用于治疗人类疾病的新型糖类药物的组合物的制作方法

用于治疗人类疾病的新型糖类药物的组合物的制作方法
【专利摘要】本发明的多个方面提供了用于治疗半乳糖凝集素依赖性疾病的组合物。具体地说，组合物包括选择性解聚、支化的半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯，其主链主要由1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)部分组成，伴随较少的交替性1,4-连接的GalA和1,2-连接的鼠李糖(Rha)的主链组成，该主链转而与任意数目的主要包含1,4-b-D-半乳糖(Gal)残基和1,5-a-L-阿拉伯糖(Ara)残基的侧链连接。
【专利说明】用于治疗人类疾病的新型糖类药物的组合物
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2011年12月28日提交的美国临时申请No. 61/580,830的权益和优 先权，该文献的全部公开内容通过引用的方式完整地并入本文。

【技术领域】
[0003] 本发明的多个方面涉及药用级的多糖、其药用组合物及其制备方法。本发明的其 他方面涉及利用这些化合物和组合物治疗疾病病况的方法，诸如至少部分与半乳糖凝集素 蛋白的异常表达或者增加的表达有关的炎症、纤维化和癌症有关的医疗状况。

【背景技术】
[0004] 植物和植物产品多年来通常以对动物和人产生生理功能的特定复杂有机分子的 形式被用于获得药物产品。除了单一的特定分子之外，已经探索了植物细胞的大的、复杂的 糖类分子的结构成分在正常的生理机能和疾病中对动物和人类的多种作用。在构成植物细 胞的细胞壁的复杂糖类中，果胶代表了一类已被广泛研究的分子。
[0005] 为了评价果胶在动物和人的全身性循环和器官中的作用，已经尝试开发可以用作 药用化合物的修饰的果胶。
[0006] 因此，对提供用作肠胃外或者肠内药用化合物的修饰的果胶和制备修饰的果胶的 方法存在需求。而且，对具有为了抑制炎症和纤维化同时保持对其他细胞和组织没有毒性 而要求的药理学性质的这些化合物存在需求。


【发明内容】

[0007] 本发明的多个方面涉及一种用于肠胃外或肠内施用的化合物或者组合物，所述组 合物包含处于可接受药用载体中的化合物，所述化合物或者组合物用于治疗性制剂。
[0008] 在一些实施方案中，所述化合物是多糖并且可以在化学上定义为阿拉伯半乳 糖-鼠李糖半乳糖醛酸聚糖（在此称为化合物G)，所述化合物G是选择性解聚的支化杂聚 物，其主链主要由1，4_连接的半乳糖醛酸（GalA)和半乳糖醛酸甲酯（MeGalA)残基组成， 伴随较少的交替性1，4-连接的GalA和1，2-连接的鼠李糖（Rha)的主链组成，该主链转而 与任意数目的主要包含1，4- β -D-半乳糖（Gal)残基和1，5- a -L-阿拉伯糖（Ara)残基或 其组合的低聚物侧链连接。其他的侧链次要组分可以包括木糖（Xyl)、葡萄糖（Glu)和岩藻 糖（Fuc)或者前述的任意组合。
[0009] 在一些实施方案中，本发明的阿拉伯半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸聚糖化合物（化 合物G)能够减少TNF-α细胞因子从内毒素应激的单核细胞中的分泌。在一些实施方案中， 化合物G能够通过激活的巨噬细胞减少至少25 %的TNF- a的分泌。
[0010] 在一些实施方案中，通过气相色谱/质谱法表征，所述1，4-连接的半乳糖醛酸残 基和半乳糖醛酸甲酯残基主链可以占总糖类摩尔含量的55到85之间的摩尔百分数，所述 交替性a-1，2-连接的鼠李糖残基和a-1，4-连接的GalA残基的支化杂聚物可以占总糖 类摩尔含量的1到6之间的摩尔百分数，所述主要分支的低聚物1，4-β-D-半乳糖可以占 总糖类摩尔含量的6到15之间的摩尔百分数，并且所述主要分支的低聚物1，5- a -L-阿拉 伯糖可以占总糖类摩尔含量的2到8之间的摩尔百分数。
[0011] 在一些实施方案中，所述1，4- β -D-半乳糖残基、1，5- a -L-阿拉伯糖残基或其组 合的低聚物占总糖类摩尔含量的至少8摩尔百分数。
[0012] 在一些实施方案中，在本发明的阿拉伯半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸聚糖化合物 中，所述1，4-β-D-半乳糖残基和1，5-α-L-阿拉伯糖残基以2:1或3:1的比例存在。
[0013] 在一些实施方案中，本发明的化合物具有范围从40%到70% (最高为87%)的甲 氧基化程度。
[0014] 在一些实施方案中，本发明化合物的半乳糖醛酸甲酯与半乳糖醛酸的比例在2:1 到1:2的范围内。
[0015] 在一些实施方案中，本发明化合物的半乳糖醛酸甲酯加上半乳糖醛酸与半乳糖的 比例在4:1到7:1的范围内。
[0016] 在一些实施方案中，所述1，4-0_D-Gal残基和l，5-a-L-Ara残基在本发明化合 物中的摩尔百分比分别可以超过总摩尔糖的10%，且二者的比例大约在1:1到3:1的范围 内。
[0017] 在一些实施方案中，所述化合物是化学上定义为半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛 酸酯（化合物G)的多糖，一种平均分子量分布为2, 000到80, 000,或20, 000到70, 000,或 5, 000到55, 000道尔顿的支化杂聚物，如通过SEC-RI和/或SEC-MALLS方法确定。
[0018] 在一些实施方案中，所述化合物可以是平均分子量充分降低（例如从大约2, 000 到大约80, 000D)的高度可溶解的修饰的多糖，以便与用于经由包括但不限于静脉内、皮 下、关节内、吸入、和口服这些途径多元施用的治疗性制剂相容。
[0019] 在一些实施方案中，所述化合物可以基本上不含有微生物内毒素、农业杀虫剂、农 业除草剂、铜、重金属、蛋白质、含氮化合物或前述物质的任意组合。
[0020] 在一些实施方案中，所述化合物可以从天然的、高度支化的、加工最少和高度甲氧 基化的USP果胶合成，所述果胶可以来自任何植物，包括但不限于柑橘类水果、苹果或者甜 菜。
[0021] 在一些实施方案中，所述化合物可以从天然的、高度支化的、加工最少和高度甲氧 基化的USP果胶合成，如同从含有8-12%果胶的苹果果渣制造出的那一种。
[0022] 在一些实施方案中，所述化合物可以在糖苷连接的甲氧基化α-1，4-连接的GalA 的充分受控和特异性水解情况下合成所述化合物，同时保留含有富集量的1，4-β -D-Gal 和1，5- a -L-Ara的侧链。可以通过GC-MS (气相色谱-质谱法）和AELC-PAD (阴离子交换 液相色谱-脉冲安培检测器）法定量地测定1，4- β -D-Gal和1，5- a -L-Ara的量。
[0023] 在一些实施方案中，可以通过如下的方法产生所述化合物，S卩：该方法包括在1到 lOOmM还原形式的额外过渡金属离子如Cu++存在或不存在的情况下，通过从抗坏血酸产生 的离子化0Γ和/或过氧化物定向过氧化裂解糖苷键所分解代谢的解聚。其他过渡金属如 Ca++或Fe++可以用于此目的。
[0024] 在一些实施方案中，所述解聚化合物可以在2°C至60°C的温度暴露在8到10之间 的pH 10到30分钟以引发受控有限的去甲氧基化，以产生与最高87%的初始水平相比甲氧 基化程度为40%到70%的解聚化合物，所产生的化合物可以称为中等甲氧基化的化合物。 认为半乳糖醛酸的完全甲氧基化是大约DE 87%。
[0025] 在一些实施方案中，所述解聚组合物可以暴露于多次热酸性醇洗涤（例如在 30-80°C的温度范围内）以除去任何残留的内毒素、铜和重金属、农业污染物和其他杂质。
[0026] 在一些实施方案中，当被用于处理LX2永生化人肝星状细胞时，所述化合物不会 引起生存力降低。
[0027] 在一些实施方案中，当被用于处理产生半乳糖凝集素-3的应激的LX2永生化人肝 星状细胞时，所述化合物能够减少半乳糖凝集素-3在细胞表面的表达或者实质性减少半 乳糖凝集素-3在介质中的分泌。
[0028] 本发明的多个方面涉及一种阿拉伯半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸聚糖化合物，所述 化合物包括1，4_连接的半乳糖醛酸（GalA)残基和半乳糖醛酸甲酯（MeGalA)残基主链，所 述主链与α-1，2-连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基的交替性低聚物的支化 杂聚物连接，所述鼠李糖残基携带1，4-β-D-半乳糖残基和1，5-a-L-阿拉伯糖残基或其 组合的低聚物的主要分支，其中，所述化合物能够减少TNF-α细胞因子从内毒素应激的单 核细胞中的分泌，其中，所述化合物在癌细胞凋亡或细胞毒性模型中不抑制癌细胞的增殖， 并且其中，所述化合物对单核细胞或者激活的单核细胞没有毒性。
[0029] 在一些实施方案中，所述化合物在癌细胞中不抑制癌细胞的增殖，并且其在浓度 高达500 μ g/mL时对单核细胞或者激活的单核细胞没有细胞毒性。
[0030] 在一些实施方案中，通过气相色谱/质谱法表征，所述1，4-连接的半乳糖醛酸和 半乳糖醛酸甲酯残基主链可以占总糖类摩尔含量的55到85之间的摩尔百分数，所述交替 性α-1，2-连接的鼠李糖残基和α-1，4-连接的GalA残基的支化杂聚物可以占总糖类摩 尔含量的1到3之间的摩尔百分数，所述主要分支的低聚物1，4-β -D-半乳糖可以占总糖 类摩尔含量的6到15之间的摩尔百分数，并且所述主要分支的低聚物1，5- a -L-阿拉伯糖 可以占总糖类摩尔含量的2到8之间的摩尔百分数。
[0031] 在一些实施方案中，所述1，4-β -D-半乳糖残基、1，5-a -L-阿拉伯糖残基或其组 合可以占总糖类摩尔含量的至少8摩尔百分数。
[0032] 在一些实施方案中，所述1，4-β-D-半乳糖残基和1，5-α-L-阿拉伯糖残基可以 以2:1的比例存在。
[0033] 在一些实施方案中，所述化合物可以具有范围从5kDa到55kDa或者从2kDa到 70kDa的平均分子量。
[0034] 在一些实施方案中，所述化合物具有范围从40 %到70 % (最高为87%)的甲氧基 化程度。
[0035] 在一些实施方案中，所述化合物的半乳糖醛酸甲酯与半乳糖醛酸的比例在2:1到 1:2的范围内。
[0036] 在一些实施方案中，所述化合物的半乳糖醛酸甲酯加上半乳糖醛酸与半乳糖的比 例在4:1到8:1的范围内。
[0037] 在一些实施方案中，当被用于处理LX2永生化人肝星状细胞时，所述化合物不会 引起生存力降低。
[0038] 在一些实施方案中，当被用于处理产生半乳糖凝集素-3的应激的LX2永生化人肝 星状细胞时，所述化合物能够引起半乳糖凝集素-3在细胞表面的表达实质性减少或者半 乳糖凝集素-3在介质中的分泌实质性减少。
[0039] 本发明的多个方面涉及用于治疗性制剂的包含处于可接受药用载体中的化合物 的组合物。在一些实施方案中，所述组合物可以经由静脉内、皮下或口服途径进行肠胃外施 用。
[0040] 在一些实施方案中，所述组合物还可以包括治疗性制剂。例如，所述治疗性制剂可 以是抗氧化化合物、抗炎剂、维生素、营养补充剂或其组合。
[0041] 在一些实施方案中，所述组合物可以用于治疗非酒精性脂肪肝炎、纤维化、炎性和 自身免疫疾病、肿瘤病况或癌症。
[0042] 在一些实施方案中，所述组合物可以用于治疗肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化或者 心脏纤维化。
[0043] 在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗半乳糖凝集素至少部分参与发病机理的 炎性疾病和纤维化疾病的组合物或者化合物或其治疗方法，所述炎性疾病和纤维化疾病包 括但不限于器官中增强的抗纤维化活动，所述器官包括但不限于肝、肾、肺和心脏。
[0044] 在一些实施方案中，本发明涉及一种对减少与非酒精性脂肪性肝炎（NASH)相关 联的病变和疾病活动具有治疗活性的组合物或化合物或者减少这种病变和疾病活动的方 法，所述NASH包括但不限于脂肪变性（肝细胞中脂肪累积）、肝细胞气球样变性、肝脏中炎 性浸润和胶原蛋白沉积或者纤维化。
[0045] 在一些实施方案中，本发明涉及一种用于治疗半乳糖凝集素至少部分参与发病机 理的炎性疾病和自身免疫性疾病的组合物或化合物或其治疗方法，所述炎性疾病和自身免 疫性疾病包括但不限于关节炎、类风湿关节炎、哮喘和炎性肠病。
[0046] 在一些实施方案中，本发明涉及一种用于通过抑制因半乳糖凝集素增加而促进的 过程治疗半乳糖凝集素至少部分参与发病机理的肿瘤病况（例如癌症）的组合物或化合物 或其治疗方法，所述肿瘤病况包括但不限于肿瘤细胞侵袭、转移和新生血管形成。
[0047] 在一些实施方案中，本发明涉及一种用于增强肿瘤浸润T细胞更有效地识别和杀 死肿瘤细胞并因此减慢、停止或者逆转肿瘤进展的能力的组合物或者化合物，或者用于增 强这项能力的方法，所述肿瘤浸润T细胞至少部分地被肿瘤衍生的半乳糖凝集素蛋白的作 用抑制。
[0048] 在一些实施方案中，治疗有效量的解聚化合物或组合物可以与治疗有效剂量的多 种抗炎药、维生素、其他药物和营养药（不限于这些）相容并且有效地组合。
[0049] 在一些实施方案中，治疗有效量的解聚化合物或组合物可以与治疗有量的多种抗 氧化化合物（诸如甘草酸、抗坏血酸、L-谷胱甘肽、半胱胺等等或其组合）相容并且有效地 组合。
[0050] 在一些实施方案中，治疗有效量的化合物或组合物可以是无毒性的，且当被添加 到细胞培养基时，在包括但不限于细胞系LX-2或其他星状细胞的培养细胞系中不引起细 胞凋亡。
[0051] 在一些实施方案中，当被添加到细胞培养基时，治疗有效量的化合物或组合物 对包括但不限于B16-F10黑素瘤细胞、THP-1单核细胞/巨噬细胞、原代外周血单核细胞 (PBMC)和MRC-5肺成纤维细胞的哺乳动物培养细胞是无毒性的。
[0052] 在一些实施方案中，治疗有效量的化合物或组合物可以对细胞系具有抗炎作用， 如通过包括但不限于TNF-α的促炎性细胞因子的产生测定。
[0053] 在一些实施方案中，用于治疗肝纤维化的化合物或组合物的功效可以通过向包括 但不限于腹腔内注射化学毒素硫代乙酰胺的大鼠的纤维化的动物模型施用该化合物或组 合物来确定，导致肝脏中胶原蛋白含量降低至少5%到25%，如通过形态定量法确定。
[0054] 在另一个实施方案中，用于治疗NASH的组合物的功效可以通过向包括但不限于 被诱导糖尿病且喂养高脂膳食的小鼠的NASH的动物模型施用该化合物或组合物来确定， 导致肝细胞中脂肪累积降低至少5%，带有气球样变性的肝细胞的数量降低至少5 %，肝脏 中炎性细胞浸润降低至少5%以及肝脏胶原蛋白含量降低至少5%，如通过形态定量法（通 过天狼猩红阳性染色评估）确定。
[0055] 在另一个实施方案中，向NASH的动物模型施用治疗有效量的解聚化合物或组合 物可以导致如通过活组织检查的标准组织病理学所测定的纤维化降低，通过NAFLD评分评 定的疾病活动性降低，表达α平滑肌肌动蛋白的细胞的数量降低或者其他炎性介质降低 或者脂质运输和包括但不限于CD36的代谢酶降低。
[0056] 在另一个实施方案中，施用治疗有效剂量的解聚化合物或者组合物可以导致半乳 糖凝集素-3的减少，如通过mRNA的水平或者半乳糖结合蛋白的表达测定。
[0057] 在另一个实施方案中，施用治疗有效剂量的解聚化合物或者组合物可以导致生 长、入侵、转移降低或者对动物中同源性肿瘤或他形肿瘤的先天性免疫系统的敏感性增加。
[0058] 本发明的这些和其他方面通过参考下列详细描述将变得显而易见。

【专利附图】

【附图说明】
[0059] 将结合附图对本发明进行进一步的解释，其中相同的结构在几个视图中始终由相 同的数字表示。所示出的图不必要地按比例绘出，相反重点通常放在示出本发明的原理。
[0060] 图1示出了在一个制备化合物G(药用活性成分）的实施方案中所使用的生产工 艺流程的示意图。
[0061] 图2示出了根据一些实施方案的化合物G的分子结构的图示。
[0062] 图3a示出了由多角度激光散射分析仪（MALS)方法测定，计算本发明选择性解聚 化合物（化合物G)的平均分子量的齐姆图计算。图3b示出了由多角度激光散射分析仪 (MALS)方法测定，计算本发明选择性解聚化合物（化合物G)在10 nM EDTA缓冲溶液中的 dn/dc参数的齐姆图计算。
[0063] 图4a示出了使用体积排阻色谱法（SEC)测定本发明选择性解聚化合物（化合物 G)的分子量分布。标准曲线通过参考多糖分子量（MW)标准而建立，所述多糖分子量标准通 过折射率（RI)检测器监测并用于计算平均分子量。图4b示出了由折射率（RI)检测器表 征的本发明选择性解聚化合物（化合物G)的分布图。
[0064] 图5a示出了化合物G的D1和C13 NMR组合光谱的二维NMR(2-D NMR)。该二维 NMR描述了化合物G的糖苷键的指纹识别。图5b示出了化合物S的D1和C13 NMR组合光 谱的二维NMR(2_D NMR)。图5c示出了这些光谱的重叠比较用于表明化合物G和化合物S 之间的区别。圆圈标记特指化合物G。
[0065] 图6a_d是对证实在培养的星状肝细胞系LX-2中化合物G没有细胞毒素和细胞凋 亡的不同类型实验的描述。图6a是示出了在培养的LX-2细胞中包含放射性标记的胸苷的 图表。图6b是示出了评估在培养的LX-2细胞中细胞生存力的图表。图6c描述了通过流式 细胞仪（FACS)对培养的LX-2细胞中的凋亡和细胞周期的评价。图6d示出了使用Annexin V凋亡检测试剂盒APC (eBioscience公司）通过在培养的LX-2细胞中的DNA断裂来评价凋 亡。
[0066] 图7是示出了在本发明化合物G(正方形）、化合物D、半乳糖甘露聚糖产品（菱 形）和毛地黄毒苷（三角形）存在下三天后对单核细胞/巨噬细胞系THP-1的相对细胞毒 性的图表。
[0067] 图8是示出了在本发明化合物G(菱形）、化合物D、半乳糖甘露聚糖产品（正方 形）和5-氟脲嘧啶（三角形）存在下三天后对培养的黑色素瘤细胞系B-16-F10的相对细 胞毒性的图表。
[0068] 图9是示出了化合物G对培养的外周血单核细胞（PBMC)和原代细胞培养物没有 细胞毒性的图表。
[0069] 图10是示出了在化合物G和化合物D存在下生长四天后对肺成纤维（MRC-5*)细 胞的生长没有细胞毒性的图表。使用四唑氮盐（MTS)测定法测量细胞毒性。
[0070] 图11是示出了包括本发明化合物G的三种修饰的多糖对PBMC细胞分泌TNF- α 的相对抗炎作用的图表，所述PBMC细胞用细菌内毒素（50ng/mL)应激。
[0071] 图12是本发明化合物G和化合物Η对PBMC细胞分泌TNF-α的作用之间的比较， 所述PBMC细胞用细菌内毒素（50ng/mL)应激。
[0072] 图13是用MAb-HRP对半乳糖凝集素-3进行免疫染色的照片，其描述了化合物G 对LX-2细胞分泌半乳糖凝集素-3的抗半乳糖凝集素抑制作用。
[0073] 图14是对通过注射硫代乙酰胺诱导的实验性大鼠纤维化模型（TAA模型，化学毒 性肝纤维化模型）的描述。
[0074] 图15是对用化合物G治疗TAA诱导的肝纤维化4周后纤维化（对胶原蛋白用天 狼猩红染色）的组织学消退的照片描述。
[0075] 图16是在用溶媒对照、化合物D和化合物G处理4周后，在TAA模型中肝脏中（作 为纤维化的一种测量方式）的胶原蛋白的百分比的图表和统计比较。天狼猩红染色用于定 量测量组织学切片中的胶原蛋白的百分比。
[0076] 图17是对小鼠脂肪肝纤维化模型的描述，该模型是一种与代谢紊乱（严重的糖尿 病）和高脂饮食相关联的NASH实验模型。还示出了用化合物G和化合物D处理的实验设 计。
[0077] 图18是示出了用溶媒、化合物D或者化合物G处理的NASH小鼠的体重变化的图 表。
[0078] 图19A-B示出了描述用溶媒、化合物D和化合物G处理的小鼠中肝细胞脂肪变性、 气球样变性和小叶炎症（如在NAFLD活动性评分中所总结的）的程度的统计显著性。
[0079] 图20A-B示出了通过天狼猩红染色法所测量的用溶媒、化合物D和化合物G处理 的NASH小鼠的肝脏切片中胶原蛋白百分比的统计显著性。

【具体实施方式】
[0080] 本文中公开了本发明的详细实施方案；然而，应当理解的是，所公开的实施方案仅 是说明可以按多种方式体现的本发明。此外，所给出的与本发明的多个实施方案相关的每 个示例是旨在说明性的而非限制性的。另外，附图不必然地按照比例绘出，可以放大一些特 征以显示特定组分的细节。此外，附图中所示出的任何量值、说明等都旨在说明性的而非限 制性的。因此，本文中公开的特定结构和功能细节不应理解为限制性的，而仅理解为教导本 领域的技术人员以多种方式实施本发明的代表性基础。
[0081] 本文中所引用的文献并不意味着承认任何本文中所引用的文献是相关的现有技 术，或者承认所引用的文献被认为对本申请的权利要求的专利性是重要的。
[0082] 除非另外说明，否则本文中所表达的全部百分数均是重量/重量。
[0083] 果胶由多样化大的糖类聚合物组成，该糖类聚合物由聚合的半乳糖醛酸的主链并 伴随有周期性点缀的鼠李糖分子和多种包括半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡萄糖和其他的糖 类的周期性支链构成。半乳糖醛酸分子在高百分比的残基下通过甲氧基化得到天然修饰。 [0084] 已经研究了在天然状态（从植物中直接提取后）和经过不同程度修饰后的大的果 胶糖类聚合物，该修饰是指对这些聚合物进行水解和化学修饰。虽然修饰的果胶由于它们 的胶化能力而广泛应用于食品行业，而且对多种食品制备提供一致性，但是它们也被评估 为潜在的药物化合物。
[0085] 源于植物的果胶材料，不管是天然的还是被修饰过的，都在口服施用至动物和人 类时得到了广泛的评估。已经描述了多种口服施用的天然和修饰的果胶的作用，包括增加 饱腹感、减轻体重、改变肠蠕动性，以及对包括对便秘和腹泻的有益作用的肠功能的作用。 摄入的果胶材料既不能由正常的肠道酶消化也不能被肠道吸收。因此，在口服吸收后几乎 没有果胶被吸收进血流中。
[0086] 为了评估果胶和修饰的果胶分子在动物和人的全身性循环和器官中的作用，已经 尝试开发可以用作肠胃外化合物的修饰的果胶。已经评估了在细胞培养模型和在疾病的动 物模型中，尤其是在动物的癌细胞和癌症模型中源自柑橘类水果的混合物的果胶。已经表 明使用修饰的柑橘果胶引起动物细胞系中的细胞毒素和凋亡。这种修饰的柑橘果胶已经被 建议用于恶性病况（参见US 8, 128, 966)。
[0087] 半乳糖凝集素
[0088] 半乳糖凝集素（也称为半乳素或S-凝集素）是结合β -半乳糖苷的凝集素家 族。半乳糖凝集素作为通用的名字于1994年针对动物凝集素家族提出（Bar〇ndes，S. Η·等人,Galectins:a family of animal b-galactoside-binding lectins.Cell 76, 597-598, 1994)。该家族由含有至少一个对β -半乳糖苷存在亲和力的特征性糖识别 结构域（CRD)并共有某些序列元件定义。在相同肽链内部，一些半乳糖凝集素含有仅存在 一些额外氨基酸的CRD，而其他半乳糖凝集素含有两个由连接肽连接的两个CRD，并且一种 半乳糖凝集素（半乳糖凝集素-3)含有与一种不同类型结构域连接的一个CRD。半乳糖凝 集素糖类识别结构域（CRD)是约135个氨基酸的β-夹层。两个折叠片轻微弯曲，同时6 条链形成凹陷侧并且5条链形成凸出侧。凹陷侧形成结合糖的凹槽（Leffler H，Carlsson S, Hedlund M, Qian Y, Poirier F(2004) · "Introduction to galectins".Glycoconj. J. 19(7-9) :433-40) 〇
[0089] 已经表明很多生物现象都与半乳糖凝集素相关，例如，发育、分行、形态发生、肿瘤 转移、凋亡、RNA剪接等。然而，关于半乳糖凝集素借以发挥这些功能（特别在糖识别方面） 的机制，相对知之甚少。
[0090] 通常，糖结合域结合到与糖蛋白接合的半乳糖残基。已经鉴别出以串联方式含有 一个或两个糖结构域的至少15种哺乳动物半乳糖凝集素蛋白。
[0091] 半乳糖凝集素蛋白存在于胞内空间中，其中它们被赋予多种功能并被分泌入胞 外空间。在胞外空间中，半乳糖凝集素蛋白能够具有包括促进糖蛋白之间的相互作用的 多种功能，所述糖蛋白可以造成功能下降，或者功能增强，或者在内在膜糖蛋白受体的情 况下修饰细胞信号（Sato 等人"Galectins as danger signals in host-pathogen and host-tumor interactions:new members of the growing group of "Alarmins.，'In"Gale ctins，"(Klyosov,等人编著），John Wiley and Sons, 115-145, 2008, Liu 等人"Galectins in acute and chronic inflammation,，'Ann. N. Y. Acad. Sci. 1253:80-91，2012) 〇 在 胞外空间内的半乳糖凝集素蛋白还能促进细胞-细胞和细胞-基质相互作用（Wang等 人，''Nuclear and cytoplasmic localization of glectin-1 and galectin-3 and their roles in pre-mRNA splicing." In "Galectins"（Klyosov 等人编著），John Wiley and Sons, 87-95, 2008)。
[0092] 已经表明半乳糖凝集素具有促进同型二聚化的结构域。因此，半乳糖凝集素能够 用作糖蛋白之间的某种"分子胶"。半乳糖凝集素存在于包括胞核和细胞质的多种细胞区室 中，并且分泌入它们与细胞表面和胞外基质糖蛋白发生相互作用的胞外空间中。分子相互 作用机制取决于位置。当半乳糖凝集素可以与糖蛋白在胞外空间中发生相互作用时，半乳 糖凝集素与其他蛋白质在胞内空间中的作用通常经由蛋白质结构域发生。在胞外空间中， 细胞表面受体的缔合可以增加或减少受体信号或者与配体相互作用的能力。半乳糖凝集 素蛋白在许多动物和人疾病状态中显著增加，所述疾病状态包括但不限于与炎症、纤维症、 自身免疫和肿瘤形成相关联的疾病。半乳糖凝集素直接参与疾病的发病机理，如下所述。 例如，可能依赖于半乳糖凝集素的疾病状态包括但不限于急性或慢性炎症、过敏性疾病、哮 喘、皮炎、自身免疫性疾病、炎症和退行性关节炎、免疫介导的神经系统疾病、多种器官（包 括但不限于肝脏、肺、肾、胰腺和心脏）的纤维化、炎性肠病、动脉粥样硬化、心力衰竭、眼炎 性疾病和多种癌症。
[0093] 除了疾病状态，半乳糖凝集素在调节免疫细胞对于接种疫苗、外源病原体和癌细 胞的响应中是重要的调节分子。
[0094] 本领域的技术人员将理解的是，可以与半乳糖凝集素结合和/或改变半乳糖凝集 素对糖蛋白的亲和力，减少半乳糖凝集素之间的异型相互作用或同型相互作用，或者另外 改变半乳糖凝集素蛋白的功能、合成或代谢的化合物在半乳糖依赖性疾病中具有重要的疗 效。
[0095] 半乳糖凝集素表现出对附接到其他有机化合物的半乳糖残基的亲和力，诸如乳糖
[(β -D-半乳糖苷）-D-葡萄糖]、N-乙酰基-乳糖胺、聚-N-乙酰胺基乳糖、半乳甘露聚糖、 果胶片段以及其他包含半乳糖的化合物中的半乳糖残基。应当注意的是，半乳糖不能自动 地结合到半乳糖凝集素上，或者结合得很微弱以至于几乎不能检测到这种结合。
[0096] 已经表明果胶和修饰的果胶可能在包含半乳糖残基的基础上结合到半乳糖凝集 素蛋白，所述乳糖残基在大分子的情形下出现，在这种情况下是复合糖而不是在动物细胞 情况下的糖蛋白。
[0097] 已经表明半乳糖凝集素蛋白在炎症、纤维化疾病和肿瘤形成中显著增加 （Ito 等人"Galectin-l as a potent target for cancer therapy:role in the tumor microenvironment"，Cancer Metastasis Rev. PMID: 22706847 (2012)，Nangia-Makker 等人 Galectin-3 binding and metastasis,''Methods Mol Biol. 878:251-266, 2012, Canesin 等人 Galectin-3expression is associated with bladder cancer progression and clinical outcome,，'Tumour Biol. 31:277-285, 2010, Wanninger 等人 "Systemic and hepatic vein galectin-3 are increased in patients with alcoholic liver cirrhosis and negatively correlate with liver function,，'Cytokine. 55:435-40,2011)。而且，实验表明半乳糖凝集素，特别是半乳糖凝集素-1和半乳糖 凝集素-3,直接参与这类疾病的发病机理（Toussaint等人，"Galectin_l，a gene preferentially expressed at the tumor margin, promotes glioblastoma cell invasion. "，Mol Cancer. 11:32, 2012, Liu 等人 2012, Newlaczyl 等人，"Galectin-3 - a jack-of-all-trades in cancer，"Cancer Lett. 313:123-128, 2011，Banh 等人，"Tumor galectin-1 mediates tumor growth and metastasis through regulation of T-cell apoptosis,，'Cancer Res. 71:4423-31, 2011, Lefranc 等人,"Galectin-1 mediated biochemical controls of melanoma and glioma aggressive behavior, ^orld J. Biol. Chem. 2:193-201, 2011, Forsman 等人，"Galectin 3aggravates joint inflammation and destruction in antigen-induced arthritis,''Arthritis Reum. 63:445-454, 2011, de Boer 等人，"Galectin_3in cardiac remodeling and heart failure,，'Curr. Heart Fail. Rep. 7, 1-8, 2010, Ueland 等人，''Galectin-3 in heart failure:high levels are associated with all-cause mortality,，'Int J Cardiol. 150: 361-364, 2011，Ohshima 等人，"Galectin 3 and its binding protein in rheumatoid arthritis,''Arthritis Rheum. 48:2788-2795, 2003)。
[0098] 因此，对识别出对于参与人类疾病（诸如炎性疾病、纤维化疾病、肿瘤疾病或其组 合）的半乳糖凝集素具有作用且具有可靠的安全性的治疗剂存在需求，以便用于治疗。
[0099] 化学修饰的果胶和纟目合物
[0100] 之前已经描述过含有源自苹果果胶的、化学修饰的果胶的组合物和制备这种在炎 性纤维化的细胞分析中具有活性的修饰的苹果果胶的方法[参见US 8, 236, 780,其公开的 内容在此通过引用整体并入本文]。已经表明这种修饰的果胶减少对肝衍生的成纤维样细 胞的诱导而不影响细胞的生存力。
[0101] 本发明的多个方面涉及化学修饰的果胶或者修饰的果胶组合物和产生具有抗炎 性和抗纤维化作用的修饰的果胶或者修饰的果胶组合物的方法。在一些实施方案中，修饰 的果胶是在化学上定义为半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯的多糖。
[0102] 本文公开了用于肠胃外或肠内施用至受治疗者的组合物。在一些实施方案中，所 述组合物可以包括处于可接受的药用载体中的本发明的果胶衍生物或者修饰的果胶化合 物。术语"药学上可接受的载体"指可以这样的一种载体或者佐剂，即：该载体或者佐剂可 以与本发明的化合物一起施用至受治疗者（例如，患者）并且不破坏该化合物的药理活性， 并且当以足够的剂量施用以递送治疗剂量和有效量的该化合物时是无毒的。
[0103] "药学上可接受的载体"指生理相容的任何和全部溶剂、分散介质（例如，人白蛋白 或交联型明胶多肽）、包衣、抗细菌剂和抗真菌化合物、等渗剂（例如，氯化钠或谷氨酸钠） 和吸收延迟性化合物等。用于药学活性物质的此类介质和化合物的用途是本领域熟知的。 优选地，载体适于口服、静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或硬膜外使用（例如，通过注射或 输注）。取决于施用途径，活性化合物可以包覆于保护该化合物免遭可能使这种化合物失活 的酸和其他天然条件作用的材料中。
[0104] 在一些实施方案中，所述修饰的果胶化合物从药用级果胶中获得。
[0105] 在一些实施方案中，当与之前的果胶组合物相比时，本发明修饰的果胶化合物能 够具有增强的抗炎作用和/或增强的抗纤维化作用。在多种实施方案中，本发明修饰的果 胶能够抑制肿瘤坏死因子（TNF-α，恶质素（cachexin))的分泌，肿瘤坏死因子是参与全身 性炎症的一种蛋白质并且是刺激急性期反应的一组细胞因子的主要成员。它主要由激活的 巨噬细胞产生。在多种实施方案中，本发明修饰的果胶不引起细胞毒性。在多种实施方案 中，所述修饰的果胶或者修饰的果胶组合物具有有效的抗炎性和抗纤维化性而没有细胞毒 性。这表示一种新型且出乎意料的联合作用，这表明药用级修饰的果胶在治疗人类炎性疾 病、纤维化疾病、肿瘤疾病或其组合中具有重要作用。
[0106] 在一方面，特征在于用于治疗需要其的受治疗者中半乳糖凝集素参与其中的一种 或多种疾病、病症或病况（例如，控制、减轻、缓解、改善或延缓其进展）的方法或者用于预 防所述疾病、病症或病况的方法。所述方法包括向受治疗者施用有效量的本发明的化合物 或者向受治疗者施用包含本发明化合物的组合物。
[0107] 本文中所使用的术语"有效量"指单独使用或者与一定量的治疗剂联合使用的化 合物的量，当所述量在作为肠胃外、皮下、吸入、关节内、眼用或口服制剂施用于患有半乳糖 凝集素依赖性炎症、纤维化或肿瘤疾病的动物或人时能够降低疾病活动性，如下面在多种 实施方案中所限定的。
[0108] "施用"指口服或包括静脉内、皮下、局部、经皮、真皮内、经粘膜、腹腔内、肌内、囊 内、眶内、心内、经气管、皮下、角皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内 的肠胃外注射和输注。
[0109] 在一些实施方案中，所述半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯化合物含有能够构 成半乳糖凝集素蛋白的主结合实体的末端半乳糖残基。剩余的侧链组合物可以稳定或者增 强其与半乳糖凝集素蛋白的相互作用并因此增强该化合物的治疗作用。与半乳糖凝集素 的相互作用可能不是化合物G发挥治疗作用的唯一机制。虽然不希望被推测所束缚，但是 本发明的支化半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯化合物能够与半乳糖凝集素蛋白发生 相互作用，并能够具有在半乳糖或者半乳糖的小分子衍生物中没有观察到的广泛的治疗作 用。
[0110] 在一些实施方案中，本发明的化合物是在化学上定义为半乳阿拉伯糖-鼠李糖半 乳糖醛酸酯（在此也称为"化合物G"）的多糖，其为一种具有主链的支化杂聚物，所述主链 的特征为多数均聚的1，4-连接的半乳糖醛酸（GalA)分子和半乳糖醛酸甲酯（MeGalA)残 基，伴有交替性α-1，4_连接的GalA和α-1，2连接的鼠李糖（Rha)的间歇性短区域，然而 Rha单元还连接到侧链上。这些侧链主要由Μ-β-D-半乳糖（Gal)残基和l，5-a-L-阿 拉伯糖（Ara)残基构成。其他糖类可以以少量的形式存在于Gal和Ara侧链上，诸如L-木 糖（Xyl)、D-葡萄糖（Glu)和L-岩藻糖（Fuc)残基。如在本文中所使用的，"主链"指多糖 的主链，或者源自起始多糖的主链的链，其具有由α或者β糖苷键顺序连接的糖部分。主 链可以包括在沿着顺序链中的多个位置处连接到其上的另外的单糖部分。
[0111] 在一些实施方案中，化合物G是化学上受控修饰的天然支化的植物多糖的杂聚 物，其中一些可作为USP果胶材料在商业上获得。这些天然果胶材料具有范围在40, 000到 超过1，000, 000道尔顿（D)的高平均分子量，且它们是粗混合物。多数常见的USP果胶来 自柑橘类水果、苹果和甜菜，尽管其他的也可以获得。
[0112] 在一些实施方案中，化合物G组合物可以具有从2, 000到80, 000D的平均分子量。 在一些实施方案中，化合物G的平均分子量可以在20, 000到70, 000D范围内。在具体实施 例中，半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯可以具有5, 000到55, 000D的平均分子量。这 种半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯化合物可以优选地通过化学和物理处理和从苹果 果胶的天然果胶物质中提纯而获得。然而，类似于化合物G的化合物可以在恰当的提取和 化学处理条件下从柑橘、甜菜碱果胶和其他植物中获得。
[0113] 在一个实施方案中，选择性解聚的半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯（化合 物G)，其为一种支化杂聚物，可以具有2, 000到80, 000、或20, 000至70, 000、或5, 000至 55, 000道尔顿的平均分子量，如通过SEC-RI和/或MALLS法确定。如在本文中所使用的， 术语"解聚"指例如当多糖经过化学处理时发生的多糖主链局部、选择性或者完全水解，结 果产生当与原始多糖相比时尺寸减小的片段。
[0114] 产牛化合物G的方法
[0115] 本发明的多个方面涉及产生选择性解聚的半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯 的方法。在一些实施方案中，本发明的处理过程包括旨在保护结构和/或β半乳糖特性和 主要由半乳糖和阿拉伯糖构成的侧链的半乳糖结合能力，并且提高在半乳阿拉伯糖-鼠李 糖半乳糖醛酸酯化合物中半乳糖结合部分普遍性的方法。在一些实施方案中，所述方法能 够生成具有减小的平均分子量的半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯化合物，以便与用于 经由包括但不限于静脉内、皮下、吸入、关节内、眼用和口服这些途径多元施用的治疗性制 剂相容。
[0116] 在一些实施方案中，所述化合物可以从天然的、高度支化的、加工最少和高度甲氧 基化的USP果胶合成，所述果胶可以来自任何植物，包括但不限于柑橘类水果、苹果或者甜 菜。
[0117] 在一些实施方案中，所述化合物可以从天然的、高度支化的、加工最少和高度甲氧 基化的USP果胶合成，如同从含有8-12%果胶的苹果果渣制造出的那一种。
[0118] 在一些实施方案中，所述化合物可以在糖苷连接的甲氧基化α-1，4-连接的GalA 的充分受控和特异性水解情况下合成所述化合物，同时保留含有富集量的1，4-β -D-Gal 和1，5- a -L-Ara的侧链。可以通过GC-MS (气相色谱-质谱法）和AELC-PAD (阴离子交换 液相色谱-脉冲安培检测器）法定量地测定1，4- β -D-Gal和1，5- a -L-Ara的量。
[0119] 在一些实施方案中，可以通过如下的方法产生所述化合物，即：该方法包括在1 到100 mM还原形式的过渡金属离子如Cu++存在的情况下，通过从抗坏血酸产生的离子化 0?Γ和/或过氧化物定向过氧化裂解糖苷键（也称为β消除反应）所分解代谢的解聚。其 他过渡金属如Ca ++或Fe++可以用于此目的。
[0120] 在一些实施方案中，所述解聚化合物可以在2°C至60°C的温度暴露在8到10之间 的pH 10到30分钟以引发受控有限的去甲氧基化，以产生与大约87%的初始水平相比甲氧 基化程度为40%到70%的、选择性中等解聚化合物。所产生的化合物也可以称为中等甲氧 基化的化合物。认为半乳糖醛酸的完全甲氧基化是大约DE 87%。
[0121] 在一些实施方案中，本发明的选择性解聚多糖可以含有不多于100 EU或者不多于 300 EU的内毒素水平，如通过LAL法评定。
[0122] 在一些实施方案中，本发明的选择性解聚多糖可以含有不多于0.05%的含氮杂 质，如通过总氮量评定。
[0123] 在一些实施方案中，所述解聚组合物可以暴露于多次热酸性醇洗涤（30_80°C )以 除去任何残留的内毒素、铜和重金属、农业污染物和其他杂质。
[0124] 用涂
[0125] 在一些实施方案中，本发明化合物的治疗活性可以源自在该化合物中存在的多个 半乳糖和阿拉伯糖部分。这种部分可以模拟细胞表面和胞外基质上、结合半乳糖凝集素 蛋白（例如半乳糖-结合蛋白）的细胞糖蛋白，半乳糖凝集素蛋白在炎性、纤维化和肿瘤化 过程中被高度表达。已经证明半乳糖凝集素_3的表达对于多种器官的炎症和纤维化形成 是十分关键的，所述器官包括但不限于肝脏、肾、心脏和肺。因此，调节它们的活性可以抑制 或者会逆转病理过程。
[0126] 在另一个实施方案中，本发明的选择性-解聚多糖没有细胞毒性，而且在细胞培 养系统中不引发细胞凋亡。因此，本发明的选择性-解聚多糖与已经报道的其他已知修饰 的果胶制备物（参见US 8, 128, 966)不同。
[0127] 在另一个实施方案中，本发明的选择性-解聚多糖可以对外周血单核细胞（PMBC) 和其他炎性细胞系具有抗炎作用。例如，化合物G可以减少细胞因子基因或者蛋白质的诱 导物（包括但不限于TNF-α)的表达或响应。炎症和修复的过程可以涉及处于复杂和相互 联系的级联事件中的多种细胞类型（包括免疫系统细胞）和多种炎性介质。急性炎症可以 被终止或者可以发展为可能导致纤维化（一种在多种人类器官疾病中观察到的晚期损伤 阶段）的慢性期，所述器官包括但不限于肝脏、肺、肾、心脏和胰腺。
[0128] 器官中的慢性炎症经常导致纤维化组织的积累。事实上，由多种基础性病因所引 起的炎症的最终结果通常是纤维化和随之而来的器官功能障碍。例如，这在肺、心脏、肾、 胰腺和肝脏中是明显的。多个系列的证据指向尤其是在器官纤维化的发病机理中作为关 键因素的半乳糖凝集素蛋白和半乳糖凝集素-3。已经证明，例如，半乳糖凝集素_3敲除无 效小鼠可以抵抗响应于肝毒素的肝纤维化，抵抗响应于气管内博来霉素的肺纤维化，而且 可以用作肾纤维化、心脏纤维化和慢性胰腺炎的模型（Henderson等人，"The regulation of inflammation by galectin-3，，'Immunol Rev. 230:160-171, 2009, Iacobini 等 人,"Galectin-3 ablation protects mice from diet-induced NASH:a major scavenging role for galectin-3 in liver, ·，'J. Hepatol. 54:975-983, 2011, Lopez 等 人，"Gene expression profiling in lungs of chronic asthmatic mice treated with galectin-3:downregulation of inflammatory and regulatory genes, ''Mediators Inflamm·，823279. Epub 2011，Kolatsi-Joannou 等人，"Modified citrus pectin reduces galectin_3expression and disease severity in experimental acute kidney injury, "PLoS One. 6(4) :el8683, 2011)。
[0129] "纤维化"指任何组织疾病，包括但不限于如下细胞疾病，例如，肝硬化、肾纤维化、 肝纤维化、卵巢纤维化、肺纤维化、胃肠道或胃纤维化和平滑肌瘤。术语"纤维化"既指因胞 外基质包裹组织损伤而导致的病理过程，又指该过程的结果，该结果是病理性瘢痕组织的 形成。
[0130] "硬化"指包括如下细胞疾病的任何组织疾病：包括但不限于肾硬化、肝硬化、卵巢 硬化、肺硬化、胃肠道或胃肝硬化。术语"硬化"指由存在包裹的结节所定义的纤维化晚期。 出于本说明书和权利要求的目的，"硬化"被理解为纤维化的一种类型，且包括在本文所使 用的术语"纤维化"的含义内。
[0131] 如本文所使用的，"分子标记"、"生化标记"、"生物标记"或"标记"可互换使用，并 且指生物来源的单个分子，其可以被监测为特定代谢事件的"读出（readout)"。这些事件 伴随有"标记"的形成，这些标记的定量水平通常可以用来指示该事件的发展。
[0132] 引发肝脏中纤维化的损伤可以发生以响应多种慢性损害，包括但不限于酗酒、药 物、毒素、脂肪沉积、病毒性肝炎B和C、一些引发慢性和/或永久性组织刺激导致炎症、胶原 蛋白沉积或纤维化的代谢性疾病。
[0133] 肝纤维化的晚期是由存在宽的纤维组织带所包裹的肝细胞结节所定义的肝硬化。 纤维化是对慢性损伤的全身性和协调性响应，通过一系列高度协调的分子事件（统称为纤 维化形成）形成。例如，纤维化可以由于哺乳动物的慢性肝损伤而形成。紧随慢性肝损伤 的阶段可以导致肝星状细胞的激活。星状细胞的激活可以导致细胞增殖、纤维化形成和硬 化。星状细胞中的激活事件可以由特定分子标记识别，诸如胶原蛋白I、α 1-平滑肌肌动蛋 白、β TOGF-受体（一种增殖生物标记）、基质金属蛋白酶和它们的抑制剂ΜΜΡ2、ΜΜΡ9、--ΜΡ1 和ΤΜΡ2 (基质降解的标记）和多种细胞因子，包括但不限于TFG-β 1 (-种纤维化形成的标 记）。可以通过各种标记的定量水平评估纤维化的形成。可以通过在纤维化的不同阶段各 种标记水平的降低评估纤维化的减少。
[0134] 纤维化的病理生理学谱可能与如下血清生物标记物有关：包括但不限于透明质 酸、胶原蛋白的其他分解产物、细胞角蛋白-18和其他细胞骨架细胞蛋白、金属蛋白酶I和 II的组织抑制剂、其他来自肝脏的胶原蛋白和基质蛋白酶或其组合。可以使用免疫测定法 和与疾病的严重性和治疗相关的水平在血清或肝脏组织中测定这些化合物和/或生物标 记。
[0135] 纤维化的病理生理学谱也与如下血清生物标记有关：包括但不限于脂质或蛋白质 来源的反应性氧产物、脂质分子或缀合物或其组合。可以通过包括免疫测定法和电泳以及 它们与疾病严重性和治疗相关的水平的各种手段测量这些生物标记。其他的生物标记可以 包括血清蛋白或者尿蛋白的蛋白质组分析中的总体变动。
[0136] 纤维化的病理生理学谱也可以与NASH的血清生物标记有关，NASH是一种导致纤 维化且在本申请中所描述的慢性代谢性炎性疾病。这些生物标记可以是细胞因子，包括但 不限于TNF-α、TGF-i3或IL-8、或指示NASH的存在或严重性的血清组分的代谢谱（这些包 括血清标记和尿标记）或其组合。如通过免疫测定法或采用LC质谱的蛋白质组评估所测量 的一种或多种这些细胞因子谱可以提供对疾病活动性的评估和在疾病治疗中追踪的标记。
[0137] 肝脏中的病理生理学谱也可以与在肝脏活组织检查时的组织病理学研究结果有 关，这些研究结果包括但不限于胶原蛋白沉积迹象（包括但不限于窦周、门脉、中央胶原蛋 白沉积或其组合）、门脉至中央桥接胶原蛋白沉积、扭曲正常构造的肝细胞结节、与恶变一 致的肝细胞异型性和其组合。
[0138] 肝脏中纤维化的病理生理学谱也可以与在肝脏活组织检查时的其他病理组织研 究结果有关，这些研究结果与导致纤维化的慢性肝病的基础性原因有关。这类研究结果可 以包括但不限于肝细胞中的异常（包括但不限于，气球样变性和细胞内透明和巨囊泡或微 囊泡脂肪或其组合），内皮细胞、巨噬细胞或胆管细胞中的异常和多种类型炎性细胞诸如淋 巴细胞、单核细胞核/或嗜中性粒细胞，或者前述细胞的任意组合的浸润。
[0139] 纤维化的病理生理学谱也可以包括在肝脏活组织检查时与NASH基础性疾病有关 的组织病理学研究结果。这些研究结果可以包括但不限于肝细胞内脂肪迹象，肝细胞毒性， 包括但不限于透明体、炎性细胞浸润（包括但不限于淋巴细胞和各种淋巴细胞亚类和嗜中 性粒细胞），胆管细胞变化，内皮细胞变化，枯否（Kupffer)巨噬细胞数目、胶原蛋白沉积 (包括但不限于窦周、门脉和中央胶原蛋白沉积和门脉至中央桥接胶原蛋白沉积）、扭曲正 常构造的肝细胞结节、与恶变一致的肝细胞异型性和组合用于NASH严重性分级的各类观 察结果的各种量表和方法或前述的任意组合。这类组织学的评估可以是NASH诊断的必要 条件并且因此整体地与评估疗法相关。
[0140] 纤维化的病理生理谱也包括在肝脏活组织检查时的组织病理学研究结果，这些研 究结果观测在肝组织或各种细胞类型中各种分子的表达或者在这些表达中的改变以及它 们的定位。合适的分子包括但不限于各种细胞因子蛋白。感兴趣的细胞因子蛋白包括但不 限于TGF-β、炎性介质、活性代谢物清除剂转运蛋白（包括但不限于⑶36)和半乳糖凝集素 蛋白（包括但不限于半乳糖凝集素-3蛋白）或前述的任意组合。
[0141] 纤维化的临床表现可以包括但不限于临床检验的阶段和疾病的严重性、疾病的临 床体征和症状和/或由纤维化引起的医学并发症。肝脏纤维化的阶段和严重性的临床检 验包括但不限于血液学检验（包括但不限于红细胞计数和/或形态、白细胞计数和/或分 化和/或形态和/或血小板计数和形态）、血清或血浆脂类，包括但不限于甘油三酯、胆固 醇、脂肪酸、脂蛋白种类和脂质过氧化种类、血清或血浆酶（包括但不限于天冬氨酸转氨酶 (AST)、丙氨酸转氨酶（ALT)、碱性磷酸酶（ΑΡ)、γ谷氨酰转肽酶（GGTP)、乳酸脱氢酶（LDH) 和同工型、指示肝脏合成能力的血清或血浆白蛋白和其他蛋白质、指示肝脏清除代谢副产 物的能力的胆红素或其他化合物的血清或血浆水平、血清或血浆电解质（包括但不限于 钠、钾、氯化物、钙、磷）、凝血谱，包括但不限于凝血酶时间（PT)、部分促凝血酶原激酶时间 (PTT)、特定凝血因子水平、出血时间和血小板功能。临床检验还包括但不限于评估肝脏构 造、结构完整性或功能的非侵入性和侵入性检验，包括但不限于计算机化断层成像（CT扫 描）、超声法（US)、超声波弹性成像（FibroScan)或其他肝组织弹性测量法、磁共振扫描或 光谱法、磁共振弹性成像法、经皮针或薄壁细针或经颈静脉肝脏活组织检查和组织学评估 (包括但不限于使用亲和染料或免疫组织化学对不同组分染色）、测量肝门-静脉楔压梯 度，或可以被开发用于评估肝组织中纤维化严重性的其他非侵入性或侵入性检验或者前述 的任意组合。
[0142] 已经进展成硬化的晚期纤维化的临床体征和症状可以包括疲劳、肌肉重量减轻、 蛛形血管瘤、腹痛、腹胀、腹水、胃肠道出血、其他出血并发症、易于淤紫和淤斑、外周性水 肿、肝肿大、结节性硬肝（nodular firm liver)、嗜睡、睡眠障碍、意识模糊和/或昏迷。纤维 化的医学并发症与肝硬化相关并且包括腹水、外周性水肿、食管及其他胃肠道血管曲张、胃 肠道出血、其他出血并发症，消瘦和肌肉消耗、肝肾综合征和肝性脑病。与肝硬化相关的纤 维化的其他并发症是形成足够严重到确保列入肝移植名单或接受肝移植的并发症。
[0143] 非酒精性脂肪肝病（NAFLD)和脂肪性肝炎（NASH)在美国和欧洲是常见的肝病。在 组织病理学上，这些病症类似于酒精性肝病，但是它们出现在很少饮酒或不饮酒的人中。肝 脏中的病理学变化包括但不限于肝细胞中脂肪积累、肝细胞变性迹象、炎性细胞浸润、过多 纤维组织沉积、肝细胞结节形成、肝硬化、肝细胞癌和其组合。
[0144] NAFLD的主要特征是肝细胞中脂肪积累伴有少量炎症。通常基于肝脏活组织检查 鉴定NAFLD，所述肝脏活组织检查因为血清中轻度升高的肝脏转氨酶水平或在非侵入性检 验（诸如计算机化断层成像或超声法）时怀疑脂肪肝而进行。
[0145] 发现一个亚类的患有NAFLD的个体患有NASH，其为脂肪肝外加炎性细胞（包括但 不限于嗜中性粒细胞或淋巴细胞）浸润在小叶、中央静脉和门脉区内部形成和肝细胞损伤 迹象，包括但不限于气球样变性。NASH的这种炎性状态可以导致纤维组织（包括但不限于 胶原蛋白）沉积，这可以导致肝硬化、结节形成和/或肝细胞癌。
[0146] 疾病进程是隐伏的，因为大部分患有NASH的人感觉良好并且没有意识到他们具 有肝脏问题。尽管缺少症状，但NASH可能是严重的并且可以导致纤维物质在肝脏中沉积， 这可以导致严重瘢痕化和/或肝硬化以及在一些情况下导致肝细胞癌。
[0147] NASH中肝损伤的原因未知。已经提出了多个理论，存在一些表明它们的参与的实 验数据。这些理论中的一些包括但不限于肝细胞抵抗胰岛素作用，损伤肝脏并招募额外炎 性细胞的炎性细胞因子由脂肪细胞及其他炎性细胞产生和肝细胞中的氧化应激，伴随产生 损伤肝脏细胞并引起炎症的反应性氧自由基。
[0148] 目前，不存在针对NASH或纤维化的特异性疗法并且目前仅向患者提供一般健康 建议。这些建议包括减轻体重、摄入平衡和健康膳食、增加体力活动并避免酒和不必要的药 物。减轻体重可以在一些NASH患者中改善血清肝脏检验并且可以改善组织学肝损伤迹象， 但是它不逆转严重的肝病。此外，应当注意的是，并非全部NASH患者均超重。
[0149] 已经评价或正在NASH或纤维化患者中评价多种实验方法，包括但不限于施用抗 氧化剂，诸如维生素 E、硒、甜菜碱和抗糖尿病剂，包括二甲双胍、罗格列酮和吡格列酮。全 部临床结果迄今均令人失望。在一些实施例中，本发明的化合物可以用于治疗NASH或纤维 化。本发明的化合物可以通过控制参与发病机理和疾病进展的半乳糖凝集素蛋白产生作 用。
[0150] 在一些实施方案中，除纤维化之外，本发明的化合物（即化合物G)对脂肪肝的代 谢具有临床上显著的作用，然而除炎症和纤维化之外它对相关病变具有临床上更为显著的 作用。
[0151] 在一些实施方案中，本发明的化合物在由化学毒性硫代乙酰胺（TAA)引发纤维化 的大鼠纤维化模型中具有抗纤维化的作用，该模型具有与导致纤维化、肝硬化和肝癌发生 率增加的长期饮酒的影响类似的病变（图13-14)。
[0152] 在一些实施方案中，本发明的化合物通过减少TNF-α分泌产生抗炎作用，如在使 用细胞内毒素应激的PBMC细胞来生成TNF-a ( -种主要的细胞因子、生物标记和炎性蛋 白）的体外模型中所描述的那样（图16)。
[0153] 基于这一发现，提出了将所述化合物G单独或与上文所列出的用于治疗人NASH 的其他化合物组合的疗法。在一些实施方案中，本发明的化合物可以用于缓解或逆转肝细 胞脂肪积累、门脉内和小叶内炎性浸润和/或纤维化（包括但不限于窦周隙中胶原蛋白沉 积）、肝硬化和用于阻止肝细胞癌进展。
[0154] 除了 NASH之外，还有多种引发肝纤维化和可以进展为肝硬化的其他慢性肝病。例 如，慢性肝病可以包括但不限于慢性肝炎病毒感染（乙型、丙型和丁型肝炎）、慢性酗酒、胆 道疾病（包括但不限于硬化性胆管炎）、原发性胆汁性肝炎、遗传性贮积病和金属贮积病 (包括但不限于血色沉着病和威尔逊氏（Wilsons)病）。
[0155] 在一些实施方案中，不论是否为基础性病因，化合物G对所有导致纤维化的慢性 肝病都可以是有效的。
[0156] 在一些实施方案中，化合物G可以有效治疗非肝脏的器官（包括但不限于肺、肾、 心脏和胰腺）中因慢性炎症而发生的纤维化，所述慢性炎症导致除肝脏特有的星状细胞之 外的细胞类型沉积胶原蛋白。在其他器官中导致纤维化的细胞是具有前体细胞的肌成纤维 细胞，所述前体细胞包括但不限于通过称为EMT--上皮间充质转化的过程所生成的常驻 组织成纤维细胞、循环型纤维细胞或上皮细胞。
[0157] 肺纤维化可以作为包括但不限于特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病和慢性感染的 多种疾病中的慢性炎症过程的结果而发生。
[0158] 肺部的纤维化通常导致肺组织僵硬，引起肺功能降低，包括但不限于肺总容量、肺 活量、用力呼吸量和扩散能力降低。这些降低的功能可以导致临床症状，包括但不限于呼吸 急促、锻炼耐力降低和气体交换减少，导致低血氧水平。最终结果是需要进行肺移植的肺衰 竭。目前还没有针对肺纤维化的药物治疗。
[0159] 肾纤维化可以作为包括但不限于糖尿病、尿路梗阻、高血压、血管疾病和自身免疫 性疾病的多种基础性疾病的结果而发生。
[0160] 肾纤维化可以进展为抑制肾功能，其导致尿排出量减少和血流中毒性代谢物的积 累。与肾纤维化相关联的肾衰竭需要通过透析的外部支持或者肾移植。目前还没有针对肾 纤维化的药物治疗。
[0161] 进行性心力衰竭与多种疾病相关联，包括但不限于慢性高血压、冠状动脉病、心脏 瓣膜病和肥厚性心脏疾病。心力衰竭可以部分由于心肌中纤维组织沉积而发生，所述纤维 组织沉积是一个已经被证实与半乳糖凝集素-3表达增加因果相关的一个过程。进行性心 力衰竭可以导致心脏收缩性下降、心室扩展、心输出量下降并伴有多种从而产生的症状，包 括水肿、呼吸急促、肾功能下降、精神混乱和其他症状。对于末期的心力衰竭仅能用机械心 脏辅助装置或心脏移植来治疗。
[0162] 最通常但不完全是由于酗酒引起的胰腺的慢性炎症可以导致胰腺纤维化及外分 泌胰腺和内分泌胰腺功能下降。外分泌功能下降可以导致食物吸收不良，而且内分泌功能 下降可以导致内分泌失调，诸如糖尿病。到目前为止，还没有针对胰腺纤维化的药物治疗。
[0163] 已经表明半乳糖凝集素蛋白在癌细胞中具有多种功能，包括但不限于改善侵袭 性，导致化疗抗性，促进转移，增强新血管形成，和允许侵入免疫系统。
[0164] 大多数癌症表达增加了半乳糖凝集素蛋白的量。由施用本发明的化合物（例如化 合物G)来抑制半乳糖凝集素可以有效治疗表达半乳糖凝集素的癌症，包括但不限于皮肤 癌（鳞状和黑色素瘤）、口腔癌、头颈癌、淋巴系统癌、血细胞癌、消化道（食道、胃、小肠、结 肠和直肠）癌、胰腺癌、胆道系统癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、睾丸癌、子宫颈癌、 子宫癌和神经系统癌。
[0165] 本发明的多个方面涉及一种用于治疗半乳糖凝集素参与发病机理的炎性疾病和 纤维化疾病的化合物或者包含这种化合物的组合物，所述炎性疾病和纤维化疾病包括但不 限于器官中增强的抗纤维化活动，所述器官包括但不限于肝、肾、肺和心脏。本发明的其他 方面涉及治疗半乳糖凝集素参与发病机理的炎性疾病和纤维化疾病的方法。
[0166] 在一些实施方案中，本发明涉及一种对减少与非酒精性脂肪性肝炎（NASH)相关 联的病变和疾病活动具有治疗活性的化合物或组合物，或者涉及一种减少此类病变和疾病 活动的方法，所述NASH包括但不限于脂肪变性（肝细胞中脂肪累积）、肝细胞气球样变性、 肝细胞中炎性浸润和胶原蛋白沉积或者纤维化。
[0167] 在一些实施方案中，本发明涉及一种用于治疗半乳糖凝集素参与发病机理的炎性 疾病和自身免疫疾病的化合物或者包含这种化合物的组合物，所述炎性疾病和自身免疫疾 病包括但不限于关节炎、类风湿性关节炎、哮喘和炎性疾病（溃疡性结肠炎和克罗恩病）。
[0168] 在一些实施方案中，本发明涉及一种用于通过抑制因半乳糖凝集素增加而促进的 过程治疗半乳糖凝集素参与发病机理的肿瘤病况（例如癌症）的化合物或者包含这种化合 物的组合物，所述肿瘤病况包括但不限于肿瘤细胞侵袭、转移和新生血管形成。
[0169] 在一些实施方案中，本发明涉及一种用于增强肿瘤浸润T细胞更有效地识别和杀 死肿瘤细胞并因此减慢、停止或者逆转肿瘤进展的能力的化合物或者包含这种化合物的组 合物，或者用于增强这项能力的方法，所述肿瘤浸润T细胞被肿瘤衍生的半乳糖凝集素蛋 白的作用抑制。
[0170] 在一些实施方案中，本发明涉及一种与肿瘤免疫治疗联合使用的化合物或者包含 这种化合物的组合物，所述化合物或组合物可以是针对特定肿瘤抗原的疫苗或激活或抑制 特定免疫调节分子（包括但不限于CTLA4、0X40、PD-1或ro-L)的药物。
[0171] 有效剂量的本发明化合物或者包含有效剂量的该化合物的组合物可以经由多种 途径施用，包括经由以重复静脉推注或恒量输注给予的静脉内输注的肠胃外施用，皮内注 射，以重复快速浓注或恒量输注给予的皮下施用，关节内注射，以合适的制剂吸入施用或者 口服施用。
[0172] 施用量取决于化合物制剂、施用途径等，且通常根据经验由例行试验确定，而且必 要时将出现变化，这取决于施用目标、宿主和途径等。
[0173] "施用"指口服或包括静脉内、皮下、局部、经皮、真皮内、经粘膜、腹腔内、肌内、囊 内、眶内、心内、经气管、皮下、角皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内 的肠胃外注射和输注。
[0174] 对于实验动物，以本发明化合物的有效肠胃外剂量在静脉给予时可以是在2mg/kg 直至200mg/kg体重范围内。对于动物，本发明化合物的有效皮下注射剂量可以是在2mg/kg 直至200mg/kg体重范围内，或者经由腹腔内是在2mg/kg直至200mg/kg体重范围内，或者 经由口服施用l〇mg/kg或者50mg/kg或者200mg/kg或者1500mg/kg体重。也可以考虑更 高或更低的剂量。
[0175] 对于人类受治疗者，本发明化合物的有效肠胃外剂量在静脉给予时可以是在 0. 2mg/kg直至20mg/kg体重范围内。对于人类受治疗者，本发明化合物的有效皮下注射剂 量可以是在〇· 2mg/kg直至50mg/kg体重范围内，或者经由口服施用10mg/kg直至200mg/kg 体重。也可以要求比上述剂量更高或更低的剂量。对于特定患者具体的剂量和治疗方案将 取决于多种因素，包括所使用具体化合物的活性、年龄、体重、整体健康状态、性别、饮食、施 用时间、排泄率、联合用药、疾病、病况或症状的严重程度和病程、患者对疾病、病况或症状 的反应以及治疗医生的判断。
[0176] 有效肠胃外剂量可以每日（以一次剂量或分次的剂量）、每周三次、每周二次或每 月一次经由静脉内、真皮内、皮下或者医学专业人员施用药物所采用的其他途径来给予。
[0177] 对于实验动物或者人，有效口服剂量的本发明化合物可以与多种增强经过胃部和 小肠吸收该化合物的赋形剂和添加剂配制在一起。
[0178] 有效口服剂量可以是有效肠胃剂量的10倍甚至高达100倍。
[0179] 有效口服剂量可以每天一次或者分次地给予，或者每周两次、每周三次或者每月 一次地给予。
[0180] 本发明化合物或者包含本发明化合物的组合物可以口服施用；或者通过静脉注射 施用；或者通过直接注射到受影响的组织如例如通过注射到关节炎的关节中施用。在一些 示例中，该化合物或组合物可以以滴眼液、鼻腔喷雾剂、药膏或类似形式局部地施用。而且， 可以采用其他诸如经皮给药系统、吸入或类似方式的技术。
[0181] 在一些实施方案中，本文中所描述的化合物可以与一种或多种其他治疗剂共同施 用。在某些实施方案中，所述额外的治疗剂相对于本发明的化合物，可以作为多剂量方案 的一部分单独施用（例如依次地进行，例如在与本发明化合物的施用不同的重叠时间表）。 在其他实施方案中，这些治疗剂可以是单一剂型的一部分，在单一组合物中与本发明化合 物混合在一起。在又一个实施方案中，这些治疗剂可以作为与本发明化合物在大约相同时 间施用的单独剂量给予。当该组合物包含本发明化合物和一种或多种额外治疗剂或预防 剂的组合时，该化合物和额外制剂都可以呈现为单药治疗方案中正常施用剂量的大约1到 100%的剂量水平，并且更优选地在大约5到95%之间的剂量水平。
[0182] 在一些实施方案中，治疗有效量的解聚化合物或者组合物可以与多种治疗有效量 的抗氧化化合物（甘草酸苷、抗坏血酸、L-谷胱甘肽、半胱胺）相容且有效组合，如在美国 专利No 7, 078, 064中所描述的。
[0183] 给予患有NASH和肝纤维化的动物或人的有效剂量是指化合物单独或者与其他治 疗剂组合的量，当作为肠胃夕卜、皮下、吸入、关节内、眼用或者口服制剂施用时，该有效剂量 导致肝细胞脂肪、具有气球样变性的肝细胞、浸润的炎性细胞减少至少10%，在NAFLD活动 性评分降低至少一分，或者通过天狼猩红组织学染色来评估的肝脏中胶原蛋白沉积减少至 少10%，或者肝脏中纤维化组织沉积的进展减慢至少10%。
[0184] 给予患有NASH和肝纤维化的人类受治疗者的有效剂量可以导致与NASH相关联的 血清生物标记减少至少10%，或者如通过超声法或MR弹性成像法所评估的肝细胞脂肪量 或者肝硬度改善至少10%，或测量肝脏中代谢功能或分流的肝功能试验改善至少10%，或 由肝纤维化和肝硬化引起的临床症状和并发症减少至少10%，包括但不限于由降低的代谢 和消除过程（包括但不限于胆红素）、降低的肝脏合成能力（包括但不限于白蛋白和凝血蛋 白）、门静脉高血压和肝性脑病所引起的症状和并发症。
[0185] 给予患有NASH和肝纤维化的人类受治疗者的有效剂量是指当与未经治疗的人类 受治疗者对照相比较时改善临床参数或者降低临床参数的进展，包括但不限于与NASH相 关联的的血清生物标记至少减少10%，或如通过超声法或MR弹性成像法所评估的肝细胞 脂肪含量或者肝脏硬度改善至少10%，或测量肝脏中代谢功能或分流的肝功能试验改善至 少10%，或由肝纤维化和肝硬化引起的临床症状和并发症减少至少10%，包括但不限于由 降低的代谢和消除过程（包括但不限于胆红素）、降低的肝脏合成能力（包括但不限于白蛋 白和凝血蛋白）、门静脉高血压和肝性脑病所引起的症状和并发症。
[0186] 给予患有由紊乱而非NASH引起的肝纤维化或肝硬化的动物或人的有效剂量是指 单独或者与其他治疗剂的量组合的化合物的量，当作为肠胃外、皮下、吸入、关节内、眼用或 者口服制剂施用时，该有效剂量导致例如通过天狼猩红组织学染色来评估的肝脏中胶原蛋 白沉积减少至少10%，或者肝脏纤维化组织沉积的进展减慢至少10%。
[0187] 给予患有由紊乱而非NASH引起的肝纤维化或肝硬化的人类受治疗者的有效剂量 是指单独或者与其他治疗剂的量组合的化合物的量，当作为肠胃外、皮下、吸入、关节内、眼 用或者口服制剂施用时，该有效剂量导致但不限于与肝纤维化相关联的血清生物标记减少 至少10%，或者如通过超声法或MR弹性成像法所评估的肝脏硬度改善至少10%，或测量肝 脏中代谢功能或分流的肝功能试验改善至少10%，或由肝纤维化和肝硬化引起的临床症状 和并发症减少至少10%，包括但不限于由降低的代谢和消除过程（包括但不限于胆红素）、 降低的肝脏合成能力（包括但不限于白蛋白和凝血蛋白）、门静脉高血压和肝性脑病所引 起的症状和并发症。
[0188] 给予患有由紊乱而非NASH引起的肝纤维化或肝硬化的人类受治疗者的有效剂量 是指当与未经治疗的人类受治疗者对照组相比较时改善临床参数或者降低临床参数的进 展，包括但不限于与肝硬化相关联的的血清生物标记减少至少10%，或如通过超声法或MR 弹性成像法所评估的肝脏硬度改善至少10%，或测量肝脏中代谢功能或分流的肝功能试验 改善至少10%，或由肝纤维化和肝硬化引起的临床症状和并发症减少至少10%，包括但不 限于由降低的代谢和消除过程（包括但不限于胆红素）、降低的肝脏合成能力（包括但不限 于白蛋白和凝血蛋白）、门静脉高血压和肝性脑病所引起的症状和并发症。
[0189] 给予患有肾纤维化的动物或人类受治疗者的有效剂量是指当与未经治疗的动物 或人类受治疗者的对照组相比较时改善临床参数或者降低临床参数的进展，包括但不限于 通过组织学所评估的肾纤维化减少至少10%，或肾小球滤过率改善至少10%，或与肾功能 不全有关的临床迹象和症状改善至少10%。
[0190] 给予患有肺纤维化的动物或人类受治疗者的有效剂量是指当与未经治疗的动物 或人类受治疗者的对照组相比较时改善临床参数或者降低临床参数的进展，包括但不限于 通过组织学所评估的肺纤维化减少至少10%，或肺容量改善至少10%，或呼气量改善至少 10%，或与肺功能不全有关的临床迹象和症状改善至少10%。
[0191] 给予患有心脏纤维化的动物或人类受治疗者的有效剂量是指当与未经治疗的动 物或人类受治疗者的对照组相比较时改善临床参数或者降低临床参数的进展，包括但不限 于通过组织学所评估的心脏纤维化组织减少至少10%，或心肌收缩性改善至少10%，或心 输出量改善至少10%，或与心力衰竭有关的临床迹象和症状改善至少10%。
[0192] 给予患有胰腺纤维化的动物或人类受治疗者的有效剂量是指当与未经治疗的动 物或人类受治疗者的对照组相比较时改善临床参数或者降低临床参数的进展，包括但不限 于通过组织学所评估的胰腺纤维化组织减少至少10%，或胰腺外分泌酶（包括但不限于 胰岛素）的合成或分泌改善至少10%，或与胰功能不全有关的临床迹象和症状改善至少 10%。
[0193] 作为单一药剂或者与其他癌症化疗、免疫治疗或肿瘤疫苗组合施用至患有癌症的 动物或人类受治疗者的有效剂量是指当与未经治疗的动物或人类受治疗者的对照组相比 较时改善临床参数或者降低临床参数的进展，包括但不限于减少肿瘤尺寸10%，或癌症转 移的数目减少至少10%，免疫系统对抗癌细胞的活性增加至少10%，或与癌症有关的临床 迹象和症状改善至少10%，所述癌症包括但不限于提高无进展存活率或者整体存活率，或 降低治疗的副作用，或提高患者生活质量。
[0194] 虽然描述了本发明的多个实施方案，但是可以理解的是这些实施方案仅是示例性 的，而且并非限制性的，多种修改和/或替代性实施方案对于本领域的技术人员来说可以 变得显而易见。例如，可以以任何需要的顺序来执行任何步骤（而且可以增加任何需要的 步骤和/或去掉任何需要的步骤）。因此，将理解的是，所附的权利要求书旨在包括所有的 这些在本发明的精神和范围内的修改和实施方案。
[0195] 在下列实施例中将对本发明进行进一步描述。应当理解的是，这些实施例仅是说 明性的目的且不得被解释成以任何方式限制本发明。
[0196] 实施例
[0197] 为了参考方便，本发明选择性解聚的产物（化合物G)指根据本文中实施例1的 描述所制备的化合物，化合物D指根据US专利No. 7, 893, 252所描述的方法制备的参考 多糖，该文献公开的内容在此通过引用整体并入本文。化合物Η指高分子量的解聚果胶 多糖（90, 000到140, 000D)，不是根据本文中实施例1的描述来制备，而是根据美国专利 No. 8, 236, 780所描述的方法来制备，该文献公开的内容在此通过引用整体并入本文。化合 物S指根据美国专利No. 8, 128, 966所公开的方法用USP柑橘果胶制备的多糖。本发明提供 制备修饰的果胶的制备方法和在癌症治疗中的用途。该文献公开的内容通过引用整体并入 本文。化合物T指在Amazon, com上购买的商业MCP "索恩研究分馏果胶粉5盎司（Thorne Research Fractionated Pectin Powder 5 0Z)，'。
[0198] 实施例1 :化合物G的制各
[0199] 本发明选择性解聚的产物通过图1所示的工艺制备。
[0200] 将苹果果胶USP HM(50 kg)溶解并且在水中加热至35-85°C。加入1 M HC1或 NaOH以将溶液的pH调节到pH 5-7并充分混合。在35-85°C设定点继续混合2小时。根据 需要加入1 M NaOH或HC1以将pH再调节到5和7之间。将溶液冷却至30°C。在30°C，将 pH调节到5和7之间。
[0201] 将CuS04加入到调节过pH的果胶溶液中，从而形成ImM的最终CuS0 4浓度。将ImM CuS04溶液在10°C和30°C之间的温度混合30分钟。
[0202] 在30分钟ImM CuS04混合步骤结束时，加入50克抗坏血酸钠（量经预先校准以获 得所需的MW)并混合5到20分钟。加入H 202，以0. 02开始并直至1. 0摩尔/kg果胶（对 于初始的开始果胶丽预先校准），并且将H202浓度维持4小时（使用定量检验，Sigma， St-Louis)，同时将溶液pH维持在4和7之间。
[0203] 向溶液加入5 M NaOH从而形成pH在8和10之间的溶液。将调节过pH的溶液混 合10-30分钟。随后向调节过pH的溶液加入浓HC1以将溶液的pH调节到4和5之间。一 旦调节到pH 4和5之间，可以将溶液在2°C和8°C之间保持混合2至24小时。
[0204] 随后将溶液加热到80°C持续30-180分钟，并且向该溶液加入l_5kg过滤助剂 (Celite)，并将添加过Celite的溶液搅拌30分钟，随后过滤。弃去过滤产生的固体。
[0205] 将滤液在真空下浓缩1. 5-3倍，随后将pH调节到3和5之间。按50%重量加入热 的乙醇或异丙醇。将混合物搅拌1-2小时以沉淀产物，随后过滤混合物。弃去滤液，留下白 色至米白色沉淀物。
[0206] 向该溶液加入冷的96%乙醇，并且随后将所产生的浆液搅拌30分钟。将溶液过滤 并弃去滤液。重复96%乙醇浆液步骤，接着是最终过滤并回收白色至米白色沉淀物。
[0207] 该工艺的最终产物生成了具有图2所示一般的分子结构的组合物，如通过在下面 实施例2、3、4和5中描述的分析来评估。
[0208] 实施例2 :通讨MALLS分析平询分子质量
[0209] 利用多角度激光散射检测系统来生成单独显示聚合物分子量的齐姆（ZIMM)图。 MALLS方法的原理是基于以下事实，S卩：光线通过大分子比通过小分子能被更强烈地散射。 光散射探测器的输出与大分子的平均分子量和浓度的增加成比例。因此，光散射峰的形状 是不对称的。获得分子量对洗脱体积，且可以计算平均分子量和平均分子量分布。
[0210] 下表1和图3A-3B说明了通过MALLS确定的本发明选择性解聚化合物的平均分子 量，表明了在EDTA缓冲溶液中大约为37千道尔顿（kD)的平均分子量（具有8%的标准偏 差）。
[0211] 表 1
[0212]

【权利要求】
1. 一种阿拉伯半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸聚糖化合物，包括1，4-连接的半乳糖醛酸 (GalA)残基和半乳糖醛酸甲酯（MeGalA)残基主链，所述主链与α-1，2_连接的鼠李糖残 基和α -1，4-连接的GalA残基的交替性低聚物的支化杂聚物连接，所述鼠李糖残基携带 1，4-β -D-半乳糖残基、1，5-a -L-阿拉伯糖残基或其组合的低聚物的主要分支，其中，所 述阿拉伯半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸聚糖化合物能够减少TNF-α细胞因子从内毒素应激 的单核细胞中的分泌。
2. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物G能够通过激活的单核细胞 /巨噬细胞减少至少25%的TNF-α的分泌。
3. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，通过气相色谱/质谱法表征，所述 1，4-连接的半乳糖醛酸残基和半乳糖醛酸甲酯残基主链占总糖类摩尔含量的55到85 之间的摩尔百分数，所述交替性a-l，2_连接的鼠李糖残基和a-l，4-连接的GalA残 基的支化杂聚物占总糖类摩尔含量的1到6之间的摩尔百分数，所述主要分支的低聚物 1，4-β -D-半乳糖占总糖类摩尔含量的6到15之间的摩尔百分数，并且所述主要分支的低 聚物1，5-a -L-阿拉伯糖占总糖类摩尔含量的2到8之间的摩尔百分数。
4. 根据权利要求1所述的化合物，还包括木糖残基、葡萄糖残基、岩藻糖残基或其组 合。
5. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述l，4-i3-D-半乳糖残基、 1，5-a -L-阿拉伯糖残基或其组合的低聚物占总糖类摩尔含量的至少8摩尔百分数。
6. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，1，4-β -D-半乳糖残基和1，5-a -L-阿 拉伯糖残基以2:1或3:1的比例存在。
7. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有范围从2kDa到80kDa 的平均分子量。
8. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有范围从20kDa到70kDa 的平均分子量。
9. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有范围从5kDa到55kDa 的平均分子量。
10. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有范围从2到80kDa的 分子量。
11. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有范围从40%到70% (最高为87% )的甲氧基化程度。
12. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物的半乳糖醛酸甲酯与半乳 糖醛酸的比例在2:1到1:2的范围内。
13. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物的半乳糖醛酸甲酯加上半 乳糖醛酸与半乳糖的比例在4:1到7:1的范围内。
14. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物基本上不含有微生物内毒 素、农业杀虫剂、农业除草剂、铜、重金属、蛋白质、含氮化合物或前述物质的任意组合。
15. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，当被用于处理LX2永生化人肝星状细 胞时，所述化合物不会引起生存力降低。
16. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，当被用于处理产生半乳糖凝集素-3的 应激的LX2永生化人肝星状细胞时，所述化合物能够减少半乳糖凝集素-3的表达或者实质 性减少半乳糖凝集素-3的分泌。
17. -种阿拉伯半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸聚糖化合物，包括1，4-连接的半乳糖醛酸 (GalA)残基和半乳糖醛酸甲酯（MeGalA)残基主链，所述主链与α-1，2_连接的鼠李糖残 基和α-1，4-连接的GalA残基的交替性低聚物的支化杂聚物连接，所述鼠李糖残基携带 1，4-β -D-半乳糖残基、1，5-a -L-阿拉伯糖残基或其组合的低聚物的主要分支， 其中，所述化合物能够减少TNF-α细胞因子从内毒素应激的单核细胞中的分泌； 其中，所述化合物在癌细胞凋亡或细胞毒性模型中不抑制癌细胞增殖或凋亡；以及 其中，所述化合物对单核细胞或者激活的单核细胞没有细胞毒性。
18. 根据权利要求17所述的化合物，其特征在于，所述化合物不抑制癌细胞增殖，并且 其在浓度高达500 μ g/mL时没有细胞毒性。
19. 根据权利要求17所述的化合物，其特征在于，通过气相色谱/质谱法表征，所述 1，4-连接的半乳糖醛酸残基和半乳糖醛酸甲酯残基主链占总糖类摩尔含量的55到85 之间的摩尔百分数，所述交替性a-l，2_连接的鼠李糖残基和a-l，4-连接的GalA残 基的支化杂聚物占总糖类摩尔含量的1到3之间的摩尔百分数，所述主要分支的低聚物 1，4-β -D-半乳糖占总糖类摩尔含量的6到15之间的摩尔百分数，并且所述主要分支的低 聚物1，5-a -L-阿拉伯糖占总糖类摩尔含量的2到8之间的摩尔百分数。
20. 根据权利要求17所述的化合物，其特征在于，1，4-β -D-半乳糖残基、1，5-a -L-阿 拉伯糖残基或其组合占总糖类摩尔含量的至少8摩尔百分数。
21. 根据权利要求17所述的化合物，其特征在于，l，4-i3-D-半乳糖残基和 1，5-α-L-阿拉伯糖残基以2:1的比例存在。
22. 根据权利要求17所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有范围从2kDa到 80kDa的平均分子量。
23. 根据权利要求17所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有范围从20kDa到 70kDa的平均分子量。
24. 根据权利要求17所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有范围从5kDa到 55kDa的平均分子量。
25. 根据权利要求17所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有范围从2到80kDa的 分子量。
26. 根据权利要求17所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有范围从40%到70% (最高为87% )的甲氧基化程度。
27. 根据权利要求17所述的化合物，其特征在于，所述化合物的半乳糖醛酸甲酯与半 乳糖醛酸的比例在2:1到1:2的范围内。
28. 根据权利要求17所述的化合物，其特征在于，所述化合物的半乳糖醛酸甲酯加上 半乳糖醛酸与半乳糖的比例在4:1到8:1的范围内。
29. 根据权利要求17所述的化合物，其特征在于，当被用于处理LX2永生化人肝星状细 胞时，化合物会引起生存力降低。
30. 根据权利要求17所述的化合物，其特征在于，当被用于处理产生半乳糖凝集素-3 的应激的LX2永生化人肝星状细胞时，所述化合物能够引起半乳糖凝集素-3的表达实质性 减少或者半乳糖凝集素-3的分泌实质性减少。
31. -种包含处于可接受药用载体中的如权利要求1或17所述的化合物的组合物，用 于治疗性制剂。
32. 根据权利要求31所述的组合物，其特征在于，所述组合物能够经由静脉内、皮下或 口服途径进行肠胃外施用。
33. 根据权利要求31所述的组合物，还包括治疗剂。
34. 根据权利要求33所述的组合物，其特征在于，所述治疗剂是抗氧化化合物、抗炎 齐U、维生素、营养补充剂或其组合。
35. 权利要求31所述的组合物用于治疗非酒精性脂肪肝炎、纤维化、炎性和自身免疫 疾病、肿瘤病况或癌症。
36. 权利要求31所述的组合物用于治疗肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化或者心脏纤维 化。
【文档编号】C07H3/00GK104245717SQ201280068334
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2012年9月14日 优先权日:2011年12月28日
【发明者】E·佐默, 彼得·G·特拉伯, 阿纳特尔·A·科尔约瑟夫, 埃琳娜·契诃娃 申请人:卡莱克汀医疗有限公司