专利名称：一种利用单克隆抗体技术生产孕马血清促性腺激素的方法
技术领域：
本发明涉及生物小分子提取纯化技术领域，特别涉及一种利用单克隆抗体技术生产孕马血清促性腺激素的方法。
背景技术：
孕马血清促性腺激素(Pregnant Mare Serum Gonadotropin,缩写PMSG)分子由 α及β亚基组成，α亚基由96个氨基酸组成，β亚基由149个氨基酸组成，分子量大致为39500 (决定于含糖量)，含糖量为45%左右，其中唾液酸为10. 8% 12. 1%，等电点PI2.6-2. 65，易溶于水，干燥时稳定。PMSG具备用于牲畜繁殖中促卵泡素及黄体生成素的双重性质，对雌性动物可促进卵巢中卵泡发育及黄体生成，对雄性可促进睾丸精细管中精子生成及睾丸间质细胞分泌。
我国具有丰富的马匹资源，采集50-120天的健康孕血，其中含高滴度的激素，提纯后可用于动物繁殖、品种改良及生物技术研究方面，用途广泛。随着我国畜牧业由粗放型向集约化发展，特别是当前国家推广的工厂化高效养殖中，PMSG在工厂化高效养羊(牛)配套技术中，用于超数排卵(可使单胎动物产双胎或多胎)、同期发情(规模化生产中的关键技术)、同期受孕，大大提高生产效率，便于管理和操作，因此受到学术界和用户的高度重视和欢迎，展现了极好的市场前景。既解决了因过度放牧而造成草场退化的生态环境保护问题，又实现了高效生产，用户收益大幅度增加，兼顾了经济效益和社会效益，保护了生态环境。
目前，现有的PMSG制备工艺需严格控制酸沉淀、盐析、低温酒精沉淀的各种提取参数，生产工艺繁琐，劳动强度大，技术方法不够先进，严重制约了 PMSG的生产和应用。如中国专利CN1872088A公开了一种兽用血促性素生产工艺，取孕马血清用等量蒸馏水稀释， 边搅拌边加固体硫酸铵，用浓氨水调ΡΗ，充分搅拌后，滤布过滤，清液滴加偏磷酸调pH，滤布过滤。清液经中空纤维超滤器浓缩，使体积浓缩至原体积的40 50%左右，缓慢加入预冷酒精，使40%乙醇沉淀，用浓氨水调pH，静止分层后，虹吸上清，加预冷医用酒精，用冰醋酸调ΡΗ，静止分层后，虹吸法吸弃上清，剩余的部分混浊液离心取沉淀。将此沉淀用生理盐水溶起，透析，酒精沉淀，沉淀物置干燥器中负压抽气至干燥。该工艺用到酸处理，多次使用乙醇，导致部分促性腺激素蛋白失活，且整个工艺流程较长，增加了促性腺激素蛋白丢失， 所以回收率较低(平均活性回收率为60%)。发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目在于建立一种基于抗体亲和层析的高效孕马血清促性腺激素纯化方法，用于规模化生产孕马血清促性腺激素。
本发明的目的是这样实现的
—种利用单克隆抗体技术生产孕马血清促性腺激素的方法，包括如下步骤
(I)制备抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体；
(2)制备抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体的免疫亲和层析柱；
(3)通过抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体的免疫亲和层析柱纯化孕马血清促性腺激素。
所述的利用单克隆抗体技术生产孕马血清促性腺激素的方法，优选包括如下步骤
(I)制备抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体用孕马血清促性腺激素免疫BALB/ c小鼠，再用免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体的杂交瘤细胞，体内接种杂交瘤细胞，制备腹水，腹水离心除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清液后采用protein A亲和层析柱，或者辛酸-硫酸铵沉淀法纯化出抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体；
(2)制备抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体的免疫亲和层析柱将步骤(I)所得抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体与活化的Sepharose2B或Sepharose4B连接,得免疫亲和层析柱；
(3)通过抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体的免疫亲和层析柱纯化孕马血清促性腺激素取孕马血清，上样所述免疫亲和层析柱，依次用O. IM Na2HPO3,0. 15M NaCl，pH 7. 5 溶液洗去杂蛋白，用O. IM Tris-醋酸，2. OM NaCl，pH7. 7溶液洗脱并收集，收集液经O. OlM Na2HPO3,0. 15M NaCl，pH 7. 2溶液透析，过滤浓缩，得孕马血清促性腺激素纯品。
与现有技术相比，本发明涉及的孕马血清促性腺激素生产方法具有如下优点和显著进步
(I)免疫亲和层析柱利用抗原抗体特异结合，有效排除杂蛋白，一次性提纯孕马血清促性腺激素，所得孕马血清促性腺激素纯度高(25001u/mg以上，FPLC测定只一个峰， SDS-PAGE测定一条带)，质量好，收率高(90%以上)。
(2)条件温和，蛋白质变性少。由于本发明不使用乙醇、酸溶液等潜在使孕马血清促性腺激素变性的溶剂，因此能有效保护孕马血清促性腺激素的天然状态，蛋白质变性少。
(3)生产工艺简单，生产成本低。虽然本发明用到较贵的ProteinA-Sepharose CL-4B,Sepharose2B,单克隆抗体制备技术等,但由于免疫亲和层析柱可反复使用(使用25 次以上未出现明显的柱效降低)，因此实际综合成本降低。应用免疫亲和层析一步就可得到孕马血清促性腺激素，所以有效地减少了生产步骤，减少了废水排放，有效减少了环境污染。
(4)有利于利用孕马血清进一步开发其他产品。本发明以含有多种蛋白质及血液因子的马血浆为原料，通过免疫亲和层析纯化技术获得了高纯度的孕马血清促性腺激素后，剩余血清由于保持天然状态，仍可用于其他血液因子提取，比如马血清白蛋白的纯化， 所以本发明显著提高了原料利用价值。
具体实施方式
以下是本发明的具体制备例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
本发明以孕马血清为原料，用促性腺激素单克隆亲和层析柱一次性分离纯化出促性腺激素。亲和层析柱制备采用常规小鼠免疫及单克隆抗体筛选技术，得到的单克隆抗体与活化的Sepharose2B、Sepharose4B连接制成免疫亲和层析柱,孕马血清通过亲和层析柱后促性腺激素被吸附到亲和层析柱上，然后经高盐溶液洗脱，透析，一次性纯化出促性腺激素。
实施例I利用单克隆抗体技术生产孕马血清促性腺激素
A、制备抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体
(I)动物免疫
应用常规方法免疫BALB/c小鼠18_24g，多点皮下注射1000IU/ml的PMSG O. 3ml， 多次免疫后取眼球血做抗体滴度测定，从中选出产生高滴度(> I : 9000)抗体的小鼠用于杂交瘤制备。
(2)细胞融合
从免疫30天后的小鼠脾脏分离出脾细胞并与对数期骨髓瘤细胞SP2/0按4 I混合，加入50 % PEG6000处理45秒以促进融合形成杂交瘤细胞，处理后的细胞经稀释后置于 HAT培养液中，铺到96孔板及24孔板中，在含5% C02，37 °C条件下培养，融合7-8天后琼脂单扩法筛选抗体生成孔，细胞经多次传代后形成单克隆.
(3)杂交瘤细胞筛选
通过间接ELISA法筛选出产生高单位(滴度> I : 10000)，特异性强的单克抗体杂交瘤细胞株，保存于液氮中。
(4)动物免疫及大量抗血清制备方法
取BALB/c小鼠18_24g预先注入降值烷，7_10天后腹腔注入对数生长期的杂交瘤细胞Iml细胞浓度为7 X 106/ml，7-14天后待瘤细胞生长并分泌大量抗体形成腹水时收获腹水，4000rpm离心5分钟，去除细胞及杂质后得到抗血清。也可用连续体内杂交瘤细胞培养方法制备大量抗血清。即从小鼠体内得到腹水后，通过1200rpm离心7分钟及加入细胞分离液的方法，从中分离出杂交瘤细胞，以2-4X 107/ml浓度注射小鼠腹腔Iml/只，7_14天后收获腹水。每只小鼠可收到5-10ml腹水。
(5)抗体纯化
收集的腹水离心(4000rpm，5分钟)，除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清液后采用proteinA亲和层析柱,或者辛酸_硫酸铵沉淀法纯化出抗促性腺激素IgG。一般腹水中 IgG 可达 O. 5 10mg/ml。
辛酸-硫酸铵沉淀法按以下流程进行
20ml腹水中加入40ml醋酸缓冲液0. 06M ρΗ5· O稀释，用IM HCl调pH 4. 8，加入 660ul辛酸4°C处理2小时，15000g离心30分钟得上清液，过滤后加入1/10体积的PBS然后用IM NaOH调ρΗ7· 2随后加饱和硫酸铵至45%饱和度，沉淀I. 5小时，IOOOOrpm离心30 分钟沉淀溶于 PBS ρΗ7· 2 (含 0. 137 MNaCl，2. 6MKC1，0. 2mMEDTA)，抗体溶液 PBS 透析， IOOOOrpm离心30分钟，纯化的IgG。
该法简单易行,但对IgG3的回收率低,纯化效果不如protein A亲和层析。
protein A亲和层析纯化IgG法按以下流程进行
收集到的腹水经12000g离心15min得腹水上清液,然后过Protein A-Sepharose CL-4B柱(流速为lml/min), IgG结合到ProteinA-Sepharose CL-4B柱上，亲和层析柱经20mM PBS,O. 15M NaCl, ρΗ7. O洗去杂蛋白后，结合的IgG经O. 02Μ, ρΗ4. O的柠檬酸缓冲液洗脱，抗体溶液立即用1Μ，P H 9. O的tris-HCl缓冲液调整pH值至7. 0，得到抗体IgG。
protein A亲和层析纯化法的优点是protein A-Sepharose CL-4B柱具有良好的再生性，其耐受低PH反复处理的性能极佳，纯化后的单克隆抗体产率高，特异性强，且方法简便快捷。Protein A-sepharose cl_4b凝胶可再生后反复使用10-20次以上。
(6) ProteinA-Sepharose CL-4B 再生
先用10倍柱体积O. IM pH8. 6 tris含O. 5M NaCl溶液洗脱柱；再用10倍柱体积含O. 5M NaCl的O. IM pH4. 5醋酸缓冲液洗柱；0. IM pH8. O PBS平衡，4°C贮存。
B、亲和层析柱制备(处理Sepharose4B方法与Sepharose2B相同)
(I)活化亲和层析柱
在烧杯中倒入Sepharose2B(Amersham公司)乙醇液200ml,先用蒸懼水洗漆10 次，每次300ml，每次洗涤后都用过滤器抽干，然后加200ml的O. 2M Na2CO3 pH8. 3溶液于 Sepharose2B中，于室温滴加CNBr乙氰溶液6. 4ml，一分钟加完，摇动反应5分钟，快速过滤，去除 CNBr，活化后的 Sepharose2B 用 2000ml ImM HCl 洗，然后用 400ml O. ImM HCl 洗。
(2)抗体准备
从小鼠腹水收到并纯化后的抗体IgG溶液经O. IM Na2C03/0. 5MNaClpH8. 3透析后， 再于4°C离心100，OOOg I小时得纯化后的IgG溶液。
(3)抗体与亲和层析柱连接
20ml IgG 溶液(5mg/ml)+200ml Sepharose2B 于 4°C揽祥过夜，然后加 O. 05M 甘氛酸溶液屏蔽S印harose2B上剩余的活性位点后，得亲和层析柱200ml。
C、促性腺激素纯化
将收集到的妊妊娠45-120天的健康牧养母马血清2000ml，(ELISA测定效价为 50IU/ml)，加入200ml平衡后的亲和层析柱内，设置流速为O. 5ml/min，取前，中，后段流出液测定是否有PMSG流失。待上样完成后，用2000ml0. I M Na2HP03，0. 15M NaCl，pH 7. 5溶液洗去杂蛋白，214nM监测杂蛋白洗脱效果。然后用含O. IM Tris-醋酸，2. OM NaCl,pH7. 7 溶液400ml洗脱孕马血清促性腺激素，把收集到的促性腺激素溶液放入透析袋在O. OlM Na2HP03 O. 15M NaCl,pH 7. 2溶液中透析过夜。最后促性腺激素溶液分装成4ml/瓶，冷冻干燥后于低温2-8°C保存。共收集到92瓶，每瓶效价为1000IU.总收率为92%。
权利要求
1.一种利用单克隆抗体技术生产孕马血清促性腺激素的方法，包括如下步骤 (1)制备抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体； (2)制备抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体的免疫亲和层析柱； (3)通过抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体的免疫亲和层析柱纯化孕马血清促性腺激素。
2.根据权利要求I所述的利用单克隆抗体技术生产孕马血清促性腺激素的方法，其特征在于包括如下步骤 (1)制备抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体用孕马血清促性腺激素免疫BALB/c小鼠，再用免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选克隆获得分泌抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体的杂交瘤细胞，体内接种杂交瘤细胞，制备腹水，腹水离心除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清液后采用protein A亲和层析柱，或者辛酸-硫酸铵沉淀法纯化出抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体； (2)制备抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体的免疫亲和层析柱将步骤(I)所得抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体与活化的Sepharose2B或Sepharose4B连接,得免疫亲和层析柱； (3)通过抗孕马血清促性腺激素单克隆抗体的免疫亲和层析柱纯化孕马血清促性腺激素取孕马血清，上样所述免疫亲和层析柱，依次用O. IM Na2HP03,0. 15M NaCl，pH7. 5溶液洗去杂蛋白，用O. IM Tris-醋酸，2. OM NaCl，pH 7. 7溶液洗脱并收集，收集液经O. 01MNa2HP03，0. 15 M NaCl，pH 7. 2溶液透析，过滤浓缩，得孕马血清促性腺激素纯品。
全文摘要
本发明公开了一种利用单克隆抗体技术生产孕马血清促性腺激素的方法，该方法以孕马血清为原料，用促性腺激素单克隆亲和层析柱一次性分离纯化出促性腺激素，其中亲和层析柱为采用常规小鼠免疫及单克隆抗体筛选技术，得到单克隆抗体与活化的Sepharose2B连接制成的亲和层析柱，孕马血清通过亲和层析柱后促性腺激素被吸附到亲和层析柱上，然后经高盐溶液洗脱，透析，一次性纯化出促性腺激素。本发明将免疫亲和层析柱利用抗原抗体特异结合，有效排除杂蛋白，一次性提纯孕马血清促性腺激素，所得孕马血清促性腺激素纯度高，质量好，收率高。
文档编号C07K1/22GK102924586SQ201210366478
公开日2013年2月13日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者王勇, 王秀丽, 高飞 申请人:内蒙古博格农牧业开发有限责任公司