工程化亚胺还原酶以及用于酮和胺化合物的还原胺化的方法
【专利摘要】本公开内容提供了具有亚胺还原酶活性的工程化多肽、编码该工程化亚胺还原酶的多核苷酸、能够表达该工程化亚胺还原酶的宿主细胞、以及使用这些工程化多肽与一系列酮和胺底物化合物制备仲胺和叔胺产物化合物的方法。
【专利说明】工程化亚胺还原酶以及用于酮和胺化合物的还原胺化的方 法 1.【技术领域】
[0001] 本公开内容涉及对于将各种酮和胺底物向仲胺和叔胺产物的转化有用的具有亚 胺还原酶活性的工程化多肽。
[0002] 2.对序列表、表格或计算机程序的引用
[0003] 序列表的正式文本作为ASCII格式文本文件与说明书经EFS-Web同时被提交，文 件名为"CX2-120US2_ST25.txt"，创建日期为2013年5月8日，且大小为1，729, 414字节。 经EFS-Web提交的序列表为本说明书的一部分，并且通过引用以其整体并入本文。
[0004] 3.背景
[0005] 手性仲胺和叔胺是制药工业中的重要合成砌块（buildingblock)。不存在生产 此类手性胺化合物的已知的有效生物催化路径。现有的化学方法使用手性硼试剂或多步合 成。
[0006] 存在很少有关仲胺的生物催化合成的文献的报道。报道厌氧细菌伍氏醋酸杆 菌（Acetobacteriumwoodii)的完整细胞亚胺还原酶活性还原亚节基亚胺和亚丁基亚 胺（Chadha，等人，2008,Tetrahedron:Asymmetry. 19:93-96)。使用伍氏醋酸杆菌的完 整细胞的另一个报道使用在含水介质中的苯甲醛或丁醛和丁胺或苯胺（Stephens等人， 2004,Tetrahedron. 60:753-758)。报道链霉菌Str印tomycessp.GF3587 和GF3546 立体选 择性地还原 2-甲基-1-卩比略啉（Mitsukara等人，2010,Org.Biomol.Chem. 8:4533-4535) 〇
[0007] 在开发用于该类型反应的生物催化路径中的一个挑战是鉴定可被工程化以提供 在工业适用条件下有效地进行此类反应的酶种类。冠癭碱脱氢酶（opinedehydrogenase) 是使用NADH或NADPH作为辅因子的作用于CH-NH键的一类氧化还原酶。冠瘿碱脱氢酶 的天然反应是α-酮酸与氨基酸的还原胺化。已鉴定了编码具有冠瘿碱脱氢酶种类的特 征活性的酶的具有一定同源性的至少五个天然存在的基因。这五种酶包括：来自节杆菌 ArthrobacterSp.菌株IC的冠癭碱脱氢酶（CENDH)、来自欧洲大扇贝（Pectenmaximus) (大扇贝（greatscallop))的章鱼碱脱氢酶（OpDH)、乳酸乳球菌（Lactococcuslactis) Kl的鸟氨酸合酶（CE0S)、来自斗笠螺（Cellanagrata)的β-丙氨酸冠癭碱（β-alanine opine)脱氢酶（BADH)、和来自寄居蟹皮海绵（Suberitesdomuncula)的tauropine脱氢 酶（TauDH)。已确认了冠瘿碱脱氢酶CENDH的晶体结构（参见Britton等人，"Crystal structureandactivesitelocationofN- (1-D-carboxyethyl)-L-norvaline dehydrogenase, "Nat.Struct.Biol. 5 (7) : 593-601 (1998))。已知另一种酶，来自恶臭假单 胞菌（Pseudomonasputida)的N-甲基L-氨基酸脱氢酶（NMDH)具有与冠癭碱脱氢酶类似 的活性，与α-酮酸和烷基胺反应，但显示与冠瘿碱脱氢酶和氨基酸脱氢酶的很少或没有 序列同源性。NMDH已表征为属于NAD(P)依赖的氧化还原酶的超家族（superfamily)(参见 例如，US7, 452, 704B2;Esaki等人，FEBSJournal2005, 272, 1117-1123) 〇
[0008] 本领域中存在对用于合成手性仲胺和叔胺的生物催化剂以及在工业适用条件下 使用该生物催化剂的方法的需要。
[0009] 4.概述
[0010] 本公开内容提供了用于通过使用未激活的酮和未激活的胺作为底物的直接还原 胺化合成手性仲胺和叔胺的新颖生物催化剂以及使用该新颖生物催化剂的相关的方法。本 公开内容的生物催化剂是源自来自节杆菌Arthrobactersp.菌株IC的野生型基因的工程 化多肽变体，该野生型基因编码具有SEQIDN0:2的氨基酸序列的冠瘿碱脱氢酶。这些工 程化多肽能够催化酮（包括未激活的酮底物诸如环己酮和2-戊酮）或醛底物，与伯胺或仲 胺底物（包括未激活的胺底物诸如丁胺、苯胺、甲胺、和二甲胺）的转化以形成仲胺或叔胺 产物化合物。提及了源自冠瘿碱脱氢酶的这些工程化多肽的酶活性，且本文公开的工程化 酶还称为"亚胺还原酶（iminereductase) "或"IRED"。IRED的一般亚胺还原酶活性示于 以下方案1中。
[0011]方案 1
【权利要求】
1. 一种具有亚胺还原酶活性的工程化多肤，所述工程化多肤包括具有与SEQ ID N0:2 的至少80%序列同一性和与SEQ ID N0:2的序列相比在选自W下的残基位置上的一个或 更多个残基差异的氨基酸序列；X198、XIII、X136、X156、X197、X201、X259、X280、X292、和 X293。
2. 如权利要求1所述的工程化多肤，其中所述残基差异选自X198E/A/H/P/S、X111M/Q/ S、X136G、X156G/I/Q/S/T/V、X197I/P、X201L、X259E/H/I/L/M/S/T、X280L、X292C/G/I/P/S/ T/V/Y、和 X293H/I/K/L/N/Q/T/V。
3. 如权利要求1的任一项所述的工程化多肤，其中所述氨基酸序列包括至少选自W下 的残基差异组合： (a)XlllM、X156T、X198H、X259M、X280L、X292V、和 X293H ; 化）X156T、X197P、X198H、X259H、X280L、X292P、和 X293H ; (c) XlllM、X136G、X156S、X197I、X198H、X201L、X259H、X280L、X292V、和 X293H ; (d) X197I、X198E、X259M、和 X280L ; (e) X156T、X197I、X198E、X201L、X259H、X280L、X292V、和 X293H ; (f) XlllM、X136G、X19細、X259M、X280L、X292S、和 X293H ; W及 (g) X156V、X197P、X198E、X201L、X259M、X280L、和 X292T。
4. 如权利要求1所述的工程化多肤，所述工程化多肤能够在适当的反应条件下将底物 化合物（la)丙酬酸，
和底物化合物（2b) 了胺
转化为产物化合物（3b)，N-2-( 了基氨基）丙酸，
5. 如权利要求1所述的工程化多肤，所述工程化多肤能够在适当的反应条件下将底物 化合物（化）环己酬，
和底物化合物（2a化-正鄉氨酸
转化为产物化合物（3c)，（巧-2-(环己基氨基）戊酸，
6. 如权利要求1所述的工程化多肤，所述工程化多肤能够在适当的反应条件下将底物 化合物（化）环己酬，
和底物化合物（2b) 了胺
转化为产物化合物（3d)，N- 了基环己胺，
7. 如权利要求1至3的任一项所述的工程化多肤，所述工程化多肤还包括与SEQ ID N0:2的序列相比在选自W下的残基位置上的一个或更多个残基差异；X4、X5、X14、X20、 X29、X37、X67、X71、X74、X82、X94、X97、X100、XIII、X124、X137、X141、X143、X149、X153、 X154、X157、X158、X160、X163、X177、X178、X183、X184、X185、X186、X220、X223、X226、X232、 X243、X246、X256、X258、X259、X260、X261、X265、X266、X270、X273、X274、X277、X279、X283、 X284、X287、X288、X294、X295、X296、X297、X308、X311、X323、X324、X326、X328、X332、X353、 和 X356。
8. 如权利要求7所述的工程化多肤，其中所述残基差异选自X4H/L/R、X5T、X14P、 X20T、X29R/T、X37H、X67A/D、X71C/V、X74R、X82P、X94K/R/T、X97P、X100W、X111R、X124L/ N、X137N、X141W、X143W、X149L、X153V/Y、X154F/M/Q/Y、X157D/H/L/M/N/R、X158K、X160N、 X163T、X177C/H、X178E、X183C、X184K/Q/R、X185V、X186K/R、X220D/H、X223T、X226L、X232A/
R、X243G、X246W、X256V、X258D、X259V/W、X260G、X261A/G/I/K/R/S/T、X265G/L/Y、X266T、 X270G、X273W、X274M、X277A/I、X279F/L/V/Y、X283V、X284K/L/M/Y、X287S/T、X288G/S、 X294A/I/V、X295R/S、X296L/N/V/W、X297A、X308F、X311C/T/V、X323C/I/M/T/V、X324L/T、 X326V、X328A/G/E、X332V、X353E、和 X356R。
9. 如权利要求7所述的工程化多肤，其中所述氨基酸序列包括至少选自W下的残基差 异组合： (a) X29R、X184R、X223T、X261S、X284M、和 X287T ; 化）X29R、X157R、X184Q、X220H、X223T、X232A、X261I、X284M、X287T、X288S、X324L、 X332V、和 X353E ; (c) X29R、X157R、X184Q、X220H、X223T、X232A、X259V、X261I、X284M、X287T、X288S、 X324UX332V、和 X353E ; (d) X29R、X94K、XlllR、X137N、X157R、X184Q、X220H、X223T、X232A、X259V、X261I、X279V、 X284M、X287T、X288S、X32化、X332V、和 X353E ; W及 (e) X29R、X94K、XlllR、X137N、X157R、X184Q、X220H、X223T、X232A、X259V、X261I、X266T、 X279V、X284M、X287T、X288S、X295S、X311V、X32化、X328E、X332V、和 X353E。
10. 如权利要求7所述的工程化多肤，其中所述氨基酸序列包括残基差异X156T、 X197I、X198E、X201L、X259H、X280L、X292V、和X293H的组合，和选自W下的一个或更多个残 基差异；X29R/T、X94K/R/T、X111R、X137N、X157D/H/L/M/N/R、X184K/Q/R、X220D/H、X223T、 X232A/R、X259V/W、X261A/G/I/K/R/S/T、X266T、X279F/L/V/Y、X284K/L/M/Y、X287S/T、 X288G/S、X295S、X311V、X324L/T、X328E、X332V、和 X353E。
11. 如权利要求7所述的工程化多肤，其中所述氨基酸序列包括残基差异X156T、 X197I、X198E、X201L、X259H、X280L、X292V、和X293H的组合，至少选自W下的残基差异组 合： (a) X29R、X184R、X223T、X261S、X284M、和 X287T ; 化）X29R、X157R、X184Q、X220H、X223T、X232A、X261I、X284M、X287T、X288S、X324L、 X332V、和 X353E ; (c) X29R、X157R、X184Q、X220H、X223T、X232A、X259V、X261I、X284M、X287T、X288S、 X324UX332V、和 X353E ; (d) X29R、X94K、XlllR、X137N、X157R、X184Q、X220H、X223T、X232A、X259V、X261I、X279V、 X284M、X287T、X288S、X32化、X332V、和 X353E ; W及 (e) X29R、X94K、XlllR、X137N、X157R、X184Q、X220H、X223T、X232A、X259V、X261I、X266T、 X279V、X284M、X287T、X288S、X295S、X311V、X32化、X328E、X332V、和 X353E。
12. 如权利要求7所述的工程化多肤，所述工程化多肤能够在适当的反应条件下将底 物化合物（li)，
和底物化合物（2b)
13. 如权利要求7所述的工程化多肤，所述工程化多肤能够在适当的反应条件下将底 物化合物（Ij)，
14. 如权利要求1所述的工程化多肤，其中所述氨基酸序列包括选自由W下组成的组 的序列；SEQ ID N0:4-100、和112-750的偶数序列标识符。
15. -种多核巧酸，所述多核巧酸编码权利要求1至14的任一项所述的工程化多肤。
16. 如权利要求15所述的多核巧酸，其中所述多核巧酸包括选自由W下组成的组的核 酸序列；SEQ ID NO:3-99、和111-749的奇数序列标识符。
17. -种表达载体，所述表达载体包含权利要求15至16的任一项所述的多核巧酸。
18. -种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求15至16的任一项所述的多核巧酸或权 利要求17所述的表达载体。
19. 一种制备具有亚胺还原酶活性的工程化多肤的方法，所述方法包括在适合于表达 所述多肤的条件下培养权利要求18所述的宿主细胞，任选地还包括分离所述工程化多肤。
20. -种用于制备式（III)的胺化合物的方法，
其中 Ri和R2基团独立地选自氨原子，和任选地取代的烧基、締基、诀基、烧氧基、駿基、氨基 幾基、杂烧基、杂締基、杂诀基、駿基烧基、氨基烧基、面代烧基、烧基硫代烧基、环烧基、芳 基、芳基烧基、杂环姪基、杂芳基和杂芳基烧基；且任选地Ri与R 2连接W形成3元至10元 环； R3和R4基团独立地选自氨原子，W及任选地取代的烧基、締基、诀基、烧氧基、駿基、氨 基幾基、杂烧基、杂締基、杂诀基、駿基烧基、氨基烧基、面代烧基、烧基硫代烧基、环烧基、芳 基、芳基烧基、杂环姪基、杂芳基和杂芳基烧基，条件是R 3和R4两者不能同时是氨；且任选地 R3和R4连接W形成3元至10元环；W及 任选地，由*指示的碳原子和/或氮原子是手性的； 所述方法包括在适当的反应条件下在辅因子的存在下使 式（I)的化合物，
其中 Ri、和R2如W上所定义； W及 式（II)的化合物，
其中 R3、和R4如W上所定义； 与具有亚胺还原酶活性的工程化多肤接触，任选地其中所述工程化多肤是； (a)源自选自W下的天然存在的冠瘦碱脱氨酶；来自节杆菌Arthrobacter sp.菌株 1C(SEQ ID N0:2)的冠瘦碱脱氨酶、来自欧洲大扇贝（Pecten maximus)的D-章鱼碱脱氨 酶669 10^:102)、来自乳酸乳球菌江3(：1〇(3〇(3州3 13(3^3)1(1的鸟氨酸脱氨酶669 10 NO: 104)、来自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)的N-甲基-k氨基酸脱氨酶（NMDH) 669 1〇^:1〇6)、来自斗笠螺佑6113船肖脚*3)的0-丙氨酸冠瘦碱脱氨酶669 1〇 N0:108)、来自居蟹皮海绵（Suberites domun州la)的 tauropine 脱氨酶（SEQ ID N0:110); 或
(b)权利要求1至14的任一项所述的工程化多肤。
21. 如权利要求20所述的方法，其中R 3和R 4连接W形成3元至10元环。
22. 如权利要求20所述的方法，其中所述式（II)的底物化合物选自甲胺、二甲胺、异丙 胺、了胺、异了胺、k正鄉氨酸、苯胺、（巧-2-氨基戊-4-締酸、化咯烧、和哲基化咯烧。
23. 如权利要求20所述的方法，其中式（I)的化合物的R 1和R2的至少一个与式（II) 的胺化合物的R3和R4的至少一个连接，由此用于制备式（III)的胺化合物的方法包括分子 内反应。
24. 如权利要求20所述的方法，其中所述适当的反应条件包括 (a)约lOg/L至lOOg/L的底物载量； 化）约0. Ig/L至约50g/L的所述工程化多肤； (C)约 0. 05g/L(0. 001M)至约 2. 5g/L(0. 050M)的 NAD(P)H ; (d) 约6至10的抑； (e) 约20°C至50°C的温度；化及 (f) 2-120小时的反应时间。
【文档编号】C07K14/435GK104428313SQ201380037039
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年5月9日 优先权日:2012年5月11日
【发明者】陈海滨, 杰弗里·穆尔, 史蒂文·J·科利尔, 德里克·史密斯, 约瓦娜·纳佐尔, 格雷戈里·休斯, 雅各布·杰恩, 哈思曼 吉伽特, 斯科特·诺维克, 尼古拉斯·阿加德, 奥斯卡·阿尔维左, 乔治·科普, 杨万林, 乔利·苏库玛兰, 斯特法妮·额·迈纳 申请人:科德克希思公司