去气泡，然后湿法装入层析柱中，柱子尺寸50X600mm，装柱高度400mm，静置60-80小时；
(7)、收集步骤5中的正丁醇相萃取物，用甲醇溶解，用三倍其质量的60-100目硅胶拌样，干法上样于步骤(6)的层析柱中，分别以氯仿甲醇水=7 3 :0. I进行梯度洗脱，用 50mL试管分段收集，每管收集45mL，利用TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段， 合并Rf和颜色相同的部分，减压浓缩得七种混合物级分C1-C7 ；Cl 第1-6管合并；C2 第7-19管合并；C3 :第20-34管合并；C4 第35-47管合并；C5 第48-61管合并；C6 第62-72管合并；C7 :第73-89管合并；
(8)、取硅胶200-300目，按照步骤6的过程活化后湿法装柱，柱子尺寸20X400mm， 装柱高度280mm ；
(9)、取步骤7分离所得的级分C2，用甲醇溶解，用三倍其质量的6(Γ100目硅胶拌样，干法上样于步骤(8)的层析柱中，以氯仿甲醇冰=9 2 :0. I进行梯度洗脱，用20mL试管分段收集，每管收集18mL，利用TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段，合并Rf 和颜色相同的部分，减压浓缩得五种混合物级分C2-1、C2-2、C2-3、C2_4、C2-5 ；
C2-1 :第1-3管合并；C2-2 第4-12管合并；C2_3 第13-21管合并；C2_4 :第22-29管合并；C2-5 :第30-39管合并；
(10)、取Sephadex LH-20凝胶装柱,柱子规格15X800mm ;装柱高度700mm,取步骤9 分离所得的级分C2-4，用氯仿甲醇=1:1溶解，上样；
经氯仿甲醇=1 :1洗脱，用IOmL试管分段收集，每管收集5mL，利用TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段，合并Rf和颜色相同的部分，其中第10-17管为C2-4c，有白色固体析出，用氯仿反复洗涤，得到白色粉末状物质，为三磷酸腺苷。实施例2
(I )、将红藻角叉菜粉末置于5倍其质量的溶剂中常温冷浸10天，保证浸泡后的溶剂质量浓度为85%，连续换溶剂5次，即进行5次提取；
所述的溶剂为乙醇；常温一般为20-30°C ；
(2)、步骤I中的提取物过滤去除藻渣，合并上述5次的提取液，减压蒸干溶剂，即减压蒸干提取液中的酒精，得深绿色油状浸膏；
(3)、将步骤2得到的深绿色油状浸膏首先加水悬浮，然后用与悬浮液等量的石油醚常温萃取8次，合并石油醚相，减压浓缩得到深绿色浸膏；
(4)、步骤3所得的水相再加入与水相等量的乙酸乙酯常温萃取8次，合并乙酸乙酯相， 减压浓缩得到棕黄色浸膏；
(5)、步骤4所得的水相再加入与水相等量的正丁醇常温萃取8次，合并正丁醇相，减压浓缩得到黄色浸膏；
(6)、取100-200目的硅胶，110°C ±5°C下活化35分钟，与石油醚混合，超声去气泡，然后湿法装入层析柱中，柱子尺寸50X600mm，装柱高度400mm，静置60-80小时；
(7)、收集步骤5中的正丁醇相萃取物，用甲醇溶解，用三倍其质量的60-100目硅胶拌样，干法上样于步骤(6)的层析柱中，分别以氯仿甲醇水=7 3 :0. I进行梯度洗脱，用 50mL试管分段收集，每管收集45mL，利用TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段， 合并Rf和颜色相同的部分，减压浓缩得七种混合物级分C1-C7 ；
Cl :第1-6管合并；C2 第7-19管合并；C3 第20-34管合并；C4 第35-47管合并；C5 第48-61管合并；C6 第62-72管合并；C7 :第73-89管合并；
(8)、取硅胶200-300目，按照步骤6的过程活化后湿法装柱，柱子尺寸20X400mm， 装柱高度280mm ；
(9)、取步骤7分离所得的级分C2，用甲醇溶解，用三倍其质量的6(Γ100目硅胶拌样，干法上样于步骤(8)的层析柱中，以氯仿甲醇冰=9 2 :0. I进行梯度洗脱，用20mL试管分段收集，每管收集18mL，利用TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段，合并Rf 和颜色相同的部分，减压浓缩得五种混合物级分C2-1、C2-2、C2-3、C2_4、C2-5 ；
C2-1 :第1-3管合并；C2-2 第4-12管合并；C2_3 :第13-21管合并；C2_4 :第22-29管合并；C2-5 :第30-39管合并；
(10)、取Sephadex LH-20凝胶装柱,柱子规格15X800mm ;装柱高度700mm,取步骤9 分离所得的级分C2-4，用氯仿甲醇=1:1溶解，上样；
经氯仿甲醇=1 :1洗脱，用IOmL试管收集，每管收集5mL，利用TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段，合并Rf和颜色相同的部分，其中第10-17管为C2-4c，有白色固体析出，用氯仿反复洗涤，得到白色粉末状物质，为三磷酸腺苷。实施例3
(I )、将红藻角叉菜粉末30kg置于4倍其质量的溶剂中常温冷浸7天，保证浸泡后的溶剂质量浓度为90%，连续换溶剂4次，即进行4次提取；
所述的溶剂为乙醇；常温一般为20-30°C ；
(2)、步骤I中的提取物过滤去除藻渣，合并上述4次的提取液，减压蒸干溶剂，即减压蒸干提取液中的酒精，得深绿色油状浸膏；
(3)、将步骤2得到的深绿色油状浸膏首先加水悬浮，然后用与悬浮液等量的石油醚常温萃取6次，合并石油醚相，减压浓缩得到深绿色浸膏；
(4)、步骤3所得的水相再加入与水相等量的乙酸乙酯常温萃取6次，合并乙酸乙酯相， 减压浓缩得到棕黄色浸膏；
(5)、步骤4所得的水相再加入与水相等量的正丁醇常温萃取6次，合并正丁醇相，减压浓缩得到黄色浸膏；
(6)、取100-200目的硅胶，110°C ±5°C下活化25-35分钟，与石油醚混合，超声去气泡，然后湿法装入层析柱中，柱子尺寸50X600mm，装柱高度400mm，静置60-80小时；
(7)、收集步骤5中的正丁醇相萃取物，用甲醇溶解，用三倍其质量的60-100目硅胶拌样，干法上样于步骤(6)的层析柱中，分别以氯仿甲醇水=7 3 :0. I进行梯度洗脱，用 50mL试管分段收集，每管收集45mL，利用TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段， 合并Rf和颜色相同的部分，减压浓缩得七种混合物级分C1-C7 ；
Cl 第1-6管合并；C2 第7-19管合并；C3 :第20-34管合并；C4 :第35-47管合并；C5 第48-61管合并；C6 第62-72管合并；C7 :第73-89管合并；
(8)、取硅胶200-300目，按照步骤6的过程活化后湿法装柱，柱子尺寸20X400mm， 装柱高度280mm ；
(9)、取步骤7分离所得的级分C2，用甲醇溶解，用三倍其质量的6(Γ100目硅胶拌样，干法上样于步骤(8)的层析柱中，以氯仿甲醇冰=9 2 :0. I进行梯度洗脱，用20mL试管进行分段收集，每管收集18mL，利用TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段，合并Rf和颜色相同的部分，减压浓缩得五种混合物级分C2-1、C2-2、C2-3、C2_4、C2-5 ；
C2-1 第1-3管合并；C2-2 第4-12管合并；C2_3 :第13-21管合并；C2_4 :第22-29管合并；C2-5 :第30-39管合并；
(10)、取Sephadex LH-20凝胶装柱,柱子规格15X800mm ;装柱高度700mm,取步骤9 分离所得的级分C2-4，用氯仿甲醇=1:1溶解，上样；经氯仿甲醇=1 :1洗脱，用IOmL试管收集，每管收集5mL，利用TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段，合并Rf和颜色相同的部分，其中第10-17管为C2-4c，有白色固体析出，用氯仿反复洗涤，得到白色粉末状物质，为三磷酸腺苷。本发明一种从红藻角叉菜中提取的化合物三磷酸腺苷(ATP)是一种辅酶。有改善肌体代谢的作用，参与体内脂肪、蛋白质、糖、核酸及核苷酸的代谢，同时又是体内能量的主要来源。适用于细胞损伤后细胞酶减退引起的疾病。动物试验发现本品对心肌细胞的电生理有明显作用，可抑制慢反应细胞的钙离子内流，阻断和延长房室结折返环路的前向传导， 大剂量尚可阻断房室旁路的折返性，具有增强迷走神经的作用，可用室上性心动过速。ATP 可能会被作为纳米技术和灌溉的能源。人工心脏起搏器可能收益于这种技术而不再需要电池提供动力。在家禽养殖中1.用于肉鸡、肉鸭、猪、肉牛、肉羊、鱼、虾等肉质动物的增肥、促生长；2.用于因疾病导致的动物饮水、采食量下降，快速补充机体能量水平；3.使用本品能促使动物发病后快速恢复健康；4.适用于动物因疾病、药物、毒素等各种致病因素引起的肝脏损伤、肾脏损伤、肠粘膜损伤、输卵管损伤后的修复。
权利要求
1.一种从红藻角叉菜中提取三磷酸腺苷的方法，其特征在于包括以下步骤(1)、将红藻角叉菜粉末置于3-5倍其质量的溶剂中冷浸提取，保证浸泡后的溶剂质量浓度为80%-90%，过滤去除藻渣，合并提取液，减压蒸干溶剂，得深绿色油状浸膏；(2)、先后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取提取物浓缩液；(3)、将正丁醇相萃取物采用硅胶柱层析，用氯仿甲醇水=7:3:0.I进行洗脱，利用 TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段，合并Rf和颜色相同的部分，减压浓缩得七种混合物级分C1-C7，取C2备用；(4)、取C2再次用硅胶柱层析，用氯仿甲醇水=9:2:0.1，得C2-l、C2-2、C2-3、C2-4、 C2-5 ;经过大量的筛选，取C2-4用Sephadex LH-20柱经氯仿甲醇=1:1洗脱，其中C2_4c， 用氯仿反复洗涤，得到白色粉末状物质。
2.—种从红藻角叉菜中提取三磷酸腺苷的方法，其特征在于上述提取过程的具体步骤如下(I )、将红藻角叉菜粉末置于3-5倍其质量的溶剂中常温冷浸7-10天，保证浸泡后的溶剂质量浓度为80%-90%，连续换溶剂3-5次，即进行3-5次提取；所述的溶剂为乙醇；常温一般为20-30°C ；(2)、步骤I中的提取物过滤去除藻渣，合并上述3-5次的提取液，减压蒸干溶剂，即减压蒸干提取液中的酒精，得深绿色油状浸膏；(3)、将步骤2得到的深绿色油状浸膏首先加水悬浮，然后用与悬浮液等量的石油醚常温萃取4-8次，合并石油醚相，减压浓缩得到深绿色浸膏；(4)、步骤3所得的水相再加入与水相等量的乙酸乙酯常温萃取4-8次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩得到棕黄色浸膏；(5)、步骤4所得的水相再加入与水相等量的正丁醇常温萃取4-8次，合并正丁醇相，减压浓缩得到黄色浸膏；(6)、取100-200目的硅胶，110°C ±5°C下活化25-35分钟，与石油醚混合，超声去气泡，然后湿法装入层析柱中，柱子尺寸50X600mm，装柱高度400mm，静置60-80小时；(7)、收集步骤5中的正丁醇相萃取物，用甲醇溶解，用三倍其质量的60-100目硅胶拌样，干法上样，分别以氯仿甲醇水=7 3 :0. I进行梯度洗脱，用50mL试管分段收集，每管收集45mL，利用TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段，合并Rf和颜色相同的部分，减压浓缩得七种混合物级分C1-C7 ；Cl :第1-6管合并；C2 :第7-19管合并；C3 :第20-34管合并；C4 :第35-47管合并；C5 第48-61管合并；C6 :第62-72管合并；C7 第73-89管合并；(8)、取硅胶200-300目，按照步骤6的过程活化后湿法装柱，柱子尺寸20X400mm， 装柱高度280mm ；(9)、取步骤7分离所得的级分C2，用甲醇溶解，用三倍其质量的6(Γ100目硅胶拌样，干法上样，以氯仿甲醇水=9 20.1进行梯度洗脱，用20mL试管分段收集，每管收集 18mL,利用TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段，合并Rf和颜色相同的部分，减压浓缩得五种混合物级分C2-1、C2-2、C2-3、C2_4、C2-5 ；C2-1 :第1-3管合并；C2-2 :第4-12管合并；C2_3 :第13-21管合并；C2_4 :第22-29管合并；C2-5 :第30-39管合并；(10)、取Sephadex LH-20凝胶装柱,柱子规格15X800mm ;装柱高度700mm,取步骤9 分离所得的级分C2-4，用氯仿甲醇=1:1溶解，上样；经氯仿甲醇=1 :1洗脱，用IOmL试管分段收集，每管收集5mL，利用TLC薄层色谱跟踪检测，根据Rf和颜色进行分段，合并Rf和颜色相同的部分，其中第10-17管为C2-4c，有白色固体析出，用氯仿反复洗涤，得到白色粉末状物质，经检测为三磷酸腺苷。
全文摘要
本发明涉及一种从红藻角叉菜中提取化合物的提取方法，属药物植物化学提取工艺技术领域。发明红藻角叉菜中单体成分的分离制备方法，将角叉菜用乙醇提取，提取物先后用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将正丁醇相萃取物采用硅胶柱层析，用氯仿甲醇水=7:3:0.1进行洗脱，根据颜色和Rf值进行分段收集、合并相同部分，减压浓缩得七个级分C1-C7。其中C2再次用硅胶柱层析，氯仿甲醇水=9:2:0.1，得五个级分。其中C2-4用SephadexLH-20柱经氯仿甲醇=1:1洗脱，得到白色粉末状物质三磷酸腺苷，纯度高于98%。
文档编号C07H19/20GK102584923SQ20121002052
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月30日 优先权日2012年1月30日
发明者周革非, 孔娜娜, 李丽, 邢荣莲, 马伟伟 申请人:烟台大学