专利名称：鸡胚高血管紧张素转化酶抑制活性混合肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种活性肽的提取方法，特别涉及一种从鸡胚中提取具有高ACE抑制活性混合肽的方法。
背景技术：
目前，随着人们生活水平的提高，高血压日渐成为威胁人类健康的一个主要因素。对于高血压患者，血压过高往往会引起心、脑、肾等器官的损坏，从而对生命构成严重威胁。在血压调节的生理活动中，血管紧张素转化酶(ACE :肽酰二肽水解酶，EC 3,4,15，I)发挥了关键的作用。它一方面将非活态的血管紧张素I转化成具有加强心肌收缩能力的血管紧张素II，另一方面也可以使具有血管舒张作用的血管舒缓激肽失活，在这两方面的协同作用下，引起生物体内血压的升高。因此，对ACE的抑制成为了达到降低血压目的 的主要手段。目前，市面上已有化学合成的ACE抑制剂，第一个产品为卡托普利(captopril)(D-2-甲基-3-巯基氧丙基-L-脯氨酸)。尽管这些化学类药物具有很强的降血压效果，但是也存在一些副作用。因此，中外学者不断尝试从天然来源的材料中获得降血压功能因子，以期望为高血压患者开发出更加安全的降血压药物。另一方面，随着社会竞争日趋激烈，人们的工作压力增大，血压偏高而未达到高血压范围的亚健康人群不断增加。对于这部分人群来说，根据中医药食同源的理论，从日常食物中提取出具有降血压效果的成分加以开发成功能性食品是很有市场前景的。目前，人们已经通过利用蛋白酶水解的手段从各种天然材料中得到ACE抑制肽，这些材料包括大豆、小麦等植物蛋白，以及鱼类、猪肉、蛋类等动物蛋白。但是，从这些来源中获得ACE抑制肽的方法都需要对源蛋白进行初步的纯化，并需要用蛋白酶在一定的条件下反应，这样就增加了工艺的复杂性以及最终产品的开发成本。鸡胚是用受精鸡蛋(即鸡受精卵)通过人工或鸡本身的孵化而培育出来的一种动物胚胎。鸡受精卵在短短的21天内，与外界环境仅有气体交换，在合适的温度下便可利用自身的蛋白质、脂肪等生物大分子从一个单细胞发育成为一个成熟的生命个体并破壳而出。由于鸡胚蛋的生长发育吸收利用了鸡蛋中的营养物质，并进行了一系列复杂的生化反应，其营养价值和生物活性与未受精的鸡蛋相比发生了巨大的变化。而尚未发育完全的雏鸡因故夭折不再继续吸收蛋白养分，从而用于滋长生命的剩余营养物就留在蛋内。基于其丰富的营养价值，鸡胚深得广大群众的喜爱，尤其在中国南方及东南亚地区有很多人食用，并有不少关于将鸡胚加工成为营养品的发明专利。但是，之前人们更多关注的是其营养价值，而忽视了更有研发价值的生物活性因子，这些小分子在生命形成过程中对内环境平衡的维持起到了重要作用。例如，在雏鸡血管形成的过程中，必然有一些蛋白质水解得到的小分子肽类参与到雏鸡体内血压的平衡活动中。而当前，还没有利用简单的分离方法从鸡胚中提取ACE抑制肽的相关技术报道。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的是提供一种利用人工控制孵化时间，得到血管紧张素转化酶抑制活性最高的天数的鸡胚，然后利用简便的分离方法，从鸡胚中提取含有高血管紧张素转化酶抑制活性多肽的组分。本发明的技术方案是一种鸡胚高血管紧张素转化酶抑制活性混合肽的制备方法，包括以下步骤(I)鸡胚孵化；⑵粉碎，冻干；⑶复溶于水；⑷离心；(5)超滤；(6)冻干。具体步骤为
(I)精选无损健康的受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度控制在37. 8°C,相对湿度60%，每2小时翻蛋一次，待孵化至第4-15天，胚胎处于营养成分增长的高峰期，各种器官基本形成，此时取出受精鸡蛋，放入4°C冰柜中结束其生命并保存，以备加工用；(2)对鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚胎，在4°C下将鸡胚胎用组织匀浆机粉碎后，倒入托盘中放入冷冻干燥机中进行冻干，待样品完全冻干后，将其碾碎成粉末，密封包装放入_30°C冰箱内低温保存，以备加工用；(3)将干燥的鸡胚粉末中加入无菌水按照5g粉末/IOOmL无菌水的比例进行复溶，搅拌均匀得到鸡胚浆液；(4)将鸡胚衆液在4°C, 5000Xg条件下离心20min ；(5)收集离心后的上清液，将其通过截留分子量为1000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集超滤液，即得含有高活性的血管紧张素转化酶抑制肽混合液；(6)将混合液进行冷冻干燥，得到含有高活性的血管紧张素转化酶抑制肽混合物的粉末状产品，密封后放在4°C下低温保存。优选的，步骤(I)孵化至第15天。本发明提供一种通过本发明所述的方法制得的高血管紧张素转化酶抑制活性混合肽，其为具有血管紧张素转化酶抑制活性的小分子肽，其分子量小于1000道尔顿。本发明提供一种高血管紧张素转化酶抑制活性混合肽的用途，加工成为具有降血压活性的食品，或者作为功能因子添加到功能性食品中。本发明的有益效果第一、本发明提供了一种来源于鸡胚的高活性血管紧张素转化酶抑制肽的加工方法，该方法不需要提前对目标物进行纯化，也不需要借助于蛋白酶的水解作用，仅仅通过冷冻干燥、复溶、离心、超滤等手段即可制得具有高活性的血管紧张素转化酶抑制肽产品。因而其产品具有安全性高、成本低廉、天然健康、无副作用等优点，尤其对于中老年人、血压偏高的亚健康人群以及对降血压药物过敏的人群来说具有潜在的药物开发价值。第二、经过液质联用等分析手段分析，最终得到的混合肽组分的分子量小于1000道尔顿，这样的小分子更有利于其在人体内被吸收并发挥生理功效。第三、该方法的整个过程采用低温粉碎、冷冻干燥、低温保藏等低温手段，最大限度地保存了生物活性肽的生理功效。第四、经过高效液相的实验，制得的混合肽组分具有很高的血管紧张素转化酶抑制活性。这种源材料丰富、加工成本低廉；产品效果突出，可作为功能因子添加在食品中，或作为一种新型的天然高效降血压药物的成分进行开发。
图1是血管紧张素转化酶抑制活性随孵化天数的变化。
具体实施例方式下面结合实施例，进一步阐述本发明一种鸡胚高血管紧张素转化酶抑制活性混合肽的制备方法，包括以下步骤(I)鸡胚孵化；⑵粉碎，冻干；(3)复溶于水；⑷离心；(5)超滤；(6)冻干。具体步骤为
(I)精选无损健康的受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度控制在37. 8°C,相对湿度60%，每2小时翻蛋一次，待孵化至第4-15天，胚胎处于营养成分增长的高峰期，各种器官基本形成，此时取出受精鸡蛋，放入4°C冰柜中结束其生命并保存，以备加工用；(2)对鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚胎，在4°C下将鸡胚胎用组织匀浆机粉碎后，倒入托盘中放入冷冻干燥机中进行冻干，待样品完全冻干后，将其碾碎成粉末，密封包装放入_30°C冰箱内低温保存，以备加工用；(3)将干燥的鸡胚粉末中加入无菌水按照5g粉末/IOOmL无菌水的比例进行复溶，搅拌均匀得到鸡胚浆液；(4)将鸡胚浆液在4°C，5000 X g条件下离心20min ；(5)收集离心后的上清液，将其通过截留分子量为1000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集超滤液，即得含有高活性的血管紧张素转化酶抑制肽混合液；(6)将混合液进行冷冻干燥，得到含有高活性的血管紧张素转化酶抑制肽混合物的粉末状产品，密封后放在4°C下低温保存。优选的，步骤(I)孵化至第15天。本发明提供一种通过本发明所述的方法制得的高血管紧张素转化酶抑制活性混合肽，其为具有血管紧张素转化酶抑制活性的小分子肽，其分子量小于1000道尔顿。本发明提供一种高血管紧张素转化酶抑制活性混合肽的用途，加工成为具有降血压活性的食品，或者作为功能因子添加到功能性食品中。实施例1鸡胚高血管紧张素转化酶抑制活性混合肽的制备方法(I)精选无损健康的受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度控制在37. 8°C,相对湿度60%，每2小时翻蛋一次，待孵化至第15天，胚胎处于营养成分增长的高峰期，各种器官基本形成，此时取出受精鸡蛋，放入4°C冰柜中结束其生命并保存，以备加工用；(2)对鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚胎，在4°C下将鸡胚胎用组织匀浆机粉碎后，倒入托盘中放入冷冻干燥机中进行冻干，待样品完全冻干后，将其碾碎成粉末，密封包装放入_30°C冰箱内低温保存，以备加工用；(3)将干燥的鸡胚粉末中加入无菌水按照5g粉末/IOOmL无菌水的比例进行复溶，搅拌均匀得到鸡胚浆液；(4)将鸡胚衆液在4°C, 5000 X g条件下离心20min ；(5)收集离心后的上清液，将其通过截留分子量为1000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集超滤液，即得含有高活性的血管紧张素转化酶抑制肽混合液；(6)将混合液进行冷冻干燥，得到含有高活性的血管紧张素转化酶抑制肽混合物的粉末状产品，密封后放在4°C下低温保存。实施例2鸡胚高血管紧张素转化酶抑制活性混合肽的制备方法(I)精选结束生命的孵化至第15天的鸡蛋，以备加工用；(2)对鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚胎，在4°C下将鸡胚胎用组织匀浆机粉碎后，倒入托盘中放入冷冻干燥机中进行冻干，待样品完全冻干后，将其碾碎成粉末，密封包装放入_30°C冰箱内低温保存，以备加工用；
(3)将干燥的鸡胚粉末中加入无菌水按照5g粉末/IOOmL无菌水的比例进行复溶，搅拌均匀得到鸡胚浆液；(4)将鸡胚浆液在4°C，5000 X g条件下离心20min ；(5)收集离心后的上清液，将其通过截留分子量为1000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集超滤液，即得含有高活性的血管紧张素转化酶抑制肽混合液；(6)将混合液进行冷冻干燥，得到含有高活性的血管紧张素转化酶抑制肽混合物的粉末状产品，密封后放在4°C下低温保存。实施例3鸡胚高血管紧张素转化酶抑制活性混合肽的活性测定(I)材料血管紧张素转化酶(ACE)、马尿酸组氨酰亮氨酸(HHL)和马尿酸(HA)标品从Sigma公司购得；三氯乙酸(TFA)、乙腈等试剂均为色谱级。(2)活性肽的提取方法实施例1或2。(3)ACE抑制活性的测定通过高效液相色谱(HPLC)的分析方法测定样品中的ACE抑制活性。所述的HPLC方法是对Cushman与Cheung(1971)方法的改进。具体方法是取100 μ L的上述超滤液与50 μ L的ACE酶(25mU/mL)在37°C下混合预热10分钟，之后该混合物与50 μ L的底物HHL(溶解在50mM含有O. 5M氯化钠的四硼酸钠缓冲液中，8. 3mM, pH为8. 3)在室温下混合放置60分钟。之后通过加入1. OM的盐酸(200 μ L)终止反应。吸取上层反应液，通过反相色谱柱C18柱来分离和量化反应得到的马尿酸(HA)。流动相为含有O. 1%三氟乙酸(TFA)的50%甲醇溶液。最终通过测定HA的峰面积来计算样品中的ACE抑制活性。与常规分光光度法比较，该方法避免了使用乙酸乙酯萃取ΗΑ，并使得ACE反应混合物可以直接注入色谱柱中，精确度更高。(4) ACE抑制活性计算根据以下公式对样品的ACE抑制活性进行计算抑制活性(%) = [ (Vm-Vin) /VJ X 100其中V111是不加超滤液样品的空白所对应的生成HA的体积；Vin是加入超滤液样品所对应的生成HA的体积。从图中可以看出提取的多肽混合液具有很高的ACE抑制活性，并且随着孵化时间的增长而增强。尤其是孵化到第15天，ACE抑制活性达到78.0%，说明孵化至第4-15天的鸡胚是一种良好的ACE抑制剂来源，特别是孵化至第15天的鸡胚。
权利要求
1.一种鸡胚高血管紧张素转化酶抑制活性混合肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(I)鸡胚孵化；⑵粉碎，冻干；⑶复溶于水；⑷离心；(5)超滤；(6)冻干。
2.如权利要求1所述的一种鸡胚高血管紧张素转化酶抑制活性混合肽的制备方法，其特征在于，具体步骤为(1)精选无损健康的受精鸡蛋，放入孵化箱内进行孵化，孵化温度控制在37.8°C，相对湿度60 %，每2小时翻蛋一次，待孵化至第4-15天，胚胎处于营养成分增长的高峰期，各种器官基本形成，此时取出受精鸡蛋，放入4°C左右的冰柜中结束其生命并保存，以备加工用；(2)对鸡蛋进行表面消毒，去除蛋壳取出鸡胚胎，在4°C下将鸡胚胎用组织匀浆机粉碎后，倒入托盘中放入冷冻干燥机中进行冻干，待样品完全冻干后，将其碾碎成粉末，密封包装放入_30°C冰箱内低温保存，以备加工用；(3)将干燥的鸡胚粉末中加入无菌水按照5g粉末/IOOmL无菌水的比例进行复溶，搅拌均匀得到鸡胚浆液；(4)将鸡胚浆液在4°C，5000X g条件下离心20min ；(5)收集离心后的上清液，将其通过截留分子量为1000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集超滤液，即得含有高活性的血管紧张素转化酶抑制肽混合液；(6)将混合液进行冷冻干燥，得到含有高活性的血管紧张素转化酶抑制肽混合物的粉末状产品，密封后放在4°C下低温保存。
3.如权利要求2所述的一种鸡胚高血管紧张素转化酶抑制活性混合肽的制备方法，其特征在于，步骤(I)中优选孵化至第15天。
4.根据权利要求1-3任一项所述方法制得的高血管紧张素转化酶抑制活性混合肽，其特征在于，为具有血管紧张素转化酶抑制活性的小分子肽，其分子量小于1000道尔顿。
5.根据权利要求4所述的高血管紧张素转化酶抑制活性混合肽的用途，加工成为具有降血压活性的食品，或者作为功能因子添加到功能性食品中。
全文摘要
本发明涉及一种从鸡胚中提取具有高血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性混合肽的方法。本发明的技术手段是收集孵化至一定天数的健康鸡胚，通过组织匀浆、冷冻干燥、与无菌水复溶、冷冻离心、过超滤膜、冷冻干燥等加工手段，从鸡胚中提取出具有高ACE抑制活性的混合肽成品。该成品可作为功能因子添加在食品中，或作为一种新型的天然高效降血压药物的成分进行开发。本发明方法手段简单、成本低廉，得到的产品具有天然、健康、高活性等优点，尤其对于中老年人、血压偏高的亚健康人群以及对化学类降血压药物过敏的人群来说具有潜在的药物开发价值，是一种对鸡胚的高附加值加工方法，同时也是传统中医里药食同源理论在保健领域当中的应用。
文档编号C07K1/14GK103012584SQ20121057921
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者徐学明, 段翔, 杨哪, 吴凤凤, 金征宇, 周星, 田耀旗, 王金鹏, 焦爱权, 赵建伟, 谢正军 申请人:江南大学