专利名称：重组人源lect2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，尤其是涉及重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的分泌表达和纯化制备方法。
背景技术：
LECT2 蛋白，即白细胞衍生趋化因子2 (leukocyte cell-derived chemotaxin 2) 是一个多功能的蛋白质，分子量约为16 kDa，含三个分子内二硫键。LECT2蛋白最初被鉴定为趋化因子，但越来越多的文献表明，LECT2蛋白更类似于细胞因子，是一个多功能的蛋白。 报道表明，在小鼠刀豆碱性肝损伤模型试验中，LECT2蛋白的表达瞬时减少；在类风湿性关节炎发展中，血液LECT2蛋白含量与病症严重程度呈负相关；它能触发肝再生的早期事件， 表现为肝细胞增殖的伴生抑制；它能通过抑制血管增生达到抑制肝癌的生长和迁移；它也与肾淀粉样病变紧密相关。因此，LECT2蛋白被认为是一种潜在的相关疾病治疗药物和分子诊断标记。LECT2蛋白的制备可以从血清中分离纯化，但由于血清少，含量低，如果从血清中分离提取LECT2蛋白，产量极低，成本极高，并且不同物种的LECT2蛋白不能替代，因此无法规模化生产。在外源基因表达系统中，原核表达系统产量高，成本低，但用于表达真核基因有重大缺陷，由于缺少翻译后的加工修饰，表达产物的生物学活性往往会受到影响。真核表达系统中的中国仓鼠卵巢细胞表达系统，活性较高，但产量低，并且细胞培养成本很高。真核表达系统中的巴斯德毕赤酵母iPichia pastoris)表达系统，表达量大，并且具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后加工修饰功能，重组蛋白生物学活性高，是表达真核基因的理想系统之一。但是，目前国内外均未见采用毕赤酵母表达制备重组人源LECT2蛋白并进一步进行纯化制备的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种表达水平高、生产成本低及产量高的重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为将人工合成的人源LECT2基因插入胞外表达载体PPICZaA中；酶切线性化后电击导入毕赤酵母X33中，获得重组工程菌株； 经过摇瓶发酵和甲醇诱导，实现重组人源LECT2蛋白的分泌表达；再利用柱层析进行纯化制备得到纯度为95%以上的重组人源LECT2蛋白，步骤如下
(1)构建重组表达质粒
抽取人外周血细胞中RNA，逆转录合成cDNA得到人源LECT2蛋白基因序列，登录号为 NM002302,以此为模板设计引物进行PCR扩增人源LECT2蛋白，将含人源LECT2基因的PCR 扩增产物用限制性内切酶和幻7/71双酶切，将用相同限制性内切酶和^双酶切的的质粒PPICZ α A与酶切后的PCR产物用Τ4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌Dffia中， 得到重组表达质粒pPICZ α -LECT2 ；(2)筛选高表达重组工程菌株
将重组表达质粒？？扣2(1-1^012经5^1酶切后，将感受态毕赤酵母X33细胞与经Mel 酶切线性化的重组表达质粒PPICZ α -LECT2按比例16ul Iug混合后，进行电击转化获得转化子，将转化子经博莱霉kocin高抗性筛选及PCR鉴定，阳性克隆为重组工程菌X33/ pPICZ α -LECT2 ；将获得的博莱霉高抗性重组工程菌株Χ33/ pPICZ α -LECT2接种于BMGY培养基中，培养至0D600达2. 0 6. 0收集细胞，重悬于BMMY培养基中，0. 5%甲醇诱导表达，上清液用SDS-PAGE蛋白电泳及Wfestern blot免疫印迹鉴定分析，筛选表达水平为60_70mg/ L的菌株，得到高表达重组工程菌株；
(3)高表达酵母菌株扩大培养
将高表达重组工程菌株接种于IOOmL BMGY培养基生长，30 °C培养22-26小时直至 0D600达2. 0 6. 0，1500rpm离心5min收集菌体，然后将菌体转入400mL BMMY培养基中进行甲醇诱导，0. 5%甲醇诱导表达，30°C继续培养70-75小时，每M小时补加一次甲醇，使毕赤酵母分泌表达重组人源LECT2蛋白；
(4)重组人源LECT2蛋白的纯化
收集步骤(3)扩大发酵后得到的上清液，经强阳离子交换柱层析，收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩后，再经superdex 75分子筛分离纯化，收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥，即得到纯度达95%以上的重组人源LECT2蛋白。步骤(1)中PCR引物序列如下
正向引物为 5，-GGAATTCGGGCCATGGGCTAATATATG-3‘, 反向引物为 5，-GGGTACCCAGGTATGCAGTAGGGTCAC-3，。步骤(2)中所述的感受态毕赤酵母X33的制备方法如下将毕赤酵母X33接种于 YPD培养基中，30°C振荡培养至0D600为1. 3-1. 5，离心收集菌体，用预冷无菌水和1 mol/L 山梨醇各洗一次，最后用1 mol/L山梨醇200 μ L悬浮，即得到X33感受态毕赤酵母。于步骤(2)具体过程如下
(1)电击转化感受态毕赤酵母Χ33获得转化子
将80 μ L感受态毕赤酵母Χ33细胞和5 μ g SacI酶切线性化的重组表达质粒混合，在 1500ν，25μΡ，20(Μ条件下电击转化，用浓度为1 mol/L山梨醇悬浮，30°C静置1小时，再加入YPD培养基，振荡培养3小时得到转化液，将转化液涂布含100 μ g/ml博莱霉kocin的 YPDS平板，30 °C培养3 4天，得到大量转化子；
(2)博莱霉高抗性重组工程菌株X33/pPICZ α -LECT2的制备
将转化子点到含1000 μ g/ml博莱霉的YPDS培养基上，获得博莱霉高抗性菌株，将博莱霉高抗性菌株的菌落置于无菌水中，混勻并煮沸，离心后取上清进行PCR扩增，阳性克隆获得博莱霉高抗性重组工程菌株X33/ pPICZ α -LECT2 ；
(3)高表达重组工程菌株的制备
将博莱霉高抗性重组工程菌株Χ33/ 扣2(1-1^012接种于51^ BMGY培养基中，30 V 培养22-26小时至0D600达2. 0 6. 0，1500rpm离心5min收集菌体，用40 mL BMMY培养液悬浮菌体，0. 5%甲醇诱导表达，30°C继续培养70-75小时，每M小时补加一次甲醇，取发酵液离心，上清液用于12% SDS-PAGE蛋白电泳及Wfestern blot蛋白免疫印迹鉴定分析，筛选表达水平为60-70mg/L的菌株，得到高表达重组工程菌株。
步骤(4)具体如下收集步骤(3)扩大发酵后得到的上清液浓缩至10 mL后，上样强阳离子交换柱，以3.0 ml/min的流速洗脱，洗脱液为lmol/L氯化钠溶液，收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩至500ul后，上样superdex 75分子筛层析柱，以1. 0 ml/min的流速洗脱，洗脱液为lOOmmol/L碳酸铵溶液，收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥，即得到纯度达95%以上的重组人源LECT2蛋白。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明首次提出了一种重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中得分泌表达和纯化制备方法，具体是通过获得毕赤酵母重组工程菌株，经发酵和诱导高效分泌表达，再通过柱层析的方法纯化，获得纯度较高的重组人源LECT2蛋白。本发明选用毕赤酵母表达系统表达，分泌型表达菌株的表达水平达到Mmg/L左右。通过柱层析重组蛋白纯度为96%。利用趋化小室检测表明，该重组人源LECT2蛋白具有趋化活性。鉴于人源LECT2蛋白的多功能性及与多种疾病的相关性，因此采用毕赤酵母大量表达高活性的重组人源LECT2蛋白，具有稳定、产量高、活性强等优势，可用于制药和诊断检测。
图1为重组人源LECT2蛋白UW80 nm处的UNQsphere S阳离子交换柱洗脱曲线； 图2为重组人源LECT2蛋白UW80 nm处的Superdex75分子筛洗脱曲线。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。一、具体实施例实施例1
本发明重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，将人工合成的人源 LECT2基因插入胞外表达载体pPICZ α A中；酶切线性化后电击导入毕赤酵母Χ33中，获得重组工程菌株；经过摇瓶发酵和甲醇诱导，实现重组人源LECT2蛋白的分泌表达；再利用柱层析进行纯化制备得到纯度为95%以上的重组人源LECT2蛋白，步骤具体如下
(1)构建重组表达质粒
抽取人外周血细胞中RNA，逆转录合成cDNA得到人源LECT2蛋白基因序列，登录号为 NM002302,以此为模板设计引物进行PCR扩增人源LECT2蛋白，将含人源LECT2基因的PCR 扩增产物用限制性内切酶和幻7/71双酶切，将用相同限制性内切酶和^双酶切的的质粒PPICZ α A与酶切后的PCR产物用Τ4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌Dffia中， 得到重组表达质粒pPICZ α -LECT2，其中PCR引物序列如下 正向引物为 5，-GGAATTCGGGCCATGGGCTAATATATG-3，， 反向引物为 5，-GGGTACCCAGGTATGCAGTAGGGTCAC-3‘；
(2)筛选高表达重组工程菌株
将重组表达质粒？？扣2(1-1^012经5^1酶切后，将感受态毕赤酵母Χ33细胞与经Mel 酶切线性化的重组表达质粒pPICZ α -LECT2按比例16ul Iug混合后，进行电击转化获得转化子，将转化子经博莱霉kocin高抗性筛选及PCR鉴定，阳性克隆为重组工程菌X33/pPICZ α -LECT2 ；将获得的博莱霉高抗性重组工程菌株Χ33/ pPICZ α -LECT2接种于BMGY培养基中，培养至0D600达2. 0 6. 0收集细胞，重悬于BMMY培养基中，0. 5%甲醇诱导表达，上清液用SDS-PAGE蛋白电泳及Wfestern blot免疫印迹鉴定分析，筛选表达水平为60_70mg/L的菌株，得到高表达重组工程菌株；
(3)高表达酵母菌株扩大培养
将高表达重组工程菌株接种于IOOmL BMGY培养基生长，30 °C培养22-26小时直至0D600达2. 0 6. 0，1500rpm离心5min收集菌体，然后将菌体转入400mL BMMY培养基中进行甲醇诱导，0. 5%甲醇诱导表达，30°C继续培养70-75小时，每M小时补加一次甲醇，使毕赤酵母分泌表达重组人源LECT2蛋白；
(4)重组人源LECT2蛋白的纯化
收集步骤(3)扩大发酵后得到的上清液，经强阳离子交换柱层析，收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩后，再经superdex 75分子筛分离纯化，收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥，即得到纯度达95%以上的重组人源LECT2蛋白。实施例2
本发明重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，具体包括如下步骤1、人源LECT2基因毕赤酵母表达载体的构建
抽取人外周血细胞总RNA，逆转录合成cDNA，根据已发表人源泉LECT2基因序列(NM_002302)设计引物，正向引物为 5，-GGAATTCGGGCCATGGGCTAATATATG-3，，反向引物为 5，-GGGTACCCAGGTATGCAGTAGGGTCAC-3，。PCR反应条件按照常规设置进行，PCR扩增LECT2，将含LECT2的PCR产物用切胶回收试剂盒回收(OMEGA)，回收产物用限制性内切酶和^(Takara)双酶切，将酶切后的PCR产物与相同酶切的质粒pPICZ α A用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a中，得到重组质粒pPICZ α -LECT2,重组子经酶切鉴定和测序验证，表明重组表达质粒的构建完全正确。2、重组表达质粒电转化毕赤酵母Χ33及筛选博莱霉高抗性重组工程菌株接种毕赤酵母Χ33 (Invitrogen)于YPD培养基(Clontech)中，30°C振荡培养至
0D600=1. 3-1. 5，离心，收集菌体，用预冷无菌水和1 mol/L山梨醇各洗一次，最后用1 mol/L山梨醇200 μ L悬浮，即得到Χ33感受态细胞毕赤酵母Χ33 ；取80 μ L感受态毕赤酵母Χ33细胞和5 μ g McI(Takara)酶切线性化的重组表达质粒混合，在1500V，25 μ F，200W条件下电击转化，用1 mol/L山梨醇1 mL悬浮，30°C静置1小时，再加入1 mL YPD，振荡培养3小时得到转化液，将转化液涂布含100 μ g/ml博莱霉kocin (Invitrogen) YPDS平板，30 °C培养3 4天，结果得到1300多个转化子。将这些转化子点到1000 μ g/ml博莱霉的YPDS培养基上，获得5个博莱霉高抗性菌株。3、酵母转化子的PCR鉴定
取上述博莱霉高抗性菌株的菌落置于无菌水，混勻和煮沸，离心后取上清进行PCR扩增，其中PCR扩增
正向引物为 5，-GGAATTCGGGCCATGGGCTAATATATG-3，，
反向引物为5’ -GGGTACCCAGGTATGCAGTAGGGTCAC-3’，PCR反应条件按照常规设置进行，阳性克隆为博莱霉高抗性重组工程菌株X33/ pPICZ α -LECT2。4、高表达重组人源LECT2蛋白的工程菌筛选挑取博莱霉高抗性重组工程菌株X33/ pPICZ α -LECT2接种于5mL BMGY培养基中，30°C培养22-26小时(0D600达2. 0 6. 0)，1500rpm离心5min收集菌体，用40 mL BMMY培养悬浮菌体，0. 5%甲醇诱导表达，30°C继续培养70-75小时，每M小时补加一次甲醇，取发酵液离心，上清用于12% SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot蛋白免疫印迹鉴定分析，筛选表达水平为60-70mg/L的菌株，得到高表达重组工程菌株。5、扩大培养
将高表达重组工程菌接种于IOOmL BMGY培养基生长，30 °C培养2246小时(0D600达2. 0 6. 0)，1500rpm离心5min收集菌体，然后转入400mL BMMY培养基中进行甲醇诱导，0. 5%甲醇诱导表达，30°C继续培养70-75小时，每M小时补加一次甲醇，使毕赤酵母分泌表达重组人源LECT2蛋白。以上所用培养基均为通用培养基，在此不详细说明。6、纯化重组人源LECT2蛋白
收集扩大培养后得到的培养上清液浓缩至10mL，全部上样强阳离子交换柱(型号UNQsphere S，生产厂家Biorad)，以3. 0 ml/min的流速洗脱，洗脱液为lmol/L氯化钠溶液，收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩至500ul后，上样superdex 75分子筛层析柱，以1. 0ml/min的流速洗脱，洗脱液为lOOmmol/L碳酸铵溶液，收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥，即得到重组人源LECT2蛋白，其中目的组分采用BCA-200蛋白含量测定试剂盒(Pierce)测定总蛋白量，并用12% SDS-PAGE检测纯化效果，通过电泳条带的积分光密度计算蛋白纯度为96%，重组人源LECT2蛋白UW80 nm处的UNQsphere S阳离子交换柱洗脱曲线如图1所示，重组人源LECT2蛋白UW80 nm处的Superdex75分子筛洗脱曲线如图2所
7J\ ο二、重组人源LECT2蛋白的活性验证
健康志愿者抽血加入抗凝剂，离心去除血浆，加入生理盐水重悬，再加入葡聚糖，缓慢混勻，静置去除红细胞。经Percoll梯度离心，获得人嗜中性粒细胞，按照2X1 O6 / mL重悬于RPMI1640 (生产厂家hvitrogen)完全培养基备用。利用Beydon趋化小室法(生产厂家Corning)对利用本方法制备得到的重组人源LECT2蛋白进行活性测定。在趋化小室的底孔中，加入重组人源LECT2蛋白，设置浓度梯度分别为0、0. 1 μ g/mL、1.0μ g/mL、10 μ g/mL、100 μ g/mL,变性重组人源LECT2蛋白作为阴性对照。趋化小室底孔上面覆盖5. 0 μ m孔径的无聚乙烯吡咯酮多聚碳酸酯膜，再覆盖上顶板，于趋化小室顶孔中加入50 μ L人嗜中性粒细胞。将整个小室置37°c、5% C02，孵育箱中作用池。取出多聚碳酸酯膜，刮去上表面残留的细胞，将整个膜置于甲醛中固定，再进行姬姆萨染色。在显微镜下计数5个高倍视野中迁移至多聚碳酸酯膜背面的染色细胞总数，并计算趋化指数CTU:100X (SM-RM) / (FM-RM)，SM表示待测样品迁移细胞数，RM表示空白对照迁移细胞数，FM表示阳性对照(趋化肽FMLP)迁移细胞数。实验重复3次，采用t检验对数据进行分析。结果表明，与对照相比，重组人源LECT2蛋白针对人嗜中性粒细胞，具有明显的趋化活性。不同稀释浓度的蛋白对靶细胞的趋化呈现量效关系，在浓度为1. 0 μ g/mL时，CTU最高值为250。上述实施例是对本发明的详细说明，但本发明的保护范围并不限于上述实施方式所述的技术方案，而以权利要求所述的保护范围为准。
权利要求
1.一种重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特征在于步骤如下(1)构建重组表达质粒抽取人外周血细胞中RNA，逆转录合成cDNA得到人源LECT2蛋白基因序列，登录号为 NM002302,以此为模板设计引物进行PCR扩增人源LECT2蛋白，将含人源LECT2基因的PCR 扩增产物用限制性内切酶&oRI和^μI双酶切，将用相同限制性内切酶和^ΜI双酶切的质粒PPICZ α A与酶切后的PCR产物用Τ4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌Dffia中， 得到重组表达质粒pPICZ α -LECT2 ；(2)筛选高表达重组工程菌株将重组表达质粒？？扣2(1-1^012经5^1酶切后，将感受态毕赤酵母Χ33细胞与经Mel 酶切线性化的重组表达质粒pPICZ α -LECT2按比例16ul Iug混合后，进行电击转化获得转化子，将转化子经博莱霉kocin高抗性筛选及PCR鉴定，阳性克隆为重组工程菌X33/ pPICZ α -LECT2 ；将获得的博莱霉高抗性重组工程菌株Χ33/ pPICZ α -LECT2接种于BMGY培养基中，培养至0D600达2. 0 6. 0收集细胞，重悬于BMMY培养基中，0. 5%甲醇诱导表达，上清液用SDS-PAGE蛋白电泳及Wfestern blot免疫印迹鉴定分析，筛选表达水平为60_70mg/ L的菌株，得到高表达重组工程菌株；(3)高表达酵母菌株扩大培养将高表达重组工程菌株接种于IOOmL BMGY培养基生长，30 °C培养22-26小时直至 0D600达2. 0 6. 0，1500rpm离心5min收集菌体，然后将菌体转入400mL BMMY培养基中进行甲醇诱导，0. 5%甲醇诱导表达，30°C继续培养70-75小时，每M小时补加一次甲醇，使毕赤酵母分泌表达重组人源LECT2蛋白；(4)重组人源LECT2蛋白的纯化收集步骤(3)扩大发酵后得到的上清液，经强阳离子交换柱层析，收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩后，再经superdex 75分子筛分离纯化，收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥，即得到纯度达95%以上的重组人源LECT2蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特征在于步骤(1)中PCR引物序列如下正向引物为 5’ -GGAATTCGGGCCATGGGCTAATATATG-3，，反向引物为 5，-GGGTACCCAGGTATGCAGTAGGGTCAC-3，。
3.根据权利要求1所述的重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特征在于步骤(2)中所述的感受态毕赤酵母X33的制备方法如下将毕赤酵母X33接种于YPD 培养基中，30°C振荡培养至0D600为1. 3-1. 5，离心收集菌体，用预冷无菌水和1 mol/L山梨醇各洗一次，最后用1 mol/L山梨醇200 μ L悬浮，即得到Χ33感受态毕赤酵母。
4.根据权利要求1或3所述的重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法， 其特征在于步骤(2)具体过程如下(1)电击转化感受态毕赤酵母Χ33获得转化子将80 μ L感受态毕赤酵母Χ33细胞和5 μ g SacI酶切线性化的重组表达质粒混合，在 1500ν，25μΡ，20(Μ条件下电击转化，用浓度为1 mol/L山梨醇悬浮，30°C静置1小时，再加入YPD培养基，振荡培养3小时得到转化液，将转化液涂布含100μ g/ml博莱霉kocin的 YPDS平板，30 °C培养3 4天，得到大量转化子；(2)博莱霉高抗性重组工程菌株X33/pPICZ α -LECT2的制备将转化子点到含1000 μ g/ml博莱霉的YPDS培养基上，获得博莱霉高抗性菌株，将博莱霉高抗性菌株的菌落置于无菌水中，混勻并煮沸，离心后取上清进行PCR扩增，阳性克隆获得博莱霉高抗性重组工程菌株X33/ pPICZ α -LECT2 ；(3)高表达重组工程菌株的制备将博莱霉高抗性重组工程菌株Χ33/ 扣2(1-1^012接种于51^ BMGY培养基中，30 V 培养22-26小时至0D600达2. 0 6. 0，1500rpm离心5min收集菌体，用40 mL BMMY培养液悬浮菌体，0. 5%甲醇诱导表达，30°C继续培养70-75小时，每M小时补加一次甲醇，取发酵液离心，上清液用于12% SDS-PAGE蛋白电泳及Wfestern blot蛋白免疫印迹鉴定分析，筛选表达水平为60-70mg/L的菌株，得到高表达重组工程菌株。
5.根据权利要求1所述的重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特征在于步骤(4)具体如下收集步骤(3)扩大发酵后得到的上清液浓缩至10 mL后，上样强阳离子交换柱，以3.0 ml/min的流速洗脱，洗脱液为lmol/L氯化钠溶液，收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩至500ul后，上样superdex 75分子筛层析柱，以1. 0 ml/min的流速洗脱，洗脱液为lOOmmol/L碳酸铵溶液，收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥，即得到纯度达95%以上的重组人源LECT2蛋白。
全文摘要
本发明公开了重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，特点是包括将人工合成的人源LECT2基因插入胞外表达载体pPICZαA中构建重组表达质粒的步骤；酶切线性化后电击导入毕赤酵母X33中，获得重组工程菌株的步骤；经过摇瓶发酵和甲醇诱导，实现重组人源LECT2蛋白的分泌表达的步骤；再利用柱层析进行纯化制备得到纯度为95%以上的重组人源LECT2蛋白的步骤，优点是首次提出了重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中得分泌表达和纯化制备方法，采用毕赤酵母大量表达高活性的重组人源LECT2蛋白，具有稳定、产量高、活性强等优势，可用于制药和诊断检测。
文档编号C07K1/18GK102559739SQ20121001877
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者史雨红, 李明云, 李长红, 章瑞程, 陆新江, 陈炯 申请人:宁波大学