核桃粕抗氧化肽及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及核桃粕抗氧化肽及其制备方法，本发明利用核桃粕蛋白，通过酶法水解，得到青养蛋白酶解液，再利用凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱对其进行分离纯化得到十四种新的抗氧化肽产品，并测定其氨基酸序列。本发明所制得的抗氧化肽具有很强的抗氧化作用，氧自由基吸收能力都约为粗肽的4倍，而且肽具有分子量小、可被人体直接吸收的特点，因此可以广泛应用于食品、保健品及化妆品等领域。
【专利说明】核桃粕抗氧化肽及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及天然抗氧化肽【技术领域】，具体涉及核桃柏抗氧化肽及其制备方法。
【背景技术】
[0002]自从英国Harman于1956年提出自由基理论以来,人们逐步认识到人体许多慢性疾病如免疫力下降、心血管疾病、神经组织退化紊乱、癌症及衰老都与体内氧化产生的自由基有关，因而抗氧化剂的研究越来越被人们所关注。传统使用的抗氧化剂多为化学合成抗氧化剂，如二叔丁基羟基甲苯(BHT)，叔丁基羟基茴香醚(BHA)，由于价廉且具有很强的抗氧化能力而被广泛使用，但是由于其对人体健康存在潜在的危害而被限制使用。因此，寻找和开发安全、无毒、高效的天然抗氧化剂，已成为当今社会的研究热点。
[0003]天然抗氧化肽是存在于动植物体中具有抗氧化活性的肽类，它具有清除自由基、螯合金属离子、猝灭单线态氧、分解过氧化物及抑制脂质过氧化等功效，易被人体吸收，无毒副作用，营养和加工特性良好，因此在人类食品和药品中具有巨大的开发前景。目前也有很多学者采用酶解的技术从植物或者动物组织中制备得到活性很强的抗氧化肽。发明申请专利(申请号201010141974.3)公开了一系列的胶原蛋白抗氧化肽，具有如下之一的氨基酸序列:(I) Hyl-Cys ； (2) Gln-Gly-Ala-Arg ； (3) Leu-Gln-Gly-Met ； (4)Leu-Gln-Gly-Met-Hyp,该产品抗氧化作用很强，不仅可以替代BHT等用作食品的添加剂，而且可以作为活性功能性成分，而且具有分子量小的特点，易被消化道直接吸收。发明申请专利(申请号200510009423.0)公开了通过将蜂王浆用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶进行酶处理，可以获得具有和维生素E同等强度的强抗氧化能力的三种抗氧化肽，氨基酸序列为:
(I)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu ； (2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln ； (3)Ser-Leu-Pro-1Ie-Leu-His-Glu-Trp。
[0004]核桃，又名羌桃、胡桃，属胡桃 科胡桃属植物，是一种经济价值和营养价值都很高的珍贵果木。核桃与扁桃、腰果、榛子并列为世界四大干果。核桃蛋白中蕴涵许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解有可能释放出活性的肽段。核桃经过浸提出大部分油脂剩下的部分即为核桃柏，含有40%以上的蛋白质。核桃蛋白是一种优质的植物蛋白，含有18种氨基酸，且人体所需的8种必需氨基酸含量合理。但目前大部分优质核桃柏直接当做饲料和肥料处理掉，浪费了许多优质蛋白质资源。通过酶解得到核桃多肽可以作为食品添加剂或营养多肽，以提高核桃蛋白的经济价值。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种更安全、高效利用原料，且抗氧化活性很强的抗氧化肽的制备方法，该抗氧化肽的氨基酸序列有来自D2的Tyr-Ser (269.1126), Tyr-Ser-Val-His (505.2281)，Tyr-Lys (310.1367)，Tyr-Thr (283.1281)，Leu-Pro-Cys(331.1644)，Glu-Met(279.1336)和 D3 的 Tyr-Ala (253.1181), Tyr-Gly (239.1025), Ala-His (255.1593), Ala-Cys(192.1384), Asn-Trp(318.3007), Cys-Arg(288.2900), Ser-Gln-Lys(362.3272), Cys-His-Cys(362.3265)。
[0006]本发明提供一种利用商业食品级蛋白酶，酶解核桃柏蛋白，并对酶解物进行分离纯化，得到十四种抗氧化肽。
[0007]核桃柏抗氧化肽的制备方法，具体步骤如下:[0008](I)核桃柏蛋白酶解物的制备:将核桃柏与水按质量比1:8~1:10混合，加入占核桃柏蛋白质量1%_2%的胰酶，在50-55°C酶解18-22h ;沸水中10_30min灭酶，离心，取上清液，抽滤，得到核桃柏蛋白酶解液，冻干得到核桃柏蛋白多肽粉末；
[0009](2)抗氧化肽的分离纯化:将核桃柏蛋白酶解液冻干后，用01.6x100 cm的Sephadex G-15凝胶柱进行分离纯化,用去离子水以0.5~2.0ml/min的流速进行洗脱,检测波长为214nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的组分D，冷冻干燥得粉末D ；
[0010](3)将粉末D溶于水后，用反相高效液相色谱进行纯化，分别得到活性组分D2和活性组分D3，得到所述抗氧化肽；其中纯化条件为:色谱柱为XBr i dgeTMpre C18tt (5 μ m, 10X150mm;WaterS，USA)，流动相为A相-B相，所述A相为已腈，所述B相为
0.l%-0.2%V/V 二氟乙酸水溶液，洗脱程序为:在0_4min内米用的流动相中A、B的体积百分比分别为5%和95% ;在4-8min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为15%和85% ;在8-12min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为15%和85%，在12_30min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为40%和60%，流速为1.5-4mL/min，检测波长为215nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的两个峰。
[0011]将得到的目标肽，用电喷雾串联质谱法测定肽的分子量及氨基酸序列。
[0012]上述方法得到的抗氧化肽，所述活性组分D2具有Tyr-Ser (269.1126)，Tyr-Ser-Val-His(505.2281)，Tyr-Lys(310.1367)，Tyr-Thr(283.1281)，Leu-Pro-Cys(331.1644)，Glu-Met (279.1336)的氨基酸序列，所述活性组分 D3 具有 Tyr-Ala (253.1181), Tyr-Gly (239.1025)，Ala-His(255.1593)，Ala-Cys(192.1384)，Asn-Trp(318.3007)，Cys-Arg (288.2900)
，Ser-Gln-Lys (362.3272)，Cys-His-Cys (362.3265)的氨基酸序列。
[0013]在本发明中，米用ORAC(Oxygen radical absorbance capacity,氧自由基吸收能
力)法来测定抗氧化肽的活性。该方法现已经成为美国农业部、美国卫生院、FDA评价食
品抗氧化能力的重要标准。欧洲、日本等国家的食品、功能食品行业也普遍采用ORAC作为
抗氧化能力的重要评价标准，是目前评价体外抗氧化能力最权威性的方法。基于ORAC反
应在75mmol.L-1磷酸盐缓冲液(pH=7.4)环境中进行，FL (荧光素钠盐)、AAPH (自由基产
生剂)、标准抗氧化物质Trolox (水溶性维生素E类似物)以及待测样品均用该缓冲液溶
解和稀释。具体测定操作为:在96孔板各微孔中分别加入待测样品20 μ 1，FL (终浓度为
70nmol.L—1) 120 μ 1，在37°C下预置15min后，用多道移液器迅速在各孔中加入AAPH (终
浓度为12mmol.171) 60 μ I启动反应，并将微孔板置于荧光分析仪中在37°C下以激发波长
485nm,发射波长528nm进行连续测定,每Imin测定一次各孔突光强度,测定120min,突光强
度分别记为fo，f1； f2...f120O将记录的各微孔不同时间点的绝对荧光强度数据fn与初
120 f
始荧光强度&相比，折算成相对荧光强度，并根据公式Αυ(>1+Σ.^，统计荧光熄灭曲线
i=l 1O
下面积(AUCsample)值，然后根据公式netAUC=AUCsample-AUCblank，分别计算不同浓度Trolox和样品的net AUC值，其中AUCblank为没有抗氧化剂存在时自由基作用对照的AUC值。
[0014]本发明的抗氧化肽具有很强的抗氧化作用，经液相分离后得到的活性最好的两个组分的氧自由基吸收能力是是粗肽的4倍左右。本发明提供的抗氧化肽具有很强的抗氧化作用，可以作为抗氧化剂应用于食品添加剂、保健品、化妆品及护肤品等。
[0015]本发明与现有技术相比，具有如下优点:
[0016](I)酶解技术及色谱分离技术制备出十四种抗氧化肽；
[0017](2)本发明提供的抗氧化肽活性很强，两个抗氧化活性最好的组分D2和D3的氧自由基吸收能力为粗肽的4倍左右，不仅可以用作食品添加剂，也可以作为功能性成分，用于保健品、化妆品及护肤品中；
[0018](3)本发明提供的抗氧化肽有二肽、三肽和四肽，分子量小，可被人体直接吸收；
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为Sephadex G_15凝胶过滤色谱分离纯化抗氧化肽图谱，
[0020]图2为经Sephadex G_15凝胶过滤色谱分离出的各组分的抗氧化活性测定图，
[0021]图3为半制备型反相高效液相色谱分离纯化抗氧化肽图谱，
[0022]图4为半制备型反相高效液相色谱分离得出的各组分的抗氧化活性测定图。
具体实施方案
[0023]通过下述实施例将`更详细地说明本发明。
[0024]实施例1
[0025](I)核桃柏蛋白酶解物的制备:将核桃柏与水按质量比1:8混合，加入核桃柏蛋白质量1%的胰酶，在55°C酶解18h ;沸水中IOmin灭酶，离心，取上清液，抽滤，得到核桃柏蛋白酶解液，水解度为9.65 ±0.37% ；
[0026](2)抗氧化肽的分离纯化:将核桃柏蛋白酶解液冻干后，用Sephadex G_15凝胶柱(01.6x100 cm)进行分离纯化，用去离子水以0.8ml/min的流速进行洗脱，检测波长为
214nm,测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的组分D，冷冻干燥得活性最高的粉末D ；
[0027](3)将粉末D溶于水后，用反相高效液相色谱进行纯化，分别得到活性组分D2和活性组分D3，其中纯化条件为:色谱柱为XBridge? pre C18柱(5 μ m, IOX 150mm; Waters, USA)，流动相为A相(已腈)_B相(0.1%三氟乙酸V/V),洗脱程序为:在0-4min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为5%和95% ;在4_8min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为15%和85% ;在8-12min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为15%和85%，在12-30min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为40%和60%，流速为1.5mL/min，检测波长为215nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集得到活性最高的组分D3和活性次高的组分D2，冷冻干燥，得到目标肽；
[0028](4)将步骤(3)得到的目标肽，用电喷雾串联质谱法进行序列分析，经二级质谱分析，得到 D2 具有 Tyr-Ser (269.1126), Tyr-Ser-Val-His (505.2281), Tyr-Lys (310.1367)，Tyr-Thr (283.1281), Leu-Pro-Cys (331.1644), Glu-Met (279.1336)的氨基酸序列，所述活性组分 D3 具有 Tyr-Ala(253.1181), Tyr-Gly (239.1025), Ala-His (255.1593), Ala-Cys (I92.1384), Asn-Trp(318.3007), Cys-Arg(288.2900), Ser-Gln-Lys(362.3272), Cys-His-Cys (362.3265)的氨基酸序列。
[0029]实施例2
[0030](I)核桃柏蛋白酶解物的制备:将核桃柏与水按质量比1:10混合，加入核桃柏蛋白质量2%的胰酶，在50°C酶解20h ;沸水浴30min灭酶，离心，取上清液，抽滤，得到核桃柏蛋白酶解液，水解度为10.03 ±0.46% ；
[0031](2)抗氧化肽的分离纯化:将核桃柏蛋白酶解液冻干后，用Sephadex G_15凝胶柱(01.6x100 cm)进行分离纯化，用去离子水以1.5mL/min的流速进行洗脱，检测波长为214nm,测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的组分D，然后冷冻干燥得活性最闻的粉末D ；
[0032](3)将粉末D溶于水后，用反相高效液相色谱进行纯化，分别得到活性组分D2和活性组分D3，其中纯化条件为:色谱柱为XBridge? pre C18柱(5 μ m, IOX 150mm; Waters, USA)，流动相为A相(已腈)_B相(0.1%三氟乙酸V/V),洗脱程序为:在0-4min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为5%和95% ;在4_8min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为15%和85% ;在8-12min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为15%和85%，在12-30min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为40%和60%，流速为2mL/min，检测波长为215nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集得到活性最高的组分D3和活性次高的组分D2，冷冻干燥得到目标肽；
[0033](4)将步骤(3)得到的目标肽，用电喷雾串联质谱法进行序列分析，经二级质谱分析，得到 D2 具有 Tyr-Ser (269.1126), Tyr-Ser-Val-His (505.2281), Tyr-Lys (310.1367)，Tyr-Thr (283.1281), Leu-Pro-Cys (331.1644), Glu-Met (279.1336)的氨基酸序列，所述活性组分 D3 具有 Tyr-Ala(253.1181), Tyr-Gly (239.1025), Ala-His (255.1593), Ala-Cys (I92.1384)，Asn-Trp (318.3007)，Cys-Arg(288.2900)，Ser-Gln-Lys(362.3272)，Cys-His-Cys (362.3265)的氨基酸序 列。
[0034]实施例3
[0035]按照与实施2同样的实施方式进行，不同之处是酶解时间为22h，得到核桃柏蛋白酶解液，水解度提高至11.93±0.12%，半制备液相洗脱流速为3mL/min。
[0036]图1为S印hadex G-15凝胶过滤色谱分离纯化抗氧化肽图谱，由图2可以看出峰D的抗氧化活性最高。图3为半制备型高效液相色谱分离纯化抗氧化肽图谱，由图4可见，组分D3抗氧化活性最高和D2组分的活性次高，经SPSS分析发现两组份间无显著性差异(Ρ>0.05)。
【权利要求】
1.核桃柏抗氧化肽的制备方法，其特征在于该方法步骤如下: (O核桃柏蛋白酶解物的制备:将核桃柏与水按质量比1:8~1:10混合，加入占核桃柏蛋白质量1%_2%的胰酶，在50-55 °C酶解18-22h ;沸水中10-30 min灭酶，离心，取上清液，抽滤，得到核桃柏蛋白酶解液，冻干得到核桃柏蛋白多肽粉末； (2)抗氧化肽的分离纯化:将核桃柏蛋白酶解液冻干后，用01.6X100 cm的S^hadexG-15凝胶柱进行分离纯化，用去离子水以0.5~2.0 ml/min的流速进行洗脱，检测波长为214nm,测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的组分D，冷冻干燥得粉末D ； (3)将粉末D溶于水后，用反相高效液相色谱进行纯化，分别得到活性组分D2和活性组分D3，得到所述抗氧化肽；其中纯化条件为:色谱柱为XBridge? pre C18柱(5 μ m, 10X 150 mm; Waters, USA)，流动相为A相-B相，所述A相为已腈，所述B相为0.1%_0.2%V/V二氟乙酸水溶液，洗脱程序为:在0_4min内米用的流动相中A、B的体积百分比分别为5%和95% ;在4-8min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为15%和85% ;在8_12min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为15%和85%，在12-30min内采用的流动相中A、B的体积百分比分别为40%和60%，流速为1.5-4mL/min，检测波长为215nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活性，收集活性最高的两个峰。
2.由权利要求1所述制备方法得到的核桃柏抗氧化肽，其特征在于，所述活性
组分 D2 具有 Tyr-Ser(269.1126), Tyr-Ser-Val-His(505.2281), Tyr-Lys(310.1367), Tyr-Thr (283.128), Leu-Pro-Cys (331.1644), Glu-Met (279.1336)的氨基酸序列，所述活性组分 D3 具有 Tyr-Ala(253.1181)，Tyr-Gly (239.1025)，Ala-His (255.1593)，Ala-Cys (192.1384)，Asn-Trp(318.3007)，Cys-Arg(288.2900)，Ser-Gln-Lys(362.3272)，Cys-His-Cys (362.3265)的 氨基酸序列。
【文档编号】C07K5/107GK103497985SQ201310404993
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】任娇艳, 陈卉平, 赵谋明, 崔春, 顾敏, 蔡孟森 申请人:华南理工大学