一种用于分离纯化凝血因子Ⅷ的方法
【专利摘要】本发明公开了一种分离纯化凝血因子Ⅷ的方法，主要是将冷沉淀通过DEAE-Spherodex吸附，然后经过免疫亲和层析纯化，DEAE琼脂糖凝胶去除抗凝血因子Ⅷ抗体，本发明的特征之处在于亲和层析柱上首先吸附2%的CaCO3，然后将抗凝血因子Ⅷ抗体吸附上去；亲和层析时，凝血因子Ⅷ在亲和缓冲液中搅拌均匀，用洗脱缓冲液洗脱得到纯化的凝血因子Ⅷ。本发明能降低生产成本，而且还使得血浆中凝血因子Ⅷ的直接提取变为可能，避免了原先低收率、低纯度分离方法的使用。
【专利说明】—种用于分离纯化凝血因子WI的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于分离纯化凝血因子VDI的方法，属于生物分离材料领域。
【背景技术】
[0002]生物分离配体是专门用于分离和提纯生物相关产品的一类材料。这种工艺广泛的应用于医药行业、发酵行业、生物制品、血液制品、疫苗等产品的分离。在纯化产品时，利用生物分离配体工艺可以达到分离效果好、产品纯度高等优点。尤其是当需要从血浆中分离提纯的目标产品含量较低时，这种分离技术就显的尤为重要。
[0003]凝血因子珊由健康人血浆，经分离、提纯，并经病毒去除和灭活处理、冻干制成。该制剂对缺乏人凝血因子VDI所致的凝血机能障碍具有纠正作用，主要用于防治甲型血友病和获得性凝血因子VDI缺乏而致的出血症状及这类病人的手术出血治疗。甲型血友病是一种伴性遗传性疾病，人群中的发病率为0.01%。病人由于凝血机制的缺陷，在遇外伤后往往流血不止，需要输注足量的凝血因子珊，但是该制剂在人体内的半衰期仅有8~12小时，因此病患需要大量的制剂来维持病情。目前国内国际的凝血因子珊制剂呈现出供不应求的局面。[0004]目前已有的技术中，亲和效果最好的配基为Ca2+依赖型单克隆抗体，其结合-解离条件温和，在含有Ca2+的缓冲溶液中抗体可以和抗原特异性结合，将淋洗液换成含有EDTA的缓冲液即可洗脱下抗原。但是，单克隆抗体造价昂贵，且稳定性较差。肝素是另一种亲和配基，它是一种带负电荷的多聚体，是AT-1II的辅因子，优势许多凝血因子的抑制剂，可以通过静电和亲和相互作用可分离血浆中的很多凝血因子。肝素价格较便宜，但是亲和的特异性较差。
[0005]因此，选择合适的分离纯化技术的不但能降低生产成本，而且还使得血浆中凝血因子珊的直接提取变为可能，避免了原先低收率、低纯度分离方法的使用。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种用于分离纯化凝血因子珊的方法，具体来说是一种提高从血浆中分离凝血因子VDI的方法，主要通过降低亲和层析的负荷量，保持配基牢固的吸附能力来延长使用寿命，达到高效分离凝血因子珊的目的。
[0007]一种用于分离纯化凝血因子VDI的方法，包括血浆的收集、处理以及冷沉淀中凝血因子VDI的分离纯化，其中冷沉淀通过DEAE-Spherodex吸附,然后经过免疫亲和层析纯化，DEAE琼脂糖凝胶去除抗凝血因子珊抗体，其中:亲和层析柱上首先吸附2%的CaCO3,然后将抗凝血因子VDI抗体吸附上去；亲和层析时，凝血因子VDI在亲和缓冲液中搅拌均匀，用洗脱缓冲液洗脱得到纯化的凝血因子珊。
[0008]一种用于分离纯化凝血因子VDI的方法，其中亲和缓冲液为0.01mol/L Tris-HCl,pH7.0，3mmol/LCaCl2，所述的洗脱缓冲液为 0.05mol/L Tris-HCl, pH7.0,6mmol/L EDTA。
【具体实施方式】[0009]免疫亲和层析柱的制备:将2g CNBr-activated sepharose 4B Fast Flow 用400ml lOmmol/L的HCl洗涤，然后缓慢加入层析柱中，保持流出口开放，胶自然沉降；此时，缓慢加入2%的CaCO3,循环3次，将溶液排放干净后将抗凝血因子VDI抗体用0.22um的细菌过滤器过滤后加入柱中，然后用0.lmol/L的NaHCO3充分透析；经过充分偶联后，冲洗至流出液OD28tl为0，再用200ml 0.01mol/L的Tris-HCl，pH7.0缓冲液充分洗柱，以封闭胶上未偶联的活化位点；用3倍体积0.01mol/L Tris-HCl,pH7.0，3mmol/LCaCldP 3被体积0.05mol/L Tris-HCl, pH7.0,6mmol/L EDTA循环洗涤层析柱，进行5个循环。
[0010]不同反应条件对分离效果的影响
将本发明的最终效果与传统的两步离子交换层析分离法相比较，结果如下表所示:
【权利要求】
1.一种用于分离纯化凝血因子VDI的方法，包括血浆的收集、处理以及冷沉淀中凝血因子VDI的分离纯化，其中冷沉淀通过DEAE-Spherodex吸附,然后经过免疫亲和层析纯化，DEAE琼脂糖凝胶去除抗凝血因子VDI抗体，其特征在于:亲和层析柱上首先吸附2%的CaCO3,然后将抗凝血因子VDI抗体吸附上去；亲和层析时，凝血因子VDI在亲和缓冲液中搅拌均匀，用洗脱缓冲液洗脱得到纯化的凝血因子珊。
2.如权利要求1所述的一种用于分离纯化凝血因子VDI的方法，其特征在于:亲和缓冲液为 0.01mol/L Tris-HCl，pH7.0，3mmol/LCaCl2，所述的洗脱缓冲液为 0.05mol/LTris-HCl, pH7.0,6mmol/L EDTA`。
【文档编号】C07K14/755GK103864919SQ201410045491
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年2月8日 优先权日:2014年2月8日
【发明者】吕献忠, 苏峰 申请人:新疆德源生物工程有限公司