特异于her3的结合分子及其用途
【专利摘要】本发明涉及结合HER3受体胞外域并且通过配体依赖性和/或非配体依赖性机制抑制多种HER3受体相关功能的抗体及其抗原结合片段。还提供了半衰期增加的组合物。另外，本发明提供了用于诊断和治疗与HER3介导的信号转导有关的疾病的组合物和方法。
【专利说明】特异于HER3的结合分子及其用途
[0001] 对电子提交的序列表的引用
[0002] 本发明申请作为参考引入了作为标题为"Her3_100W01_SL"的文本文件与本发明 申请一起提交的序列表，该文本文件于2012年11月12日生成并且大小为31. 3千字节。
【技术领域】
[0003] 本发明提供了特异性结合至HER3的组合物和使用这些组合物治疗癌症的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 人表皮生长因子受体3(HER3,也称为Erbb3)是受体蛋白酪氨酸并且属于受 体蛋白酪氨酸激酶（RTK)的表皮生长因子受体（EGFR)EGFR/HER亚家族，所述亚家族由 EGFR(HER1/Erbbl)、HER2/Erbb2、HER3/Erbb3 和 HER4/Erbb4 组成。EGFR 和 HER2 是公认的 驱动多种类型的实体瘤的致瘤作用的致癌RTK，所述实体瘤包括如乳腺癌、结肠直肠癌和肺 癌的主要类别。已显示EGFR和HER2的酪氨酸激酶活性是它们致癌活性所必需的。
[0006] 像原型EGFR-样，跨膜受体HER3由胞外配体结合域（E⑶）、E⑶内的二聚 域、跨膜域和胞内蛋白酪氨酸激酶域（TKD)和C末端磷酸化域组成（参见，例如，Kim 等人，（1998)，Biochem.J. 334,189-195 ;Roepstorff 等人，（2008)Histochem. Cell Biol. 129, 563-578)。
[0007] 配体调蛋白（Heregulin) (HRG)结合至HER3的胞外域并通过促进与其他EGFR家 族成员（例如，其他HER受体）的二聚作用以及其胞内域的转磷酸作用激活受体介导的信 号通路。已显示HER3缺少可检测的酪氨酸激酶活性，这可能是由于酪氨酸激酶域中的某些 关键残基的非保守置换所造成的。因此，作为这种激酶缺乏的后果，HER3需要与其他RTK， 特别是EGFR和HER2形成异二聚体以经历磷酸化作用并且需要在功能上是有活性的。
[0008] HER3在肿瘤发生中的主要作用是用作支架蛋白，从而使得能够最大程度地诱 导PI3K/AKT途径。HER3已显示包含含有一簇6个C末端酪氨酸的基序，当磷酸化时，其 模拟了共有PI3K/p85结合位点。因此，通过与HER3形成异二聚体，上游的肿瘤驱动子 (onco-drivers)、EGFR、HER2、cMET和FGFR2能够最有效地结合至PI3K/AKT途径。因此，对 HER3活性的损失能够阻断不同RTK驱动的多种系统中癌症发展的预期是合理的。研究已表 明HER2增强的乳腺癌细胞中HER3siRNA的抑制导致了与HER2siRNA抑制类似的抗增殖作 用，这进一步表明了癌症非常需要HER3。
[0009] 除了促进非应激条件下肿瘤的生长外，已发现HER3高度参与了赋予对多种靶标 药物的治疗耐受性，所述药物包括EGFR酪氨酸激酶抑制剂，HER2单克隆抗体如曲妥珠单 抗，和PI3K或AKT或MEK的小分子抑制剂。作为对于尽管开始有临床反应，但是一定会出 现的原发瘤破坏以及对抗癌症耐受性问题的有希望的癌症靶标，这为HER3增加了另一层 吸引力。
[0010] HER3具有两种不同的与其伴侣RTK二聚的方式：配体依赖性（在存在HRG的情况 下）或非配体依赖性。就HER2-HER3二聚体而言，已知在低至中HER2表达的细胞中，HER3 仅可以在配体结合后与HER2复合，相反在HER2扩增的细胞中（HER2IHC3+)，它们与HRG形 成自发的二聚体（Junttila等人，（2009) Cancer Cell. 15 (5): 429-40)。在存在或不存在配 体的情况下形成的二聚体在结构上是不同的，如早期研究所显示的，该研究显示曲妥珠单 抗/ Herceptin? (Genentech/Roche批准用于HER23+乳腺癌的HER2单克隆抗体）仅能够 破坏非配体依赖性二聚体，但是不能破坏配体依赖性二聚体，而帕妥珠单抗\ Omnitarg? (rhuMAb2C4, Genentech/Roche的3期临床试验中的HER2单克隆抗体）仅可以破坏配体依 赖性二聚体。
[0011] HER家族成员之间二聚体的形成增强了 HER3的信号电位，并且是不但能够用于信 号多样化而且可以用于信号放大的方式。在多个细胞背景中，已显示HER3是磷酸化的。例 如，在过表达HER3的人乳腺癌亚型中，HER3是酪氨酸残基组成型磷酸化的（参见，例如， Kraus 等人，（1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2900-2904 ;Kim 等人，（1998)，81〇。1^111· J. 334, 189_1% ;Schaefer等人，（2〇〇4) Cancer Res. Μ, 3395_34〇5 ;Schaefer等人，（2〇〇6) Neoplasia8, 612-622)。因此，有效干扰HER3磷酸化的疗法是所期望的。
[0012] 另外，已发现在几种类型的癌症中HER3是过表达和/或过度激活的，所述癌症如 乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、肾癌和膀胱癌、胰癌、脑癌、造血组织肿瘤、成视网膜细胞 瘤、黑素瘤、结肠直肠癌、胃癌、头颈癌、肺癌等。（参见，例如，Sithanandam&Anderson (2008) Cancer Gene Ther. 15, 413-448)。一般地，HER3 通常在 EGFR、HER2、C-Met 和 FGFRII 表达 癌症中激活。
[0013] 已显示了 HER2/HER3的表达和从非侵袭性向侵袭性阶段的发展之间的相关性 (Alimandi 等人，0ncogenel0, 1813-1821 ;DeFazio 等人，Cancer87,487_498 ;Naidu 等 人，Br. J. Cancer78, 1385-1390)。因此，HER3可以用作提高的肿瘤侵袭性和存活率较差的 诊断标志物。PI3K/AKT的持续HER3激活已反复显示导致了肿瘤对EGFR/HER2抑制剂的耐 受性。
[0014] 尽管已研究了 HER3在癌症的发展和进展中的作用（参见，例如，Horst等 人，（2005) Int.J.Cancerl 15, 519-527 ;Xue 等人，（2006) Cancer Res. 66, 1418-1426)，但是 HER3作为临床干预的靶标仍很大程度上是未理解的。目前大部分免疫疗法主要集中在抑制 HER2,具体地，HER2/HER3复合物的异二聚体的作用（参见，例如，Sliwkowski等人，（1994) J. Biol. Chem. 269, 14661-14665)。因此，本发明的目标是提供有效抑制HER3介导的能够用 于多种癌症的诊断、预后预测和治疗的细胞信号的改善的免疫治疗剂。
[0015] 发明概述
[0016] 本发明公开内容提供了抗HER3结合分子，例如，其抗体或抗原结合片段，例如，在 配体依赖性和非依赖性环境中能够抑制HER3活性的单克隆抗体。相反，本领域中其他抗 HER3单克隆抗体（例如，Ab#6(国际专利公开W0 2008/100624)和Ul-59(国际专利公开W0 2007077028 ;在本文中也称为AMG)仅能够抑制配体依赖性HER3活性。还公开了效力提高 并且半衰期延长的亲合力成熟的抗HER3结合分子，并因此能够以延长的剂量间间隔并且 以较小的剂量体积不太频繁地施用所述结合分子。本发明公开还提供了治疗人受试者中疾 病（如癌症）的方法，其包括施用抗HER3结合分子。在一些具体的方面中，使用了 2C2-来 源的YTE突变体人抗体。
[0017] 本发明公开提供了特异性结合至HER3胞外域内表位的分离的结合分子或其抗原 结合片段，其中所述结合分子特异性结合至与包含CL16或2C2的重链可变区（VH)和轻链 可变区（VL)的抗体或其抗原结合片段相同的HER3表位。还提供了特异性结合至HER3并 且通过包含CL16或2C2的VH和VL的抗体或其抗原结合片段竞争性抑制HER3结合的分离 的结合分子或其抗原结合片段。
[0018] 本发明公开还提供了包含抗体VL的特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗 原结合片段，其中所述VL包含以下氨基酸序列 ：
[0019] [FWJ X1GSX2SNIGLNYVS [FW2] RNNQRPS [FW3] AAWDDX3X4X5GE X6 [FWJ
[0020] 其中[FWJ、[FW2]、[FW3]和[FWJ代表VL框架区，并且其中
[0021] (a)Xi代表氨基酸残基精氨酸（R)或丝氨酸（S)，
[0022] (b)X2代表氨基酸残基丝氨酸（S)或亮氨酸（L)，
[0023] (c)X3代表氨基酸残基丝氨酸（S)或甘氨酸（G)，
[0024] (d)X4代表氨基酸残基亮氨酸（L)或脯氨酸（P)，
[0025] (e)X5代表氨基酸残基精氨酸（R)、异亮氨酸（I)、脯氨酸（P)或丝氨酸（S)，和
[0026] (f)X6代表氨基酸残基缬氨酸（V)或丙氨酸（A)。
[0027] 此外，本发明公开提供了包含抗体VH的特异性结合至HER3的分离的结合分子或 其抗原结合片段，其中所述VH包含以下氨基酸序列：
[0028] [Fff5] YYYMQ [Fff6] X7IGSSGGVTNYADSVKG [Fff7] VGLGDAFDI [F ff8]
[0029] 其中[FW5]、[FW6]、[FW7]和[FW 8]代表VH框架区，并且其中X7代表氨基酸残基酪 氨酸（Y)、异亮氨酸（I)或缬氨酸（V)。
[0030] 本发明公开提供了包含抗体VL和抗体VH的特异性结合至HER3的分离的结合分 子或其抗原结合片段，其中所述VL包含以下氨基酸序列：
[0031] [FffJ XiGSX^NIGLNYVS [Fff2] RNNQRPS [Fff3] AAWDDX3X4X5GEX6 [Fff4]
[0032] 其中[FWJ、[FW2]、[FW3]和[FWJ代表VL框架区，并且其中
[0033] (aUi代表氨基酸残基精氨酸（R)或丝氨酸（S)，
[0034] (b)X2代表氨基酸残基丝氨酸（S)或亮氨酸（L)，
[0035] (c)X3代表氨基酸残基丝氨酸（S)或甘氨酸（G)，
[0036] (d)X4代表氨基酸残基亮氨酸（L)或脯氨酸（P)，
[0037] (e)X5代表氨基酸残基精氨酸（R)、异亮氨酸（I)、脯氨酸（P)或丝氨酸（S)，和
[0038] (f) X6代表氨基酸残基缬氨酸（V)或丙氨酸（A)，和
[0039] 其中所述VH包含以下氨基酸序列：
[0040] [Fff5] YYYMQ [Fff6] X7IGSSGGVTNYADSVKG [Fff7] VGLGDAFDI [F ff8]
[0041] 其中[FW5]、[FW6]、[FW7]和[FW 8]代表VH框架区，并且其中X7代表氨基酸残基酪 氨酸（Y)、异亮氨酸（I)或缬氨酸（V)。
[0042] 本发明公开还提供了包含抗体VL的特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗 原结合片段，其中所述VL包含与SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19或SEQ ID N0:20相同或者 除了4个、3个、2个或1个氨基酸取代外与SEQIDN0:18、SEQIDN0 :19或SEQIDN0:20 相同的VL互补决定区-l(VL-CDRl)氨基酸序列。另外，本发明公开提供了包含抗体VL的 特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其中所述VL包含与SEQ ID N0 : 21相同或者除了 4个、3个、2个或1个氨基酸取代外与SEQ ID NO :21相同的VL互补决定 区-2 (VL-〇)R2)氨基酸序列。
[0043] 另外，本发明公开提供了包含抗体VL的特异性结合至HER3的分离的结合分子或 其抗原结合片段，其中所述VL包含与：SEQ ID N0 :22、SEQ ID N0 :23、SEQ ID N0 :24、SEQ IDN0:25、SEQIDN0:26、SEQIDN0:27、SEQIDN0 :28、SEQIDN0:29*SEQIDN0:30 相同或者除了 4个、3个、2个或1个氨基酸取代外与SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29 或 SEQ ID NO :30相同的互补决定区-3(VL-⑶R3)氨基酸序列。另外，本发明公开提供了包含抗体 VH的特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID NO :31相同或者除了 4个、3个、2个或1个氨基酸取代外与SEQ ID NO :31相同的互补决定 区-1 (VH-⑶R1)氨基酸序列。
[0044] 此外，本发明公开提供了包含抗体VH的特异性结合至HER3的分离的结合分子或 其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:33或SEQ ID N0:34相同 或者除了 4个、3个、2个或1个氨基酸取代外与SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33或SEQ ID NO :34相同的互补决定区-2(VH-CDR2)氨基酸序列。还提供了包含抗体VH的特异性结合 至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其中所述VH包含与SEQ ID N0:35相同或者 除了 4个、3个、2个或3个氨基酸取代外与SEQ ID N0 :35相同的互补决定区-3 (VH-⑶R3) 氨基酸序列。
[0045] 本发明公开提供了包含抗体VL的特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原 结合片段，其中所述VL包含分别与以下氨基酸序列相同或者除了一种或多种VL-VDR中的 4个、3个、2个或1个氨基酸取代外与之相同的VL-⑶R1、VL-⑶R2和VL-⑶R3氨基酸序列， 所述氨基酸序列为：SEQ ID N0 :18、21 和 22、SEQ ID N0 :18、21 和 26、SEQ ID N0 :18、21 和 27、SEQIDN0:20、21和22、SEQIDN0:19、21和22、SEQIDN0 :18、21和25、SEQIDN0: 18、21和28、SEQIDN0:18、21和29、SEQIDN0:18、21和30、SEQIDN0 :18、21和23、SEQ ID NO :19、21 和 23、SEQ ID NO :20、21 和 23、SEQ ID NO :18、21 和 24 或者 SEQ ID NO :18、 21和25。本发明公开还提供了包含抗体VH的特异性结合至HER3的分离的结合分子或其 抗原结合片段，其中所述VH包含分别与以下氨基酸序列相同或者除了一种或多种VH-VDR 中的4个、3个、2个或1个氨基酸取代外与之相同的VH-⑶Rl、VH-⑶R2和VH-⑶R3氨基酸 序列，所述氨基酸序列为：SEQ ID N0 :31、32 和 35、SEQ ID N0 :31、33 和 35 或 SEQ ID N0 : 31、34 和 35。
[0046] 另外，本发明公开提供了包含VL和VH的特异性结合至HER3的分离的抗体或其抗 原结合片段，其中所述VL和VH包含分别与以下氨基酸序列相同或者除了一种或多种VDR 中的4个、3个、2个或1个氨基酸取代外与之相同的VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3，VH-CDR1、 VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列，所述氨基酸序列为：SEQ ID N0:18、21、22、31、32和35、SEQ IDN0:18、21、26、31、32和35、SEQIDN0 :18、21、27、31、32和35、SEQIDN0:20、21、22、31、 32和35、SEQIDN0 :19、21、22、31、32和35、SEQIDN0:18、21、25、31、32和35、SEQIDN0 : 18、21、28、31、32和35、SEQIDN0:18、21、29、31、32和35、SEQIDN0:18、21、30、31、32和 35、SEQIDN0 :18、21、23、31、32和35、SEQIDN0:19、21、23、31、32和35、SEQIDN0 :20、 21、23、31、32和35、SEQIDN0:18、21、24、31、32和35，或SEQIDN0 :18、21、25、31、32和 35。还提供了包含抗体VL和抗体VH的特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合 片段，其中所述VL包含与参比氨基酸序列至少约90%至约100%相同的氨基酸序列，所述 参比氨基酸序列选自 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO : 14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17。本发明公开还提供了包含抗体VL和 抗体VH的特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其中所述VH包含与参 比氨基酸序列至少约90%至约100%相同的氨基酸序列，所述参比氨基酸序列选自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :12和SEQ ID NO :13。此外，本发明公开提供了特异性结合至HER3的分 离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含VL，所述VL包含与参比氨 基酸序列至少约90%至约100%相同的序列，所述参比氨基酸序列选自SEQ ID NO :1、SEQ ID NO ：3, SEQ ID NO ：4, SEQ ID NO ：5, SEQ ID NO ：6, SEQ ID NO ：7, SEQ ID NO ：8, SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO :16 和 SEQ ID NO : 17,并且其中所述抗体或抗原结合片段包含VH，所述VH包含与参比氨基酸序列至少 约90%至约100%相同的序列，所述参比氨基酸序列选自SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:12和 SEQ ID NO ：13〇
[0047] 本发明公开还提供了分离的抗体或其抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO :49的 VL和包含SEQ ID NO :50的VH。另外，本发明公开提供了分离的抗体或其抗原结合片段， 其包括包含SEQ ID N0:3的VL和包含SEQ ID N0:2的VH。此外，本发明公开提供了特异 性结合至HER3胞外域内的表位的分离的结合分子或其抗原结合片段，其包含SEQ ID N0 :3 的抗体VL、SEQ ID N0:2的抗体VH和SEQ ID46的IgGl恒定区。还提供了特异性结合至 HER3胞外域内的表位的分离的结合分子或其抗原结合片段，其由SEQ ID N0:3的抗体VL、 SEQ ID NO :2的抗体VH和SEQ ID46的IgGl恒定区组成。
【专利附图】
【附图说明】
[0048] 图1显示了 KPL4细胞中克隆16抗HER3单克隆抗体的内化，其表现为表面荧光染 色的缺失。顶部部分显示了时间=0时的内化。底部部分显示了 2. 5小时后的内化。
[0049] 图2A显示了对应于抗HER3单克隆抗体克隆16(CL16 ;原始，亲本克隆）、克隆 16 (GL ;生殖系克隆）、5H6、8A3、4H6、6E. 3、2B11、2D 1、3A6和4C4的VL序列的多重序列比对。 显示了⑶R1、⑶R2和⑶R3的位置。将不同于CL16(GL)抗体的氨基酸残基加亮。
[0050] 图2B显示了对应于抗HER3单克隆抗体克隆16(CL16 ;亲本克隆）以及克隆 15D12. 1(也称为15D12. I)和15D12. 2(也称为15D12. V)的VH序列的多重序列比对。显示 了⑶R1、⑶R2和⑶R3的位置。将不同于CL16亲本抗体的氨基酸残基加亮。
[0051] 图2C显示了对应于抗HER3单克隆抗体CL16(原始，亲本克隆）、CL16(GL ;生殖系 克隆）、1A4、2C2、3E.1、2F10和2B11的VL序列的多重序列比对。显示了CDR1、CDR2和CDR3 的位置。将不同于CL16(GL)抗体的氨基酸残基加亮。
[0052] 图3显示了配体驱动的MCF-7细胞中HER3磷酸化（pHER3)的抑制，其中HER3仅 通过外源HRG (配体）激活。测定了 2C2抗HER3单克隆、公开的抗HER3单克隆抗体AMG和 MM，以及R347对照抗体。提供了 pHER3的最大抑制百分比和IC5Q。
[0053] 图4显示了 MDA-MB-175细胞中的生长抑制，它是已确立的HRG-自分泌环驱动模 型，其中内源HRG驱动HER3活性和细胞生长。测定了 2C2抗HER3单克隆、公开的抗HER3 单克隆抗体AMG和MM，以及R347对照抗体。提供了最大生长抑制百分比和IC 5(I。
[0054] 图5显示了 HMCB细胞中的生长抑制，它是已确立的HRG-自分泌环驱动模型，其中 内源HRG驱动HER3活性和细胞生长。测定了 2C2抗HER3单克隆、公开的抗HER3单克隆抗 体AMG和丽，以及R347对照抗体。提供了 IC5Q。
[0055] 图6显示在该配体依赖性黑素瘤中2C2不但抑制HMCB细胞生长，而且还抑制HER3 磷酸化（PHER3)和AKT磷酸化（ρΑΚΤ)。
[0056] 图7显示在配体依赖性A549NSCLC中2C2抑制HER3磷酸化（pHER3)和ΑΚΤ磷酸 化（ρΑΚΤ)。
[0057] 图8显示在肺癌、胃癌和乳腺癌的细胞模型中HER3磷酸化（pHER3)的抑制。部 分Α显示了 HCC827细胞系（具有EGFR/HER3信息交流（cross-talk)的突变体EGFR驱 动的NSCLC模型）中pHER3的抑制。部分B显示了通过用EGFR TKI长期处理所获得的 EGFR-TKI-耐受性HCC827NSCLC模型中pHER3的抑制。部分C显示了 MKN45细胞系（具有 CMET-HER3信息交流（cross-talk)的cMET扩增的胃癌模型）中pHER3的抑制。部分D显 示了 Kato III细胞系（具有FGFR2-HER3信息交流（cross-talk)的FGFR2扩增的胃癌模 型）中PHER3的抑制。部分E显示了 BT-474细胞系（HER2扩增的乳腺癌非配体依赖性模 型（即细胞缺少HRG表达））中pHER3的抑制。测定了 2C2抗HER3单克隆、公开的抗HER3 单克隆抗体AMG和MM，以及R347对照抗体。提供了 pHER3的最大抑制百分比和IC5Q。
[0058] 图9显示在胃癌和乳腺癌的细胞模型中AKT磷酸化（ρΑΚΤ)的抑制。部分A显示 了 MKN45细胞系中ρΑΚΤ的抑制。部分B显示了 Kato III细胞系中ρΑΚΤ的抑制。部分C 显示了 ΒΤ-474细胞系（HER2扩增的乳腺癌非配体依赖性模型（即细胞缺少HRG表达））中 ρΑΚΤ的抑制。测定了 2C2抗HER3单克隆、公开的抗HER3单克隆抗体AMG和丽，以及R347 对照抗体。提供了 ρΑΚΤ的最大抑制百分比和IC5(I。
[0059] 图10显示2C2抑制MDA-MB-361细胞中的细胞信号和增殖。部分A显示在HER2 扩增的MDA-MB-361细胞中2C2抑制HER3磷酸化（pHER3)。部分B显示2C2以剂量依赖性 方式抑制细胞生长。显示了 6和14天处理时的百分比抑制率（分别为上部分和下部分）。
[0060] 图11显示了在表达高水平HRG的HARA-B细胞中2C2抑制HER3磷酸化（pHER3)。
[0061] 图12显示2C2和rhuMab2C4而不是EGFR拮抗剂西妥昔单抗或吉非替尼抑制HRG 配体依赖性信号（部分A和B的底部）。部分A和B的顶部部分为基底细胞，SW620 (部分 A，左侧）、SW480 (部分A，中间）、C〇1〇205 (部分A，右侧）、L0V0 (部分B，左侧）、HCT15 (部 分B，中间）和Caco-2 (部分B，右侧）。
[0062] 图13显示了测量克隆16、公开的AMG和丽抗HER3单克隆抗体、阳性对照配体阻 断的抗HER3单克隆抗体和R347对照抗体直接阻断HRG结合至HER3的HRG-HER3ELISA结 合测定。
[0063] 图14显示2C2阻断了 HER2-HER3的二聚。部分A显示评价配体依赖性模型T-47D 细胞中HER2-HER3复合物形成程度的HRG可诱导的HER2-HER3二聚测定，其显示用2C2、 CL16、AMG和丽抗HER3单克隆抗体预处理的清楚的HRG诱导的HER2-HER3结合。所有抗 HER3抗体阻断这种配体诱导的HER2-HER3二聚作用。部分B显示了评价BT-474细胞中 HER2-HER3复合物形成程度的非配体依赖性HER2-HER3二聚测定，用2C2或CL16预处理阻 断了这种非配体依赖性HER2-HER3二聚作用。
[0064] 图15显示了 2C2诱导的HER3内化和降解。部分A显示了定量对两种不同2C2单 克隆抗体浓度反应的时间过程和目标内化程度的基于FACS的内化测定。部分B显示了用抗 HER32C2单克隆抗体或R347对照抗体预处理的模型结肠直肠癌细胞Lovo、HCT15和SW620 中的HER3降解作用。
[0065] 图16显示了基于FACS的细胞周期分析，其表明在SkBR3细胞中，HER2扩增的乳 腺癌细胞类似于BT-474, HerceptilT? (曲妥珠单抗）和CL16单克隆抗体（2C2单克隆抗 体的亲本前导抗体（parental lead))两者均导致在G1期的细胞周期停滞。还显示了对应 于用R347对照抗体和用rhuMAb2C4抗HER2单克隆抗体（帕妥珠单抗/ Omnitarg? )处 理的细胞的结果。
[0066] 图17显示了抗HER3抗体对HRG诱导的VEGF分泌的抑制。部分A显示了用抗HER3 单克隆抗体CL16和Merrimack MM、抗HER2单克隆抗体Herceptill? (曲妥珠单抗），或R347 对照抗体预处理的BT-474乳腺癌细胞中VEGF分泌的变化。部分B显示了用抗HER3单克 隆抗体CL16和MerrimBck MM、抗HER2单克隆抗体·Herceptin? (曲妥珠单抗），或R347对 照抗体预处理的MCF-7模型乳腺癌细胞中VEGF分泌的变化。
[0067] 图18显示抗HER3单克隆抗体2C2结合至在Ad293细胞中异位表达的基于细胞表 面的食蟹猴HER3(cyno HER3)并调节其活性。部分A显示了用对照载体（左侧）或表达食 蟹猴HER3的载体（右侧）转染的Ad293细胞的免疫印迹分析。在具有或不具有HRG共刺 激的情况下，用2C2或对照抗体（R347)处理细胞，并用抗HER3 (中间印迹）、抗pHER3 (顶部 印迹）和抗GAPDH(底部印迹）抗体探查。部分B表示部分A的上方4个泳道中基于密度 测定法的PHER3定量。
[0068] 图19显示在使用人FADU头颈异种移植模型时，施用2C2单克隆抗体后肿瘤体积 的剂量依赖性减小。部分A显示在该模型中每周施用两次7mg/kg的2C2是最有效的，其 dTGI (肿瘤生长抑制）为99%。部分B显示在使用人FADU头颈异种移植模型时，在混合施 用2C2单克隆抗体和抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗后肿瘤体积显著减小。组合治疗在10 个中产生了 7个部分消退并且在10个中产生了 2个完全消退。
[0069] 图20显示在向具有肿瘤的小鼠施用5mg/kg或30mg/kg的单次剂量和反复剂量 后2C2的非线性药物动力学。数据表明小鼠 HER3用作吸附物（sink)以结合施用于小鼠的 2C2,并且作为单次剂量的30mg/kg足以使所述吸附物（sink)饱和。
[0070] 图21显示在使用人FADU头颈异种移植模型时10mg/kg负荷剂量的单克隆抗体 2C2的抗肿瘤益处。施用2C2负荷剂量以饱和小鼠 HER3吸附物使得3mg/kg的2C2能够显 示出强烈的抗肿瘤活性，而无负荷剂量的3mg/kg的2C2仅具有适度的活性。
[0071] 图22显示用2C2-YTE处理降低了 FADU异种移植肿瘤提取物中pHER3和ρΑΚΤ的 水平。在该实验中，PHER3和ρΑΚΤ的水平分别降低了 59. 5%和51. 7%。在该实验中，在总 HER3水平中未观察到变化。
[0072] 图23显示在使用人Detroit562头颈异种移植模型时，施用2C2单克隆抗体后肿 瘤体积的剂量依赖性减小。部分A显示每周施用2次10mg/kg的2C2是最有效的，其dTGI 为72%。部分B显示在使用人Detroit562头颈异种移植模型时，在混合施用2C2单克隆抗 体和抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗后肿瘤体积减小。组合治疗在10个中产生了 9个部分 消退，而单独的西妥昔单抗在10个中产生了 5个部分消退。Detroit562异种移植模型含有 PIK3CA 突变。
[0073] 图24显示在使用人CAL27头颈异种移植模型时，在施用2C2-YTE单克隆抗体后肿 瘤体积的剂量依赖性减小。
[0074] 图25显示在使用人A549NSCLC异种移植模型时，施用2C2单克隆抗体后肿瘤体积 的剂量依赖性减小。部分A显示每周施用2次30mg/kg的2C2至处理期的最后一天（第33 天；之后是再生长）是最有效的，其dTGI为91%。10mg/kg时的2C2-YTE和2C2具有相当 的活性。部分B显示在使用人a549NSCLC异种移植模型时，在混合施用2C2单克隆抗体和 抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗后肿瘤体积减小。在处理期期间，向2C2加入西妥昔单抗提 高了 2C2的活性，并且在肿瘤再生长期期间延缓了肿瘤的再生长。A549异种移植模型含有 KRAS突变和LKB-1缺失。
[0075] 图26显示在使用人HARA-B鳞状细胞癌异种移植模型时，在施用2C2-YTE单克隆 抗体后肿瘤体积减小。每周施用2次30mg/kg的2C2-YTE是最有效的，其dTGI为64. 6%。 l〇mg/kg的2C2-YTE具有相当的活性，而3mg/kg的2C2-YTE无活性。
[0076] 图27显示在使用人HT-29结肠直肠异种移植模型时，施用2C2单克隆抗体后肿瘤 体积的剂量依赖性减小。每周施用2次30mg/kg的2C2至处理期的最后一天（第26天；之 后是再生长）是最有效的，其dTGI为56%。30mg/kg时的2C2-YTE和2C2具有相当的活性。 HT-29异种移植模型含有BRAF突变。
[0077] 图28显示在使用人HCT-116结肠直肠异种移植模型时，施用2C2单克隆抗体后肿 瘤体积减小。每周施用2次30mg/kg的2C2是最有效的，其dTGI为43%。10mg/kg时的 2C2-YTE和2C2具有相当的活性。HCT-116异种移植模型含有KRAS突变。
[0078] 图29显示在使用人L0V0结肠直肠异种移植模型时，施用2C2单克隆抗体后肿 瘤体积减小。每周施用2次30mg/kg的2C2是最有效的，其dTGI为48%。10mg/kg时的 2C2-YTE和2C2具有相当的活性。L0V0异种移植模型含有KRAS突变。
[0079] 图30显示在使用人DU145前列腺异种移植模型时，施用2C2单克隆抗体后肿瘤体 积减小。每周施用2次30mg/kg的2C2是最有效的，其dTGI为77%。DU145异种移植模型 含有LKB-1缺失。
[0080] 图31显示在使用人BT-474乳腺癌正位异种移植模型时，施用2C2单克隆抗体后 肿瘤体积减小。部分A显示每周施用2次30mg/kg的2C2是最有效的，其dTGI为55%。部 分B显示在使用人BT-474乳腺癌正位异种移植模型时，在混合施用2C2单克隆抗体和小分 子药物拉帕替尼后肿瘤体积减小。在处理期期间，向拉帕替尼加入2C2提高了拉帕替尼的 活性，并且在肿瘤再生长期期间适当延缓了肿瘤的再生长。在处理期期间，作为单一效力治 疗，30mg/kg时的2C2-YTE和2C2具有相当的活性。部分C显示在使用人BT-474乳腺癌正 位异种移植模型时，在施用2C2单克隆抗体后肿瘤体积减小。在该模型中，单独的曲妥珠单 抗是非常有活性的，并且在该模型中，通过2C2是加入观察到了轻微的提高。BT-474异种移 植模型含有扩增的HER2 (通过Here印Test为3+)。
[0081] 图32显示用克隆16 (2C2前体）处理降低了 BT-474异种移植肿瘤提取物中pHER3 和ρΑΚΤ的水平。在该实验中，pHER3和ρΑΚΤ的水平分别降低了 50%和46. 1%。在该实验 中，在总HER3水平中未观察到变化。
[0082] 图33显示在使用人MCF-7乳腺癌正位异种移植模型时，施用2C2单克隆抗体后肿 瘤体积减小。部分A显示每周施用2次lOmg/kg的2C2是最有效的，其dTGI为34%。10mg/ kg时的2C2-YTE和2C2具有相当的活性。部分B显示在使用人MCF-7乳腺癌正位异种移 植模型时，在混合施用2C2单克隆抗体和小分子药物紫杉醇后肿瘤体积减小。向紫杉醇中 加入2C2提高了处理期期间紫杉醇的活性。MCF-7异种移植模型含有低水平的HER2 (通过 HercepTest 为 1+)。
[0083] 图34显示使用人MDA-MB-361乳腺癌正位异种移植模型（部分A-C)时，在2C2-YTE 施用后肿瘤体积减小。在处理期期间，向单克隆抗体曲妥珠单抗加入2C2-YTE提高了曲妥 珠单抗的活性，并且在肿瘤再生长期期间延缓了肿瘤的再生长（部分A)。向单克隆抗体 rhuMAb2C4加入2C2-YTE适当提高了 rhuMAb2C4的活性，但是不会延缓肿瘤的再生长（部分 B)。向小分子药物拉帕替尼中加入2C2-YTE提高了拉帕替尼的活性，但是不会延缓肿瘤的 再生长（部分C)。
[0084] 图35显示在这些抗体60mg/kg的单次剂量后，与2C2和克隆16-GL相比，首次接 受试验的人FcRn SCID转基因小鼠的血清中单克隆抗体2C2-YTE的延长的暴露水平。
[0085] 图36显示HER3蛋白对用MEK抑制剂（MEKi)司美替尼处理起反应的水平提高（星 号表示）。在HT-29细胞（左侧）、L0V0 (中间）和C〇1〇205 (右侧）中，用MEKi结合2C2处 理使HER3水平降低回到正常水平。还在HT-29和L0V0模型中检查了 pHER3的水平并显示 出类似的反应。
[0086] 图37显示在皮下癌症异种移植模型和A549 (部分A，顶部）、HT-29 (部分B，顶部） 和L0V0(部分C，顶部）中，2C2-YTE和司美替尼的组合提高了任一种试剂单独的抗肿瘤效 力。用所述组合处理的小鼠的肿瘤裂解液（A549、HT-29和L0V0异种移植模型）的免疫印 迹分析显示磷酸HER3和磷酸ERK被完全抑制（部分A-C，底部）。
[0087] 发明详述
[0088] 本发明提供了结合至HER3的分子及其抗原结合片段。在一些方面，这些分子是特 异性结合至HER3的抗体及其抗原结合片段。还提供了相关的多核苷酸、包含所述抗HER3 抗体或其抗原结合片段的组合物和制备抗HER3抗体和抗原结合片段的方法。还提供了使 用新型抗HER3抗体的方法，如治疗受试者中癌症的方法和诊断使用。
[0089] 为了使本发明可以更容易理解，首先定义了某些术语。这整详细说明中描述了其 他定义。
[0090] I.定义
[0091] 在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于具体的组成或处理步骤，照此它是 可以改变的。除非上下文中明确规定，否则如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形 式的"一个"和"所述"包括复数对象。在本文中，术语"一个"以及术语"一个或多个"和 "至少一个"可以互换使用。
[0092] 此外，在本文中使用时，"和/或"将作为两种指定的特征或组成中的每一个与另一 个或不与另一个一起的具体公开。因此，在本文中，如在短语如"A和/或B"中使用的，术 语"和/或"旨在包括"A和B"、"A或B"、"A(单独的）"和"B(单独的）"。同样地，如在短 语如"A、B和/或C"中所使用的，术语"和/或"旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C ; A、B或C;A或C;B或C;A和C;A和B;B和C;A(单独的）；B(单独的）；和C(单独的）。 [0093] 除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语的含义与本发明公开 相关领域技术人员通常理解的含义相同。例如，"生物医学和分子生物学简明词典（the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology)，'，Juo, Pei-Show,第二 版，2002, CRC Press; "细胞和分子生物学词典（The Dictionary of Cell and Molecular Biology)"，第三版，1999, Academic Press;和"生物化学和分子生物学牛津词典（the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)"，修订版，2000, Oxford University Press，向技术人员提供了本发明中使用的多种术语的常规词典。
[0094] 单位、前缀和符号以它们在SystSme International de Unites (SI)中接受的形 式表示。数值范围包括限定该范围的数值。除非另外说明，否则氨基酸序列以氨基至羧基 的方向从左到右书写。本文提供的标题不是对多个方面的限制，它可以通过总体上参考本 说明书得出。因此，通过全面参考本说明书对以下所定义的术语进行了更充分的定义。 [0095] 应理解在本文中用语言"包括"描述了无论哪些方面，还提供了用术语"由……组 成"和/或"基本由……组成"描述的其他类似方面。
[0096] 在本文中，用一般已知的三字母符号或用IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的 单字母符号表示氨基酸。同样地，用一般接受的单字母编码表示核苷酸。
[0097] 术语" HER3 "和" HER3受体"在本文中是可互换使用的并且表示ErbB3蛋白 (在文献中也称为HER3, ErbB3受体）如在美国专利No. 5480968和在Plowman等人， (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,4905-4909 中所述；还参见，Kani 等人，（2005) Biochemistry44, 15842-15857 和 Cho&Leahy (2002) Science297, 1330-1333。全长成熟 HER3 蛋白序列（无前导序列）对应于图4中所示的序列和美国专利No. 5480968中的SEQ ID NO: 4减去从成熟蛋白上切割下的19个氨基酸的前导序列。
[0098] 术语"抑制"可互换使用并且表示生物活性的任何统计学显著降低，其包括活性 的完全阻断。例如，"抑制"可以表示生物活性约10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、 80 %、90 %或100 %的降低。因此，当术语"抑制"用于描述，例如，对配体介导的HER3磷酸化 的影响时，则该术语是指相对于未处理（对照）细胞中的磷酸化，抗体或其抗原结合片段统 计学显著降低EGF样配体诱导的HER3磷酸化的能力。表达HER3的细胞可以是天然存在的 细胞或细胞系（例如，癌细胞）或者可以是通过将编码HER3的核酸引入至宿主细胞而重组 产生的。在一个方面，抗HER3结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段将配体介导的HER3磷 酸化抑制了至少10 %，或至少20 %，或至少30 %，或至少40 %，或至少50 %，或至少60 %， 或至少70%，或至少80%，或至少90%，或约100%，如通过（例如）免疫印迹然后用抗磷 酸酪氨酸抗体探查或通过ELISA所确定的，如以下实施例中所述。
[0099] 如本文所使用的，术语表达HER3的细胞的"生长抑制"是指相对于在不存在抗 HER3结合分子（例如，抗体或其抗原结合片段）的情况下的增殖，所述抗HER3结合分子 (例如，抗体或其抗原结合片段）统计学显著地减少表达HER3的细胞的增殖的能力。在一 个方面，当细胞与抗HER3结合分子（例如，本发明的抗体或其抗原结合片段）接触时，相对 于在不存在所述抗HER3结合分子（例如，抗体或其抗原结合片段）时所测量的增殖（对照 条件），表达HER3的细胞（例如，癌细胞）的增殖能够减少至少10%，或至少20%，或至少 30 %，或至少40 %，或至少50 %，或至少60 %，或至少70 %，或至少80 %，或至少90 %或约 100%。可以使用本领域承认的技术通过测量细胞分裂率（细胞群体内经历细胞分裂的细 胞部分）和/或由于终末分化或细胞死亡（例如，胸苷掺入）所造成的细胞群体中的细胞 损失率来测定细胞增殖。
[0100] 在本文中，术语"抗体"或"免疫球蛋白"是可互换使用的，其包括完整抗体及其任 何抗原结合片段或单链。
[0101] 典型的抗体包含通过二硫键相互连接的至少两条重链（H)和两条轻链（L)。每 条重链由重链可变区（在本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区包括三个域， CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区（在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链 恒定区包括一个域，CL。VH和VL区还可以再分为与更保守的区域（称为框架区（FW))相 互交替的高变区（称为互补决定区（⑶R))。每个VH和VL由3个⑶R和4个FW组成，它 们从氨基末端至羧基末端按以下顺序布置JWi、CDR1、FW 2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。重链和轻 链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区能够介导免疫球蛋白与宿主组织 或因子的结合，其包括免疫系统的多种细胞（例如，效应细胞）和经典补体系统的第一组分 (Clq)。本发明的示例性抗体包括克隆16(CL16)抗HER3抗体（原始和生殖系）、亲合力优 化克隆，其包括（例如）抗HER32C2抗体，和血清半衰期优化抗HER3抗体，其包括（例如） 抗 HER32C2-YTE 抗体。
[0102] 术语"生殖系"是指抗体中特定位置的氨基酸突变回到生殖系中的那些氨基酸。参 见，例如，CL16 "生殖系"抗体是通过将三个点突变Y2S、E3V和M20I引入至VL区的FWi中 从原始CL16抗体所产生的。
[0103] 术语"抗体"是指通过免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点识别并 特异性结合至靶标（如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或上述的组合）的免 疫球蛋白分子。如本文所使用的，只要抗体显示出所需的生物活性，则术语"抗体"涵盖了 完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段（如Fab、Fab'、F(ab'）2和Fv片段）、单链 Fv(scFv)突变体、从至少两个完整抗体产生的多重特异性抗体（如双重特异性抗体）、嵌合 抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任 何其他修饰的免疫球蛋白分子。抗体可以是五大类免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、 1 86和1811，或者它们的亚类（同种型）（例如，1861、1862、1863、1864、1841和1842)，根据 它们重链恒定区的同一性，其分别称为α、δ、ε、 Y和μ。不同种类的免疫球蛋白具有不 同的并且熟知的亚单位结构和立体构型。抗体可以是裸抗体或者可以结合至其他分子，如 毒素、放射性同位素等。
[0104] "阻断"抗体或者"拮抗剂"抗体是抑制或降低它所结合的抗原（如HER3)的生物 活性的抗体。在某些方面，阻断抗体或者拮抗剂抗体显著或完全抑制抗原的生物活性。期 望地，所述生物活性降低了 10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%或者甚至100%。
[0105] 术语"HER3抗体"或者"结合至HER3的抗体"或者"抗HER3"是指能够以足够的 亲合力结合HER3从而使所述抗体在作为靶向HER3的治疗剂或诊断剂时有用的抗体。抗 HER3抗体与不相关的非HER3蛋白结合的程度小于抗体与HER3结合的约10%，如通过（例 如）放射免疫测定（RIA)、BIAC0RE?(使用重组HER3作为分析物并使用抗体作为配体，或反 之），或本领域中已知的其他结合测定所测量的。在某些方面，结合至HER3的抗体的解离常 数（K D)彡 1 μ M、彡 ΙΟΟηΜ、彡 10nM、彡 InM、彡 0· InM、彡 10pM、彡 ΙρΜ 或彡 0· ΙρΜ。
[0106] 术语"抗原结合片段"是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的抗原决定可变 区。在本领域中，已知能够通过全长抗体的片段实施抗体的抗原结合功能。抗体片段的实 例包括（但不限于）Fab、Fab'、F(ab'）2和Fv片段、线性抗体（linear antibody)、单链抗 体和由抗体片段形成的多重特异性抗体。
[0107] "单克隆抗体"是指参与高特异性识别和单一抗原决定簇或表位的结合的同源性 抗体群。这与通常包含针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体形成对比。术语"单 克隆抗体"涵盖了完整和全长单克隆抗体以及抗体片段（如Fab、Fab'、F (ab'）2、Fv)、单链 (scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋 白分子。此外，"单克隆抗体"是指以多种方式制备的这些抗体，所述方式包括（但不限于） 通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。
[0108] 术语"人源化抗体"是指来源于非人（例如，鼠）免疫球蛋白的抗体，其已通过工程 设计包含了最少的非人（例如，鼠）序列。通常，人源化抗体是其中来自互补决定区（CDR) 的残基被具有所需特异性、亲合力和能力的来自非人物种（例如，小鼠、大鼠、兔或仓鼠）的 ⑶R的残基取代的人免疫球蛋白（Jones等人，1986, Nature, 321:522-525 ;Riechmann等 人，1988, Nature, 332:323-327 ;Verhoeyen 等人，1988, Science, 239:1534-1536)。在一些 情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区（FW)残基被具有所需特异性、亲合力和能力的非人物种 的抗体中相应的残基取代。
[0109] 可以通过Fv框架区中和/或取代的非人残基内其他残基的取代来进一步修饰人 源化抗体以改善和优化抗体特异性、亲合力和/或能力。一般地，人源化抗体将包含基本 全部的至少一个，并且通常两个或三个可变区，所述可变区包含全部或基本全部的对应于 非人免疫球蛋白的CDR区，而全部或基本全部的FR区为人免疫球蛋白共有序列的那些。 人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区或结构域（Fc)的至少一部分，所述恒定区或域 通常为人免疫球蛋白的恒定区或结构域。用于产生人源化抗体的方法的实例在美国专利 No. 5225539或5639641中有所描述。
[0110] 抗体的"可变区"是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。重链 和轻链可变区分别由通过三个也称为高变区的互补决定区（CDR)连接的四个框架区（FW) 组成。每条链中的⑶R通过FW区紧密结合在一起，并且与来自另一条链的⑶R -起促进抗 体的抗原结合位点的形成。用于确定CDR的技术至少有两种：（1)基于物种间序列差异性 的方法（艮P Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (第 5 版， 1991，National Institutes of Health, Bethesda Md·));和（2)基于抗原抗体复合物的晶 体学研究的方法（Al-lazikani 等人，（1997) J.Molec. Biol. 273:927-948))。另外，有时在 本领域中使用了这两种方法的组合来确定⑶R。
[0111] 当提及可变区中的残基（大致为轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常 使用 Kabat 编号系统（例如，Kabat 等人，Sequences of Immunological Interest,第 5 版.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))〇
[0112] 如Kabat中氨基酸的位置编号是指Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)中抗体汇编的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系 统。使用该编号系统，真实的线性氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FW或CDR的缩 短或插入的较少或其他的氨基酸。例如，重链可变结构域可以在H2的残基52之后包含单 个氨基酸插入（根据Kabat，残基52a)和在重链FW残基82之后包含插入的残基（例如，根 据 Kabat，残基 82a、82b 和 82c 等）。
[0113] 表 1
[0114]
【权利要求】
1. 一种分离的结合分子或其抗原结合片段，其特异性结合至HER3胞外域内表位，其 中，所述结合分子特异性结合至与包含CL16或2C2的重链可变区（VH)和轻链可变区（VL) 的抗体或其抗原结合片段相同的HER3表位。
2. -种分离的结合分子或其抗原结合片段，其特异性结合至HER3,并且通过包含CL16 或2C2的VH和VL的抗体或其抗原结合片段竞争性抑制HER3结合。
3. 根据权利要求1或权利要求2所述的结合分子或其片段，其中，CL16的VH和VL分 别包含SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:1，并且2C2的VH和VL分别包含SEQ ID N0:2和SEQ ID NO :3。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的结合分子或其片段，其包含抗体或其抗原结合片 段。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的结合分子或其片段，其中，所述结合分子是亲合 力成熟的。
6. -种特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其包含抗体VL，其中 所述VL包含以下氨基酸序列 ： [FffJ XiGSX^NIGLNYVS [Fff2] RNNQRPS [Fff3] AAWDDX3X4X5GEX6 [Fff4] 其中，[FWJ、[FW2]、[FW3]和[FWJ代表VL框架区，并且其中 (a) &代表氨基酸残基精氨酸（R)或丝氨酸（S)， 〇3)&代表氨基酸残基丝氨酸（S)或亮氨酸（L)， (0&代表氨基酸残基丝氨酸（S)或甘氨酸（G)， (d) X4R表氨基酸残基亮氨酸（L)或脯氨酸（P)， (e) X5R表氨基酸残基精氨酸（R)、异亮氨酸（I)、脯氨酸（P)或丝氨酸（S)，和 (f) X6R表氨基酸残基缬氨酸（V)或丙氨酸（A)。
7. 根据权利要求6所述的结合分子或其片段，其中，FWi包含SEQ ID N0:40或SEQ ID NO :44, FW2 包含 SEQ ID NO :41，FW3 包含 SEQ ID NO :42,和 FW4 包含 SEQ ID NO :43。
8. -种特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其包含抗体VH，其中 所述VH包含以下氨基酸序列 ： [fw5] yyymq [fw6] x7igssggvtnyadsvkg [fw7] vglgdafdi [f ff8] 其中，[FW5]、[FW6]、[FW7]和[FW8]代表VH框架区，并且其中x 7代表氨基酸残基酪氨酸 (Y)、异亮氨酸（I)或缬氨酸（V)。
9. 根据权利要求8所述的结合分子或其片段，其中，FW5包含SEQ ID N0:36, FW6包含 SEQ ID NO :37，FW7 包含 SEQ ID NO :38 并且 FW8 包含 SEQ ID NO :39。
10. -种特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其包含抗体VL和抗 体VH，其中所述VL包含以下氨基酸序列 ： [FffJ XiGSX^NIGLNYVS [Fff2] RNNQRPS [Fff3] AAWDDX3X4X5GEX6 [Fff4] 其中，[FWJ、[FW2]、[FW3]和[FWJ代表VL框架区，并且其中 (a) &代表氨基酸残基精氨酸（R)或丝氨酸（S)， 〇3)&代表氨基酸残基丝氨酸（S)或亮氨酸（L)， (0&代表氨基酸残基丝氨酸（S)或甘氨酸（G)， (d)X4R表氨基酸残基亮氨酸（L)或脯氨酸（P)， (e) X5R表氨基酸残基精氨酸（R)、异亮氨酸（I)、脯氨酸（P)或丝氨酸（S)，和 (f) X6R表氨基酸残基缬氨酸（V)或丙氨酸（A)，和 其中所述VH包含以下氨基酸序列： [Fff5] YYYMQ [Fff6] X7IGSSGGVTNYADSVKG [Fff7] VGLGDAFDI [F ff8] 其中，[FW5]、[FW6]、[FW7]和[FW8]代表VH框架区，并且其中X 7代表氨基酸残基酪氨酸 (Y)、异亮氨酸（I)或缬氨酸（V)。
11. 根据权利要求10所述的结合分子或其片段，其中，FWi包含SEQ ID N0:40或SEQ ID NO :44, FW2 包含 SEQ ID NO :41，FW3 包含 SEQ ID NO :42, FW4 包含 SEQ ID NO :43, FW5 包 含 SEQ ID NO :36, FW6 包含 SEQ ID NO :37, FW7 包含 SEQ ID NO :38 和 FW8 包含 SEQ ID NO : 39 〇
12. 根据权利要求6-11中任一项所述的结合分子或其片段，其包含抗体或其抗原结合 片段。
13. -种特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其包含抗体VL，其 中，所述VL包含与SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19或SEQ ID NO :20相同，或者除了 4个、3 个、2个或1个氨基酸取代之外与SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19或SEQ ID N0:20相同的 VL互补决定区-1 (VL-⑶Rl)氨基酸序列。
14. 一种特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其包含抗体VL，其 中所述VL包含与SEQ ID NO :21相同，或者除了 4个、3个、2个或1个氨基酸取代之外与 SEQ ID NO :21相同的VL互补决定区-2(VL-CDR2)氨基酸序列。
15. -种特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其包含抗体VL，其 中所述 VL 包含与 SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29 或 SEQ ID NO :30 相同，或者除了 4 个、 3 个、2 个或 1 个氨基酸取代之外与 SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29 或 SEQ ID NO :30 相 同的互补决定区-3 (VL-⑶R3)氨基酸序列。
16. -种特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其包含抗体VH，其 中所述VH包含与SEQ ID NO :31相同，或者除了 4个、3个、2个或1个氨基酸取代之外与 SEQ ID N0:31相同的互补决定区-1(VH-⑶R1)氨基酸序列。
17. -种特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其包含抗体VH，其 中所述VH包含与SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:33或SEQ ID N0:34相同，或者除了 4个、3个、 2个或1个氨基酸取代之外与SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33或SEQ ID NO :34相同的互补 决定区-2(VH-⑶R2)氨基酸序列。
18. -种特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其包含抗体VH，其 中所述VH包含与SEQ ID NO :35相同，或者除了 4个、3个、2个或3个氨基酸取代之外与 SEQ ID N0:35相同的互补决定区-3(VH-⑶R3)氨基酸序列。
19. 一种特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其包含抗体VL，其 中所述VL包含在一种或多种VL-VDR中分别与以下氨基酸序列相同，或者除了 4个、3个、2 个或1个氨基酸取代外与之相同的VL-⑶Rl、VL-⑶R2和VL-⑶R3氨基酸序列，所述氨基酸 序列为：SEQ ID NO :18、21 和 22, SEQ ID NO :18、21 和 26, SEQ ID NO :18、21 和 27, SEQ ID N0:20、21和22，SEQIDN0:19、21和22，SEQIDN0:18、21和25，SEQIDN0 :18、21和28， SEQ ID NO :18、21 和 29, SEQ ID NO :18、21 和 30, SEQ ID NO :18、21 和 23, SEQ ID NO :19、 21和23，SEQIDN0:20、21和23，SEQIDN0:18、21和24，或SEQIDN0 :18、21和25。
20. -种特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其包含抗体VH，其 中所述VH包含在一种或多种VH-VDR中分别与以下氨基酸序列相同，或者除了 4个、3个、2 个或1个氨基酸取代外与之相同的VH-⑶Rl、VH-⑶R2和VH-⑶R3氨基酸序列，所述氨基酸 序列为：SEQ ID N0:31、32 和 35，SEQ ID N0:31、33 和 35,或 SEQ ID N0:31、34 和 35。
21. 根据权利要求13-20中任一项所述的结合分子，其中，所述结合分子或其片段包含 抗体或其抗原结合片段。
22. -种特异性结合至HER3的分离的抗体或其抗原结合片段，其包含VL和VH，所述VL 和VH包含在一个或多个CDR中分别与以下氨基酸序列相同，或者除4个、3个、2个或1个氨 基酸取代外与之相同的 VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3, VH-CDR1、VH-CDR2 和 VH-CDR3 氨基酸 序列，所述氨基酸序列为：SEQIDN0:18、21、22、31、32和35，SEQIDN0 :18、21、26、31、32 和35，SEQIDN0:18、21、27、31、32和35，SEQIDN0 :20、21、22、31、32和35，SEQIDN0: 19、21、22、31、32和35，SEQIDN0:18、21、25、31、32和35，SEQIDN0:18、21、28、31、32和 35，SEQIDN0 :18、21、29、31、32和35，SEQIDN0:18、21、30、31、32和35，SEQIDN0 :18、 21、23、31、32和35，SEQIDN0:19、21、23、31、32和35，SEQIDN0 :20、21、23、31、32和35， SEQIDN0:18、21、24、31、32和35，或SEQIDN0:18、21、25、31、32和35。
23. -种特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其包含抗体VL和抗 体VH，其中所述VL包含与参比氨基酸序列至少约90 %至约100 %相同的氨基酸序列，所述 参比氨基酸序列选自 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO ：7, SEQ ID NO ：8, SEQ ID NO ：9, SEQ ID NO ：10, SEQ ID NO ：1U SEQ ID NO ： 14、SEQIDN0:15、SEQIDN0:16和SEQIDN0:17。
24. -种特异性结合至HER3的分离的结合分子或其抗原结合片段，其包含抗体VL和抗 体VH，其中所述VH包含与参比氨基酸序列至少约90%至约100%相同的氨基酸序列，所述 参比氨基酸序列选自SEQIDN0 :2、SEQIDN0:12和SEQIDN0:13。
25. 根据权利要求23或权利要求24所述的结合分子或其片段，其包含抗体或其抗原结 合片段。
26. -种特异性结合至HER3的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结 合片段包含VL，所述VL包含与参比氨基酸序列至少约90 %至约100 %相同的序列，所述参 比氨基酸序列选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO : 6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO : 15、SEQ ID NO :16和SEQ ID NO : 17,并且其中所述抗体或抗原结合片段包 含VH，所述VH包含与参比氨基酸序列至少约90 %至约100 %相同的序列，所述参比氨基酸 序列选自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :12 和 SEQ ID NO :13。
27. -种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含VL和VH，所述VL包含表4中所提供的 VL共有序列且所述VH包含表4中所提供的VH共有序列。
28. -种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含VL和VH，所述VL包含SEQ ID N0:3且 所述VH包含SEQ ID NO :2。
29. 根据权利要求4、12、21、22或25-28中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包 含重链恒定区或其片段。
30. 根据权利要求29所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述重链恒定区或其片段 是IgG恒定区。
31. 根据权利要求30所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述IgG恒定区选自IgGl 恒定区、IgG2恒定区、IgG3恒定区和IgG4恒定区。
32. 根据权利要求30所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述IgG恒定区是IgGl恒 定区。
33. 根据权利要求4、12、21、22或25-32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包 含轻链恒定区，所述轻链恒定区选自人κ恒定区和人λ恒定区。
34. 根据权利要求30-32中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述IgG恒定结 构域包含相对于野生型IgG恒定结构域的一个或多个氨基酸取代，其中与具有野生型IgG 恒定结构域的IgG的半衰期相比，所述修饰的IgG具有增加的半衰期。
35. 根据权利要求31所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中，所述IgG恒定结构域在 位置251-257、285-290、308-314、385-389和428-436处包含氨基酸残基的一个或多个氨基 酸取代，其中所述编号是根据如Kabat中所述的EU索引进行的。
36. 根据权利要求35所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中，至少一个IgG恒定结构 域氨基酸取代选自： (a) 位置252处使用酪氨酸（Y)、苯丙氨酸（F)、色氨酸（W)或苏氨酸（T)的氨基酸取 代， (b) 位置254处使用苏氨酸（T)的氨基酸取代， (c) 位置256处，使用丝氨酸（S)、精氨酸（R)、谷氨酰胺（Q)、谷氨酸（E)、天冬氨酸（D) 或苏氨酸（T)的氨基酸取代， (d) 位置257处使用亮氨酸（L)的氨基酸取代， (e) 位置309处使用脯氨酸（P)的氨基酸取代， (f) 位置311处使用丝氨酸（S)的氨基酸取代， (g) 位置428处使用苏氨酸（T)、亮氨酸（L)、苯丙氨酸（F)或丝氨酸（S)的氨基酸取 代， (h) 位置433处使用精氨酸（R)、丝氨酸（S)、异亮氨酸（I)、脯氨酸（P)或谷氨酰胺（Q) 的氨基酸取代， (i) 位置434处使用色氨酸（W)、蛋氨酸（M)、丝氨酸（S)、组氨酸（H)、苯丙氨酸（F)或 酪氨酸的氨基酸取代，和 (j) 两种或更多种所述取代的组合， 其中，所述编号是根据如Kabat中所述的EU索引进行的。
37. 根据权利要求36所述的分离的抗体或者抗原结合片段，其中，相对于野生型人IgG 恒定结构域，所述人IgG恒定结构域在位置252、254和256处包含氨基酸取代，其中 (a) 用酪氨酸（Y)取代位置252处的氨基酸， (b) 用苏氨酸（T)取代位置254处的氨基酸，和 (c) 用谷氨酸（E)取代位置256处的氨基酸， 其中，所述编号是根据如Kabat中所述的EU索引进行的。
38. 根据权利要求37所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中，位置434处的氨基酸被 选自色氨酸（W)、蛋氨酸（M)、酪氨酸（Y)和丝氨酸（S)的氨基酸取代，并且其中所述编号是 根据如Kabat中所述的EU索引进行的。
39. 根据权利要求38所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中，位置428处的氨基酸被 选自苏氨酸（T)、亮氨酸（L)、苯丙氨酸（F)和丝氨酸（S)的氨基酸取代，并且其中所述编号 是根据如Kabat中所述的EU索引进行的。
40. 根据权利要求38所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中，位置257处的氨基酸被 亮氨酸（L)取代，并且Kabat位置434处的氨基酸被酪氨酸（Y)取代，并且其中所述编号是 根据如Kabat中所述的EU索引进行的。
41. 根据权利要求39所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中，Kabat位置428处的氨 基酸被亮氨酸（L)取代，并且Kabat位置434处的氨基酸被丝氨酸（S)取代。
42. -种特异性结合至HER3胞外域内的表位的分离的结合分子或其抗原结合片段，其 包含SEQ ID NO :3的抗体VL、SEQ ID NO :2的抗体VH，和SEQ ID46的IgGl恒定区。
43. -种特异性结合至HER3胞外域内的表位的分离的结合分子或其抗原结合片段，其 由SEQ ID NO :3的抗体VL、SEQ ID NO :2的抗体VH和SEQ ID46的IgGl恒定区组成。
44. 根据权利要求29或权利要求30所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中，所述人 IgG恒定区相对于野生型人IgG恒定结构域在位置252、254和256包含氨基酸取代，其中所 述编号是根据如Kabat中所述的EU索引进行的，并且其中 (a) 用酪氨酸（Y)取代位置252处的氨基酸， (b) 用苏氨酸（T)取代位置254处的氨基酸，和 (c) 用谷氨酸（E)取代位置256处的氨基酸。
45. 根据权利要求4、12、21、22或25-44中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所 述抗体是完全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、多重特 异性抗体，或它们的抗原结合片段。
46. 根据权利要求4、12、21、22或25-45中任一项所述的抗原结合片段，其为Fv、Fab、 F(ab'）2、Fab'、dsFv、scFv 和 sc (Fv) 2。
47. 根据权利要求4、12、21、22或25-46中任一项所述的抗体或其片段，其结合至至少 一种异源试剂。
48. 包含根据权利要求4、12、21、22或25-47中任一项所述的抗体或其片段和载体的组 合物。
49. 包含编码根据权利要求4、12、21、22或25-48中任一项所述的抗体的序列的核酸。
50. 包含根据权利要求49所述的核酸的组合物。
51. 包含根据权利要求49所述的核酸的载体。
52. 包含根据权利要求49所述的核酸序列、根据权利要求50所述的组合物或根据权利 要求51所述的载体的宿主细胞。
53. -种制备根据权利要求4、12、21、22或25-46中任一项所述的抗体或抗原结合片段 的方法，包括（a)培养根据权利要求46所述的细胞；和（b)分离所述抗体或其抗原结合片 段。
54. 根据权利要求48所述的组合物，还包含抗癌剂。
55. -种诊断试剂，包含被标记的根据权利要求4、12、21、22或25-47中任一项所述的 抗体或抗原结合片段。
56. -种试剂盒，包含根据权利要求4、12、21、22或25-47中任一项所述的抗体或根据 权利要求48或54中任一项所述的组合物。
57. 根据权利要求4、12、21、22或25-47中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其不引 起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)。
58. 根据权利要求57所述的抗体或抗原结合片段，其在BT-474细胞、SkBR3细胞或它 们的组合中不会引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)。
59. 根据权利要求4、12、21、22、25-47、57或52中任一项所述的抗体或抗原结合片段， 它是HER3的拮抗剂。
60. 根据权利要求59所述的抗体或抗原结合片段，它是选择以下的细胞中HER3的拮 抗剂，所述细胞选自BT-474细胞、SkBR3细胞、MDA-MB-175细胞、MDA-MB-361细胞、A549细 胞、HARA-B细胞、HMCB细胞、HCC827细胞、MCF-7细胞、MKN45细胞、Kato III细胞、吉非替 尼耐受性HCC827细胞，或所列举细胞的两种或更多种的组合。
61. 根据权利要求59或60中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述HER3为人 HER3。
62. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-61中任一项所述的抗体或抗原结合片段， 其中，所述抗体或抗原结合片段与HER3的结合能够减少细胞增殖。
63. 根据权利要求62所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段与 HER3的结合能够减少BT-474细胞、MDA-MB-175细胞、MDA-MB-361细胞、HMCB细胞或两种 或更多种所列举的细胞的组合中的细胞增殖。
64. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-63中任一项所述的抗体或抗原结合片段， 其中，所述抗体或抗原结合片段与HER3的结合能够减少HER3介导的信号转导。
65. 根据权利要求64所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段与 HER3的结合能够减少细胞中HER3介导的信号转导，所述细胞选自BT-474细胞、SkBR3细 胞、MDA-MB-175 细胞、MDA-MB-361 细胞、A549 细胞、HARA-B 细胞、HMCB 细胞、HCC827 细胞、 MCF-7细胞、MKN45细胞、Kato III细胞、吉非替尼耐受性HCC827细胞，或两种或更多种所 列举的细胞的组合。
66. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-65中任一项所述的抗体或抗原结合片段， 其中，所述抗体或抗原结合片段与HER3的结合能够减少配体依赖性HER3磷酸化。
67. 根据权利要求66所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段与 HER3的结合能够减少MCF-7细胞、HMCB细胞、HCC827细胞、MKN45细胞、Kato III细胞或两 种或更多种所列举的细胞的组合中的配体依赖性HER3磷酸化。
68. 根据权利要求66或67中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述配体依赖 性HER3磷酸化为HRG驱动、EGFR驱动、cMET驱动或FGFR2驱动的，或者它们的组合。
69. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-68中任一项所述的抗体或抗原结合片段， 其中，所述抗体或抗原结合片段与HER3的结合能够减少Akt蛋白激酶的配体依赖性磷酸 化。
70. 根据权利要求69所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段与 HER3的结合能够减少A549细胞、HMCB细胞、MKN45细胞、Kato III细胞或两种或更多种所 列举的细胞的组合中Akt蛋白激酶的配体依赖性磷酸化。
71. 根据权利要求69或70中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述配体依赖 性Akt磷酸化是cMET驱动的，FGFR2驱动的或两者。
72. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-71中任一项所述的抗体或抗原结合片段， 其中，所述抗体或抗原结合片段与HER3的结合能够减少非配体依赖性AKT或HER3磷酸化。
73. 根据权利要求72所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段与 HER3的结合能够减少BT-474细胞中非配体依赖性AKT磷酸化、HER3磷酸化或两者。
74. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-73中任一项所述的抗体或抗原结合片段， 其中，所述抗体或抗原结合片段与HER3的结合能够减少对靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制剂 (TKI)耐受的细胞中的HER3磷酸化。
75. 根据权利要求74所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段与 HER3的结合能够减少吉非替尼耐受性HCC827细胞中靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制剂（TKI) 耐受性细胞中的HER3磷酸化。
76. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-75中任一项所述的抗体或抗原结合片段， 其中，所述抗体或抗原结合片段能够结合至人HER3、食蟹猴HER3和小鼠 HER3。
77. -种抑制表达HER3的细胞生长的方法，包括将所述细胞与根据权利要求4、12、21、 22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触。
78. -种治疗受试者中癌症的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要 求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
79. 根据权利要求78所述的方法，其中，所述癌症选自结肠癌、肺癌、胃癌、乳腺癌和头 颈癌。
80. 根据权利要求79所述的方法，其中，所述癌症包括包含KRAS突变的细胞。
81. 根据权利要求80所述的方法，其中，所述KRAS突变包含人KRAS基因的密码子12 的突变。
82. 根据权利要求78-81中任一项所述的方法，其中，所述受试者为人。
83. -种治疗受试者中癌症的方法，包括与治疗有效量的第二试剂组合，向所述受试者 施用治疗有效量的第一试剂，所述第一试剂是根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76所 述的抗体或其抗原结合片段，所述第二试剂是不同于所述第一试剂的抗癌剂。
84. 根据权利要求83所述的方法，其中，所述第一试剂和所述第二试剂的组合是协同 起效的。
85. 根据权利要求83或84中任一项所述的方法，其中，所述第二试剂是EGFR抑制剂、 HER2抑制剂、HER3抑制剂或MEK抑制剂。
86. 根据权利要求83-85中任一项所述的方法，其中，所述第二试剂包含抗体或其抗原 结合片段。
87. 根据权利要求86中任一项所述的方法，其中，所述第二试剂特异性结合至表皮生 长因子受体（EGFR)。
88. 根据权利要求83-87中任一项所述的方法，其中，所述第二试剂为西妥昔单抗、帕 尼单抗、马妥珠单抗或尼妥珠单抗。
89. 根据权利要求86所述的方法，其中，所述第二试剂特异性结合至HER2。
90. 根据权利要求83-87和89中任一项所述的方法，其中，所述第二试剂为曲妥珠单 抗、曲妥珠单抗-emtansine、帕妥珠单抗、MM-111或帕妥珠单抗。
91. 根据权利要求85所述的方法，其中，选自吉非替尼、卡纽替尼、拉帕替尼、厄洛替 尼、阿法替尼、来那替尼、司美替尼、WX-554、司美替尼、曲美替尼、refametinib、E-6201和 MEK-162。
92. -种抑制耐受酪氨酸激酶抑制剂的细胞生长的方法，包括将所述细胞与治疗有效 量的根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-75中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触。
93. -种治疗受试者中对酪氨酸激酶抑制剂耐受的方法，包括向所述受试者施用治疗 有效量的根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-75中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段。
94. 根据权利要求92或93中任一项所述的方法，其中，所述酪氨酸激酶抑制剂靶向 EGFR 或 HER2。
95. -种抑制耐受苏氨酸激酶抑制剂的细胞生长的方法，包括将所述细胞与治疗有效 量的根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-75中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触。
96. -种治疗受试者中对苏氨酸抑制剂耐受的方法，包括向所述受试者施用治疗有效 量的根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-75中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
97. 根据权利要求95或96所述的方法，其中，所述苏氨酸激酶抑制剂靶向MEK。
98. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以由约0.45nM(+/-0.05nM)或更好的解离常数（K D)表征的亲合力特异性结合至 HER3多肽或其片段，所述解离常数通过Biacore?表面等离子共振测定测量，其中所述抗体 或其抗原结合片段结合至Biacore?芯片。
99. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以由约〇. InM或更好的解离常数（KD)表征的亲合力特异性结合至HER3多肽或 其片段，解离常数通过Biacore?表面等离子共振测定测量，其中所述HER3多肽或其片段结 合至Biacore?芯片。
100. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以由1X 1〇5Μ?至6 X 105Μ?之间的Km和/或0. 5 X l(T4s_1和2. 0 X 10?之 间的Kf表征的亲合力特异性结合至HER3多肽或其片段，Km和/或1(。"通过Biacore?表 面等离子共振测定测量，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至Biacore?芯片。
101. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，通过ELISA测量，其能够以约30ng/mL或更好的IC 5(I特异地抑制HRG驱动的MCF-7细胞 中的HER3磷酸化。
102. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，通过ELISA测量，其能够以约10ng/mL或更好的IC 5(I特异地抑制HRG驱动的MCF-7细胞 中的HER3磷酸化。
103. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以约〇. 90 μ g/mL或更好的IC5Q特异地抑制MDAMB-175细胞中的细胞生长。
104. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以约〇. 15 μ g/mL或更好的IC5Q特异地抑制MDAMB-175细胞中的细胞生长。
105. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以约〇. 2 μ g/mL或更好的IC5(I特异地抑制HMCB细胞中的细胞生长。
106. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以约〇. 03 μ g/mL或更好的IC5Q特异地抑制HMCB细胞中的细胞生长。
107. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以约20ng/mL或更好的IC 5Q特异地抑制HCC827细胞中的HER3磷酸化。
108. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以约2ng/mL或更好的IC 5(I特异地抑制HCC827细胞中的HER3磷酸化。
109. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以约25ng/mL或更好的IC 5(I特异地抑制耐受酪氨酸激酶抑制剂的HCC827细胞中 的HER3磷酸化。
110. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以约5ng/mL或更好的IC 5(I特异地抑制耐受酪氨酸激酶抑制剂的HCC827细胞中 的HER3磷酸化。
111. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以约10ng/mL或更好的IC 5(I特异地抑制MKN45细胞中的HER3磷酸化。
112. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以约5ng/mL或更好的IC 5(I特异地抑制MKN45细胞中的HER3磷酸化。
113. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以约10ng/mL或更好的IC 5(I特异地抑制MKN45细胞中的ρΑΚΤ。
114. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以约5ng/mL或更好的IC 5(I特异地抑制ΜΚΝ45细胞中的ρΑΚΤ。
115. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以约8ng/mL或更好的IC 5Q特异地抑制Kato III细胞中的pHER。
116. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以约Ing/mL或更好的IC 5(I特异地抑制Kato III细胞中的pHER。
117. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以约5ng/mL或更好的IC 5(I特异地抑制Kato III细胞中的ρΑΚΤ。
118. 根据权利要求4、12、21、22、25-47或57-76中任一项所述的抗体或其抗原结合片 段，其能够以约Ing/mL或更好的IC 5(I特异地抑制Kato III细胞中的ρΑΚΤ。
119. 一种检测HER3活性水平的离体方法，包括检测来自受试者的皮肤活组织检查中 的磷酸化HER3的水平，其中在活组织检查之前或之后用HRG处理所述皮肤。
【文档编号】C07K16/40GK104093743SQ201280067754
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2012年11月20日 优先权日:2011年11月23日
【发明者】帕塔·S·乔杜里, D·泰斯, 肖战, 菲力浦·斯泰纳, 克丽斯塔·齐纳尔, 马龙·雷贝拉托 申请人:医学免疫有限责任公司