Hiv立体结构识别抗体诱导肽的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种能够诱导针对HIV的更优异的或者新的中和抗体的肽，由此实现HIV感染症的预防、治疗或丰富其选择项。作为解决方法，其特征在于使用识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽，该HIV立体结构识别抗体诱导肽的特征在于，通过带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物，HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物进行3分子结合。
【专利说明】HIV立体结构识别抗体诱导肽
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种诱导识别HIV (人类免疫缺陷病毒：Human ImmunodeficiencyVirus)的立体结构的抗体的肽、其合成方法、以及以由该肽诱导的HIV立体结构识别抗体或该肽作为有效成分的HIV感染症的预防和/或治疗剂。特别涉及一种相对于作为向HIV的靶细胞内的侵入机制的HIV疫苗的HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34和N36的六聚体的形成，通过作用于螺旋区域C34的三聚体区域，阻碍该gp41的C34和N36的六聚体形成，阻止向HIV的靶细胞侵入的识别HIV立体结构的抗体诱导肽、其合成方法、以及以由该肽诱导得到的HIV立体结构识别抗体或该肽作为有效成分的HIV感染症的预防和/或治疗剂。
【背景技术】
[0002]获得性免疫缺陷综合征（acquiredimmunodeficiency syndrome ;AIDS)是 1983年由Montagnier L等分离并发现的人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus ；HIV)引起的疾病(参照非专利文献I)。HIV的起源认为是以灵长类为自然宿主的猴子免疫缺陷病毒（Simian Immunodeficiency Virus ;SIV)因突变而获得对人的感染能力引起的。HIV不以空气感染，主要通过性感染、血液感染、母婴感染这3条途径感染。性感染的最大原因是接触性分泌液，血液感 染的原因是输血、伤痕、随意使用注射针等而引起感染。因此，需要从伦理观点出发预防感染。另外，母婴感染的原因是生产时接触产道中的体液、母亲的哺乳、病毒移动通过妊娠中的胎盘等。
[0003]HIV为逆转录病毒的一种，特别是以人⑶4阳性T细胞为靶点而感染的外来性病毒(参照非专利文献I)。HIV感染于人⑶4阳性T细胞之后，经过比较长的潜伏期而活化，破坏该T细胞。T细胞在免疫系统中发挥重要的作用，因此，T细胞的破坏使得体内的免疫能力显著降低。其结果，对于正常状态下能够简单排除的病原体也不能发挥充分的抵抗力，从而陷入慢性的免疫缺陷状态，即，陷入被称为“AIDS发病”的状态。
[0004]全世界的HIV感染者数虽然增加的速度缓慢，但是已经达到3300万人，2007年的新增HIV感染人数为240万人，与HIV相关的死亡人数为200万人(参照非专利文献2)。特别是在具有世界最多人口的亚洲，HIV的感染增长迅速。日本也不例外，虽然在发达国家中为特例，但是也在一直增加。具体而言，日本的现状为在2007年AIDS患者数为418人，HIV感染人数为1082人，首次超过1000人，且现在也没有停止的迹象(参照非专利文献3)。但是，HIV从其发现时开始就进行着积极的研究，在至今为止的25年之间，关于感染症的诊断方法的确立、进而治疗方法而言，与其它感染症相比也看到了极大的进步(参照非专利文献4及5)。通过对治疗药物进行深入的研究开发，使AIDS成为非直接至死的疾病。但是，根本的治疗方法尚未确立，新的问题点也出现了。因此，期望新型的治疗药物。
[0005]HIV在来自宿主细胞的病毒膜上具有为了与靶细胞结合所需要的被称为gpl20、gp41的包膜蛋白。在病毒膜的内部作为支架蛋白存在基质（Matrix)蛋白，由此保持HIV的结构。另外，HIV的类核体具有被衣壳（Capsid)蛋白包围的正12面体结构，在其内部含有RNA基因组、整合酶（integrase ;IN)、蛋白酶（protease ;PR)、逆转录酶（reversetranscriptase ;RT)(图I)。HIV的RNA基因组约为9000bp，该基因组夹入被称为末端重复序列（long terminal repeat ;LTR)的结构中而存在。该基因所编码的十几种病毒蛋白控制着复杂的复制(参照非专利文献4及5)。
[0006] 将从侵入HIV的靶细胞至出芽的一系列的增殖循环称为生命周期。该生命周期分为以下的[I]~[6]的各阶段，即，[I]病毒向细胞膜吸附及膜融合、[2] RNA基因组的逆转录、[3]病毒DNA插入宿主染色体和复制、[4]病毒结构蛋白的加工、[5]病毒颗粒的组装、
[6]出芽的过程，HIV经过以上过程而进行增殖(参照图2)(参照非专利文献4~7)。
[0007]在1985年作为最初的抗HIV药被开发的叠氮胸苷（AZT)是逆转录酶的竞争性抑制剂，是通过抑制上述生命周期而抑制HIV增殖的药剂。该AZT开发以后，更详细地明白了HIV的生命周期，抗HIV药物的开发也得到迅速的发展(参照非专利文献8及9)。其结果，目前，临床应用的抗HIV药物达到15种以上，并用作用机制不同的抗HIV药物的高效抗逆转录病毒治疗（Highly Active Anti Retroviral Therapy ;HAART)成为可能。该 HAART 目前成为HIV感染者及AIDS患者的治疗的主流，提高一定的效果。但是，为了持续极力抑制体内病毒量，需要将药剂长期给药，其结果，也存在出现药剂耐性株、严重的副作用、进而需要高额的治疗费用的问题点。特别是药剂耐性病毒的出现是很严重的。作为药剂耐性病毒出现的原因，除了药剂的长期服用之外，还可列举以下原因：由于HIV不具有DNA聚合酶那样的DNA的修复机制，因此非常容易引起变异(易变异性)。
[0008]因此，期望开发出治疗费用的负担轻、且对耐性HIV病毒也有效的HIV感染症的预防剂、治疗剂。作为着眼于上述HIV的生命周期的[1]“病毒向细胞膜吸附和膜融合”的HIV感染症的预防、治疗剂的候补，进行了以HIV的包膜蛋白gpl20及gp41为靶点的药物开发。gpl20及gp41与HIV侵入宿主细胞时的膜融合有关。在感染前，gp41的大部分被gpl20覆盖(参照图3的左图)，在感染时露出（参照图3的右图）。gp41的N末端侧区域称为N36，C末端侧区域称为C34，N36和C34分别形成三聚体结构。图4表示与HIV的宿主细胞的膜融合的机制。HIV向宿主细胞侵入时，首先，gpl20与宿主细胞的CD4结合，接着，与辅助受体结合。其后，gp41扎入宿主细胞中，引起立体结构变化。而且，以3条C34从外侧包围3条N36的方式结合，形成总计6条肽链聚集的六螺旋束（6-helical bundle),由此，HIV膜和宿主细胞的膜靠近，膜融合成立(参照图4)。
[0009]基于HIV这样的侵入机制，诱导了几种以gpl20或gp41为靶点且具有抗HIV活性的抗体。目前，作为表现出比较强的抗HIV活性（HIV中和活性)的人单克隆抗体，发现了作为针对gp41的抗体的2F5抗体(非专利文献10~13)和4E10抗体(非专利文献12~14)等，此外还有作为针对gpl20的抗体的2G12抗体(非专利文献15)和bl2抗体(非专利文献16)等。另外，在专利文献I中记载了为了阻止HIV的感染或为了使HIV的生命周期所必须的阶段失活而使用针对gpl20的抗体。但是，由于HIV基因组具有显著的易变异性，因此，虽然上述抗体对于某种特定的HIV株显示抗HIV活性，但是，对于其他株则不那么显示抗HIV活性，因此目前尚未达到临床应用。
[0010]另外，本发明的发明人等迄今为止在诱导特异性识别与gp41的C34肽相互作用的N36肽的三聚体结构的中和抗体的肽抗原的合成方面取得成功(专利文献2)。该肽抗原为在带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物的各自的接头结构上各自结合ー个N36肽的衍生物而成的抗原分子。使用该N36肽三聚体抗原诱导得到的中和抗体与使用N36肽单体诱导得到的中和抗体相比，对于N36肽三聚体的特异性更高，抗HIV活性也高出3倍。可以认为，由上述专利文献2中的N36肽三聚体抗原诱导得到的抗体与N36肽的三聚体特异性结合，抑制由N36肽和C34肽形成六螺旋束（6-helical bundle),由此抑制HIV膜融合。另外，作为进行过临床试验的已知的抗HIV活性肽，已知有C34肽衍生物単体fuzeon (T-20/DP178)(非专利文献 17)。
[0011]现有技术文献
[0012]专利文献
[0013]专利文献I :日本特开2009-080118号公报
[0014]专利文献2 ：W0/2010/134305 小册子
[0015]非专利文献
[0016]非专利又献 I ；Sinoussi, B. F.，Montagnier, L Isolation of a T-Iymphotropicretrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiencysyndrome(AIDS) ? Science20，868-871(1983)
[0017]非专利文献2 :WH0，World Health Statistics2008
[0018]非专利文献3 :厚生劳动省艾滋病动向委员会报道《ヱイズ発生動向報告》2008年发行
[0019]非专利文献4 :山本直树编ヒ卜レトロウ`イルス研究の最前線施普林格东京株式会社2002年2月22日发行
[0020]非专利文献5 :Koyanagi，Y. Outline of the HIV replication and itsceiluiar:the track of an invader in cell. Virus55, 251-258(2005)
[0021]非专利文献6:Carter，C. A.，Ehrlich，L S. Cell biology of HIV-Iinfection ofmacrophages. Annu. Rev. Macrobiol. 62，425-443 (2008)
[0022]非专利文献7:Eckert，D. M.，Kim，P. S. Mechanisms of viral membrane fusionand its inhibition. Annu. Rev. Biochem. 70，777-810(2001)
[0023]非专利文献8: Baba，M. Recent progress of ant i-HIV-Ire seach.Virus54, 59-66(2004)
[0024]非特許文献9:Kwong，P. D.，Wyatt, R.，Robinson, J. Sructure of an HIVgpl20envelope glycoprotein in complex with the CD4receptor and a newtralizinghuman antibody. Nature393, 648-659(1997)
[0025]非专利文献10: Conley, A. J. , Kessler, J. A. II, Boots, L. J. , Tung, J.S.，Arnold, B. A.，Keller，P. M.，Shaw, A. R.，and Emini, R. A. Neutralization ofdivergent human immunodeiiciency virus typeIvariants and primary isolatesby IAM—41—2F5，an anti_gp41human monoclonal antibody Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 91，3348-3352(1994)
[0026]非专利文献11:0fek，G.，Tang，M.，Sambor，A.，Katinger，H.，Mascola，J.R. , Wyatt, R. , and Kwong, P. D. Structure and mechanistic analysis of theanti-humanimmunodeficiency virus typelantibody2F5in complex with its gp4Iepitope.J. Virol. 78，10724-10737 (2004)[0027]非专利文献12: Alam，S. M.，McAdams，M.，Boren，D.，Rak，M.，Scearce，R. M.，Gaoj F.，Camacho, Z. T.，Gewirthj D.，Kelsoej G.，Chen, P.，and Haynes, B.F. The role of antibody polyspecificity and lipid reactivity inbinding ofbroadly neutralizing anti-HIV-Ienvelope human monoclonalantibodies2F5and4EIOto glycoprotein4lmembrane proximal envelope epitopes.J. Immunol. 178，4424-4435(2007)
[0028]非专利文献13 :Nelson，J. D.，Brunei，F. Μ·，Jensen，R.，Crooks，Ε·T.，Cardoso, R. M. F.，Wang, M.，HesselI, A.，WiIson, I. A.，Binleyj J. M.，Dawson, P.E.，Burton, D. R.，and ZwickjM. B. An affinity-enhanced neutralizing antibodyagainst the membrane-proximal external region of human immunodeficiencyvirus type Igp4lrecognizes an epitope between those of2F5and4E10.J. Virol. 81，4033-4043 (2007)
[0029]非专利文献14 : Car do so，R. Μ· F.，Zwi ck，Μ· Β·，Stanf i e I d，R.L.，Kunertj R.，Binleyj J. M.，Katingerj H.，Burton, D. R.，and Wilson, I. A. Broadlyneutralizing anti-HIV antibody4E10recognizes a helical conformation of a highlyconserved fusion-associated motif in gp41. Immunity22, 163-173 (2005)
[0030]非专利文献15: Trkola，Α·，Purtscher，Μ·，Muster，Τ·，Ballaun，C.，Buchacher, A.，Sullivan, N.，Srinivasanj K.，Sodroskij J.，Moore, J. P.，and Katingerj H.Human monoclonal antibody2G12defines a distinctive neutralizationepitope on the gpI20glycoprotein of human immunodeficiency virus typel.J. Virol. 70，1100-1108(1996)
[0031]非专利文献16:Pantophlet，R.，Saphire，Ε· 0·，Poignard，Ρ·，Parren，Ρ·W. Η. I. , Wilson, LA. , and Burton, D. R. Fine mapping of the interaction ofneutralizing and nonneutralizing monoclonal antibodies with the CD4binding siteof human immunodeficiency virus typelgpl20. J. Virol. 77, 642-658(2003)
[0032]非专利文献17:Akira Otakaj Miki Nakamura, Daisuke Namekij EiichiKodamajSusumu UchiyamajSyota Nakamura, Hiroaki NakanojHirokazu TamamurajYujiKobayashi，Masao Matsuokaj and Nobutaka Fujii Remodeling of gp41_C34Peptide Leadsto Highly Effective Inhibitors of the Fusion of HIV-Iwith Target Cells. Angew.Chem. Int. Ed.，41 (16)，2937-2940 (2002)
【发明内容】
[0033]发明所要解决的课题
[0034]在HIV疫苗的开发中，迄今为止对感染症有效的减毒疫苗、活疫苗这种方法存在以下的问题，即，有时由于HIV的易变异性，所以认为危险而不能使用，另外，在进行通常抗体诱导时，合成其蛋白质中的部分序列，以诱导其序列特异性抗体为目的，虽然使用部分序列所诱导得到的抗体可以与氨基酸序列特异性地结合，但对于中和靶点的立体结构的特异性及结合活性一般较低。这样，就需求对于非常容易变异的HIV也能够毫无问题地使用，并且对于作为HIV向靶细胞的侵入机制的中和靶点的立体结构的特异性及结合活性方面也具有优异的特异性及结合活性的抗体、或者在疫苗等HIV感染症的预防、治疗剂的开发中有效的HIV抗体诱导肽。作为这种肽，本发明的发明人等此前进行了诱导特异性识别HIV的gp41的N36肽的三聚体结构的中和抗体的肽抗原的开发(參照专利文献2)。
[0035]但是，为了 HIV感染症的预防、治疗，或为了预防、治疗的选择项的丰富化，谋求对于HIV更优异的、或可以诱导新的中和抗体的肽。用于解决课题的技术方案
[0036]本发明的发明人为了解决上述课题而进行了潜心研究，在研究中发现，通过化学合成在gp41的螺旋区域中据称重要的C34的部分的三聚体，用作HIV立体结构识别抗体诱导肽，可以诱导抗HIV活性和对HIV感染的中和活性优异的抗体，从而完成了本发明。
[0037]即，本发明涉及：[I] 一种识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于，包括：合成HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物的エ序；和通过将带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物与所述C34肽的衍生物结合，合成C34肽的衍生物的三聚体的エ序；[2]如上述[I]所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于，合成HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物的エ序中的C34肽的衍生物，在作为C34的天然序列的C34肽的C末端侧导入为了与模板化合物结合所需要的连接位点，在该C34肽的序列和该连接位点之间为了防止空间位阻引起的反应性降低而导入间隔氨基酸残基；[3]如上述[I]或
[2]所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于，作为带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物，使用下述通式（I)所示的化合物或其盐，
[0038]
【权利要求】
1.一种识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于，包括： 合成HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物的工序；和通过将带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物与所述C34肽的衍生物结合，合成C34肽的衍生物的三聚体的工序。
2.如权利要求1所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于： 合成HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物的工序中的C34肽的衍生物，在作为C34的天然序列的C34肽的C末端侧导入为了与模板化合物结合所需要的连接位点，在该C34肽的序列和该连接位点之间为了防止空间位阻引起的反应性降低而导入间隔氨基酸残基。
3.如权利要求1或2所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于， 作为带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物，使用下述通式（I)所示的化合物或其盐，
4.如权利要求3所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于： 作为带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物，使用下述通式（2)所示的化合物或其盐，
5.如权利要求1所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于： 合成HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物的工序中的C34肽的衍生物，在C34肽的C末端侧赋予亲水性氨基酸残基，而且，在其C末端侧导入连接位点，在该亲水性氨基酸残基和该连接位点之间为了防止空间位阻引起的反应性降低而导入间隔氨基酸残基。
6.如权利要求5所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于， 合成HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物的工序中的C34肽的衍生物为下述通式（3)所示的化合物。
7.如权利要求1~6中任一项所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽的合成方法，其特征在于： 在通过将带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物与所述C34肽的衍生物结合而合成C34肽的衍生物的三聚体的エ序中，将带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物和C34肽的衍生物在缓冲液中进行搅拌，由此使带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物与所述C34肽的衍生物结合，合成C34肽的衍生物的三聚体。
8.一种识别HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽，其特征在于： 其为利用权利要求1~7中任一项所述的合成方法所合成的。
9.一种识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽，其特征在于： 通过带有3条等价的接头结构的具有C3对称性的模板化合物，HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34肽的衍生物进行3分子結合。
10.如权利要求8或9所述的HIV立体结构识别抗体诱导肽，其特征在于： 其由下述通式（4)所示的化合物或其盐构成，
11.一种识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体的诱导方法，其特征在于： 使用权利要求8~10中任一项所述的识别C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体诱导肽对宿主动物进行致敏，诱导针对该肽的抗体。
12.—种HIV感染症的预防和/或治疗剂，其特征在于： 其以识别权利要求8~10中任一项所述的肽的C34的三聚体区域的HIV立体结构识别抗体或权利要求8~10中任一项所述的肽作为有效成分。
13.如权利要求12所述的HIV感染症的预防和/或治疗剂，其特征在于：利用权利要求8~10中任一项所述的肽的抗HIV活性进行HIV感染症的预防和/或治疗。
14.如权利要求12所述的HIV感染症的预防和/或治疗剂，其特征在于：HIV感染症的预防和/或治疗是通过HIV立体结构识别抗体对HIV颗粒的跨膜蛋白gp41的C末端侧的螺旋区域C34的三聚体区域的作用，阻碍gp41的C34和N36形成六聚体，阻止向HIV的靶细胞的侵入。
15.如权利要求12所述的HIV感染症的预防和/或治疗剂，其特征在于：其为以权利要求8~10中任一项所 述的肽作为有效成分的HIV感染症的预防和/或治疗用疫苗。
【文档编号】C07K14/155GK103502264SQ201280017413
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年4月3日 优先权日:2011年4月4日
【发明者】玉村启和, 鸣海哲夫, 野村涉, 桥本知惠, 驹野淳, 宫内浩典 申请人:国立大学法人东京医科齿科大学