一种芹菜素-7-o-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法及用途
【专利摘要】本发明公开了一种芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法及用途，属于中药有效成分提取和应用领域。包括提取、水沉、纯化步骤，本发明的方法简单、方便，制备的芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷纯度高，对于治疗冠心病和心肌梗塞有较好的疗效。
【专利说明】—种芹菜素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷制备方法及用途
【技术领域】
[0001]本发明属于中药有效成分的提取方法和用途，具体涉及从苦碟子中提取黄酮苷类的方法及用途。
【背景技术】
[0002]苦碟子味辛、苦，微寒，具有清热解毒，消痈排脓，祛瘀止痛的功效。苦碟子主要成分为黄酮类、酚酸类、倍半萜内酯类、三萜类物质，药理作用较为广泛:(I)心、脑血管保护作用；具有增加冠脉流量，降低氧代谢，提高耐缺氧能力，对实验性心肌梗死的治疗作用，增加脑血流量，改善微循环，收缩血管作用。(2)对血液系统的作用；具有抗血小板聚集，增强纤维蛋白酶活性，降血脂、活血化瘀、抗动脉粥样硬化作用。(3)镇痛、镇静作用；(4)抗氧化和清除自由基作用；(5)抗肿瘤作用；(6)抗呼吸道病毒作用；(7)肝脏保护作用；(8)其他作用。
[0003]为了分析苦碟子中各成分的药理作用，需要对苦碟子进行提取，进一步研究各成分单独的药理作用，以便在临床上更精准的应用，目前，还没有发现芹菜素-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷的提取方法以及在治疗疾病方面的文献。
【发明内容】
[0004]本发明需要解决的技术问题是提供一种简单、方便、纯度高的制备芹菜素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷的方法以及芹菜素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷的用途。
[0005]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
一种芹菜素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷制备方法，包括以下步骤:
Α、提取:称取苦碟子，向苦碟子中加10-15倍量40-70%乙醇浸泡1-3小时，回流提取两次，每次2小时，合并提取液，在40-60°C条件下减压浓缩得到生药浓度为0.8-1.2g/ml的浓缩液I ;
B、水沉:向浓缩液I中加入3-6倍量去离子水，4-10°C冷藏，过滤，滤液备用；
C、纯化:将B步骤中所得滤液依次经过大孔吸附树脂I纯化得到浓缩液I1、聚酰胺纯化得到浓缩液II1、大孔吸附树脂II纯化得到浓缩液IV、高压制备色谱或中压制备色谱纯化两次，然后按照色谱峰收集目标化合物，然后减压浓缩、冷冻干燥即得。 [0006]所述大孔吸附树脂I为HZ820大孔吸附树脂；大孔吸附树脂II为XAD7HP吸附树脂。
[0007]作为优选方式所述大孔吸附树脂I纯化步骤如下:按照树脂与生药的质量比为1: 1.5称取HZ820大孔吸附树脂，湿树脂装柱，在PH3.5-4.0条件下，将滤液上样，上样流速为2-4BV/h，上样后饱和I小时；再用PH3.5-4.0的10%乙醇洗去杂质，洗脱流速为4-6BV/h,洗脱用量为4-6BV ;再用60%乙醇洗脱，洗脱流速6-8BV/h，洗脱用量为6-8BV，收集洗脱液，在40-60°C条件下减压浓缩得到浓度为0.2-0.5g/ml浓缩液II。
[0008]作为优选方式:所述聚酰胺纯化中，聚酰胺为30-60目，聚酰胺与生药质量比为1:6，将浓缩液II上样，上样流速为2-4BV/h，上样后饱和lh，先用14-16BV水以流速4-6BV/h洗脱，再用10-12BV 20%乙醇以流速4-6BV/h洗脱，除去杂质，然后再用14-16BV的70%乙醇以流速6-8BV/h洗脱，收集洗脱液，在40-60°C条件下减压浓缩得到浓度为0.9-1.lg/ml浓缩液III。
[0009]作为优选方式所述大孔吸附树脂II纯化步骤如下:按照树脂与生药质量比为2.03:1称取XAD7HP吸附树脂，湿树脂装柱，将浓缩液III调PH8.5-9.0上样，上样流速为l-2BV/h,上样后饱和30分钟，再用4-5BV的10%乙醇以流速6_8BV/h洗脱，收集洗脱液，在40-60°C条件下减压浓缩得到浓度为12-15g/ml浓缩液IV。
[0010]作为优选方式:所述高压制备色谱的C18填料与生药质量比为1:3，纯化两次，按照色谱峰收集芹菜素-7-0- β -D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得芹菜素-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷。
[0011]作为优选方式:所述中压制备色谱的C18填料与生药质量比为1:6，纯化两次，按照色谱峰收集芹菜素-7-0- β -D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得芹菜素-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷。
[0012]芹菜素-7- ο-β -D-葡萄糖醛酸苷制备方法，包括以下步骤:
Α、提取:称取苦碟子，向苦碟子中加10倍量40%乙醇浸泡1-3小时，回流提取两次，每次2小时，合并提取液，在60°C条件下减压浓缩得到生药浓度为1.2g/ml的浓缩液I ;
B、水沉:向浓缩液I中加入6倍量去离子水，4°C冷藏，过滤，滤液备用； C、将B步骤中所得滤液经过大孔吸附树脂I纯化，按照树脂与生药的质量比为1:1.5称取HZ820大孔吸附树脂，湿树脂装柱，在PH3.5-4.0条件下，将滤液上样，上样流速为2BV/h，上样后饱和I小时；再用PH3.5的10%乙醇洗去杂质，洗脱流速为4BV/h，洗脱用量为6BV ；再用60%乙醇洗脱，洗脱流速6BV/h，洗脱用量为8BV，收集洗脱液，在60°C条件下减压浓缩得到浓度为0.2g/ml浓缩液II ；
D、将步骤C中所得浓缩液II通过聚酰胺纯化，聚酰胺为30目，聚酰胺与生药质量比为1:6，将浓缩液II上样，上样流速为2BV/h，上样后饱和lh，先用16BV水以流速4BV/h洗脱，再用12BV 20%乙醇以流速4BV/h洗脱，除去杂质，然后再用16BV的70%乙醇以流速8BV/h洗脱，收集洗脱液，在60°C条件下减压浓缩得到浓度为0.9g/ml浓缩液III ；
E、将步骤D中所得浓缩液III通过大孔吸附树脂II，按照树脂与生药质量比为2.03:1称取XAD7HP吸附树脂，湿树脂装柱，将浓缩液III调PH8.5上样，上样流速为lBV/h，上样后饱和30分钟，再用4BV的10%乙醇以流速6BV/h洗脱，收集洗脱液，在60°C条件下减压浓缩得到浓度为15g/ml浓缩液IV ；
F、将步骤E中所得浓缩液IV通过高压制备色谱纯化，高压制备色谱的C18填料与生药质量比为1: 3，纯化两次，按照色谱峰收集芹菜素-7-0- β -D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得芹菜素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷。
[0013]或芹菜素-7- ο-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法，包括以下步骤:Α、提取:称取苦碟子，向苦碟子中加12倍量40-70%乙醇浸泡2小时，回流提取两次，每次2小时，合并提取液，在50°C条件下减压浓缩得到生药浓度为1.0g/ml的浓缩液I ;
B、水沉:向浓缩液I中加入4倍量去离子水，6°C冷藏，过滤，滤液备用；
C、将B步骤中所得滤液经过大孔吸附树脂I纯化，按照树脂与生药的质量比为1:1.5称取HZ820大孔吸附树脂， 湿树脂装柱，在PH4.0条件下，将滤液上样，上样流速为3BV/h，上样后饱和I小时；再用PH4.0的10%乙醇洗去杂质，洗脱流速为5BV/h，洗脱用量为5BV ;再用60%乙醇洗脱，洗脱流速7BV/h，洗脱用量为7BV，收集洗脱液，在50°C条件下减压浓缩得到浓度为0.3g/ml浓缩液II ；
D、将步骤C中所得浓缩液II通过聚酰胺纯化，聚酰胺为50目，聚酰胺与生药质量比为1:6，将浓缩液II上样，上样流速为3BV/h，上样后饱和lh，先用15BV水以流速5BV/h洗脱，再用IlBV 20%乙醇以流速5BV/h洗脱，除去杂质，然后再用15BV的70%乙醇以流速7BV/h洗脱，收集洗脱液，在50°C条件下减压浓缩得到浓度为1.0g/ml浓缩液III ；
E、将步骤D中所得浓缩液III通过大孔吸附树脂II，按照树脂与生药质量比为2.03:1称取XAD7HP吸附树脂，湿树脂装柱，将浓缩液III调PH9.0上样，上样流速为2BV/h，上样后饱和30分钟，再用5BV的10%乙醇以流速7BV/h洗脱，收集洗脱液，在50°C条件下减压浓缩得到浓度为13g/ml浓缩液IV ；
F、将步骤E中所得浓缩液IV通过中压制备色谱纯化，中压制备色谱的C18填料与生药质量比为1: 6，纯化两次，按照色谱峰收集芹菜素-7-0- β -D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得芹菜素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷。
[0014]通常将树脂装于圆筒形的树脂柱中，溶液连续地通过，树脂柱内装载树脂的体积称为床容积(bed volume)，简写为BV，这是树脂柱的基本单位，它工作时的各种物料量都以BV为单位。例如溶液通过树脂柱的流量速度为2~4BV/h，即每小时通过溶液的体积为树脂床容积的2~4倍。树脂的处理能力亦常以BV为单位计算。
[0015]作为优选方式:在制备治疗冠心病、心肌梗死疾病药物中的应用。
[0016]由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是:
本发明采用的制备方法，操作简单，得到的目标物纯度高在90%以上，用于治疗冠心病、心肌梗塞等的治疗，效果好。
[0017]为了证明芹菜素-7-ο-β-D-葡萄糖醛酸苷对于冠心病和心肌梗塞的作用，做了如下实验:
药效实验
本实验以发生心肌缺血的动物数为指标，观察芹菜素-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷对垂体后叶素致大鼠心肌缺血的作用，评价受试物抗心肌缺血的作用。
[0018]实验材料
1.1供试品
1.1.1从苦碟子中提取的芹菜素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷。
[0019]1.1.2理化性质:芹菜素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷为褐色粉末。
[0020]1.1.3拟临床适应症:拟开发其治疗心肌缺血的作用。
[0021]1.1.4拟临床用量:无临床推荐用量。
[0022]1.1.5含量及规格:纯度大于84%。
[0023]1.1.6来源和批号:石家庄以岭药业股份有限公司，批号:20120829。
[0024]1.1.7供试品保管:冷藏4_8°C。
[0025]阳性药、工具药及主要试剂
注射用盐酸地尔硫卓，缩写:DELZ，市售，静脉注射:成人用量，初次为10mg，临用前用氯化钠注射液或葡萄糖注射液溶解、稀释成1%浓度，在3分钟内缓慢注射。石药集团中诺药业(石家庄)有限公司，规格:10mg，10瓶/盒，批准文号:国药准字H20054297，产品批号:066120302。
[0026]垂体后叶素，南京新百药业有限公司，规格:Iml:6单位，10支/盒，批准文号:国药准字H32026638，产品批号:120402。
[0027]实验系统
1.3.1动物种系:SD大鼠 1.3.2动物级别=SPF0
[0028]1.3.3动物性别和数量:160只，雄性。
[0029]1.3.4动物年龄:4~6周龄。
[0030]1.3.5 动物体重:151 ~195g。
[0031]1.3.6动物来源:中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所。
[0032]1.3.7动物合格证号及发证单位、接收日期:合格证号0270472，发证单位是中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，接收日期是2012年09月14日。
[0033]1.3.8饲养条件:动物饲养在河北省中西医结合医药研究院新药评价中心。光照12小时/天，温度18~20°C ，相对湿度41~64%。大鼠笼养，5只/笼。
[0034]1.3.9检疫过程:新领到的动物检疫期3天。在检疫期间观察动物饮水、摄食无异常情况，健康状况良好，无疾病和死亡征兆。
[0035]1.3.10饲料:实验动物全价颗粒饲料，由北京科澳协力饲料有限公司提供，合格证号:0272010o
[0036]1.3.11饮水:普通用水灌装饮水瓶，供动物自由饮用。每日冲洗饮水瓶并换水一次。
[0037]1.3.12垫料:由河北省实验动物中心提供。
[0038]1.3.13动物标识:苦味酸标记。
[0039]实验方法
2.1实验设计依据
2.1.1采用标准:国家食品药品监督管理局颁布的《药品注册管理办法》附件一:中药、天然药物注册分类及申报资料要求。
[0040]2.1.2实验系统选择说明:本实验采用垂体后叶素复制的心肌缺血模型，评价芹菜素-7-0- β -D-葡萄糖醛酸苷的抗心肌缺血的作用。
[0041]2.1.3委托单位提供资料:芹菜素-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷采用N.S.溶解，其溶解度为20mg/ml,该浓度按10ml/kg静脉注射给予大鼠未见急性毒性反应。
[0042]剂量与分组
动物按体重随机分为5组，芹菜素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷分别设低、中、高剂量组，另设溶媒对照组和阳性对照组(DEZL)，每组20只。低、中、高剂量组拟给予剂量均为2、10、50 mg/kg ;阳性对照组给予DELZ, 1.3 mg/kg，相当于临床人用量(0.167mg/kg)的8倍。根据以上剂量设置情况，实验分组结果见附表1。
[0043]给药方法
静脉注射给药，与临床用药途径基本一致。[0044]供试品配制和保存
各受试药用N.S.配制成实验用浓度(表1)，芹菜素-7-0- β -D-葡萄糖醛酸苷低、中、高剂量组拟给予剂量均为2、10、50 mg/kg，给药体积为10ml/kg体重，计算低、中、高剂量受试物配制浓度分别0.2、1.0,5.0 mg/ml ;以上各药配制后置2_8°C保存备用。DELZ直接稀释成0.13mg/ml的浓度，按照10ml/kg给予。
[0045]表1抗心肌缺血作用的分组和给药剂量
【权利要求】
1.一种芹菜素-7- O-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法，其特征在于包括以下步骤: Α、提取:称取苦碟子，向苦碟子中加10-15倍量40-70%乙醇浸泡1-3小时，回流提取两次，每次2小时，合并提取液，在40-60°C条件下减压浓缩得到生药浓度为0.8-1.2g/ml的浓缩液I ; B、水沉:向浓缩液I中加入3-6倍量去离子水，4-10°C冷藏，过滤，滤液备用； C、纯化:将B步骤中所得滤液依次经过大孔吸附树脂I纯化得到浓缩液I1、聚酰胺纯化得到浓缩液II1、大孔吸附树脂II纯化得到浓缩液IV、高压制备色谱或中压制备色谱纯化两次，然后按照色谱峰收集目标化合物，然后减压浓缩、冷冻干燥即得。
2.根据权利要求1所述的芹菜素-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法，其特征在于:所述大孔吸附树脂I为ΗΖ820大孔吸附树脂；所述聚酰胺为30-60目；大孔吸附树脂II为XAD7HP吸附树脂。
3.根据权利要求1或2所述的芹菜素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷制备方法，其特征在于所述大孔吸附树脂I纯化步骤如下:按照树脂与生药的质量比为1:1.5称取ΗΖ820大孔吸附树脂，湿树脂装柱，在ΡΗ3.5-4.0条件下，将滤液上样，上样流速为2-4BV/h，上样后饱和I小时；再用PH3.5-4.0的10%乙醇洗去杂质，洗脱流速为4-6BV/h，洗脱用量为4-6BV ;再用60%乙醇洗脱，洗脱流速6-8BV/h，洗脱用量为6-8BV，收集洗脱液，在40_60°C条件下减压浓缩得到浓度为0.2-0.5g/ml浓缩液II。
4.根据权利要求1或2所述的芹菜素-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法，其特征在于所述聚酰胺纯化步骤如下:聚酰胺为30-60目，聚酰胺与生药质量比为1:6，将浓缩液II上样，上样流速为2-4BV/h，上样后饱和lh，先用14-16BV水以流速4_6BV/h洗脱，再用10-12BV 20%乙醇以流速4-6BV/h洗脱，除去杂质，然后再用14-16BV的70%乙醇以流速6-8BV/h洗脱，收集洗脱液，在40-60°C条件下减压浓缩得到浓度为0.9-1.lg/ml浓缩液III。
5.根据权利要求1或2所述的芹菜素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷制备方法，其特征在于所述大孔吸附树脂II纯化步骤如下:按照树脂与生药质量比为2.03:1称取XAD7HP吸附树月旨，湿树脂装柱，将浓缩液III调ΡΗ8.5-9.0上样，上样流速为l_2BV/h，上样后饱和30分钟，再用4-5BV的10%乙醇以流速6-8BV/h洗脱，收集洗脱液，在40_60°C条件下减压浓缩得到浓度为12-15g/ml浓缩液IV。
6.根据权利要求1或2所述的芹菜素-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法，其特征在于所述高压制备色谱纯化步骤如下:高压制备色谱的C18填料与生药质量比为1:3，纯化两次，按照色谱峰收集芹菜素-7-0- β -D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得芹菜素-7-0- β -D-葡萄糖醛酸苷。
7.根据权利要求1或2所述的芹菜素-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法，其特征在于所述中压制备色谱纯化步骤如下:中压制备色谱的C18填料与生药质量比为1:6，纯化两次，按照色谱峰收集芹菜素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得芹菜素-7-0- β -D-葡萄糖醛酸苷。
8.根据权利要求1或2所述的芹菜素-7-ο-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法，其特征在于包括以下步骤: Α、提取:称取苦碟子，向苦碟子中加10倍量40%乙醇浸泡1-3小时，回流提取两次，每次2小时，合并提取液，在60°C条件下减压浓缩得到生药浓度为1.2g/ml的浓缩液I ;B、水沉:向浓缩液I中加入6倍量去离子水，4°C冷藏，过滤，滤液备用； C、将B步骤中所得滤液经过大孔吸附树脂I纯化，按照树脂与生药的质量比为1:1.5称取HZ820大孔吸附树脂，湿树脂装柱，在PH3.5-4.0条件下，将滤液上样，上样流速为2BV/h，上样后饱和I小时；再用PH3.5的10%乙醇洗去杂质，洗脱流速为4BV/h，洗脱用量为6BV ；再用60%乙醇洗脱，洗脱流速6BV/h，洗脱用量为8BV，收集洗脱液，在60°C条件下减压浓缩得到浓度为0.2g/ml浓缩液II ； D、将步骤C中所得浓缩液II通过聚酰胺纯化，聚酰胺为30目，聚酰胺与生药质量比为1:6，将浓缩液II上样，上样流速为2BV/h，上样后饱和lh，先用16BV水以流速4BV/h洗脱，再用12BV 20%乙醇以流速4BV/h洗脱，除去杂质，然后再用16BV的70%乙醇以流速8BV/h洗脱，收集洗脱液，在60°C条件下减压浓缩得到浓度为0.9g/ml浓缩液III ； E、将步骤D中所得浓缩液III通过大孔吸附树脂II，按照树脂与生药质量比为2.03:1称取XAD7HP吸附树脂，湿树脂装柱，将浓缩液III调PH8.5上样，上样流速为lBV/h，上样后饱和30分钟，再用4BV的10%乙醇以流速6BV/h洗脱，收集洗脱液，在60°C条件下减压浓缩得到浓度为15g/ml浓缩液IV ； F、将步骤E中所得浓缩液IV通过高压制备色谱纯化，高压制备色谱的C18填料与生药质量比为1: 3，纯化两次，按照色谱峰收集芹菜素-7-0- β -D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得芹菜素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷。
9.根据权利要求1或2所述的芹菜素-7-ο-β-D-葡萄糖醛酸苷制备方法，其特征在于包括以下步骤: Α、提取:称取苦碟子，向苦碟子中加12倍量40-70%乙醇浸泡2小时，回流提取两次，每次2小时，合并提取液，在50°C条件下减压浓缩得到生药浓度为1.0g/ml的浓缩液I ; B、水沉:向浓缩液I中加入4倍量去离子水，6°C冷藏，过滤，滤液备用； C、将B步骤中所得滤液经过大孔吸附树脂I纯化，按照树脂与生药的质量比为1:1.5称取HZ820大孔吸附树脂，湿树脂装柱，在PH4.0条件下，将滤液上样，上样流速为3BV/h，上样后饱和I小时；再用PH4.0的10%乙醇洗去杂质，洗脱流速为5BV/h，洗脱用量为5BV ;再用60%乙醇洗脱，洗脱流速7BV/h，洗脱用量为7BV，收集洗脱液，在50°C条件下减压浓缩得到浓度为0.3g/ml浓缩液II ； D、将步骤C中所得浓缩液II通过聚酰胺纯化，聚酰胺为50目，聚酰胺与生药质量比为1:6，将浓缩液II上样，上样流速为3BV/h，上样后饱和lh，先用15BV水以流速5BV/h洗脱，再用IlBV 20%乙醇以流速5BV/h洗脱，除去杂质，然后再用15BV的70%乙醇以流速7BV/h洗脱，收集洗脱液，在50°C条件下减压浓缩得到浓度为1.0g/ml浓缩液III ； E、将步骤D中所得浓缩液III通过大孔吸附树脂II，按照树脂与生药质量比为2.03:1称取XAD7HP吸附树脂，湿树脂装柱，将浓缩液III调PH9.0上样，上样流速为2BV/h，上样后饱和30分钟，再用5BV的10%乙醇以流速7BV/h洗脱，收集洗脱液，在50°C条件下减压浓缩得到浓度为13g/ml浓缩液IV ； F、将步骤E中所得浓缩液IV通过中压制备色谱纯化，中压制备色谱的C18填料与生药质量比为1: 6，纯化两次，按照色谱峰收集芹菜素-7-0- β -D-葡萄糖醛酸苷药液，然后减压浓缩，冷冻干燥，即得芹菜素-7-0-β -D-葡萄糖醛酸苷。
10.根据权利要求1或2所制备的芹菜素-7-0-β-D-葡萄糖醛酸苷的用途，其特征在于:在制备治疗 冠心病、心肌梗死疾病药物中的应用。
【文档编号】C07H17/07GK103965274SQ201310043643
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月5日 优先权日:2013年2月5日
【发明者】姜新刚, 贾继明, 赵韶华, 唐思文, 王贵金, 裴彩云 申请人:河北以岭医药研究院有限公司