使用血管生成素或血管生成素激动剂治疗癌症的方法

使用血管生成素或血管生成素激动剂治疗癌症的方法
【专利摘要】本发明提供了一种治疗受试者癌症的方法或一种诱导包括减小肿瘤体积、抑制或减缓肿瘤生长、抑制肿瘤发展、改变肿瘤的新陈代谢活动、诱发肿瘤静默、抑制或减少转移、抑制或减少肿瘤侵袭、减少肿瘤重量、减少肿瘤新血管形成、改善疾病进展时间(TDP)和/或提高存活率的抗肿瘤效应的方法，所述方法包括给予受试者有效量的血管生成素或血管生成素激动剂。
【专利说明】使用血管生成素或血管生成素激动剂治疗癌症的方法

【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及治疗癌症的方法，包括抑制肿瘤生长、减小肿瘤体积、抑制肿瘤发展、 抑制转移和提高存活率。

【背景技术】
[0002] 癌症的特征在于异常的和不受控制的细胞增殖。癌症可影响身体的任何组织并可 扩散到该器官组织的外部。不受控制的细胞生长、细胞死亡和其它的细胞异常可导致癌性 肿瘤的形成。肿瘤可破坏产生所述肿瘤的组织的功能并破坏这些组织，并当癌细胞转移时， 可邻近或远离原发性生长部位产生继发性肿瘤。
[0003] 可用的抗癌疗法包括化学治疗剂、免疫治疗剂、暴露于放射和手术治疗。本领域需 要用于治疗癌症和预防癌症发展和肿瘤生长的其他治疗方法。
[0004] 所有的参考文献，包括任意的专利或专利申请，在这里以引用的方式纳入本说明 书。可以清楚理解的是，尽管这里引用了多个现有技术出版物，但是该引用不构成对任何这 些文件形成一部分本领域公知常识的承认。


【发明内容】

[0005] 第一方面提供一种治疗受试者癌症的方法，该方法包括向受试者给予有效剂量的 血管生成素或血管生成素激动剂。
[0006] 以替代的形式，第一方面提供用于治疗受试者的癌症的血管生成素或血管生成素 激动剂，或血管生成素或血管生成素激动剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
[0007] 第二方面提供诱导抗肿瘤效应的方法，包括给予有效剂量的血管生成素或血管生 成素激动剂。
[0008] 以替代的形式，第二方面提供用于诱导受试者的抗肿瘤效应的血管生成素或血管 生成素激动剂，或血管生成素或血管生成素激动剂在制备用于诱导抗肿瘤效应的药物中的 用途。
[0009] 在第二方面的一个实施方案中，抗肿瘤效应选自减小肿瘤体积、抑制肿瘤生长、抑 制肿瘤发展、改变肿瘤的新陈代谢活动、诱发肿瘤静默、抑制或减少转移、抑制或减少肿瘤 侵袭、减少肿瘤重量、减少肿瘤新血管形成、改善疾病进展时间（TDP)以及提高存活率。 [0010] 在第一和第二方面的一个实施方案中，血管生成素激动剂是一种血管生成素富集 的乳提取物，优选通过阳离子交换法。
[0011] 发明人已发现，当喂食含有牛血管生成素的饮食时，血管生成素和血管生成素富 集的牛乳提取物增加了四头肌肌肉的重量并减少了腹部脂肪垫的重量。已证实的血管生成 素增加瘦肌肉质量和减少脂肪质量的作用表明，包含给予血管生成素或血管生成素激动剂 的方法具有各种各样的应用，其中肌肉组织的增加是治疗有益的，比如家畜生产、肌肉紊乱 以及用于全身健康和体质。
[0012] 因为血管生成素与癌症相关，发明人在小鼠癌症模型中试验他们的乳提取物来评 估其安全性。令人惊奇地，所述提取物在小鼠模型中显示延迟肿瘤发作并减小肿瘤体积。这 是特别出乎意料的并与现有技术的教导相反。因此，发明人提出，血管生成素富集的乳提取 物和由此的血管生成素，可用于预防或减缓肿瘤生长以及治疗肿瘤大小，因而预防或治疗 癌症。
[0013] 在一些实施方案中，第一和第二方面的方法进一步包括给予受试者一种或多种化 学治疗剂、放射疗法或两者。
[0014] 所述化学治疗剂可同时、分别或序贯与血管生成素或血管生成素激动剂一起给 予，且如果序贯或分别地给予，所述化学治疗剂与血管生成素或血管生成素激动剂可以任 何顺序给予。
[0015] 第一和第二方面的方法可进一步包含给予化学保护剂。这些试剂可随某些化学治 疗方案一起使用，以减小或最小化化学治疗对身体的影响。
[0016] 在第一或第二方面的一个实施方案中，血管生成素或血管生成素激动剂是口服给 药的。
[0017] 第三方面提供包含血管生成素或血管生成素激动剂与化学治疗剂的组合物。
[0018] 在第一至第三方面中任一个的实施方案中，所述血管生成素是重组血管生成素， 优选人或牛的重组血管生成素。
[0019] 在第一至第三方面中任一个的实施方案中，所述血管生成素是作为来自乳或血浆 的富集提取物提供，尤其是来自牛乳或来自牛的或人的血浆。这样的富集提取物是血管生 成素激动剂，因为它不是纯的血管生成素但是提供血管生成素。

【专利附图】

【附图说明】
[0020] 图1说明用血管生成素富集的乳级分补充对在诱发癌症后裸小鼠的平均肿瘤生 长的效应。15天后肿瘤大小的减少是由于动物被安乐死以及由于实验组数量减小（道德指 南的结果：规定当小鼠的体重达到基线体重的25%时或当肿瘤体积达到1000mm3时必须对 所述小鼠执行安乐死；不管哪个情况先发生）而使平均值变化。
[0021] 图2说明按照实施例2测试的动物的存活率。
[0022] 图3说明实施例3的研宄设计。

【具体实施方式】
[0023] 血管生成素是HkDa的肥糖基化的多肽，该多肽是由包括血管内皮细胞、主动脉 平滑肌细胞、纤维母细胞和一些肿瘤（如结肠癌、卵巢癌和胸腺癌）的几个生长细胞类型产 生的。血管生成素已从多种来源分离，包括正常人血浆、牛血浆、牛乳以及小鼠、兔和猪血 清。
[0024] 血管生成素与胰核糖核酸酶是同源的，且具有不同的核糖核酸酶活性。该蛋白质 能够引起新血管的生长，然而，目前还没有确定血管生成素的核糖核酸酶活性在由这种蛋 白质引起的血管生成中起什么作用。
[0025] 除了是血管生成的有效刺激剂之外，血管生成素也已显示出具有许多其它活性。 然而，之前没有血管生成素对癌细胞的效应的公开内容。
[0026] 本发明在一个方面涉及癌症的治疗。
[0027] "治疗（treating) "或"治疗（treatment) "指的是治疗性治疗和预防的 (prophylactic)或预防性（preventative)措施，其中所述目的是为了预防、改善、减少或 减缓（减小）癌症。本文使用的治疗包括减小肿瘤体积、抑制肿瘤生长、抑制肿瘤发展、改 变肿瘤的新陈代谢活动、诱发肿瘤静默、抑制或减少转移、抑制或减少肿瘤侵袭、减少肿瘤 重量、减少肿瘤新血管形成、改善疾病进展时间（TDP)以及提高存活率。
[0028] 治疗也包括使癌症或癌细胞易感于（或更易感于）用另一种抗癌疗法的治疗。
[0029] "预防（preventing) "、"预防（prevention) "、"预防性的（preventative) " 或"预 防的（prophylactic)"指的是抑制癌症的发生，或阻碍、保护免于或避免癌症（包括异常或 症状）的发生。需要预防的受试者可能易发生癌症或可能具有一种或多种癌症标志物。
[0030] 术语"改善（ameliorate) "或"改善（amelioration) "指的是癌症（包括异常或 症状）的减小、减少或消除。需要治疗的受试者可能已患恶性肿瘤或可易患癌症、可能具有 一个或多个癌症标志物、可能已被诊断患有肿瘤、可能未患肿瘤，且所述癌症可为转移的或 为转移前的。
[0031] 术语"受试者"包括哺乳动物。该哺乳动物可以是人或者可以是家养动物、动物园 动物、伴侣动物或在环境上有价值的动物。虽然具体地考虑的是，本发明的方法适合用于人 类的医学治疗，它们也可用于兽医学治疗，包括治疗诸如狗和猫的伴侣动物，诸如马（包括 赛马）、牛和羊的家养动物，或诸如猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄类动物的动物园动 物，或诸如袋獾的在环境上有价值的动物。受试者可能患癌症或可能未患癌症（即，无可检 测到的疾病）。受试者可能已患有或易感恶疾、癌症、肿瘤或任何肿瘤性疾病或障碍。
[0032] 术语"癌症（cancer) "和"癌性的（cancerous) "是指或描述通常由不受控制的细 胞生长表征的哺乳动物的生理学病症。本发明的方法可用于治疗与固体肿瘤（包括癌）或 血液恶性肿瘤的形成相关的癌症。
[0033] 可通过本发明的方法治疗的与固体肿瘤的形成相关的癌症，包括：如腺癌和上皮 癌的癌症，鳞状细胞癌，肺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌和大细胞癌类，结肠癌，结肠癌转 移成的肝癌，结肠直肠癌，乳腺癌，卵巢癌，肾脏癌，肾癌，膀胱癌，肝癌，肝细胞癌，胃肠道的 癌症，直肠癌，食道癌，胰腺癌，胃癌，妇科癌症（包括宫颈癌、外阴癌、子宫癌和子宫内膜 癌），前列腺癌，睾丸癌，鼻咽癌，甲状腺癌，甲状腺乳突状癌，头部、颈部或脑部的癌症，神经 系统癌症（包括成神经细胞癌），皮肤癌（包括黑素瘤），肉瘤（包括骨肉瘤和尤因氏肉瘤）， 恶性胶质瘤和唾腺癌。
[0034] 血液恶性肿瘤是影响血液、骨髓和淋巴结的癌症，并包括白血病、淋巴癌和骨髓 癌。这些恶性肿瘤通常与非固体肿瘤或非固体肿瘤块的形成相关。
[0035] 可通过本发明的方法治疗的血液恶性肿瘤包括白血病（包括急性淋巴细胞白血 病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性粒细胞白血病、多毛细胞白血病、白血病 性网状内皮组织增殖、髓细胞性白血病）、淋巴瘤（包括何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴 瘤、成熟B细胞肿瘤、成熟T细胞肿瘤和自然杀伤细胞肿瘤）、免疫缺陷相关性淋巴增生性疾 病、组织细胞和树突状细胞肿瘤以及骨髓瘤（例如多发性骨髓瘤）。
[0036] 癌症可为晚期的，处在I、II、III或IV期。
[0037] 由于物种间的血管生成素在序列和功能上高度保守，因此本发明的方法可适用于 非人哺乳动物或鸟类[例如家养动物（如犬和猫）、运动动物（如马）、食物来源动物（如 牛、猪和羊）、鸟类（如鸡、火鸟、其他猎禽或家禽）]，其中肌肉生成抑制素的存在造成或促 成不需要的病理效应或者肌肉生成抑制素水平的降低具有治疗益处。
[0038] 血管生成素或血管生成素激动剂可作为药物、兽医或营养（neutraceutical)组 合物或作为食物被提供。
[0039] 药物组合物是一种适于给予人类的药物。兽医组合物是一种适于给予动物的药 物。一般来说，这些组合物会包含纯化的血管生成素或血管生成素激动剂，或者至少所述组 合物的所有组分是可检验的。
[0040] 在第一和第二方面的方法中使用的组合物可包括一种或多种载体以及任选地其 他治疗剂。每种载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂可以是药物上"可接受的"。
[0041] "药物上可接受的载体"意指非生物上或其他不需要的材料，即所述材料可与所选 择的活性剂一起给予个体而不引起任何不需要的生物学效应或以有害的方式与包含它的 药物组合物的任何其它组分互相作用。类似地，本文提供的新型化合物的"药物上可接受 的"盐或酯是非生物上或其他不需要的盐或酯。
[0042] 本文使用的"药物载体"是向受试者递送药剂的药物上可接受的溶剂、悬浮剂或媒 介物。该载体可以是液体的或固体的并根据头脑中计划好的给药方式选择。每种载体必须 在非生物上或其他不需要的意义上是药物上"可接受的"，即所述载体可与药剂一起给予受 试者而不会引起任何的或大的不利反应。
[0043] 所述组合物可以以包含常规无毒的药物上可接受的载体、佐剂和赋形剂的制剂的 形式被口服、局部或肠胃外给药。
[0044] 本文使用的术语肠胃外的包括静脉内注射、动脉内注射、腹膜内注射、肌肉内注 射、皮下注射、结膜下注射、腔内注射、经皮注射和皮下注射，用于向肺部或鼻腔给药或通过 输注（例如通过渗透泵）给药的气溶胶。
[0045] 所述组合物可以作为片剂、水性或油性悬浮液、锭剂、糖锭、粉剂、颗粒剂、乳剂、胶 囊、糖浆剂或酏剂口服给药。用于口服使用的组合物可包含一种或多种选自甜味剂、调味 剂、着色剂和防腐剂的试剂以生产药学上美观的和适口的制剂。合适的增甜剂包括蔗糖、乳 糖、葡萄糖、阿斯巴特（aspartame)或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙 烯吡咯烷酮、黄原胶、膨润土、海藻酸或琼脂。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、楼桃油、橘 子油或覆盆子油调味剂。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素 Ε、α-生育酚、抗坏血酸、对 羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、 油酸钠、氯化钠或滑石。合适的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。片剂可包 含与适合制备片剂的无毒药学上可接受的赋形剂混合的所述试剂。
[0046] 这些赋形剂可为，例如，⑴惰性稀释剂，如碳酸钙、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；（2)粒 化和崩解剂，如玉米淀粉或海藻酸；（3)粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和（4)润滑剂，如 硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。这些片剂可为不包衣的，或可通过已知技术包衣以延缓在胃肠道 中的崩解和吸收，从而在更长的时间内提供持久的作用。例如，可采用延时材料如单硬脂酸 甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
[0047] 用于肠胃外给药的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶 剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油以及可注射的有机醋如油酸乙醋。水性载体 包括水，含醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外赋形剂包括氯化钠 溶液，林格氏右旋糖，右旋糖和氯化钠，包括流体和营养补充剂、电解质补充剂（例如基于 林格氏右旋糖的那些）的乳酸化林格氏静脉赋形剂等。还可存在防腐剂和其他添加剂，例 如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、生长因子和惰性气体等。
[0048] 所述组合物还可包含提供补充、附加或增强治疗作用的其他活性化合物。所述药 物组合物可与给药说明书一起也被包含在容器、包装或分配器内。
[0049] 适合与第一和第二方面的方法以及第三方面的组合物一起使用的化学治疗剂包 括，例如，烷化剂、亚硝基脲、抗代谢物、蒽环类抗生素及相关药物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构 酶I或II抑制剂、皮质类固醇激素和微管毒素。
[0050] 烷化剂包括：
[0051] ?芥子气衍生物：二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥和异环磷 酸胺，
[0052] ?乙烯亚胺：塞替派和六甲嘧胺，
[0053] ?烷基磺酸酯：二甲磺酸丁酯，
[0054] ?肼和三嗪：六甲蜜胺、甲基苄肼、达卡巴嗪和替莫唑胺，
[0055] ?亚硝基脲：亚硝脲氮芥、环己亚硝脲和链脲菌素，
[0056] ?金属盐：卡铂、顺铂和奥沙利铂。
[0057] 植物生物碱类包括：
[0058] ?长春花生物碱类：长春新碱、长春碱和长春瑞滨，
[0059] ?紫杉烷类：紫杉醇和多烯紫杉醇，
[0060] ?足叶草毒素：依托泊苷和替尼泊苷（Tenisopide)，
[0061] ?喜树碱类似物：伊立替康和拓扑替康。
[0062] 抗肿瘤抗生素包括：
[0063] ?蒽环类抗生素：阿霉素、道诺霉素、表阿霉素、米托蒽醌和去甲氧基柔红霉素，
[0064] ?色霉素：更生霉素和普卡霉素，
[0065] ?其它：丝裂霉素和博来霉素。
[0066] 抗代谢物包括：
[0067] ?叶酸拮抗剂：甲氨蝶呤，
[0068] ?喃啶诘抗剂：5_氟尿喃啶、氟尿苷（Foxuridine)、阿糖胞苷、卡培他滨和吉西他 滨，
[0069] ?嘌呤拮抗剂：6_巯基嘌呤和6-硫鸟嘌呤，
[0070] ?腺苷脱氨酶抑制剂：克拉屈滨、氟达拉滨、奈拉滨和喷司他丁。
[0071] 拓扑异构酶抑制剂包括：
[0072] ?拓扑异构酶I抑制剂：伊立替康、拓扑替康，
[0073] ?拓扑异构酶II抑制剂：氨吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷。
[0074] 其它抗肿瘤剂包括：
[0075] ?核苷酸还原酶抑制剂：轻基脲、肾上腺皮质类固醇抑制剂：米托坦，
[0076] ?酶：天冬酰胺酶和培门冬酶，
[0077] ?抗微小管剂：雌莫司汀，
[0078] ?类维生素 A :贝沙罗汀、异维甲酸、维甲酸（ATRA)。
[0079] 除了上述列举的化学治疗剂之外，还存在许多其它类型的化学疗法，比如靶向癌 症疗法、免疫疗法和激素疗法以及用在这些疗法中的药剂都落入本文使用的"化学治疗剂" 的定义内。
[0080] 靶向癌症疗法包括：
[0081] ?信号转导抑制剂：甲磺酸伊马替尼（蛋白酪氨酸激酶抑制剂）、吉非替尼（表皮 生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂-EGFR-TK)、西妥昔单抗（表皮生长因子受体）、拉帕替尼 (表皮生长因子受体（EGFR)和人类表皮受体2型（HER2)酪氨酸激酶抑制剂），
[0082] ?生物应答改性剂：地尼白介素（DenileukinDiftitox)，
[0083] ?蛋白酶体抑制剂：硼替佐米，
[0084] 单克隆抗体：阿仑单抗、吉妥单抗奥佐米星、利妥昔单抗、曲妥单抗、替伊莫单抗 (Ibritumomab)、贝伐单抗（Bevacizumab)、厄洛替尼（Erlotinib)、吉非替尼（Gefitinib) 和托可坦（Tioxetan)。
[0085] 免疫疗法包括：
[0086] ?细胞因子：白细胞介素和干扰素，
[0087] ?集落刺激因子，
[0088] ?肿瘤疫苗。
[0089] 激素疗法包括：
[0090] ?肾上腺皮质类固醇抑制剂：氨鲁米特、米托坦
[0091] ?雄激素：氟甲睾酮、睾酮、睾内酯，
[0092] ?抗雄激素：比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特，
[0093] ?抗雌激素：他莫西芬（tamoxifen)、托瑞米芬，
[0094] ?芳香酶抑制剂：阿那曲挫（anastrazole)、依西美坦、来曲挫，
[0095] ?雌激素 ：DES (己烯雌酚）、雌二醇（estrace)、倍美力，
[0096] · LHRH激动剂：醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、双羟萘酸曲普瑞林，
[0097] ?促孕剂：醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、甲地孕酮、孕激素，
[0098] ?选择性雌激素受体调节剂（SERM):雷洛昔芬。
[0099] 血管生成素或包括血管生成素的组合物可以单剂量给药或间隔给药比如一天一 次、一周一次和一月一次。
[0100] 可根据血管生成素或血管生成素激动剂的半衰期或患者病症的严重性来调整剂 量方案。
[0101] 通常，所述组合物以一次推注剂量给药，以使在给予所述推注剂量后最长时间内 血管生成素的循环水平最大化。在所述推注剂量后还可使用连续输注。
[0102] 还考虑的是所述方法利用营养组合物以提供血管生成素。提供了用于所述方法中 的营养组合物。
[0103] 本文使用的术语"营养制品"是指从食物中 在本申请中从乳制品中 分尚 或纯化的可食用的产品，该产品被证明当口服给药时具有生理益处或者对急性或慢性疾病 或损伤提供保护或减轻作用。因此所述营养制品可单独或者与可食用的食物或饮料一起以 膳食制品或补充剂的形式存在。
[0104] 所述营养组合可为可溶性粉末、液体或即饮制剂的形式。或者，所述营养组合物可 作为食物以固体形式存在；例如以即食棒或早餐谷类食品的形式。还可存在多种香料、纤 维、增甜剂和其他添加剂。
[0105] 所述营养制品优选地具有可接受的感官性质（如可接受的嗅觉、味觉和适口性）， 并还可包含选自维生素 A、Bl、B2、B3、B5、B6、B12、生物素、C、D、E、H以及钙、镁、钾、锌和铁 中至少一种的维生素和/或矿物质。
[0106] 所述营养组合物可以常规方式生产；例如，所述组合物可通过将蛋白质和其他添 加剂混合在一起制得。如果使用，乳化剂也可包括在所述混合物中。其他维生素和矿物质 也可在此时加入，但经常会晚一点加入以避免热降解。
[0107] 如果需要生产粉末状营养组合物，则可将蛋白质与其他组分以粉末形式混合。所 述粉末应当具有低于约5重量％的水分含量。然后可混入水一一优选已进行反渗透处理的 水 形成液体混合物。
[0108] 如果所述营养组合物以即用液体形式提供，那么可将其加热以减少细菌负荷。如 果需要生产液体营养组合物，那么优选将所述液体混合物无菌地灌装到合适的容器中。所 述容器的无菌灌装可使用本领域中通常用的技术进行。进行这种无菌灌装的合适设备是市 售的。
[0109] 优选地，所述营养组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形 剂。营养组合物可包含缓冲液如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物如葡萄 糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖；甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如 EDTA ;佐剂和防腐剂。
[0110] 所述营养制品可为婴儿配方物，特别是用于给予婴儿的人源化乳配方物。
[0111] 本发明方法中所用的血管生成素可来自任何来源。它在来源上可为天然的、合成 的或重组的。重组的血管生成素可基于任何物种的血管生成素序列，包括人、奶牛、绵羊、小 鼠等。重组人血管生成素可购自R&D Systems。
[0112] 已知血管生成素存在于正常人血浆、牛血浆、牛乳、牛血浆以及鼠、兔和猪血清中。 至少人血管生成素的DNA和蛋白序列是可得到的，并且重组人血管生成素可以从Abnova Corporation(台湾）购得以用于小规模的应用。
[0113] 在一个实施方案中，血管生成素从作为在商业规模上容易获得的血管生成素来源 的家养动物的血浆或乳中制得。
[0114] 乳可从任何泌乳动物得到，例如反刍类动物如奶牛、绵羊、水牛、山羊和鹿，非反刍 动物包括灵长类如人，以及单胃类动物如猪。在一个优选的实施方案中，血管生成素是从牛 乳中提取的。生产血管生成素的动物可为被设计在其乳中过表达血管生成素的转基因动 物。
[0115] 本申请的发明人已证明在牛乳中，血管生成素在哺乳期的首个1到14天内以最高 或最浓的量（最高达12mg/升）存在。之后，所述浓度降至约1到2mg/升的基础水平。因 此，优选在哺乳期首个14天内得到的牛乳作为在第一到十一方面的方法中使用的血管生 成素来源。考虑到哺乳期较晚期的牛乳中剩余血管生成素水平，它仍可在本发明方法中用 作来源。
[0116] 本发明的组合物和方法中使用的血管生成素可能是分离的或纯化的。分离的或纯 化的血管生成素基本上不含至少一种与其天然伴随的试剂或化合物。例如，分离的蛋白质 基本上不含来自于获得该蛋白的细胞或组织源的至少一些细胞物质或污染蛋白。词语"基 本不含细胞物质"是指制品中血管生成素具有至少50%到59% (w/w)的纯度，至少60%到 69% (w/w)的纯度，至少70%到79 % (w/w)的纯度，至少80 %到89 % (w/w)的纯度，至少 90%到 95% (w/w)的纯度，或者至少 96%、97%、98%、99%或100%(￥/^)的纯度。
[0117] 在细菌中的重组血管生成素制品可用作血管生成素的来源，并且可以蛋白聚集体 的形式提供。
[0118] 由于牛乳是已存在于食物链中成百上千年的一种天然产物，因此用作营养制品的 血管生成素不必完全纯净。然而，为了减少待给予的组合物的量，血管生成素相对于其在乳 中的浓度被显著浓缩是优选的。优选地，血管生成素以其在乳中浓度的至少10倍，更优选 其在乳中浓度的20、30、40或50倍的浓度被给予。
[0119] 当作为食物提供时，血管生成素可以采用食物补充剂、营养制剂、运动营养补充剂 或婴儿配方的形式。
[0120] 本领域技术人员会理解自然界中存在牛血管生成素的变体并可被制备。本发明预 期这些变体的用途。
[0121] 本领域的技术人员将会认识到，血管生成素可在其氨基酸序列上包含任意数目的 保守变化而不改变其生物学特性。这些保守的氨基酸修饰是基于氨基酸侧链取代基的相对 相似性，例如它们的疏水性、亲水性、带电量、大小等。考虑前述各种特性的示例性保守取代 基为本领域技术人员熟知的，包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天冬氨酸盐；丝氨酸和苏 氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
[0122] 本发明也包括血管生成素变体、同系物和片段的使用。例如，血管生成素的核酸或 氨基酸序列可包含与天然蛋白的核酸或氨基酸序列至少70-79%相同的序列、或至少80% 到89%相同、或至少90%到95%相同、或至少96%至100%相同的序列。
[0123] 本领域技术人员会真正理解许多能使他们设计该血管生成素的核苷酸序列和氨 基酸序列或其同系物的软件包，比如"BLAST"程序或其它合适的软件包。
[0124] 本领域普通技术人员理解，在一个蛋白质结构中某些氨基酸可以被其它氨基酸取 代而不会不利地影响血管生成素的活性。因而，发明人预期，在血管生成素的氨基酸序列中 可做出多种改变而不明显降低它们的生物学效用或活性。这些改变可包括主序列的缺失、 插入、截断、替换、聚变、移动等。
[0125] 此外，该血管生成素可被修饰，例如通过糖基化、通过共轭到一个聚合物上以增加 它们的循环半衰期、通过聚乙二醇化或其它化学修饰进行。这些修饰的蛋白质也被预期在 本发明的方法中使用。
[0126] 本领域技术人员会理解所用的血管生成素可使用本领域可用的方法进行修饰以 改善贮藏稳定性、生物活性、循环半衰期或用于其他目的。例如可能需要引入修饰以改善贮 藏稳定性。然而，由于血管生成素特别耐降解，因此这样的修饰不是必需的。
[0127] 本发明涉及血管生成素的激动剂。激动剂是一种能直接或间接地通过由血管生成 素激活的受体起作用的化合物。优选地，血管生成素激动剂通过所述血管生成素受体起作 用，并且优选地结合所述受体。本领域技术人员会理解如何设计血管生成素的激动剂。合 适的激动剂包括血管生成素激动剂抗体和模拟化合物。
[0128] 血管生成素、其激动剂和变体可用于制造用于在本发明的方法中使用的药剂。
[0129] 在本发明的用途和方法的一个优选的实施方案中，血管生长素是口服给药的，特 别是以血管生成素富集的乳或血浆提取物的形式或以重组血管生成素的形式。
[0130] 具体地，所述口服给药的血管生成素是从牛乳或其级分制得的，例如使用实施例1 所描述的方法。已发现所述级分提供能够全身作用而不在消化道中大量降解的血管生成 素。所述级分能够经口服提供而不采用载体或其他机制来提高血管生成素的生物利用率。
[0131] 除非上下文中另有要求，遍及本申请的单词"包含（comprise)"或变形如"包含 (comprises) "或"含有（comprising) "应理解为暗示包括所述元素或整数或各元素或整数 的集合，但不排除任意其他元素或整数或各元素或整数的集合。
[0132] 必须指出，如在本申请中使用的，单数形式"一个（a)"、"一个（an)"和"所述 (the) "包括多个方面，除非上下文另有清晰说明。
[0133] 对于本领域技术人员明显的是，虽然本发明被详细描述用于清楚和理解的目的， 但是本文中描述的实施方案和方法的多种修改和改变可在脱离本申请公开的发明构思的 范围下进行。
[0134] 实施例
[0135] 现通过引用以下实施例进一步详细描述本发明。提供所述实施例仅用于说明的目 的，且不旨在为限制性的，除非另有具体说明。因而，本发明包含由于本文中提供的教导而 变得明显的任何和所有的变化。
[0136] 实施例Ia :用于从脱脂乳制备血管生成素富集的级分的方法
[0137] 向一个 IOcm 深的柱子中填充入 SP Sepharose Big Beads (GE Healthcare)以使 柱子的总柱床体积是29. 7升。向该柱中以331cm/h (每小时每升树脂34升脱脂乳）的线 性流速施加脱脂牛乳流2小时，直至施加的脱脂乳的体积为装入该柱的树脂体积的68倍。
[0138] 通过以147cm/h(每小时每升树脂15升缓冲液）的线性流速加入2. 5倍柱体积 (CV)的水或0. 25CV/分钟的线性流速加水10分钟而除去该柱中剩余的乳。
[0139] 使用2. 5CV含有相当于2. 0% (0. 34M)NaCl的钠离子的缓冲液（pH6. 5)，通过使所 述阳离子缓冲溶液以75cm/h(每小时每升树脂7. 5升阳离子缓冲溶液）或0. 125CV/分钟 的线性流速流过20分钟，将不含血管生成素的乳酸过氧化物酶级分从柱子上洗脱下来。弃 去最初的每升树脂〇. 5升阳离子缓冲溶液，然后收集接下来的每升树脂2. 5升阳离子缓冲 溶液作为不含血管生成素的乳酸过氧化物酶级分（包括与下一种缓冲液施加时间重叠的 每升树脂〇. 5升阳离子缓冲溶液，即突破时间）。
[0140] 然后使用2. 5CV含有相当于2. 5% w/v(0. 43M)NaCl的钠离子的缓冲液（pH 6. 5)， 通过使所述阳离子缓冲溶液以75cm/h(每小时每升树脂7. 5升阳离子缓冲溶液）或 0. 125CV/分钟的线性流速流过20分钟，将血管生成素富集的级分从柱子上洗脱下来。弃去 最初的每升树脂〇. 5升阳离子缓冲溶液，然后收集接下来的每升树脂2. 5升阳离子缓冲溶 液作为血管生成素富集的级分（包括与下一种缓冲液施加时间重叠的每升树脂0. 5升阳离 子缓冲溶液）。
[0141] 最后，使用2. 5CV含有相当于8. 75% W/v(1.5M)NaCl的钠离子的缓冲液（pH 6. 5)，通过使所述阳离子缓冲溶液以75cm/h(每小时每升树脂7. 5升阳离子缓冲溶液）或 0. 125CV/分钟的线性流速流过20分钟，将乳铁蛋白级分从柱子上洗脱下来。弃去最初的每 升树脂〇. 5升阳离子缓冲溶液，然后收集每升树脂2. 5升阳离子缓冲溶液作为乳铁蛋白级 分。
[0142] 将所收集的血管生成素富集的级分进行超滤（NMWCO 5kDa)以浓缩并降低盐含 量。将所得的浓缩液冷冻干燥并储存在室温下用于后续使用。
[0143] 通过SDS-PAGE分析血管生成素富集的级分中血管生成素含量，发现所述级分含 有57% (基于蛋白）的低分子量（HkDa)蛋白，该蛋白被MALDI-TOF/TOF MS (结果未示出） 证实是血管生成素。所述级分被命名为NatraGuarcL
[0144] 本领域技术人员会理解其他来源或通过其他方法纯化的血管生成素可用于本发 明的方法中。
[0145] 实施例Ib :制备来自脱脂乳的血管生成素富集的级分的方法
[0146] 通过将脱脂乳流施加至填充有SP (磺丙基）Sepharose的柱直到被施加的乳的体 积高达填充至柱中的树脂的体积的120倍，脱脂乳被用于生产包含生长因子的乳级分。用 低离子强度的缓冲液（< 〇. 008M NaCl或等同物）持续10分钟来去除保留在柱中的乳。该 生长因子级分用包含相当于0.4至0.5M(最优选0.4M)氯化钠（虽然其它阳离子也为合适 的）的钠离子的缓冲液从柱中洗脱。在5. 5至5. 7范围内的pH提供最高收率。
[0147] 用SP Sepharose Big Beads (GE Healcare)填充IOcm深的柱，以使总柱床体积为 29. 7升。向该柱中以393cm/h (每小时每升树脂40升WGFE)的线性流速施加含1 %至1. 5 % 蛋白质的该生长因子级分流（PH6.5,含任选的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液）持续8分钟直到 所施加的脱脂乳的体积为填充至该柱中的树脂体积的5. 4倍。
[0148] 使用10. 8CV含有相当于2. 0% (0. 34M) NaCl的钠离子的缓冲液（pH 6. 5)，通过使 阳离子缓冲溶液以393cm/h(每小时每升树脂40升阳离子缓冲液）或0. 67CV/min的线性 流速流过20分钟，将不含血管生成素的乳过氧化酶级分从柱中洗脱出来。
[0149] 然后，使用5. 4CV含有相当于2. 5 % (0. 43M) NaCl的钠离子的缓冲液（pH 6. 5)，通 过使阳离子缓冲溶液以393cm/h(每小时每升树脂40升阳离子缓冲溶液）或0. 67CV/min 的线性流速流过8分钟，将血管生成素富集的级分从柱中洗脱出来。
[0150] 最后，使用5. 4CV含有相当于8.75 % (1.5M) NaCl的钠离子的缓冲液（pH 6. 5)，通 过使阳离子缓冲溶液以393cm/h(每小时每升树脂40升阳离子缓冲溶液）或0. 67CV/min 的线性流速流过8分钟，将乳铁蛋白级分从柱中洗脱出来。
[0151] 将收集的血管生成素富集的级分进行超滤（NMWCO 5kDa)以浓缩并减少盐含量， 通过用0. 1微米螺旋缠绕的过滤进行器微量过滤以去除微生物并最终通过超滤（NMWC0 5kDa)来浓缩。将所得的浓缩物冷冻干燥并且在4-8°C下储存用于后续使用。
[0152] 通过阳离子交换HPLC分析血管生成素富集的级分中血管生成素含量，发现所述 级分含有39.4%(基于蛋白）的低分子量（141^ &)蛋白，该蛋白被嫩0)1-1'0?/1'0?1^(结 果未示出）证实是血管生成素。所述级分被命名为NatraGuarcL
[0153] 本领域技术人员会理解其他来源或通过其他方法纯化的血管生成素可用于本发 明的方法中。
[0154] 实施例2 :
[0155] 血管生成素以根据实施例Ib中描述的方法自牛脱脂乳中制备的富集的提取物的 形式提供。
[0156] 将八周龄的雌性 BALB/c nu/nu 裸小鼠 （Animal Resource Centre，Western Australia)在注射癌症细胞株之前适应一周。任意提供标准食物和水。在整个实验期称 量食物和水的重量以确保癌症对照组中的重量损失不是由于热量摄入减少造成的。动物 们被随机分为三个重量匹配组，即：癌症不治疗组（对照组）、补充含NatraGuard 60 μ g/ g食物（60 μ g NatraGuard)饮食的癌症组和补充含NatraGuard 300 μ g/g食物（300 μ g NatraGuard)饮食的癌症组。
[0157] 将产生肿瘤的鼠腺癌（MAC)细胞株16 (MAC16)在含有10% FBS和0. 5 %青霉素/ 链霉素的RPMI (Invitrogen)中培养。将细胞保存在37°C的10% 0)2的加湿孵育器中。细 胞生长到80%聚集并通过胰酶消化（trypsinisation)从细胞培养瓶中移除。将这些细胞 在4°C以500xg离心5分钟并从生长介质中分离。然后将这些细胞重悬浮于在37°C预孵育 的无菌PBS中，并吸入到含25毫米针头的无菌注射器中用于随后注射到小鼠中。用卡钳 测量小鼠的肿瘤体积。在对照组中在体重减少达到25%初始体重之前或在肿瘤生长超过 IOOOmm3之前对动物执行安乐死。将组织收集并立即置于液氮中，然后储存于-80°C冷冻室 中，用于分析。
[0158] 现在的研宄是向具有一些形式的癌症的小鼠喂食NatraGuard的首次研宄。因此， 重要的是确保用NatraGuard进行补充不会促进肿瘤生长或引起小鼠的其它不利健康结 果。
[0159] 用NatraGuard进行补充在小鼠模型中对癌症的诱发不具有作用（表1)。 12. 2 ± I. 0天时在对照小鼠中、13. 3 ± 1. 6天时在补充60ug NatraGuard的小鼠中和 14. 3±2. 6天时在补充300ug NatraGuard的小鼠中，在MAC16细胞注射位点检测到可见 的或可感知的肿瘤。同样地，用NatraGuard进行补充对于肿瘤的生长速度没有作用（图 1)。各组间的最终平均肿瘤大小是没有差异的（表1)，分别为313±187mm 3(恶病质）、 412±88mm3(60ug NatraGuard)和 334±114mm3(300ug NatraGuard)。在任意组中不存在转 移。
[0160] 表I. NatraGuard补充的作用

【权利要求】
1. 治疗受试者的癌症的方法，包括向受试者给予有效量的血管生成素或血管生成素激 动剂。
2. 诱导抗肿瘤效应的方法，包含给予有效量的血管生成素或血管生成素激动剂。
3. 权利要求2的方法，其中抗肿瘤效应包括减小肿瘤体积、抑制或减缓肿瘤生长、抑制 肿瘤发展、改变肿瘤的新陈代谢活动、诱发肿瘤静默、抑制或减少转移、抑制或减少肿瘤侵 袭、减少肿瘤重量、减少肿瘤新血管形成、改善疾病进展时间（TD巧和/或提高存活率。
4. 权利要求1或权利要求2的方法，其中血管生成素激动剂是血管生成素富集的乳提 取物，任选通过阳离子交换得到。
5. 任意前述权利要求的方法，进一步包含对受试者给予化学治疗剂、放射疗法或两者。
6. 任意前述权利要求的方法，进一步包括对受试者给予化学保护剂。
7. 任意前述权利要求的方法，其中所述血管生成素或血管生成素激动剂是口服给药 的。
8. 任意前述权利要求的方法，其中所述血管生成素或血管生成素激动剂是W营养制品 的形式给药。
9. 一种包含血管生成素或血管生成素激动剂和化学治疗剂的组合物。
【文档编号】C07K14/515GK104470533SQ201380037180
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年5月10日 优先权日:2012年5月10日
【发明者】P·霍布曼, A·布朗 申请人:墨累古尔本合作有限公司, 维多利亚农业服务控股公司