专利名称：重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质的化学修饰，尤其是涉及一种重组人促红素的连续聚こニ醇化反应方法。
背景技术：
重组人促红细胞生成素(简称EP0)，是保护和促进骨髓中造血干细胞分化、増殖和成熟为红细胞的特异性造血因子，由美国安进公司首先开发上市，在临床上用于治疗各种肾性贫血和非肾性贫血，被称为迄今技术最成熟、疗效最确切和全球销售额最高的基因エ程药物。不过，该药物存在用药频繁(每周ー针或三针)和生物活性低等主要问题，给患者带来较大的治疗痛苦和生活不便，因此有进一步修饰改良的需要，也就是开发长效化EPO药物。目前，国际上比较成熟的长效EPO药物之一，就是美国安进公司开发上市的第二代EPO 制剂“Aranesp”，其半衰期比第一代EPO延长了 2倍，可以实现每周只需注射I次的治疗方案，自上市以来，受到医院和病人的欢迎，在2008年的年销售额已达10亿美元以上，并超过了第一代EPO的市场年增长率。同时，聚こニ醇化(PEG化)作为ー种很有效的制备长效蛋白质药物的化学修饰途径，也已应用于长效EPO药物的制备。以瑞士罗氏公司于2007年8月上市的“Mircera”为例，其药物活性成分就是单取代的PEG化EPO (mPEG-EPO),该药物拥有比“Aranesp”更为持久的半衰期，达到了大约134小时，可以实现毎月只需注射2次或I次的治疗方案，进ー步压缩了常规EPO药物的市场份额，形成了“长效、高活性、低治疗成本”的药物特点和竞争优势，从而显著地降低患者的治疗痛苦和经济负担，有效地提高了患者的生活质量。而在PEG-EPO药物的研发过程中，PEG-EPO的合成反应エ艺是非常关键的技术。一个好的PEG-EPO合成エ艺可以显著地减低PEG-EPO药物的生产成本，同时直接影响到了最终所得PEG-EPO药物的生物活性以及药效。目前在国际上，比较成功的PEG-EPO药物是罗氏上市的“ Mircera”，其合成エ艺的单取代反应率大约在40%左右，同时多取代产物含量达到38%，其中的单取代产物是PEG-EPO合成反应的目标产物，具有较为确定的分子结构和较高的药物活性，而多取代产物则是反应的副产物，会加大后续纯化工艺的难度。此外，相比已有的其它PEG化蛋白质药物，EPO具有9个反应位点(如图I所示)，包括8个赖氨酸残基和N端氨基，在反应中容易形成多取代产物，更难于实现特异性定点PEG化合成。以罗氏的PEG-EPO药物为例，其最终形成制剂的单取代PEG-EPO药物是由三种以上不同取代位置的单取代产物组成的，其主要的取代位置分别是氮端氨基酸、52位赖氨酸和45位赖氨酸。因此，PEG-EPO合成エ艺的重点和难点在于提高单取代率，同时降低多取代率，以利于后续纯化工艺。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种单取代率高、多取代率低的重组人促红素的连续聚こニ醇化反应方法。
本发明的目的是通过以下技术措施实现的，一种重组人促红素的连续聚こニ醇化反应方法，其中，EPO分子在第一种缓冲液中完成第一次PEG化反应后至少还包括以下步骤将第一次PEG化反应的反应液在与第一种缓冲液不同的第二种缓冲液中进ー步加入PEG进行第二次PEG化反应，得到最终反应液。为了使单取代率更高，在得到最終反应液前还包括以下若干步骤将前一次PEG化反应的反应液在与第一种缓冲液不同的缓冲液中进ー步加入PEG进行后一次PEG化反应。作为ー种优选方式，在得到最終反应液前还包括以下步骤将第二次PEG化反应的反应液在与第一种缓冲液不同的第二种缓冲液或第三种缓冲液中进ー步加入PEG进行第三次PEG化反应。具体的，所述第一种缓冲液包括pH6. 5 7. 5的磷酸缓冲液，所述与第一种缓冲液不同的缓冲液包括与第一种缓冲液PH值不重叠的pH6. 0 9. 0的磷酸缓冲液、pH7. 4
9.0的硼砂缓冲液、pH9. 0 12的硼砂-氢氧化钠缓冲液或pH4. 5 7. 0的醋酸缓冲液。更具体的，所述第一种缓冲液包括pH7. 2的磷酸缓冲液，所述与第一种缓冲液不同的缓冲液包括PH7. 4的磷酸缓冲液、pH7. 4的硼砂缓冲液、pH9. 3的硼砂-氢氧化钠缓冲液或PH5.8的醋酸缓冲液。一种优选的反应条件，所述PEG化反应方法包括将PEG与EPO混合反应至少2小时，反应pH值为7.0 7. 5，所述PEG与EPO的摩尔比为10 25 I，所述PEG中聚こニ醇的分子量为30，000 40，000道尔顿。具体的，所述PEG与EPO的摩尔比为10 25 I为全部PEG化反应步骤中PEG与EPO的摩尔比。具体的，所述PEG化反应方法包括将PEG与EPO混合反应为2. 5小时。作为进一歩提高单取代率的方式，还包括在最终反应液中纯化单取代PEG-EPO的步骤将最终反应液经疏水层析纯化得到单取代PEG-EPO与PEG的混合物，再从单取代PEG-EPO与PEG的混合物中分离得到单取代PEG-EP0。PEG-EPO合成エ艺之所以单取代率低、多取代率高，是因为在第一次PEG化反应以后，所得PEG-EPO反应液具有较高的稳定性，未反应的EPO原液很难进一歩与新加入的PEG试剂发生二次PEG化反应。其原因在于反应液中已经水解失去活性的PEG试剂，在EPO分子周围形成的空间位阻很大，阻止了新加入的带有反应活性的PEG试剂与反应液中的游离的EPO分子的相互反应。同吋，已经被单取代或多取代的EPO分子中可供修饰的氨基数目也变少了，并且剩下的位点比较难被修饰。依据缓冲液可改变蛋白质构象或封闭某些反应部位的原理，在试验中发现，在相同的PH值范围内，采用不同的缓冲体系进行修饰反应，所得反应效果有很明显的差別。这应该是由于在不同的缓冲环境中，PEG与EPO分子的氨基结合位点不同，同时在离子类型不同的缓冲液中，EPO分子各赖氨酸残基所处的微环境不同，即PEG与各氨基结合的难易程度不同。通过更深入的实验研究，我们进一歩发现，在EPO分子完成第一次PEG化反应以后，往所得反应液体系中，加入适量的另ー种缓冲液，可以非常有效地降低溶液中游离EPO分子所受到的PEG分子的位阻作用，从而为EPO分子的第二次，乃至多次PEG化反应提供了合适的反应条件。在此基础上，我们已经成功地实现了 EPO的二次、三次，乃至四次PEG化反应，建立了一种新的PEG-EPO的制备方法，所得单取代产物的收率较高，并显著地降低了多取代产物的形成。同吋，紫外光谱测试、电泳测试、唾液酸测试和体外活性测试等测试结果表明，所得PEG-EPO单取代产物很好地保留其生物活性和蛋白质分子结构。因此本发明创造性地应用了多缓冲体系的反应方法，实现了 EPO的可连续PEG化反应，建立了ー种具有较高单取代率、较低多取代率的反应方法。
图I为EPO分子的氨基酸序列图；图2为纯化产物mPEG-EPO的SEC-HPLC分析图谱；图3为纯化产物mPEG-EPO的紫外光谱分析结果(从上到下M-PEG-SCM聚合物样品；EP0原液样品；纯化产物mPEG-EPO样品)；
图4为纯化产物mPEG-EPO的电泳分析结果(从左到右EP0原液样品；分子量Marker样品；M_PEG_SCM聚合物样品；纯化产物mPEG-EPO 样品)。
具体实施例方式下面结合相关实验和具体实施例并对照附图对本发明作进ー步详细说明。在实验和具体实施例中使用了两种PEG试剂都来自北京键凯科技有限公司，分别是35KD的GLUC-PEG-NHS (葡萄糖聚こニ醇NHS酷)，以及35KD的M-PEG-SCM (甲氧基聚こニ醇こ酸酷)。所用的EPO原液，由深圳赛保尔生物药业有限公司制备。实验ー PEG-EP0反应液成分含量的长期稳定性用15ml塑料离心管，加入I. 63ml EPO原液(EP0含量3. 07mg/ml)，以及3. 37mlpH7. 5的40mM磷酸缓冲液，EPO的终浓度为lmg/ml。准确称量109. 4mg GLUC-PEG-NHS，加入1094 ill 2mM且pH3. 0的磷酸缓冲液溶解。溶解后，将GLUC-PEG-NHS溶液全部加入EPO中，试纸测定EPO溶液的pH为7. 5。反应混合液放置于振荡器上，室温振荡反应2. 5小吋。反应完毕后，取样作SEC-HPLC检测。SEC-HPLC检测条件如下SEC-HPLC 柱GE superpose 6 分析柱流动相PBS缓冲液HPLC 仪岛津 HPLC，PDA 检测器，LC solution 工作站检测波长280nm上样量20ill流速0.5ml/min所得PEG-EPO反应液未经进ー步处理，封闭保存于4°C冰箱中，在20个月后，重新取样作SEC-HPLC检测。结果列于表I。表1PEG-EP0反应液成分含量的长期稳定性考察的SEC-HPLC检测结果
权利要求
1.一种重组人促红素的连续聚こニ醇化反应方法，其特征在于EPO分子在第一种缓冲液中完成第一次PEG化反应后至少还包括以下步骤将第一次PEG化反应的反应液在与第一种缓冲液不同的第二种缓冲液中进ー步加入PEG进行第二次PEG化反应，得到最終反应液。
2.根据权利要求I所述的连续聚こニ醇化反应方法，其特征在于在得到最終反应液前还包括以下若干步骤将前一次PEG化反应的反应液在与第一种缓冲液不同的缓冲液中进ー步加入PEG进行后一次PEG化反应。
3.根据权利要求2所述的连续聚こニ醇化反应方法，其特征在于在得到最終反应液前还包括以下步骤将第二次PEG化反应的反应液在与第一种缓冲液不同的第二种缓冲液或第三种缓冲液中进ー步加入PEG进行第三次PEG化反应。
4.根据权利要求I或2或3所述的连续聚こニ醇化反应方法，其特征在于所述第一种缓冲液包括PH6. 5 7. 5的磷酸缓冲液，所述与第一种缓冲液不同的缓冲液包括与第一种缓冲液PH值不重叠的pH6. 0 9. 0的磷酸缓冲液、pH7. 4 9. 0的硼砂缓冲液、pH9. 0 12的硼砂-氢氧化钠缓冲液或pH4. 5 7. 0的醋酸缓冲液。
5.根据权利要求4所述的连续聚こニ醇化反应方法，其特征在于所述第一种缓冲液包括pH7. 2的磷酸缓冲液，所述与第一种缓冲液不同的缓冲液包括pH7. 4的磷酸缓冲液、PH7. 4的硼砂缓冲液、pH9. 3的硼砂-氢氧化钠缓冲液或pH5. 8的醋酸缓冲液。
6.根据权利要求I或2或3所述的连续聚こニ醇化反应方法，其特征在于所述PEG化反应方法包括将PEG与EPO混合反应至少2小时，反应pH值为7. 0 7. 5，所述PEG与EPO的摩尔比为10 25 1，所述PEG中聚こニ醇的分子量为30,000 40，000道尔顿。
7.根据权利要求6所述的连续聚こニ醇化反应方法，其特征在于所述PEG与EPO的摩尔比为10 25 I为全部PEG化反应步骤中PEG与EPO的摩尔比。
8.根据权利要求6所述的连续聚こニ醇化反应方法，其特征在于所述PEG化反应方法包括将PEG与EPO混合反应为2. 5小时。
9.根据权利要求I或2或3所述的连续聚こニ醇化反应方法，其特征在于还包括在最終反应液中纯化单取代PEG-EPO的步骤将最终反应液经疏水层析纯化得到单取代PEG-EPO与PEG的混合物，再从单取代PEG-EPO与PEG的混合物中分离得到单取代PEG-EP0。
全文摘要
本发明涉及蛋白质的化学修饰，公开了一种重组人促红素的连续聚乙二醇化反应方法，其中，EPO分子在第一种缓冲液中完成第一次PEG化反应后至少还包括以下步骤将第一次PEG化反应的反应液在与第一种缓冲液不同的第二种缓冲液中进一步加入PEG进行第二次PEG化反应，得到最终反应液。本发明应用多缓冲体系的反应方法，实现了EPO的可连续PEG化反应，建立了一种具有较高单取代率、较低多取代率的PEG化反应方法。
文档编号C07K17/08GK102746405SQ20121025754
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者吴园园, 张向荣, 张涤平, 盛光阳, 郑崇吉, 陈贤光, 黎雄辉 申请人:深圳赛保尔生物药业有限公司