一种用核桃粕制备具有降尿酸功效的生物活性肽的方法
【专利摘要】本发明公开了一种用核桃粕制备具有降尿酸功效的生物活性肽的方法，该方法包括以下步骤：将核桃粕加水磨浆，加入碱性蛋白酶和纤维素酶，当水解度达到10-15%时，灭酶，离心，得到核桃粕酶解液；将酶解液过超滤膜和强酸型凝胶型阳离子交换树脂，得到具有降尿酸功效的生物活性肽。本发明结合生物酶解和色谱分离技术，制备出生物活性肽，目标活性肽的降尿酸作用显著。经大鼠动物实验表明采用本发明方法制备的降尿酸肽可显著降低大鼠的血肌酐水平，并对大鼠的肾脏功能具有一定程度的保护作用，降尿酸活性强。
【专利说明】—种用核桃粕制备具有降尿酸功效的生物活性肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用核桃柏制备具有降尿酸功效的生物活性肽的方法。
【背景技术】
[0002]高尿酸血症是指细胞外液的尿酸盐呈超饱和状态，当男性血尿酸盐≥ 416umol/L,而女性≥357umol/L时应考虑高尿酸血症。
[0003]高尿酸血症分为原发性和继发性两大类，原发性高尿酸血症由尿酸生成增加或排泄减少或二者同时并存引致。痛风是尿酸盐晶体沉积引起的临床综合征，是以高尿酸血症为主要特征，表现为反复发作的关节炎、痛风石形成和关节畸形，累及肾脏可引起慢性间质性肾炎和尿酸性肾石病，严重者可出现关节致残、肾功能不全。因此，降尿酸治疗是非常必要的。
[0004]目前，降尿酸治疗的药物主要分为三大类:(1)促进尿酸排泄药，主要的药物有苯溴马龙、丙吡酮，这些药物主要是抑制近端肾小管对尿酸的重吸收，以利于尿酸排泄。(2)抑制尿酸生成药，主要的药物有别嘌呤醇和非布索坦，主要通过肝脏代谢，不依赖肾排除。(3)促尿酸分解药，主要的药物有拉布立酶和聚乙二醇尿酸酶，它们主要通过分解尿酸为易于分泌排泄出的尿囊而发挥作用。但这些降尿酸药物均为合成药物，其副作用大，容易损害肾功能，如果长期服用甚至会产生肾衰竭。
[0005]目前也有中药制剂用于治疗高尿酸症，该类中草药能有一定的治疗效果，但由于制剂中药成分较多，质量控制相对困难，服用不方便。
[0006]也有研究者对报道中具有降尿酸功效的原料中有效成分进行了分离提纯，发现一些黄酮物质具有明显的降尿酸作用。如孙玮研究了桦褐孔菌提取物对注射氧嗪酸钾造成高尿酸大鼠的血清指标和肾功能的影响，发现桦褐孔菌提取物对高尿酸血症大鼠有一定的治疗作用。赵赞采用腺嘌呤联合高糖饮食诱导的高尿酸血症大鼠模型研究了越桔果渣黄酮对其血尿酸的作用，结果表明越桔果渣黄酮对高尿酸血症及肾损伤具有明显的防治作用。王瑞坡从桑椹中提取粗黄酮，并进行大鼠实验，发现桑椹粗黄酮对大鼠肝脏黄嘌呤氧化酶酶活性具有较好的抑制作用，从而有效的降低大鼠的尿酸水平。但提取该类黄酮的工艺复杂、能耗加大、得率低，不利于在我国大面积推广。
[0007] 自1902年伦敦大学医学院的Buyliss和starlling首次发现活性多肽物质-
促胰激素以来，人们对肽的研究逐渐深入，世界上许多科学家都在致力于活性多肽物质的研究。近一个世纪的研究表明，肽是由20个天然氨基酸以不同的组成和排列方式构成的二肽到复杂的线性和环形结构的不同肽类总称，是源于蛋白质的多功能化合物。科学家们研究发现活性肽具有免疫调节、激素调节、酶调节、抗病毒、降血压和降血脂等功能。由于功能性肽的特殊功能，使得人们对它的需求增加，现在已提取出的多种功能性肽多用于医用和保健，如功能性大豆蛋白肽已经用于降血脂。伴随肽的结构和功能研究逐渐深入，越来越多的具有新的功能特性的多肽被发现。
[0008]我国年产核桃30万吨以上，占世界三分之一。我国的核桃制品主要为核桃油、核桃乳、核桃粉、核桃干等。核桃柏为核桃榨完油后所剩的残柏，其含有30%以上的蛋白质，18种氨基酸齐全，8种必需氨基酸中的精氨酸和谷氨酸含量较高，但由于其色泽和气味在加工过程中劣化，限制了去应用领域，目前，多数厂家把其当作饲料原料低价出售。
[0009]蛋白质酶解是改造蛋白质、实现蛋白质功能多兀化、提闻蛋白质价值的最有效途径之一，目前可采用酶解手段获得具多种生物活性的蛋白肽，如抗氧化肽、降血压肽、抗疲劳肽等，然而不同分子量分布、不同极性和不同氨基酸序列及空间构效的蛋白肽具有的生物活性，通过控制酶解工艺来调节获取目标功能的蛋白肽是科研工作者一直努力追求的目标。因此，以核桃柏为原料制备生物活性肽，具有较大的经济和社会意义。
【发明内容】
[0010]本发明的首要目的在于提供一种用核桃柏制备具有降尿酸功效的生物活性肽的方法，该方法的创新点在于对水解酶和水解程度的具体选择，以及采用了膜分离-大孔树脂联用分离富集步骤(包括对超滤膜和离子交换树脂的选择)。
[0011]本发明的另一目的在于提供由上述方法制得的具有降尿酸功效的生物活性肽。
[0012]本发明的再一目的在于提供上述的具有降尿酸功效的生物活性肽的用途。
[0013]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0014]一种用核桃柏制备具有降尿酸功效的生物活性肽的方法，包括以下步骤:
[0015](I)核桃柏的预处理:加水使核桃柏质量含量达到10-15% (w/w)，在100_121°C下加热30-45min，然后过胶体磨得到核桃柏浆液；
[0016](2)限制性酶解:将核桃柏浆液加热至45_55°C，加入碱性蛋白酶和纤维素酶，当水解度达到10-15%时，灭酶，离心，取上清液，为核桃柏酶解液；以原料核桃柏的质量为计算基准，碱性蛋白酶的加入量占0.6-1.2%，纤维素酶的加入量占1.0-1.5% ；
[0017](3)膜分离-大孔树脂联用分离富集降尿酸肽:将核桃柏酶解液通过膜通量为1000ODa的超滤膜，收集透过液，再过强酸型凝胶型阳离子交换树脂，以酸性水为洗脱剂洗脱，收集洗脱液；真空浓缩洗脱液，喷雾干燥，得到具有降尿酸功效的生物活性肽；
[0018]步骤(1)所用的核桃柏是油脂含量不高于10%的低温压榨核桃柏；
[0019]步骤(2)所述的灭酶是将核桃柏浆液加热至95-100°C保持15_30min ；
[0020]步骤(3)所述的强酸型凝胶型阳离子交换树脂优选001X7凝胶型阳离子交换树脂；
[0021]步骤(3)所述的酸性水优选pH值为2.5-4的水。
[0022]由上述方法制得的具有降尿酸功效的生物活性肽可以用于制备降尿酸药物。
[0023]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0024](I)本发明结合生物酶解和色谱分离技术，制备出生物活性肽，目标活性肽的降尿酸作用显著。经大鼠动物实验表明采用本专利方法制备的降尿酸肽可显著降低大鼠的血肌酐水平，并对大鼠的肾脏功能具有一定程度的保护作用。 [0025]( 2 )本发明工艺操作简单、生产成本低、没有任何污染、体外筛选指标简单准确，所得生物活性肽的降尿酸活性强。
【专利附图】
【附图说明】[0026]图1是实施例中降尿酸肽及市售大豆肽的尿酸峰色谱图。
[0027]图2是对比例中核桃肽的尿酸峰色谱图。
【具体实施方式】
[0028]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0029]以下各实施例中，采用反相高效液相色谱法测定尿酸值的方法如下:
[0030](I)溶液的配置
[0031]0.2mol/L (ρΗ7.5)磷酸缓冲液(PBS):准确称取 30.0838g Na2HPO4.12H20 和
2.4962g NaH2PO4.2H20，用去离子水溶解，定容至500ml。
[0032]黄嘌呤:准确称取6.4mg,先用ImllM NaOH溶解黄嘌呤，再加入100mlPBS,以IMHCl调节pH值至7.5。
[0033]黄嘌呤氧化酶:取120 μ I酶液，以PBS稀释至8ml。
[0034]尿酸标曲:准确称取10mg，加入IOml水，再稀释至0.1~0.9mg/ml。
[0035]醋酸胺-冰醋酸:准确称取醋酸胺3.85g定容至1000ml，然后加入4ml冰醋酸。
[0036](2)样品预处理:
[0037]将样品稀释至40mg/m·l，在96孔酶标板中依次加入50 μ I样品与50 μ I黄嘌呤，每个样品做3个平行，以50，25，10，5，2.5 μ g/ml别嘌呤醇为阳性对照。37°C保温IOmin后加入150 μ I黄嘌呤氧化酶，30s读一次吸光值，总计60次30min。读数完后以80 μ IlM HCl终止反应，过0.25 μ m水性膜，待测。
[0038]色谱柱:ZorbaxEclipse XDB-C18 柱(5 μ m, 4.6 X 250mm,安捷伦)，
[0039]液相条件:洗脱液为10%甲醇+90%醋酸胺-冰醋酸溶液，进样体积为20 μ L，流速lml/min,检测波长为290nm,运行时间lOmin。
[0040]以下各实施例中，生物活性肽对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用的实验方法如下:
[0041](I)实验材料
[0042]动物:SPF级SD大鼠110只，雄性，体重200土20g，购自广州中医药大学实验动物中心(许可证号:SCXK (粤)2013-0020)。
[0043]药品和试剂:别嘌醇片(广东彼迪药业有限公司，产品批号20130302);氧嗪酸钾(山东中科泰斗化学有限公司，批号=Batch N0.120901);羧甲基纤维素钠(上海赛璐珞厂，产品标准号:GB2760);尿酸试剂盒(南京建成生物工程研究所，生产批号:20130529)。
[0044]仪器:TGL-16G型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);多功能酶标仪(BioTelcUSA, Synergy HT)。
[0045]动物饲养状况:动物饲养于暨南大学SPF级实验动物中心，饲养鼠料、铺料均由暨南大学实验动物中心提供。自由食水，灯照12h，室温为(20±2) °C，相对湿度(60~70)%。
[0046](2)实验方法
[0047]动物分组和造模:取正常健康SD雄性大鼠185只，随机分为正常对照组(20只)和造模组(165只)，造模组大鼠每天灌胃氧嗪酸钾(2g.kg—1 )，连续处理7天，然后3%戊巴比妥钠(30mg ?kg—1)腹腔注射麻醉,眼结膜取血(0.5ml),以4°C、3000rpm、离心15min,取上层血清测定尿酸含量；正常对照组大鼠灌胃给予等容积的溶媒。将尿酸含量高于IlOumol -L-1的大鼠确定为造模成功。将造模成功的大鼠按尿酸含量随机分为模型对照组(等容积溶媒)、受试药肽样品组降尿酸肽I (200mg.kg4)、降尿酸肽2 (200mg.kg4)、降尿酸肽3(200mg ?1^_1)、核桃肽六(20011^ ?1^_1)、核桃肽13(20011^.kg—1)、核桃肽 C(200mg ?kg—1)、核桃肽 D (200mg *kgH)、核桃肽 E (200mg -kg—1)大豆肽(200mg *kg4)和别嘌醇组(50mg.kg-1),每组大鼠15只，灌胃给药(给药容积10ml/kg)，模型大鼠给予等容积的蒸馏水。上述肽样品处理10d、20d时，于末次给药50min，3%戊巴比妥钠(30mg.kg—1)后，眼结膜取血(0.5ml),测定血清尿酸含量；抗痛风肽处理第30d时，3%戊巴比妥钠麻醉后腹腔动脉取血5ml，除测定血清尿酸含量外，同时测定血清肌酐和尿素氮含量。
[0048]血清尿酸测定:采用钨酸法并严格按试剂盒说明进行操作和测定。
[0049]血清尿素氮和肌酐测定:采用二乙酰肟法测定血清尿素氮含量；采用苦味酸法测定血清肌酐含量，具体操作严格按试剂盒说明进行测定。
[0050]统计学处理:所有数据均以(i±S )表示，采用spssie.0统计软件处理，各组组间
差异比较采用t检验方法，P<0.05为差异具有统计学意义。
[0051]实施例1
[0052]一种用核桃柏制备具有降尿酸功效的生物活性肽的方法，包括以下步骤:
[0053](I)核桃柏的预处理:加水使核桃柏质量含量达到10% (w/w)，在100°C下加热45min,并过胶体磨得到核桃柏浆液。
[0054](2)限制性酶解:将核桃柏浆液加热至50°C，加入核桃柏质量0.6%的碱性蛋白酶和核桃柏质量1.0%纤维素酶，当水解度达到10%时，灭酶(加热至95-100°C保持15-30min),离心，取上清液，为核桃柏酶解液；
[0055](3)膜分离-大孔树脂联用分离富集降尿酸肽:将核桃柏酶解液通过膜通量为1000ODa的超滤膜，收集透过液，再过001 X 7凝胶型阳离子交换树脂，以水(pH值4)为洗脱剂洗脱，收集洗脱液。
[0056](4)真空浓缩洗脱液，喷雾干燥，得降尿酸肽I。
[0057]降尿酸肽高效液相色谱测定的尿酸峰形图及峰面积如图1。
[0058]降尿酸肽对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1和表2。
[0059]实施例2
[0060]一种用核桃柏制备具有降尿酸功效的生物活性肽的方法，包括以下步骤:
[0061](I)核桃柏的预处理:加水使核桃柏质量含量达到12% (w/w)，在110°C下加热40min,并过胶体磨得到核桃柏浆液。
[0062](2)限制性酶解:将核桃柏浆液加热至55°C，加入核桃柏质量0.8%的碱性蛋白酶和核桃柏质量1.5%纤维素酶，当水解度达到12%时，灭酶(加热至95-100°C保持15-30min),离心，取上清液，为核桃柏酶解液；
[0063](3)膜分离-大孔树脂联用分离富集降尿酸肽:将核桃柏酶解液通过膜通量为1000ODa的超滤膜，收集透过液，再过001 X 7凝胶型阳离子交换树脂，以水(pH值3.0)为洗脱剂洗脱，收集洗脱液。
[0064](4)真空浓缩洗脱液，喷雾干燥，得降尿酸肽2。[0065]降尿酸肽2高效液相色谱测定的尿酸峰形图及峰面积如图1。
[0066]降尿酸肽2对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1和表2。
[0067]实施例3
[0068]一种用核桃柏制备具有降尿酸功效的生物活性肽的方法，包括以下步骤:
[0069](I)核桃柏的预处理:加水使核桃柏质量含量达到15% (w/w)，在100°C下加热45min,并过胶体磨得到核桃柏浆液。
[0070](2)限制性酶解:将核桃柏浆液加热至50°C，加入核桃柏质量1.2%的碱性蛋白酶和核桃柏质量1.2%纤维素酶，当水解度达到15%时，灭酶(加热至95-100°C保持15-30min),离心，取上清液，为核桃柏酶解液；
[0071](3)膜分离-大孔树脂联用分离富集降尿酸肽:将核桃柏酶解液通过膜通量为1000ODa的超滤膜，收集透过液，再过001 X 7凝胶型阳离子交换树脂，以水(pH值2.5)为洗脱剂洗脱，收集洗脱液。
[0072](4)真空浓缩洗脱液，喷雾干燥，得降尿酸肽3。
[0073]降尿酸肽3高效液相色谱测定的尿酸峰形图及峰面积如图1。
[0074]降尿酸肽3对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1和表2。
[0075]对比例I
[0076](I)核桃柏的预处理:加水使核桃柏质量含量达到12% (w/w)，在110°C下加热40min,并过胶体磨得到核桃柏浆液。
[0077](2)限制性酶解:
[0078]A、将核桃柏浆液加热至50°C，加入核桃柏质量0.8%的碱性蛋白酶和核桃柏质量1.0%纤维素酶，当水解度达到12%时，灭酶，离心，取上清液，为核桃柏酶解液A ；
[0079]B、将核桃柏浆液加热至50°C，加入核桃柏质量0.8%的酸性蛋白酶和核桃柏质量1.0%纤维素酶，当水解度达到12%时，灭酶，离心，取上清液，为核桃柏酶解液B ;
[0080]C、将核桃柏浆液加热至50°C，加入核桃柏质量0.8%的碱性蛋白酶和核桃柏质量
1.0%纤维素酶，当水解度达到6%时，灭酶，离心，取上清液，为核桃柏酶解液C ；
[0081](3)分别将核桃柏酶解液A、B、C真空浓缩洗脱液，喷雾干燥，分别得核桃肽A、核桃肽B和核桃肽C。
[0082]核桃肽A、B、C高效液相色谱测定的尿酸峰形图及峰面积如图2。
[0083]核桃肽A、B、C对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1和表2。
[0084]对比例2
[0085](I)核桃柏的预处理:加水使核桃柏质量含量达到10% (w/w)，在100°C下加热45min,并过胶体磨得到核桃柏浆液。
[0086](2)限制性酶解:将核桃柏浆液加热至50°C，加入核桃柏质量0.8%的碱性蛋白酶和核桃柏质量1.0%纤维素酶，当水解度达到12%时，灭酶，离心，取上清液，为核桃柏酶解液；
[0087]( 3 )分离富集核桃肽:
[0088]D、将核桃柏酶解液通过膜通量为1000ODa的超滤膜，收集透过液，得超滤液D。
[0089]E、将核桃柏酶解液通过膜通量为1000ODa的超滤膜，收集透过液，再过GM201强碱型阴离子交换树脂，以水(pH值8)为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，得洗脱液E。[0090](4)分别将上述核桃柏酶解液分离物真空浓缩洗脱液，喷雾干燥，分别得核桃肽D和核桃肽E。
[0091]核桃肽D、E高效液相色谱测定的尿酸峰形图及峰面积如图2。
[0092]核桃肽D、E对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1和表2。
[0093]对比例3
[0094]市售大豆肽产品
[0095]大豆肽高效液相色谱测定的尿酸峰形图及峰面积如图1。
[0096]大豆肽对氧嗪酸钾诱致大鼠高尿酸血症的治疗作用如表1和表2。
[0097]表1抗痛风肽对氧嗪酸钾诱致高尿酸血症大鼠不同时间血清尿酸含量的影响
(X±s)
[0098]
【权利要求】
1.一种用核桃柏制备具有降尿酸功效的生物活性肽的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)核桃柏的预处理:加水使核桃柏质量含量达到10-15%(w/w)，在100-121°c下加热30-45min，然后过胶体磨得到核桃柏浆液； (2)限制性酶解:将核桃柏浆液加热至45-55°C，加入碱性蛋白酶和纤维素酶，当水解度达到10-15%时，灭酶，离心，取上清液，为核桃柏酶解液；以原料核桃柏的质量为计算基准，碱性蛋白酶的加入量占0.6-1.2%，纤维素酶的加入量占1.0-1.5% ； (3)膜分离-大孔树脂联用分离富集降尿酸肽:将核桃柏酶解液通过膜通量为1000ODa的超滤膜，收集透过液，再过强酸型凝胶型阳离子交换树脂，以酸性水为洗脱剂洗脱，收集洗脱液；真空浓缩洗脱液，喷雾干燥，得到具有降尿酸功效的生物活性肽。
2.根据权利要求1所述的用核桃柏制备具有降尿酸功效的生物活性肽的方法，其特征在于:步骤(3)所述的强酸型凝胶型阳离子交换树脂为001X7凝胶型阳离子交换树脂。
3.根据权利要求1所述的用核桃柏制备具有降尿酸功效的生物活性肽的方法，其特征在于:步骤(3)所述的酸性水是pH值为2.5-4的水。
4.一种具有降尿酸功效的生物活性肽，其特征在于是由权利要求1-3任一项所述的方法制备得到。
5.权利要求4所述的具有降尿酸功效的生物活性肽在制备降尿酸药物中的应用。
【文档编号】C07K1/34GK103627760SQ201310485124
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年10月16日 优先权日:2013年10月16日
【发明者】苏国万, 赵谋明, 赵强忠, 崔春, 孙为正 申请人:华南理工大学