专利名称：一种从金银花中制备多种咖啡酰奎尼酸单体的方法
技术领域：
本发明属于化学物质或药品的制造方法，具体涉及以金银花为原料，经过提取分离，并纯化后得到多种咖啡酰奎尼酸单体的方法。
背景技术：
金银花又名忍冬，为忍冬科多年生半常绿缠绕木质藤本植物。“金银花”一名出自《本草纲目》，由于忍冬花初开为白色，后转为黄色，因此得名金银花。药材金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬及同属植物干燥花蕾或带初开的花，金银花自古被誉为清热解毒的良药。它性甘寒气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪。金银花既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等证，均效果显著。金银花为四十种家种大宗药材之一，用途广、用量巨大，不断的开发新用途，使其用量不断增加，同时，金银花也是疫情防治的重要品种。根据文献报道，金银花所含化学成分主要有绿原酸(3-咖啡酰奎尼酸)、4_咖啡酰奎尼酸、5-咖啡酰奎尼酸、4，5- 二咖啡酰奎尼酸、3，4- 二咖啡酰奎尼酸等咖啡酰奎尼酸类生理活性物质、咖啡酸、木樨草素、肌醇、皂甙、鞣质、有机醇等物质，其中咖啡酰奎尼酸类及黄酮类化合物含量较高。一般认为，金银花的抗菌有效成分为咖啡酰奎尼酸化合物，且常以绿原酸的含量高低来评价金银花质量的优劣。绿原酸虽具有广谱的抗细菌、抗病毒作用，但其并非是金银花中唯一的抑菌成分。目前，国内的厂家仅单纯的进行金银花茶、金银花露的生产或者仅仅提取金银花中的有效成分绿原酸，往往忽略了其它同样具有生理活性的其它咖啡酰奎尼酸类物质。如
2-咖啡酰奎尼酸由中国军事医学科学院和江中集团共同研制开发，国家食品药品监督管理局已批准其进入人体临床试验阶段，药物此前经过了严格的动物药效学试验和安全性试验，在艾滋病毒感染MT4细胞中能显著抑制病毒复制，作用显著强于目前世界公认较好治疗艾滋病的鸡尾酒疗法用药。目前现有对金银花活性成分的开发，主要集中在绿原酸的提取纯化等领域上，目前常见的有以下几种石硫醇法、异戊醇法、铅沉法、醇沉法、异丙醇-乙酸乙酯法等。这些传统方法都有明显的缺陷，例如石硫醇法加入石灰乳造成绿原酸类物质的严重破坏；有机溶剂萃取的方法不仅效率不高，并且大量的溶剂在回收过程中损失，耗能大；传统的水提醇沉法现在仍然广泛应用，但是其耗醇量大，生产周期长，大量的乙醇需回收，浪费能源，得到的产品纯度也不高。对于咖啡酰奎尼酸类物质的分离纯化提取，目前具有的公开报道较少，陈育如等2012年在申请号201210055626、名称为“一种以甜叶菊为原料同时制备总咖啡酰奎尼酸和甜菊糖的方法”中采用将甜叶菊用水或有机溶剂在加热、微波或超声辅助作用下对原料进行浸提，固液分离后得到甜菊糖和咖啡酰奎尼酸提取液后，然后进行萃取分离，最后经纯化后得到甜菊糖总苷和总咖啡酰奎尼酸的纯品。该方法采用的微波、超声等方法不利于工业化生产，并且得到的产品为总咖啡酰奎尼酸，为混合物，不利于产品附加值的提高及具体应用。而在目前集中的绿原酸研究方面，通过对公开的文献查询，目前，对于绿原酸的制备方法有庞松涛等于2004年在公开号CN1616403、名称为“从金银花中提取制备绿原酸的工艺”中采用金银花加水/乙醇进行回流提取，，加乙醇沉淀杂质，过夜过滤，滤液上大孔树脂柱，用洗脱剂浓缩，收集含有绿原酸的组分，上聚酰胺柱，用洗脱剂洗脱，收集含有绿原酸的组分，浓缩，精制得到含量大于95%的绿原酸；该方法采用的醇沉淀不仅耗时长且试剂及能耗耗费大；卢定强等于2009年在公开号CN101503356、名称为“一种制备高纯度绿原酸的新方法”中采用将绿原酸原液通过至少4级大孔树脂串联吸附柱、洗杂、洗脱后，再将洗脱液再生进行连续逆流萃取，得到高纯度绿原酸；该方法采用的柱分离步骤不易操作且较繁琐，同时采用的连续逆流萃取耗费大量的有机试剂；孙波等于1999年在公开号CN1273964、名称为“杜仲叶制备绿原酸工艺”中采用由超声预处理和高温提取、超滤、乙酸乙酯萃取、D140树脂分离等步骤来完成，其中超声处理难以用于工业化放大生产，超滤过程大大增加生产成本，而乙酸乙酯萃取耗费大量的有机试剂；张东升等于2009年在公开号CN101486651、名称为“一种杜仲叶中提取绿原酸的方法及其应用”中采用粉碎、酶处理、超声波处理、过滤、提取、浓缩与纯化等步骤提取纯化绿原酸，其中采用了酶处理提高了提取效率，但其中的超声处理难以放大，且该技术运用活性炭脱色造成主要成分的部分损失，且经过大孔树脂分离后结晶，产品纯度不高。目前，还有许多关于提取、纯化、制备绿原酸的方法，但这些方法基本上都耗大量有机溶剂，引起环境污染；或运用较为复杂的分离技术难以放大生产；或取效率不高，原料利用率较低。而关于咖啡酰奎尼酸单体生理物质的制备方面的报道，目前还较少。
发明内容
本发明提供一种从金银花中制备多种咖啡酰奎尼酸单体的方法，解决现有制备咖啡酰奎尼酸类物质纯度不高，并解决现有提取及制备绿原酸技术，耗费大量有机溶剂，引起环境污染；或运用较为复杂的分离技术难以放大生产；或取效率不高，原料利用率较低等问题。本发明的一种从金银花中制备多种咖啡酰奎尼酸单体的方法，包括(I)原料前处理步骤；金银花干品原料粉碎后，加入含有纤维素酶及果胶酶的水溶液进行破壁反应，烘干后得到提取原料；(2)提取步骤；将步骤(I)得到的提取原料，50 80%乙醇提取，60 90°C下提取，料液比I : 5 I : 10，提取2 4次，合并后得到提取液；(3)大分子沉淀步骤；将步骤(2)中得到的提取液浓缩后得到浓缩液，加入沉淀剂，经过沉淀反应，过滤后取上清液，得到沉淀分离液；(4)大孔树脂分离步骤；将步骤(3)中得到的沉淀分离液，经过大孔树脂分离，得到咖啡酰奎尼酸类物质；(5)反相柱分离步骤；将步骤⑷中得到的咖啡酰奎尼酸类物质采用SephadexLH-20柱精制，分别得到3_咖啡酰奎尼酸、4_咖啡酰奎尼酸、2_咖啡酰奎尼酸、4，5- 二咖啡酰奎尼酸、3，4- 二咖啡酰奎尼酸等分离产物；(6)结晶步骤；将步骤(5)中得到的3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、5-咖啡酰奎尼酸、4，5- 二咖啡酰奎尼酸、3，4- 二咖啡酰奎尼酸等分离产物，分别用甲醇溶解后，冷却至-20 4°C，在此温度下滴加同温度的乙醚至不再出现沉淀，保持该温度静置6 18小时，过滤后，分别得到纯度大于98%的3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、2-咖啡酰奎尼酸、4，5- 二咖啡酰奎尼酸、3，4- 二咖啡酰奎尼酸。所述的一种从金银花中制备多种咖啡酰奎尼酸单体的方法，其特征在于所述原料前处理步骤中，所述纤维素酶及果胶酶的水溶液为水溶液的体积与原料的质量比为O. 5 2 I (体积质量比)，纤维素酶的量与原料的质量比为O. 5 3 1000(质量比)，果胶酶的质量与原料的质量比为O. 5 2 1000(质量比)；所述破壁反应为反应温度30 60°C，反应时间I 3小时。所述的一种从金银花中制备多种咖啡酰奎尼酸单体的方法，其特征在于所述大分子沉淀步骤中，所述浓缩液为将提取液浓缩至与金银花干品原料的体积质量比为2 5 I (L/kg);所述沉淀剂为壳聚糖、PEG4000、PEG6000中的一种；所述加入沉淀剂，经过沉淀反应，其过程为在浓缩液中加入沉淀剂，所加入沉淀剂与浓缩液的质量体积比为O. I I. 5 100 (kg/L)，调节pH6 8，搅拌20 40min后，常温静置8 16小时，过滤去除沉淀物得到沉淀分离液。所述的一种从金银花中制备多种咖啡酰奎尼酸单体的方法，其特征在于所述大孔树脂分离步骤中，所述大孔树脂为NK-2，NKA-2, NK-9, D3520, DlOl中的一种；所述经过大孔树脂分离，其过程为将沉淀分离液上样到大孔树脂上，用纯水或10% 30%的乙醇水溶液洗脱2 4柱体积，弃去洗脱液，再用40% 60%的乙醇水溶液洗脱2 4柱体积，收集洗脱液，干燥得到咖啡酰奎尼酸类物质。所述的一种从金银花中制备多种咖啡酰奎尼酸单体的方法，其特征在于所述反相柱分离步骤中，所述S印hadex LH-20柱为以S印hadex LH-20为基质，湿法填充高径比为60 100 : I的分离柱；所述采用S印hadex LH-20柱精制，其过程为将咖啡酰奎尼酸类物质湿法上样于分离柱上，以40 80%的甲醇水溶液(V/V)或甲醇三氯甲烷=80 : 20 60 : 40 (V/V)为洗脱液进行洗脱，流速为O. 5 2柱体积每小时，分段收集，分别收集富含目标产物的洗脱液，蒸干后分别得到3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、2-咖啡酰奎尼酸、4，5- 二咖啡酰奎尼酸、3，4- 二咖啡酰奎尼酸等分离产物。所述的一种从金银花中制备多种咖啡酰奎尼酸单体的方法，其特征在于所述结晶步骤中，所述用甲醇溶解为所用甲醇的体积与分离产物的质量比为0.5 2 Kml/g)，加热至40 60°C溶解。本发明的优点在于，构想合理，方法简便，容易推广，解决现有制备咖啡酰奎尼酸类物质纯度不高，并解决现有提取及制备绿原酸技术，耗费大量有机溶剂，引起环境污染；或运用较为复杂的分离技术难以放大生产；或取效率不高，原料利用率较低等问题，并获取高纯度的3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、2-咖啡酰奎尼酸、4，5- 二咖啡酰奎尼酸、3，4- 二咖啡酰奎尼酸等单体成分。项目技术包括原料前处理步骤、提取步骤、大分子沉淀步骤、大孔树脂分离步骤、反相柱分离步骤和结晶步骤等，节省了生产成本，提高了生产效率，且工艺简便并易于放大到工业化生产，同时能大大提高原料利用率。
具体实施方式
实施例I(I)原料前处理步骤取金银花干品为原料,粉碎过筛后,准确称取IOOOg,加入含有纤维素酶O. 50g、果胶酶O. 50g的水溶液500ml，其中水溶液的体积与原料的质量比为O. 5 I (体积质量比)，纤维素酶的量与原料的质量比为O. 5 1000(质量比)，果胶酶的质量与原料的质量比为0.5 1000(质量比)，加热到60°C，反应I小时后，烘干，得到提取原料；(2)提取步骤将步骤(I)中所得的提取原料，80%乙醇提取，60°C下提取，料液比I : 10，提取3次，合并提取液；(3)大分子沉淀步骤将步骤(2)中得到的提取液浓缩后得到浓缩液5000ml，浓缩液与金银花干品原料的体积质量比为5 I (L/kg)，加入O. 05kg壳聚糖为沉淀剂，所加入沉淀剂与浓缩液的质量体积比为I : 100(1^/1)，调节？!18.0，搅拌401^11后，常温静置16小时，过滤去除沉淀物得到沉淀分离液。(4)大孔树脂分离步骤将步骤(3)中得到的沉淀分离液上样到NKA-2大孔吸附树脂后，10%乙醇水溶液洗脱4柱体积，丢弃后，40%乙醇水溶液洗脱3柱体积后，收集洗脱液，干燥后得到咖啡酰奎尼酸类物质总计121. IOg ；(5)反相柱分离步骤以S印hadex LH-20为基质，湿法填充高径比为100 I的分离柱；将步骤(4)得到的咖啡酰奎尼酸类物质121. 10g，湿法上样于分离柱上，以40%的甲醇水溶液(V/V)为洗脱液进行洗脱，流速为I柱体积每小时，分段收集，分别收集富含目标产物的洗脱液，蒸干后分别得到3-咖啡酰奎尼酸分离产物26. 65g、4-咖啡酰奎尼酸分离产物17. 65g、2-咖啡酰奎尼酸分离产物11. 65g、4，5- 二咖啡酰奎尼酸分离产物7. 75g、3，4- 二咖啡酰奎尼酸分离产物6. 87g ；(6)结晶步骤将步骤(5)中得到的五种分离产物，分别加入甲醇，所用甲醇的体积与分离产物的质量比为0.5 l(ml/g)，加热至60°C溶解。溶解后，冷却至_20°C，在此温度下滴加同温度的乙醚至不再出现沉淀，保持该温度静置18小时，过滤后，分别得到纯度大于98%的
3-咖啡酰奎尼酸21. 95g、4-咖啡酰奎尼酸13. 39g、2_咖啡酰奎尼酸9. 82g、4，5- 二咖啡酰奎尼酸5. 28g、3，4- 二咖啡酰奎尼酸4. 77g。实施例2(I)原料前处理步骤取金银花干品为原料,粉碎过筛后，准确称取2000g,加入含有纤维素酶6. 0g、果胶酶4. Og的水溶液4000ml，其中水溶液的体积与原料的质量比为2 : I (体积质量比)，纤维素酶的量与原料的质量比为3 1000(质量比)，果胶酶的质量与原料的质量比为2 1000(质量比)，加热到30°C，反应3小时后，烘干，得到提取原料；(2)提取步骤将步骤(I)中所得的提取原料，50%乙醇提取,90 C下提取，料液比I : 5,提取4次，合并提取液；(3)大分子沉淀步骤将步骤(2)中得到的提取液浓缩后得到浓缩液4000ml，浓缩液与金银花干品原料的体积质量比为2 I (L/kg)，加入O. 06kgPEG4000为沉淀剂，所加入沉淀剂与浓缩液的质量体积比为1.5 100(1^/1)，调节？册.0，搅拌201^11后，常温静置8小时，过滤去除沉淀物得到沉淀分离液。(4)大孔树脂分离步骤将步骤(3)中得到的沉淀分离液上样到NK-2大孔吸附树脂后，纯水洗脱3柱体积，丢弃后，60%乙醇水溶液洗脱2柱体积后，收集洗脱液，干燥后得到咖啡酰奎尼酸类物质总计229. 70g ；(5)反相柱分离步骤以S印hadex LH-20为基质，湿法填充高径比为60 I的分离柱；将步骤(4)得到的咖啡酰奎尼酸类物质229. 70g，湿法上样于分离柱上，以80%的甲醇水溶液(V/V)为洗脱液进行洗脱，流速为2柱体积每小时，分段收集，分别收集富含目标产物的洗脱液，蒸干后分别得到3-咖啡酰奎尼酸分离产物48. 89g、4-咖啡酰奎尼酸分离产物31. 78g、2-咖啡酰奎尼酸分离产物19. 35g、4，5- 二咖啡酰奎尼酸分离产物12. 68g、3，4- 二咖啡酰奎尼酸分离产物9. 25g ；(6)结晶步骤将步骤(5)中得到的五种分离产物，分别加入甲醇，所用甲醇的体积与分离产物的质量比为2 l(ml/g)，加热至40°C溶解。溶解后，冷却至_10°C，在此温度下滴加同温度的乙醚至不再出现沉淀，保持该温度静置12小时，过滤后，分别得到纯度大于98%的3-咖啡酰奎尼酸40. 55g、4-咖啡酰奎尼酸27. 38g、2-咖啡酰奎尼酸16. 91g、4，5- 二咖啡酰奎尼酸10. 04g、3，4- 二咖啡酰奎尼酸7. 47g。实施例3(I)原料前处理步骤取金银花干品为原料,粉碎过筛后，准确称取IOOOg,加入含有纤维素酶2. 0g、果胶酶I. Og的水溶液1000ml，其中水溶液的体积与原料的质量比为I : I (体积质量比)，纤维素酶的量与原料的质量比为2 1000(质量比)，果胶酶的质量与原料的质量比为
I 1000(质量比)，加热到45°C，反应2小时后，烘干，得到提取原料；(2)提取步骤将步骤(I)中所得的提取原料，70%乙醇提取，75°C下提取，料液比I : 8，提取2次，合并提取液；(3)大分子沉淀步骤将步骤(2)中得到的提取液浓缩后得到浓缩液4000ml，浓缩液与金银花干品原料的体积质量比为4 I (L/kg)，加入O. 004kgPEG6000为沉淀剂，所加入沉淀剂与浓缩液的质量体积比为O. I 100 (kg/L)，调节pH7. 0，搅拌30min后，常温静置12小时，过滤去除沉淀物得到沉淀分离液。(4)大孔树脂分离步骤将步骤(3)中得到的沉淀分离液上样到NK-9大孔吸附树脂后，20%乙醇水溶液洗脱2柱体积，丢弃后，50%乙醇水溶液洗脱4柱体积后，收集洗脱液，干燥后得到咖啡酰奎尼酸类物质总计109. 76g ；(5)反相柱分离步骤以S印hadex LH-20为基质，湿法填充高径比为80 I的分离柱；将步骤(4)得到的咖啡酰奎尼酸类物质109. 76g，湿法上样于分离柱上，以60%的甲醇水溶液(V/V)为洗脱液进行洗脱，流速为O. 5柱体积每小时，分段收集，分别收集富含目标产物的洗脱液，蒸干后分别得到3-咖啡酰奎尼酸分离产物24. 36g、4-咖啡酰奎尼酸分离产物15. 91g、2-咖啡酰奎尼酸分离产物10. 78g、4，5-二咖啡酰奎尼酸分离产物7. 02g、3，
4-二咖啡酰奎尼酸分离产物5. 82g ；(6)结晶步骤将步骤(5)中得到的五种分离产物，分别加入甲醇，所用甲醇的体积与分离产物的质量比为I : l(ml/g)，加热至50°C溶解。溶解后，冷却至4°C，在此温度下滴加同温度的乙醚至不再出现沉淀，保持该温度静置6小时，过滤后，分别得到纯度大于98%的3-咖啡酰奎尼酸19. 24g、4-咖啡酰奎尼酸11. 56g、2-咖啡酰奎尼酸8. 25g、4，5_ 二咖啡酰奎尼酸
4.67g、3，4-二咖啡酰奎尼酸3. 79g。实施例4(I)原料前处理步骤取金银花干品为原料,粉碎过筛后,准确称取2000g,加入含有纤维素酶8. 0g、果胶酶8. Og的水溶液4000ml，其中水溶液的体积与原料的质量比为2 : I (体积质量比)，纤维素酶的量与原料的质量比为2 1000(质量比)，果胶酶的质量与原料的质量比为
2 1000(质量比)，加热到60°C，反应I小时后，烘干，得到提取原料；(2)提取步骤将步骤(I)中所得的提取原料，80%乙醇提取，70°C下提取，料液比I : 10，提取3次，合并提取液；(3)大分子沉淀步骤将步骤(2)中得到的提取液浓缩后得到浓缩液10000ml，浓缩液与金银花干品原料的体积质量比为5 I (L/kg)，加入O. lkgPEG6000为沉淀剂，所加入沉淀剂与浓缩液的质量体积比为I : 100 (kg/L)，调节pH8. 0，搅拌40min后，常温静置16小时，过滤去除沉淀物得到沉淀分离液。(4)大孔树脂分离步骤将步骤(3)中得到的沉淀分离液上样到D3520大孔吸附树脂后，30 %的乙醇水溶液洗脱2柱体积，丢弃后，60%乙醇水溶液洗脱4柱体积后，收集洗脱液，干燥后得到咖啡酰奎尼酸类物质总计240. 05g ；(5)反相柱分离步骤以Sephadex LH-20为基质,湿法填充高径比为100 : I的分离柱；将步骤(4)得到的咖啡酰奎尼酸类物质240. 05g，湿法上样于分离柱上，以甲醇三氯甲烷=80 20(V/V)为洗脱液进行洗脱，流速为O. 5柱体积每小时，分段收集，分别收集富含目标产物的洗脱液，蒸干后分别得到3-咖啡酰奎尼酸分离产物50. 02g、4-咖啡酰奎尼酸分离产物33. 19g、2-咖啡酰奎尼酸分离产物20. 80g、4，5- 二咖啡酰奎尼酸分离产物13. 12g、3，4- 二咖啡酰奎尼酸分离产物9. 89g ；(6)结晶步骤将步骤(5)中得到的五种分离产物，分别加入甲醇，所用甲醇的体积与分离产物的质量比为0.5 l(ml/g)，加热至60°C溶解。溶解后，冷却至_20°C，在此温度下滴加同温度的乙醚至不再出现沉淀，保持该温度静置18小时，过滤后，分别得到纯度大于98%的
3-咖啡酰奎尼酸42. 10g、4-咖啡酰奎尼酸29. 45g、2_咖啡酰奎尼酸17. 28g、4，5_ 二咖啡酰奎尼酸11. 09g、3，4- 二咖啡酰奎尼酸7. 86g。实施例5步骤(I) (3)同实施例4(4)大孔树脂分离步骤将步骤(3)中得到的沉淀分离液上样到DlOl大孔吸附树脂后，10%乙醇水溶液洗脱3柱体积，丢弃后，60%乙醇水溶液洗脱4柱体积后，收集洗脱液，干燥后得到咖啡酰奎尼酸类物质总计246. 60g ；(5)反相柱分离步骤以S印hadex LH-20为基质，湿法填充高径比为80 I的分离柱；将步骤(4)得到的咖啡酰奎尼酸类物质246. 60g，湿法上样于分离柱上，以甲醇三氯甲烷=60 40(V/V)为洗脱液进行洗脱，流速为I柱体积每小时，分段收集，分别收集富含目标产物的洗脱液，蒸干后分别得到3-咖啡酰奎尼酸分离产物48. 33g、4-咖啡酰奎尼酸分离产物31. 90g、2-咖啡酰奎尼酸分离产物18. 95g、4，5- 二咖啡酰奎尼酸分离产物
12.60g、3，4-二咖啡酰奎尼酸分离产物9. 15g ；(6)结晶步骤将步骤(5)中得到的五种分离产物，分别加入甲醇，所用甲醇的体积与分离产物的质量比为I : l(ml/g)，加热至50°C溶解。溶解后，冷却至4°C，在此温度下滴加同温度的乙醚至不再出现沉淀，保持该温度静置6小时，过滤后，分别得到纯度大于98%的3-咖啡酰奎尼酸39. 00g、4-咖啡酰奎尼酸27. 79g、2-咖啡酰奎尼酸16. 80g、4，5- 二咖啡酰奎尼酸
10.83g、3，4- 二咖啡酰奎尼酸7. OOgo实施例6步骤(I) (4)同实施例5(5)反相柱分离步骤以S印hadex LH-20为基质，湿法填充高径比为60 I的分离柱；将步骤(4)得到的咖啡酰奎尼酸类物质246. 60g，湿法上样于分离柱上，以甲醇三氯甲烷=70 30(V/V)为洗脱液进行洗脱，流速为2柱体积每小时，分段收集，分别收集富含目标产物的洗脱液，蒸干后分别得到3-咖啡酰奎尼酸分离产物46. 00g、4-咖啡酰奎尼酸分离产物30. 35g、2-咖啡酰奎尼酸分离产物19. 87g、4，5- 二咖啡酰奎尼酸分离产物
13.00g、3，4- 二咖啡酰奎尼酸分离产物8. 79g ；(6)结晶步骤将步骤(5)中得到的五种分离产物，分别加入甲醇，所用甲醇的体积与分离产物的质量比为2 l(ml/g)，加热至60°C溶解。溶解后，冷却至_20°C，在此温度下滴加同温度的乙醚至不再出现沉淀，保持该温度静置18小时，过滤后，分别得到纯度大于98%的3-咖啡酰奎尼酸37. 75g、4-咖啡酰奎尼酸26. 68g、2_咖啡酰奎尼酸17. 02g、4，5- 二咖啡酰奎尼酸11. 15g、3 ，4-二咖啡酰奎尼酸6. 90g。
权利要求
1.一种从金银花中制备多种咖啡酰奎尼酸单体的方法,包括(1)原料前处理步骤；金银花干品原料粉碎后，加入含有纤维素酶及果胶酶的水溶液进行破壁反应，烘干后得到提取原料；(2)提取步骤；将步骤(I)得到的提取原料，50 80%乙醇提取，60 90°C下提取，料液比I : 5 I : 10，提取2 4次，合并后得到提取液；(3)大分子沉淀步骤；将步骤(2)中得到的提取液浓缩后得到浓缩液，加入沉淀剂，经过沉淀反应，过滤后取上清液，得到沉淀分离液；(4)大孔树脂分离步骤；将步骤(3)中得到的沉淀分离液，经过大孔树脂分离，得到咖啡酰奎尼酸类物质；(5)反相柱分离步骤；将步骤⑷中得到的咖啡酰奎尼酸类物质采用SephadexLH-20柱精制，分别得到3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、2-咖啡酰奎尼酸、4，5-二咖啡酰奎尼酸、3，4- 二咖啡酰奎尼酸等分离产物；(6)结晶步骤；将步骤(5)中得到的3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、2-咖啡酰奎尼酸、4，5-二咖啡酰奎尼酸、3，4-二咖啡酰奎尼酸等分离产物，分别用甲醇溶解后，冷却至-20 4°C，在此温度下滴加同温度的乙醚至不再出现沉淀，保持该温度静置6 18小时，过滤后，分别得到纯度大于98%的3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、2-咖啡酰奎尼酸、4，5-二咖啡酰奎尼酸、3，4-二咖啡酰奎尼酸。
2.如权利要求I所述的一种从金银花中制备多种咖啡酰奎尼酸单体的方法，其特征在于所述原料前处理步骤中，所述纤维素酶及果胶酶的水溶液为水溶液的体积与原料的质量比为O. 5 2 I (体积质量比)，纤维素酶的量与原料的质量比为O. 5 3 1000(质量比)，果胶酶的质量与原料的质量比为O. 5 2 1000(质量比)；所述破壁反应为反应温度30 60°C，反应时间I 3小时。
3.如权利要求I所述的一种从金银花中制备多种咖啡酰奎尼酸单体的方法，其特征在于所述大分子沉淀步骤中，所述浓缩液为将提取液浓缩至与金银花干品原料的体积质量比为2 5 : I (L/kg);所述沉淀剂为壳聚糖、PEG4000、PEG6000中的一种；所述加入沉淀剂，经过沉淀反应，其过程为在浓缩液中加入沉淀剂，所加入沉淀剂与浓缩液的质量体积比为O. I I. 5 100 (kg/L)，调节pH6 8，搅拌20 40min后，常温静置8 16小时，过滤去除沉淀物得到沉淀分离液。
4.如权利要求I所述的一种从金银花中制备多种咖啡酰奎尼酸单体的方法，其特征在于所述大孔树脂分离步骤中，所述大孔树脂为NK-2，NKA-2, NK-9, D3520, DlOl中的一种；所述经过大孔树脂分离，其过程为将沉淀分离液上样到大孔树脂上，用纯水或10% 30%的乙醇水溶液洗脱2 4柱体积，弃去洗脱液，再用40% 60%的乙醇水溶液洗脱2 4柱体积，收集洗脱液，干燥得到咖啡酰奎尼酸类物质。
5.如权利要求I所述的一种从金银花中制备多种咖啡酰奎尼酸单体的方法，其特征在于所述反相柱分离步骤中，所述Sephadex LH-20柱为以Sephadex LH-20为基质,湿法填充高径比为60 100 : I的分离柱；所述采用S印hadex LH-20柱精制，其过程为将咖啡酰奎尼酸类物质湿法上样于分离柱上，以40 80%的甲醇水溶液(V/V)或甲醇三氯甲烷=80 20 60 40 (V/V)为洗脱液进行洗脱，流速为O. 5 2柱体积每小时，分段收集，分别收集富含目标产物的洗脱液，蒸干后分别得到3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、2-咖啡酰奎尼酸、4，5- 二咖啡酰奎尼酸、3，4- 二咖啡酰奎尼酸等分离产物。
6.如权利要求I所述的一种从金银花中制备多种咖啡酰奎尼酸单体的方法，其特征在于 所述结晶步骤中，所述用甲醇溶解为所用甲醇的体积与分离产物的质量比为O. 5 ,2 l(ml/g)，加热至40 60°C溶解。
全文摘要
一种从金银花中制备多种咖啡酰奎尼酸单体的方法，属于化学物质或药品的制造方法，解决现有制备咖啡酰奎尼酸类物质纯度不高，并解决现有提取及制备绿原酸技术，耗费大量有机溶剂，引起环境污染；或运用较为复杂的分离技术难以放大生产；或取效率不高，原料利用率较低等问题，并获取高纯度的3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、2-咖啡酰奎尼酸、4，5-二咖啡酰奎尼酸、3，4-二咖啡酰奎尼酸等单体成分。项目技术包括原料前处理步骤、提取步骤、大分子沉淀步骤、大孔树脂分离步骤、反相柱分离步骤和结晶步骤等，节省了生产成本，提高了生产效率，且工艺简便并易于放大到工业化生产，同时能大大提高原料利用率。
文档编号C07C67/48GK102942483SQ20121040695
公开日2013年2月27日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者向福, 叶冬三, 向俊, 叶新潮, 闫立新 申请人:湖北楚天舒药业有限公司