专利名称：重组人促卵泡激素的纯化方法
技术领域：
本发明涉及蛋白的纯化方法。具体而言，本发明公开了重组人促卵泡激素的纯化新工艺。
背景技术：
促卵泡激素(FSH)是由垂体前叶分泌的能促进并增强卵巢中的卵泡发育和成熟的最重要的内分泌激素，可用于诱发排卵或超排卵，在男子可以促进精子的发育。FSH同LH和绒毛膜促性腺激素(hCG) —样都是一种异源二聚体糖蛋白，由非共价结合的α和β亚基组成，分别含有92个和111个氨基酸。糖基是以N-糖苷键的方式连接在α和β两个亚基各自的区域。糖在糖蛋白激素分子中占15% 30%，主要包括甘露糖、岩藻糖和半乳糖， N —乙酰葡萄糖胺。糖链末端含唾液酸，与蛋白以共价键的方式结合，通常连接在天冬酰胺上，形成所谓的N-连糖链。FSH每个亚基上有2个糖基位点(α-亚基的分别位于第52位和第78位氨基酸残基上，β -亚基的分别位于第7位和第24位氨基酸残基上)，这2个位点还会有一些糖链分枝。糖链的组成直接影响着激素的生物学活性，采用化学或酶解的方法解离除去糖链，FSH的生物学活性降低，直到消失，且α链上糖链的解离对激素的影响比 β链更大。
FSH的应用价值
由于FSH合成和分泌的不足所致的FSH浓度的不同，是男性和女性不育的主要原因。在女性中，这一状态的特征表现为不排卵或排卵异常。在男性中，可能会由于没有足够量的有活力的精子的产生而导致不育。单独注射FSH或者与LH合用，已被成功用于治疗不育症。以前商业化的用于治疗的FSH是由尿源提取的(来自绝经妇女的uFSH)。然而,应用重组DNA技术生产的人重组FSH(rhFSH)在临床上体现了更好的质量和有效性。目前国内该类产品有瑞士雪兰诺公司生产的Gonal-F (果纳芬)和荷兰欧加农公司生产的Puregon (普利康)。
糖蛋白激素是一类重要的生物大分子，它的分离纯化，不但对研究其结构与功能具有重要的学术意义，而且作为特殊应用的医药，分离纯化出大量的高活性纯品，更有巨大的经济效益与实用价值。但是，糖蛋白激素在糖链上的不均一性为其色谱分离增加了难度， 概括起来包括三个方面的问题低含量、不稳定性及不均一性。
糖蛋白激素在生物体内的含量一般都是很低的，这就要求首先采用一定的方法进行浓缩与富集。在酸性、热、有机溶剂的作用下糖蛋白激素中唾液酸易于解离，亚基易于解离，这就要求必须采用中性pH、温和及低温的分离技术与环境。甚至冷冻干燥也会引起糖蛋白激素的失活，一般不适于在分离纯化中采用这种方法进行浓缩，而采用超滤的方法。这对于粗制原料的制备是很难能全部达到要求的。传统的分离纯化方法，由于太长的分离时间显然对保持生物学活性也是不利的。
目前纯化重组人的FSH的文 献中多数使用染料亲和层析或者金属螯合填料层析作为捕获手段，后期通过亲和层析、反相层析、离子交换层析、分子筛层析、疏水层析等多种手段、多步处理来实现该蛋白质的纯化。例如CN201080056651公开了反相、凝胶过滤、疏水层析等；在专利CN100554277C中提到利用阴离子交换层析和固定金属离子层析(即金属螯合层析)以及疏水层析对重组或天然促卵泡激素进行纯化。更多使用的捕获手段是染料亲和层析US7939296涉及阳离子交换层析、染料亲和、疏水、凝胶过滤；EP1106623 A I涉及染料亲和、洗涤、梯度洗脱等手段(rhFSH最终收率、生物活性等未明);CN200580037591.9涉及染料亲和、疏水、反相；US2009209454层析方法包括染料亲和、阴离子、疏水、强阴离子， CN201080022681涉及阴离子交换层析、疏水作用层析和染料亲和层析且排斥弱的阴离子交换层析。另外值得注意的是，这些纯化方法所涉及的阴离子交换层析采用的是吸附一洗脱模式。
反相层析需要使用有机溶剂作为蛋白质的洗脱介质，蛋白质长时间暴露在有机溶剂中将导致分子结构不同程度的改变，严重的可导致不可逆变性，严重影响蛋白的生物学活性。金属螯合层析会导致高浓度金属离子引入蛋白溶液中，不同程度导致蛋白活性的降低，并且增加了金属离子去除的难度。疏水层析用于促性腺激素的分离，本发明人发现活性回收率较低，具体失活机理不明，为此，开发一种减少蛋白活性丧失的FSH纯化工艺具有重要的现实意义。发明内容
本发明解决的技术问题是，提供了一种重组人促卵泡激素的纯化工艺，避免了使用对蛋白活性影响较大的反相层析、金属螯合层析或疏水层析，操作简便，蛋白活性高且收率高。
本发明的一种技术方案为
一种重组人促卵泡激素的纯化方法，包括以下步骤
I)阴离子交换层析含重组人FSH的细胞培养物上清液，在平衡阴离子交换层析柱后上样，收集含重组人FSH的流穿液；
2)亲和层析将FSH特异的CaptureSelect亲和层析柱(荷兰BAC公司产品)平衡， 上样，再用洗脱缓冲液洗脱层析柱，收集含重组人FSH的洗脱峰；
3)凝胶过滤层析平衡凝胶层析柱后上样，收集含有重组人FSH的组分。
上述纯化方法中所述阴离子交换层析柱的介质的配基为季铵基或二乙胺乙基。优选的阴离子交换层析柱的介质为Q sepharose F. F或DEAE sepharose F. F。其中所述阴离子交换层析所用平衡缓冲液中含有O. 1-0. 2M NaCl, pH为7. 0-7. 5。所述阴离子交换层析所用平衡缓冲液中还可以进一步含有O. 02-0. 05M Tris和O. 01-0.1M甲硫氨酸。
上述纯化方法第二个步骤所述的亲和层析中所用平衡缓冲液含有O. 02-0. 05M Tris, pH 为 7. 0-7. 5 ;洗脱重组人 FSH 的缓冲液含有 O. 02-0. 05MTris 和1. 5-2. OM MgCl2, pH 为 7. 0-7. 5。
上述纯化方法中所述凝胶层析柱的介质为分离范围在3-600kD、适于重组人FSH 纯化的凝胶，优选米用 Superdex75、Superdex200、Sephadex G-50、Sephadex G-75 或 Sephadex G_100。所述凝胶层析所用平衡缓冲液含有0. 02-0.1M枸橼酸钠和O . 01-0.1M甲硫氨酸，pH为7. 0-7.5。
更进一步说，上述纯化方法的步骤I和/或步骤3中上样前，将样品在超滤系统中进行浓缩和缓冲液置换。所述置换所用的缓冲液含O. 02-0. 05M Tris,O. 1-0. 2M NaCl和O.01-0.1M 甲硫氨酸，pH 为 7. 0-7. 5。
本发明所用原料可取自按各种方法制得的含重组人FSH的细胞培养物，宿主细胞可为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明提供了一种新的纯化思路，利用阴离子交换、亲和、凝胶过滤的层析组合即可得到纯的重组人FSH，成本低，步骤少，简便易行，质量稳定，不存在复杂的变复性过程，避免了使用对蛋白活性影响较大的反相层析、金属螯合层析或疏水层析；先利用流穿模式的阴离子交换，除去大量杂蛋白、色素以及部分残留DNA、内毒素及宿主蛋白，既保护了后续的亲和填料，又实现了粗纯与浓缩富集；亲和介质偶联了骆驼源的抗体，载量高，只特异性地结合FSH的完整分子，而不结合单个亚基，更好地去除了降解的单体亚基；凝胶过滤可进一步除去残留DNA、内毒素及宿主蛋白，还可起到去除蛋白聚体以及糖基化不足的FSH蛋白， 使FSH的纯度从亲和层析后得到的90%进一步提高到了 98%。
本发明还在超滤浓缩与置换、阴离子交换、亲和、凝胶过滤时均使用近中性的缓冲液，尤其是用中性缓冲液将FSH从亲和柱洗脱，不采用酸液洗脱再加碱中和的传统方法，因而避免了 PH剧烈变化带来的蛋白沉淀以及糖脱落问题，保证了洗脱得到的蛋白的纯度和活性；超滤置换、阴离子交换所用缓冲液中含甲硫氨酸，凝胶过滤还一并将FSH溶液置换为含甲硫氨酸的缓冲体系，避免再次浓缩置换造成的回收率下降，并可减少FSH的氧化，利于 FSH最终的保存。
本发明所述的重组人促卵泡激素的纯化新工艺，经过对重组人促卵泡激素纯度验证与活性验证，并显示了良好的实际效果。本发明制备重组人促卵泡激素与市售的促卵泡激素Puregon (普利康)经过对照，显示了本发明制备产物具有更高的生物学活性。
图1市售的促卵泡激素Puregon (普利康)SEC-HPLC检测图谱。其中，纵坐标 mAU表示A214紫外吸收值，横坐标为时间，目的蛋白于15. Smin左右出峰。
图2实施例1最终制备的促卵泡激素的SEC-HPLC图谱。其中，纵坐标mAU表示 A214紫外吸收值，横坐标为时间，目的蛋白于15. Smin左右出峰。
图3实施例2最终制备的促卵泡激素的SEC-HPLC图谱。其中，纵坐标mAU表示 A214紫外吸收值，横坐标为时间，目的蛋白于15. Smin左右出峰。
图4实施例3最终制备的促卵泡激素的SEC-HPLC图谱。其中，纵坐标mAU表示 A214紫外吸收值，横坐标为时间，目的蛋白于15. Smin左右出峰。
图5实施例1、2 、3最终制备的促卵泡激素的以及蛋白质Marker的SDS-PAGE电泳图谱。
条带1、2、3分别为实例1、2、3最终制备的重组人促卵泡激素；
条带4 :蛋白质Marker ；
图6实施例1、2、3最终制备的促卵泡激素的以及蛋白质Marker的 WesternBloting 图谱。
条带1、2、3分别为实例1、2、3最终制备的重组人促卵泡激素；
条带4 :蛋白质Marker ；
图7实施例2最终制备的促卵泡激素的氧化亚基检测图谱。其中，纵坐标mAU表示A214紫外吸收值，横坐标为时间。
图8实施例3最终制备的促卵泡激素的氧化亚基检测图谱。其中，纵坐标mAU表示A214紫外吸收值，横坐标为时间。
图9含有氧化产物的rhFSH样品的氧化亚基检测图谱，其中，纵坐标mAU表示A214 紫外吸收值，横坐标为时间。
具体实施方式
仪器与材料
Pellicon2超滤膜(截流分子量10K，0. 5M2，Millipore公司产品)，Pellicon超滤系统(Millipore公司产品)，Amicon超滤离心管(Millipore公司产品)，AKTA Purifier层析系统(GE healthcare 公司产品)；TSK gelG_2000wxl 柱(Tosoh 公司产品)；Vydac Protein and Peptide C4柱(美国格雷斯公司产品)；高压液相色谱仪(美国安捷伦Agilent公司产品);
具FSH 特异性的 CaptureSelect 填料(荷兰 BAC 公司产品)，Superdex75prep grade 填料、Superdex75prep grade 填料以及 Sephadex G-75 (GEhealthcare 公司产品), Q sepharose F. F 填料、DEAE sepharose FF 填料(GEhealthcare 公司产品)。·
一、重组人FSH的纯化
实施例1重组人促卵泡激素蛋白的纯化途径一
I)含重组人FSH的细胞培养物上清液的预处理
清洁超滤系统，并作去热原处理，浓缩上清液，用(O. 02MTris+0. 2MNaCl + O.1M甲硫氨酸)缓冲液(PH7. O)置换浓缩液。
2) Q sepharose F. F阴离子交换层析
清洁Q sepharose F. F柱层析系统,并作去热原处理,依次按以下步骤进行
用A相(O. 02MTris+0. 2MNaCl + O.1M甲硫氨酸)缓冲液(pH7. O)平衡层析柱，上样，在此条件下，杂质结合在阴离子交换柱上，而重组人促卵泡激素蛋白不结合在阴离子交换柱上，收集流穿组分。
3)亲和层析
清洁亲和层析系统，依次进行以下操作用(O. 02M Tris)缓冲液(pH7. O)平衡层析柱；上样后用(O. 02M Tris)缓冲液(pH7.0)平衡层析柱；用(O. 02MTris+l. 5M MgCl2 · 6H20)缓冲液(pH7. O)洗脱层析柱上的重组人FSH，收集该洗脱峰。
清洁超滤系统，并作去热原处理，用0. 02M Tris (pH7. 0)循环清洗超滤系统后，超滤浓缩前述层析柱洗脱峰收集液，并用0. 02M Tris (pH7. 0)充分置换。
4) Superdex75prep grade 层析
清洁Superdex75prep grade柱层析系统,并作去热原处理,依次按以下步骤进行 用0. 02M枸橼酸钠+ 0.1M甲硫氨酸缓冲液(pH7. 5)平衡层析柱；将上步收集的浓缩蛋白溶液，上样，收集含重组人FSH的组分。
实施例2重组人促卵泡激素蛋白的纯化途径二
I)含重组人FSH的细胞培养物上清液的预处理
清洁超滤系统，并作去热原处理，浓缩上清液，用(O. 02MTris+0.1MNaCl + O. OlM 甲硫氨酸)缓冲液(PH7. 2)置换浓缩液。
2) DEAE sepharose F. F 阴离子交换层析
清洁DEAE sepharose F. F柱层析系统,并作去热原处理,依次按以下步骤进行
用A相(O. 02MTris+0.1MNaCl + O. OlM甲硫氨酸)缓冲液(pH7. 2)平衡层析柱，上样，在此条件下，杂质结合在阴离子交换柱上，而重组人促卵泡激素蛋白不结合在阴离子交换柱上，收集流穿组分。
3)亲和层析
清洁亲和层析系统，依次进行以下操作用(O. 02M Tris)缓冲液(pH7. 2)平衡层析柱；上样后用(O. 02M Tris)缓冲液(pH7. 2)平衡层析柱；用(O. 02MTris+2. OM MgCl2 · 6H20)缓冲液(pH7. 2)洗脱层析柱上的重组人FSH，收集该洗脱峰。
清洁超滤系统，并作去热原处理，用O. 02M Tris (pH7. 2)循环清洗超滤系统后，超滤浓缩前述层析柱洗脱峰收集液，并用O. 02M Tris (pH7. 2)充分置换。
4) Superdex200prep grade 层析
清洁Superdex200prep grade柱层析系统,并作去热原处理,依次按以下步骤进行用O.1M枸橼酸钠+ O. OlM甲硫氨酸缓冲液(pH7. O)平衡层析柱；将上步收集的浓缩蛋白溶液，上样，收集含重组人FSH的组分。
实施例3重组人促卵泡激素蛋白的纯化途径三
I)含重组人FSH的细胞培养物上清液的预处理
清洁超滤系统，并作去热原处理，浓缩上清液，用(O. 05MTris+0. 2MNaCl + O.1M甲硫氨酸)缓冲液(PH7. 5)置换浓缩液。
2) Q sepharose F. F阴离子交换层析
清洁Q sepharose F. F柱层析系统,并作去热原处理,依次按以下步骤进行
用A相(O. 05MTris+0. 2MNaCl + O.1M甲硫氨酸)缓冲液(pH7. 5)平衡层析柱，上样，在此条件下，杂质结合在阴离子交换柱上，而重组人促卵泡激素蛋白不结合在阴离子交换柱上，收集流穿组分。
3)亲和层析
清洁亲和层析系统，依次进行以下操作用(O. 05M Tris)缓冲液(pH7. 5)平衡层析柱；上样后用(O. 05M Tris)缓冲液(pH7. 5)平衡层析柱；用(O. 05MTris+2. OM MgCl2 · 6H20)缓冲液(pH7. 5)洗脱层析柱上的重组人FSH，收集该洗脱峰。
清洁超滤系统， 并作去热原处理，用O. 05M Tris (pH7. 5)循环清洗超滤系统后，超滤浓缩前述层析柱洗脱峰收集液，并用O. 02M Tris (pH7. 5)充分置换。
4) Superdex75prep grade 层析
清洁Superdex75prep grade柱层析系统,并作去热原处理,依次按以下步骤进行 用O. 05M枸橼酸钠+ O.1M甲硫氨酸缓冲液(pH7. O)平衡层析柱；将上步收集的浓缩蛋白溶液，上样，收集含重组人FSH的组分。
实施例4目标蛋白的检测
I) SDS-PAGE 检测
将分离纯化的蛋白样品进行SDS-PAGE分析，通过实施例1、2、3最终所获得目标蛋白以及蛋白质Marker的检测结果如图5所示，目标蛋白表观分子量与理论值一致，约40kD。
2) WesternB Ioting 检测
将分离纯化的蛋白样品进行还原型WesternBloting分析,通过实施例1、2、3最终所获得目标蛋白以及蛋白质Marker的检测结果如图6所示，目标蛋白表观分子量与理论值一致，约 40kD。
3)纯度与收率
A、ELISA 检测
此方法用于FSH免疫活性分析以及定量分析，利用抗原抗体结合来检测FSH的含量。使用促卵泡激素ELISA kit (上海西唐生物科技公司产品)，检测过程按说明书进行。
B、SEC-HPLC 法
色谱柱TSKgel G_2000wxl 柱(30cmX 7. 8mm)
流动相(磷酸盐缓冲液)0. lmol/L的Na2SO4H. 2g，加950ml的水溶解，加6. 75ml 磷酸，用饱和NaOH(5-6ml)调节至pH6. 7，用水定容至1000ml，O. 45um膜过滤。
流速0.5mT ,/min,
检测波长214nm，
ST0P:30min。
通过实施例1、2、3最终所获得目标蛋白检测结果如图2、3、4所示，目标蛋白于 15. 9min出峰。对照药普利康检测结果如图1所示。
平均纯度与收率
通过ELISA、SEC_HPLC检测与计算，目标蛋白总回收率44%，其中培养物上清液中目标蛋白浓度12mg/L ;经过超滤浓缩以及缓冲液置换，目标蛋白回收率85% ;Q_S印harose FF层析目标蛋白回收率90% ;亲和层析目标蛋白回收率大于80%，蛋白质纯度约90%，紧接的超滤与缓冲液置换步骤中目标蛋白回收率80% ；Sephadex G-75凝胶过滤层析目标蛋白回收率90%以上，目标蛋白纯度大于98%。
4)蛋白质活性检测
生物活性检测根据荧光素酶(Luciferase)化学发光法。其原理为稳定表达FSHR 的细胞系在与FSH共同孵育时，将在FSH的诱导下启动与FSHR偶联的荧光素酶基因(报告基因)的表达，这种受体-报告基因的紧密关系构成本检测方法的理论基础。通过荧光素酶定量试剂盒测定报告基因的表达水平，来间接反应上游诱导物FSH的相对生物活性。在同步检测多浓度FSH国际标准品，并绘制出精确浓度相关的标准曲线后，即可通过比对检测读数和标准曲线，得到未知FSH样品的准确活度。普利康比活性值为90833IU/mg，通过实施例1、2、3最终所获得目标蛋白的活性检测结果见表I。
表I本发明纯化的重组`人促卵泡激素与原研药普利康的活性比较
实施例1实施例2实施例3活性含量11916IU/mg98333IU/mg11583IU/mg与普利康之比131. 1%108.2%127. 5%
5)RP_HPLC测氧化亚基的含量rhFSH的一级结构中含有甲硫氨酸残基，所以容易受到空气中氧气的氧化。根据质 量标准要求氧化亚基含量与a亚基的含量比不大于5%。1. RP-HPLC 色谱条件色谱柱VydacProtein and Peptide C4 柱(25cmX4. 6mm, 5um)流动相A(0. lmol/1 TEAP缓冲液):85%磷酸6. 75ml，加水9500ml，用三乙胺调pH 至6. 00 + 0. 05，用水定容至1000ml，用0. 45um膜过滤后，放置24小时后使用。流动相B:乙腈流动相C:水乙腈三氟乙酸=20:82:0. 1%流速1.OmL/min ；检测波长214nm;柱温4(TC;表2 RP-HPLC洗脱梯度表
权利要求
1.一种重组人促卵泡激素的纯化方法，包括以下步骤1)阴离子交换层析含重组人FSH的细胞培养物上清液，在平衡阴离子交换层析柱后上样，收集含重组人FSH的流穿液；2)亲和层析将FSH特异的CaptureSelect亲和层析柱平衡,上样,再用洗脱缓冲液洗脱层析柱，收集含重组人FSH的洗脱峰；3)凝胶过滤层析平衡凝胶层析柱后上样，收集含有重组人FSH的组分。
2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征是所述阴离子交换层析柱的介质的配基为季铵基或二乙胺乙基。
3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征是所述阴离子交换层析柱的介质为Q sepharose F. F 或 DEAE sepharose F. F。
4.如权利要求1所述的纯化方法，其特征是阴离子交换层析所用平衡缓冲液中含有0.1-0. 2M NaCl，pH 为 7. 0-7. 5。
5.如权利要求4所述的纯化方法，其特征是阴离子交换层析所用平衡缓冲液中还含有 O. 02-0. 05M Tris 和 O. 01-0.1M 甲硫氨酸。
6.如权利要求1所述的纯化方法，其特征是，所述亲和层析中所用平衡缓冲液含有O. 02-0. 05M Tris, pH为7. 0-7. 5 ;洗脱重组人FSH的缓冲液含有O. 02-0. 05M Tris和1.5-2. OM MgCl2, pH 为 7. 0-7. 5。
7.如权利要求1所述的纯化方法，其特征是所述凝胶层析柱的介质为分离范围在 3_600kD、适于重组人 FSH 纯化的凝胶，优选 Superdex75、Superdex200> Sephadex G-50、 Sephadex G-75 或 Sephadex G-1OO0
8.如权利要求7所述的纯化方法，其特征是凝胶层析所用平衡缓冲液含有O.02-0.1M 枸橼酸钠和O. 01-0.1M甲硫氨酸，pH为7. 0-7. 5。
9.如权利要求1所述的纯化方法，其特征是，所述步骤I和/或步骤3中上样前，将样品在超滤系统中进行浓缩和缓冲液置换。
10.如权利要求9所述的纯化方法，其特征是置换所用的缓冲液含O.02-0. 05MTris、 O. 1-0. 2M NaCl 和 O. ·01-0.1M 甲硫氨酸，pH 为 7. 0-7. 5。
全文摘要
本发明涉及一种重组人促卵泡激素的纯化方法，包括阴离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析。本发明成本低，步骤少，简便易行，质量稳定，不存在复杂的变复性过程，避免了使用对蛋白活性影响较大的反相层析、金属螯合层析或疏水层析；先利用流穿模式的阴离子交换，除去大量杂蛋白、色素以及部分残留DNA、内毒素及宿主蛋白，既保护了后续的亲和填料，又实现了粗纯与浓缩富集；亲和介质偶联了骆驼源的抗体，载量高，只特异性地结合FSH的完整分子，而不结合单个亚基，更好地去除了降解的单体亚基；凝胶过滤可进一步除去残留DNA、内毒素及宿主蛋白，还可起到去除蛋白聚体以及糖基化不足的FSH蛋白。
文档编号C07K14/59GK103059125SQ20121057937
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者海岗, 王海彬, 应跃斌, 江海燕, 郭婷婷, 缪世伟, 白骅 申请人:浙江海正药业股份有限公司