专利名称：一种接骨木果实中花青素的提取方法
技术领域：
本发明涉及植物有效部位提取技术领域，具体涉及一种接骨木果实中花青素的提取方法。
背景技术：
接骨木属Sambucus L.系忍冬科Caprofoliaceae植物，全世界约20种，分布于温带和亚热带地区，我国约有5种忍冬科接骨木属，分别为血满草S. adnata Wall, ex DC.、接骨草 S. chinensis Lindl·、接骨木 S. williamsiiHance、西伯利亚接骨木 S. sibiricaNakai、西洋接骨木S.nigraLinn.，南北各省、区均有分布。该属植物具有祛风利湿，舒筋活血之功效，我国民间广泛用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、骨折、黄疸、荨麻疹和水肿。现在接骨木果实中花青素等天然化合物的提取方法是取接骨木新鲜果实经破碎 后，先去除果实中的籽，再将剩余的果皮与适量含水低级乙醇在容器内充分混合均匀，用盐酸调PH4后，在常温下浸泡提取2小时，提取液经过滤、浓缩回收乙醇后得浓缩浸膏，浓缩浸膏经干燥后得到接骨木果实提取物。现有技术存在的问题是①原料处理麻烦，需要脱籽才能进行下道工序，因此不适宜大规模工业化生产提取方法粗糙，提取后的产物为未经分离纯化的粗品，产品回收率低，目标成分含量低，以花青素回收率计为85%，但其中花青素含量只有4 5%;③产品色泽差(棕褐色)，不利于产品的应用。
发明内容
本发明的所要解决的技术问题是提供一种接骨木果实中花青素的提取方法，本发明采用逆流提取法，能够更加充分地对花青素成分进行提取，与现有技术方法相比具有原料处理更加容易、节省溶剂、提取效率高、成本低等特点，适于工业化生产。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是一种接骨木果实中花青素的提取方法，依次包括下述步骤步骤(I )，将原料清洗后，低温粉碎；和步骤(2)，将粉碎后的原料加入3-6重量/体积倍量、PH值为3-6、质量百分数为10-30%的乙醇水溶液，25-50°C下逆流提取3-6h ;以及步骤(3 )，收集提取液，减压浓缩，得接骨木果实花青素提取物。上述步骤(2)中，乙醇水溶液加入量优选为4. 5重量/体积倍量，PH值优选为4，乙醇质量百分数优选20% ;温度优选为40°C ;提取时间优选为4h。本文所述的重量/体积倍量是指按重量或者体积计算，乙醇水溶液相对于原料的倍数。本发明与现有技术相比，具有如下优点( I)本发明采用逆流提取法，能够更加充分地对花青素成分进行提取，与现有技术方法相比具有原料处理更加容易、节省溶剂、提取效率高、成本低等特点，适于工业化生产。(2)本发明制备得到的接骨木果实花青素提取物在减少嗜酸粒细胞方面显示出较好的效果，即其可以有效地用于预防和治疗由过多的嗜酸粒细胞而引起的各种疾病。(3)本发明制备得到的接骨木果实花青素提取物可以作为细胞凋亡诱导剂、抗过敏、抗炎和保健食品。
图I是乙醇的质量百分数(％)与浸出液花青素含量(g)的关系图。图2是接触时间(h)与浸出液花青素含量(g)的关系图。图3是温度(V )与浸出液花青素含量(g)的关系图。图4是本发明一种接骨木果实中花青素的提取方法使用的装置的示意图。
具体实施例方式一、提取工艺条件考察I、浸出条件实验(I)乙醇浓度对花青素化合物浸出效果的影响工业生产中，由于原料中常含有一定的水分，乙醇经循环使用后亦含有一定水分，乙醇浓度对花青素化合物的浸出存在很大的影响，故以不同浓度乙醇液对花青素物质进行浸出实验，以花青素含量跟踪分析。在乙醇浓度对从原料中浸出花青素的影响实验中，分别取5份原料，每份40. OOg,进行实验，以不同浓度的乙醇水溶液各180. OOml,调PH值为4，浸提6h，比较所得花青素的量如图I所示。由图I可知，相同条件下，浸出能力强弱依次为20% >15% >25% >10% >30%，因此，选择20%乙醇水溶液作为浸出剂。(2)接触时间对花青素化合物浸出效果的影响分别取6份原料，每份40. OOg,各加入浓度为20%的乙醇液180. 00ml，调PH值为4，进行浸出，接触时间分别为lh，2h，3h，4h，5h，6h，其浸出结果如图2所示。由图2可知，室温下(26°C )，浸出时间为4h，浸出反应基本达到平衡；延长浸出时间，浸出率基本不变。(3)温度对花青素化合物浸出效果的影响分别取6份原料粉料，每份40. OOg,各加入180. OOml浓度为20%的乙醇液，调PH
值为4. O在不同的温度下浸出，浸出时间为2h，取样检测浸出液中花青素含量，结果如图3所示。由图3可知，随着浸出温度的增加，花青素的浸出率也相应的增加；在温度达到40°C时，增加温度，花青素的浸出率增加趋于缓慢。2、四段逆流渗漉法(工艺简图见图4)共安装了 6根Φ 25. 4mmX IOOOmm玻璃括口管，做为四段逆流渗漉浸出实验的浸出器(浸出柱)，其中四根运行，两根做周转用。每根柱中装入150. OOg接骨木果实原料粉碎料(简称原料，以下同)，用计量泵将浸出剂(10-30%乙醇水溶液)，以约5ml IirT1的流量打入第一根浸出柱中，乙醇液以约Icm · HiirT1速度渗漉，当第一柱流出450ml浸出液后，将第一柱与第二柱接通。计量泵打入的新浸出剂经第一柱，流出进入第二柱；与上相同，当第二柱流出450ml黑色浸出液后，将第二柱与第三柱接通。依此类推，等到第四根柱流出450ml流出液后，将第四根柱与第五根柱接通。同时，将计量泵出口管从第一柱上端移至第二柱上端与第二柱接通(第一柱从系统中撤出)。此时，新的浸出剂，经计量泵进第二柱，经三、四、五柱后，从第五柱流出，同样取450ml浸出液；此后，新浸出剂进第三柱，从第六柱出浸出液。依此类推，不断循环进行四段逆流渗漉浸出实验至达到浸出平衡。本试验中第九柱开始至第十二柱止，这四根柱流出的浸出液已近似平衡时的浸出液，故当新的浸出剂从从第九根柱进，经十、^ 、十二柱，而从第十二柱下流出450ml黑色浸出液后,停止浸出试验。将九、十、十一、十二柱流出的浸出液取样，送检，测定接骨木果实浸出液花青素的含量。(注柱体均为循环使用，九，十，十一，十二仅代表标号，不具实际意义)3、四段逆流渗漉浸出试验结果如上述的逆流法进行试验。每份样品为150. Og,以20%乙醇为浸出液，调PH值为么仙^下浸提处’液固比为*』。取九、十、十一、十二柱流出的浸出液进行测定，其结果如表I所示。所述液固比是指乙醇水溶液相对于样品的质量或者体积倍数。表I四段逆流渗漉浸出试验结果
浸出柱号浸出液体积浸出花青素总量浸出花青素总量平均值浸出率(平均值)
(ml)(mg)(mg)(%)
~94500588.96
10450.0589.17589.0
I450.0589.28
12450.0588.59从表I可知，接骨木果实中花青素含量以O. 41%计，则四段逆流渗漉浸出法(以浸出液计)其浸出率达到95. 77% (以花青素计)。二、实施例以下通过具体实施例，对本发明作进一步的详细描述。实施例I :将500克原料清洗后，低温粉碎，将粉碎后的原料加入3重量/体积倍量、PH值为
6、质量百分数为10%的乙醇水溶液，50°C下逆流提取6h，收集提取液，减压浓缩，得接骨木果实花青素提取物19. 16克。实施例2将500克原料清洗后，低温粉碎，将粉碎后的原料加入4. 5重量/体积倍量、PH值为4、质量百分数为20%的乙醇，40°C下逆流提取4h，收集提取液，减压浓缩，得接骨木果实花青素提取物19.51克。实施例3将500克原料清洗后，低温粉碎，将粉碎后的原料加入6重量/体积倍量、PH值为3、质量百分数为30%的乙醇，25°C下逆流提取3h，收集提取液，减压浓缩，得接骨木果实花青素提取物19. 03克。实施例4嗜酸粒细胞性细胞凋亡诱导试验和MBP激酶活性实验嗜酸粒细胞性细胞凋亡诱导试验试验根据Vermes等的方法(Journal ofImmunological Methods 184卷39-51页1995年)进行。使嗜酸粒细胞性细胞HL-60细胞悬浮于RPMI1640培养基中，细胞浓度为1-3X IO6细胞/ml。向该细胞悬浮液500 μ I中添加被检测物质(上述实施例1-3中最后收集得到的接骨木果实提取物)或培养基，使接骨木果实提取物在细胞悬浮液中的浓度为 οομ g/ml，在37°C、5% CO2的条件下培养6小时或24小时。离心洗净后,加入磷脂酞结合蛋白(Annexin)V缓冲液,然后添加5ul磷脂酞结合蛋白V-FITC。通过流动血细胞计数法，以磷脂酞结合蛋白V阳性细胞作为细胞凋亡诱导细胞，用相对总细胞数的百分比评价。MBP激酶活性试验试验根据De Souza等的方法(Blood 99卷3432-3438页2002年)进行。将嗜酸粒细胞性细胞HL-60细胞悬浮于RPMI 1640培养基，细胞浓度为1_3X IO6细胞/ml。该细胞悬浮液500 μ I中添加被检测物质或培养基，使浓度为100μ g/ml，在37°C、5% CO2的条件下培养6小时或24小时。离心洗净后，添加可溶解缓冲液，溶解细胞，使用含有MBP 5mg/ml的凝胶进行电泳。凝胶经脱变性、再变性处理后，用32P-ATP标记，实施3小时的磷酸化反应。凝胶干燥后，使用图象分析仪解析放射活性。在36kDa生长出标记带时，记做MBP激酶活化阳性(+)。接骨木果实花青素提取物在HL-60细胞中观察到了浓度依赖性的细胞凋亡诱导。 另外进行凝胶MBP激酶分析(In-gel MBP kinase assay)时,接骨木果实花青素提取物激活36kDa MBP激酶。以上结果提示。接骨木果实花青素提取物对嗜酸粒细胞能诱导细胞凋亡，该细胞凋亡与36kDa MBP激酶有关。由此推断本发明接骨木果实花青素提取物中含有可以用于抗嗜酸粒细胞性炎症作用药物的成分。所得结果如下表2所示确认实施例2和3具有强的细胞凋亡诱导活性，并伴有MBP激酶的活化。表 权利要求
1.一种接骨木果实中花青素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤(I)，将原料清洗后，低温粉碎；和 步骤(2)，将粉碎后的原料加入3-6重量/体积倍量、PH值为3-6、质量百分数为10-30%的乙醇水溶液，25-50°C下逆流提取3-6h ;以及 步骤(3)，收集提取液，减压浓缩，得接骨木果实花青素提取物。
2.如上述权利要求I所述的一种接骨木果实中花青素的提取方法，其特征在于所述步骤(2)中，将粉碎后的原料加入4.5重量/体积倍量、PH值为4、质量百分数为20%的乙醇水溶液，40 V下逆流提取4h。
全文摘要
本发明公开了一种接骨木果实中花青素的提取方法，包括以下步骤步骤(1)，将原料清洗后，低温粉碎；和步骤(2)，将粉碎后的原料加入3-6重量/体积倍量、PH值为3-6、质量百分数为10-30％的乙醇水溶液，25-50℃下逆流提取3-6h；以及步骤(3)，收集提取液，减压浓缩，得接骨木果实花青素提取物。本发明所采用逆流提取法，能够更加充分地对花青素成分进行提取，与现有技术方法相比具有原料处理更加容易、节省溶剂、提取效率高、成本低等特点，适于工业化生产。
文档编号C07D311/62GK102807544SQ20121027932
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月7日 优先权日2012年8月7日
发明者季进军 申请人:宁波杰顺生物科技有限公司