专利名称：一种齐墩果酸型皂苷的制备方法
技术领域：
本发明属于医药和化工技术领域，具体涉及一种天然植物中齐墩果酸型皂苷的制备方法。
背景技术：
齐墩果酸型皂苷是一种以齐墩果酸为苷元，3位和28位含有1-2条糖苷链取代基的五环三萜型皂苷。本类成分在多种天然植物中普遍存在，是传统药材甘草、远志、白头翁等植物中的主要有效成份和质量控制指标性成分。近年来，从常春藤、白头翁、银莲花、败酱、山萝卜等多种科属植物中发现大量齐墩果酸型皂苷，具有抗肿瘤、抗血吸虫、抗炎、抗病毒、免疫调节等多种药理活性，因而受到人们的关注。该类型单体皂苷的制备方法，成为其药理活性研究与新药开发的工作基础。·
齐墩果酸型皂苷在天然植物中常以多种性质相似的同系物共同存在，并与多酚、糖类等多种成分共存，因而分离纯化工作较为困难。已公开文献中一般均采用醇提、有机溶剂萃取、反复硅胶柱层析、碳十八反相硅胶高压半制备等多种分离技术联用以获得微量单体成分，但该分离方法步骤繁杂、工作量大，效率和得率低下，难以直接作为放大制备工艺。发明人在前期工作中，系统研究了白头翁中的皂苷制备方法，如3-0- a -L-吡喃鼠李糖-(I — 2) - a -L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元28-0- a -L-吡喃鼠李糖-(I — 4) - β -D-吡喃葡萄糖-(I — 6)-β -D-吡喃葡萄糖苷(简称ΡΒ5,中国专利申请号201010624574. 8)、23-羟基齐墩果酸-3-0-α -L-吡喃鼠李糖-(I — 2)-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(简称PA，中国专利申请号201010624822. 9)，银莲花中3-0- a -L-吡喃鼠李糖-(I — 2)[β-D-卩比喃葡萄糖-(I — 4)]-a-L_吡喃阿拉伯糖齐墩果酸皂苷(简称PB7，中国专利申请号201110291139. 2)，以及黄花败酱皂苷(中国专利申请号201110171840. O和201210073605. 4)等的制备方法，所述方法主要包括选取药材，经乙醇提取(需要时进行碱水解)，大孔树脂精制获得总皂苷，碳十八反相硅胶多重等度洗脱制备等步骤，最终获得相应单体皂苷。上述方法基本实现了目标成分的高效制备，但在规模化放大过程中，还存在一些不足之处(I)大孔树脂精制工艺中，提取物纯度一般大于50 %，但仍含有大量杂质，影响后续反相制备工艺纯化效率，精制产品纯度有待进一步提高；(2)反相柱层析纯化工艺中，多重等度洗脱工艺步骤较繁杂，同时设备自动化程度低、缺乏监测方法，放大制备时工艺可操作性较差。通过系统研究，进一步探索可行的产业化生产工艺，是有待解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种纯度大于90%、易于实现产业化的齐墩果酸型皂苷制备工艺。本发明提供的制备齐墩果酸型皂苷的方法包括以下步骤(I)选取含有齐墩果酸型皂苷的植物原料，采用水或乙醇-水混合溶剂进行提取，提取液合并，浓缩，过滤，或经水解处理后过滤，得植物提取液；(2)由⑴所得植物提取液，采用预处理好的大孔树脂进行吸附，再用乙醇-水混合溶媒按0-35%、40-80%、85-100%乙醇进行梯度洗脱，分别收集含有齐墩果酸型皂苷的相应洗脱部位洗脱液，浓缩，或重复多次经大孔树脂吸附和梯度洗脱、分别收集含有齐墩果酸型皂苷的相应洗脱部位，浓缩，干燥，得精制提取物；(3)由⑵所得精制提取物，采用加压柱色谱，以碳十八改性硅胶为填料，适宜比例甲醇-水为流动相进行洗脱，分别收集含有齐墩果酸型皂苷的相应流份，浓缩，干燥，即可获得纯度大于90%的相应齐墩果酸型皂苷成品。所述工艺步骤(I)中所述植物原料为白头翁、常春藤、银莲花、败酱、山萝卜等属植物中的任意一种，所述植物原料部位为根、茎、叶、根茎中的任意一种或多种，特征在于该植物中含有文献中已公开的所需齐墩果酸型皂苷目标成分或其前体成分。提取溶剂为水、乙醇-水中的任意一种。所述提取方法可为回流提取、超声提取、微波辅助提取、逆流提取中的任意一种。所述提取液浓缩后，可根据需要采用文献中已公开的碱法或酶法等适当方 法进行水解处理(例如中国专利申请号201110291139. 2，以及03133639. 6)，其中优选碱法水解。所述工艺步骤(2)中，所述大孔树脂为苯乙烯系或丙烯酸系树脂，其中优选丙烯酸系树脂或非极性苯乙烯系树脂或弱极性苯乙烯系树脂。所述乙醇-水混合溶媒优选按0-30%、50-75%、85-95%乙醇进行梯度洗脱，其中0-30%乙醇部位用于除去水溶性杂质，60-75%和85-95%乙醇两部位用于富集目标皂苷类成分、同时进一步除去其它杂质。所述树脂具体类型和梯度洗脱具体条件和洗脱剂用量可以根据目标产品特性、采用常规方法进一步优化，例如可参考史作清等文献方法(吸附分离树脂在医药工业中的应用.北京化学工业出版社，2008)进行工艺参数考察优化。所述含有齐墩果酸型皂苷的相应洗脱部位浓缩液可根据需要重复多次进行大孔树脂吸附和梯度洗脱过程。一般地，采用二次大孔树脂制备工艺，精制提取物中总皂苷含量即可达70%以上。所述工艺步骤(3)中所述加压柱色谱为低压或中压或高压柱色谱，其中优选中压或高压制备色谱；所述填料为碳十八球形改性硅胶，粒径范围5-120 μ m，其中优选粒径范围10-80 μ m;所述流动相为甲醇-水，所述洗脱方法优选多重等度洗脱。所述流份可采用在线紫外检测(190-210nm检测范围)或离线的分析液相检测，其中优选在线紫外检测。一般地，根据待制备样品组成特性和液相分析结果，首先选用小于或等于目标成分等度洗脱条件的甲醇-水进行洗脱除去极性较大的杂质，再采用目标成分等度洗脱条件的甲醇-水进行洗脱以除去其它杂质、获得目标成分，最后再采用大于目标成分等度洗脱条件的甲醇-水进行色谱柱再生。通过三次等度洗脱，获得的目标产品纯度一般均大于90%。本发明通过长期系统研究，所设计的制备技术路线有以下特色和优势(1)采用优选的大孔树脂和梯度洗脱工艺，结合多次上柱精制技术，高效除去大量水溶性杂质，同时有效富集了富含不同极性齐墩果酸皂苷的组份，简化了后续纯化工艺负担；(2)应用加压反相制备柱色谱多重等度洗脱工序，实现了单体皂苷纯化工序的自动化和可操作性，成功获得纯度大于90%的单体成品；(3)通过提取、大孔树脂精制、反相制备色谱各单元工序的优化和集成应用，成功实现目标高纯度单体成分的高效规模化制备。本发明工艺路线经济合理、效率高、能耗低，可实现目标产品的高效制备，溶剂便于回收和循环利用，容易实现工业化生产。本发明内容是通过大量实验研究、工艺优化分析完成的，以下述具体实施例进行说明。
具体实施例方式本发明所述的齐墩果酸皂苷是按以下实施例所表示的方法制造，所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但以下实施例不得理解为任何意义上的对本领域发明权利要求的限制。实施例I白头翁皂苷PB4和PB5的制备(I)参考白头翁药材分析结果(参见舒展，中药白头翁化学成分研究2，苏州大学硕士论文，2012)，选取富含白头翁皂苷PB4[化学名3-0-a-L-吡喃鼠李糖-(I — 2) - a -L-吡喃阿拉伯糖羽扇豆皂苷元28-0- a -L-吡喃鼠李糖-(I — 4) - β -D-吡 喃葡萄糖-(I — 6)-β-D-吡喃葡萄糖苷]和ΡΒ5的白头翁根茎药材(产地安徽，批次PC20091101)作为原料。称取Ikg白头翁饮片，用8L70%乙醇回流提取2次，每次2h，滤过，合并滤液，减压浓缩至无醇味，加适量水调整药液使每Iml药液相当于I. Og生药，备用。(2)大孔树脂精制工艺研究参考文献方法(史作清，施荣富，王春红等.吸附分离树脂在医药工业中的应用.北京化学工业出版社，2008)，首先采用静态吸附-解吸附法，通过计算吸附量与解吸率来评价树脂，对常用大孔树脂进行筛选。结果见表I。结果表明十二种树脂对PB4和PB5都能吸附与解吸附，但以丙烯酸系中极性树脂LX17和苯乙烯系XDA-8极性树脂较好。选用丙烯酸系LX17树脂，采用动态法进一步优化洗脱溶剂梯度条件、系统体积、上样量、饱和吸附量等工艺参数。最终确定工艺为称取LX-17树脂装柱(按干重计为1350g, IOOOmmX 100mm i. d.，柱体积2. 0L/BV)，经预处理后，取(I)中白头翁提取液(稀释为O. 4g生药/mL) 5500mL上柱，吸附平衡150min后，依次用水6BV，10%乙醇2BV，80%乙醇4BV，90%乙醇2BV洗脱，流速6. 5L/h。其中60%乙醇洗脱部位为富含PB4和PB5的精制提取物，经HPLC检测，PB4、PB5含量分别为39. 9 %、12. 5 %，转移率分别为92. 9 %、86. 8 %。表I常见型号树脂对PB4和PB5的最大吸附量和解吸率
权利要求
1.一种齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于所述的制备方法步骤如下 (1)选取含有齐墩果酸型皂苷的植物原料，采用水或乙醇-水混合溶剂进行提取，提取液合并，浓缩，过滤，或经水解处理后过滤，得植物提取液； (2)由(I)所得植物提取液，采用预处理好的大孔树脂进行吸附，再用乙醇-水混合溶媒按0-35%、40-80%、85-100%乙醇进行梯度洗脱，分别收集含有齐墩果酸型皂苷的相应洗脱部位洗脱液，浓缩，或重复多次经大孔树脂吸附和梯度洗脱、分别收集含有齐墩果酸型皂苷的相应洗脱部位洗脱液后浓缩，干燥，得精制提取物； (3)由(2)所得精制提取物，采用加压柱色谱，以碳十八改性硅胶为填料，适宜比例甲醇-水为流动相进行洗脱，分别收集含有齐墩果酸型皂苷的相应流份，浓缩，干燥，即可获得纯度大于90%的相应齐墩果酸型皂苷成品。
2.根据权利要求I所述齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于所述步骤(I)中植物原料为白头翁、常春藤、银莲花、败酱、山萝卜等属植物中的任意一种，所述植物原料部位为根、茎、叶、根茎中的任意一种或多种。
3.根据权利要求I所述齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于所述步骤(I)中所述提取液浓缩后，可采用碱法或酶法等适当方法进行水解处理。
4.根据权利要求I所述齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中所述大孔树脂为苯乙烯系或丙烯酸系树脂，其中优选丙烯酸系树脂。
5.根据权利要求I所述齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(2)中所述乙醇-水混合溶媒优选按0-30%、50-75%、85-95%乙醇进行梯度洗脱。
6.根据权利要求I所述齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(2)中所述含有齐墩果酸型皂苷的相应洗脱部位可重复多次进行大孔树脂吸附和梯度洗脱过程。
7.根据权利要求I所述齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(3)中所述加压柱色谱优选中压或高压柱色谱，所述碳十八球形改性硅胶优选粒径范围10-80 μm。
8.根据权利要求I所述齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(3)中所述流动相为甲醇-水，所述洗脱方法优选多重等度洗脱。
9.根据权利要求I所述齐墩果酸型皂苷的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(3)中所述含有齐墩果酸型皂苷的流份优选在线紫外检测，检测波长在190-210nm范围。
全文摘要
本发明公开了一种齐墩果酸型皂苷的制备方法，所述制备方法包括以下步骤(1)选取含有齐墩果酸型皂苷的植物原料，采用水或乙醇-水混合溶剂进行提取，提取液浓缩，过滤，或经水解处理后过滤；(2)所得植物提取液采用大孔树脂进行一次或重复多次吸附，用乙醇-水混合溶媒进行梯度洗脱，收集相应目标产品洗脱部位，浓缩，干燥；(3)所得精制提取物，采用加压柱色谱，以碳十八改性硅胶为填料，适宜比例甲醇-水为流动相进行洗脱，分别收集相应目标产品流份，浓缩，干燥，即可获得纯度大于90％的相应成品。本发明工艺路线经济合理、效率高、能耗低，可实现目标产品的高效制备，溶剂便于回收和循环利用，容易实现工业化生产。
文档编号C07J75/00GK102898496SQ20121038455
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月12日 优先权日2012年10月12日
发明者杨世林, 刘江云, 许琼明, 王黎明, 苏胜, 舒展, 冯育林, 李笑然 申请人:苏州世林医药技术发展有限公司