一种从血浆中提取人凝血因子Ⅷ的工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高凝血因子Ⅷ分离效率、活性、比活、回收率经济、简单的方法。此方法将冷沉淀先进行两次肝素钠洗涤，再通过一次离子交换层析，洗脱液洗脱最后得到较纯的凝血因子Ⅷ。和传统方法比较，本发明的优势在于操作简便，成本低，与此同时，还提高了分离效率、活性、比活和回收率。
【专利说明】—种从血浆中提取人凝血因子WI的工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种人凝血因子VDI的制备工艺，属生物制药领域。
【背景技术】
[0002]凝血因子VDI是治疗甲型血友病唯一的特效药，在临床上有巨大的应用价值，病人由于凝血机制有缺陷，偶遇外伤往往流血不止，需要输入足量的凝血因子珊制剂，加上凝血因子VDI在人体内的半衰期只有8~12个小时，虽然效果显著，但是不能持久，一旦患病，终身需要此药。虽然这类人人数不多，但是需求量大，所以在全球形成供不应求的局面。
[0003]出于对安全的考虑，我国尚无对血液进口解禁的打算，中国市场完全为国内生产商生产，均为从血液中提取，在现阶段研发出安全性高、产品比活性好、造价低廉的人凝血因子珊有着积极意义。
[0004]发展到现在，国内外已经有多种从血液中提取纯化因子珊的方法，现有的多步离子交换层析法虽然纯化率高，但步骤繁琐，需要耗费大量时间；近年来单克隆抗体技术的发展，免疫亲和层析法得到应用，但单克隆抗体造价昂贵，且稳定性较差，有可能对血浆造成二次污染，难以大规模的运用到工业生产中；肝素作为另一种亲和配基，可以利用静电和亲和相互作用分离血浆中很多凝血因子，肝素价格便宜，但亲和特异性差。本次技术方案采用先进行两次肝素钠洗涤法分离提取凝血因子，再用离子交换层析法进行针对性洗脱，纯化，以达到更好的效果。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供回收效率和活性高，并且生产成本低的一种人凝血因子VDI的制备工艺。
[0006]本发明的技术效果是通过以下步骤得以实现的:
1、将新鲜血浆进行一次沉淀:将新鲜冷冻血浆通过O~4°C水浴融化，并控制血浆温度在O~4°C，进行离心分离得到一次沉淀，离心时的进液速度≤2000mL/min，分离出液温度应不闻于4.0°C ；
2、将步骤I得到的一次沉淀进行悬浮:将一次沉淀粉碎投入溶解液，水浴至26.0~29.(TC，搅拌溶解0.5小时，用浓度为0.25~0.3mol/L盐酸调pH为6.80~7.00，调整后加入2500IU/L的肝素钠溶液，速度200~400mL/分钟，使之终含量为60IU/L，向溶液中以500~600mL/min的速度加入溶液A(含31.56%聚乙二醇3350，0.32%枸橼酸钠，用1.0mol/L盐酸调pH为6.20~6.60，温度25.0 ± 5.(TC )使制品中聚乙二醇浓度达到3.0 %~5.0 %，用0.5mol/L的醋酸溶液(加液速度控制在小于200mL/min)调整制品pH至6.50±0.20，降温至10.0~20.(TC后反应30分钟，静置I~2小时；
3、将步骤2得到的悬浮液进行离心分离出上清液:虹吸静置后的制品上清液进行离心分离，出液速度控制在1000~1500mL/min，温度控制在12.0~18.(TC，收集离心出液，离心出液应澄清，使用0.15~0.45mol盐酸调整制品pH至7.00±0.20，过滤离心后的上清，过滤制品压力不得高于0.3Mpa，速度不得高于5.0L/分钟，检查出液应澄清，滤液温度12.0 ~18.(TC ；
4、将步骤3中的上清液进行病毒灭活:根据过滤后制品体积加入10%S/D溶液，至终溶液含S/D浓度为1.2%，终溶液含Triton X-100为1.2%，含磷酸三丁酯0.4% ;搅拌均匀后升温至23~25°C，连续搅拌3~5小时；
5、将步骤4灭活后的制品进行悬浮:灭活结束前使用平衡液(配方:0.02mol/L三羟甲基氨基甲烷、3.5%的聚乙二醇3350，0.032%枸橼酸钠，pH为6.40~6.60)平衡装有澄清滤材的滤器及制品输送管道，将灭活后的制品澄清过滤入制作罐，滤液温度应在16~25°C。开启搅拌，搅拌转速控制在40~80转/分钟(频率为30%~50%)，加入溶液IIK配方:含31.56%聚乙二醇3350，0.32%枸橼酸钠，pH 5.60~5.80)，添加速度在500~600mL/min，使制品中聚乙二醇浓度达到12.0±1.0%，加完后用0.5mol/L的醋酸溶液(加液速度控制在小于200mL/min)调整制品pH至5.80±0.10，再降温制品至7.0±2.(TC后搅拌反应30~60分钟，关闭搅拌静置60~90分钟；
6、将步骤5中的悬浮液进行离心分离出二次沉淀:离心分离蛋白沉淀，离心进出液速度控制在1000~2500mL/min，温度保持在6~9 °C，收集沉淀，上清液废弃；
7、将步骤6离心分离出的二次沉淀物进行两次洗涤，两次离心分离出三次沉淀:用注射用水配制甘氨酸洗涤液，(配制量为冷沉淀量的0.5~I倍体积)内含甘氨酸13.14%，枸橼酸钠?.53%，肝素钠80.5 μ g/L,用1.0 mol/L盐酸溶液调pH为6.65~6.75，降温至-1.0~1.(TC备用，进行两次洗涤(加11~14倍沉淀量的洗涤液溶解沉淀，将沉淀切碎，切割搅拌速度控制在3000~4500rpm，台式离心机转速在3000~4000rpm，温度为0.0~
4.5°C，分离时间为20分钟)，得三次沉淀；
8、将步骤7中分离出的三次沉淀进行溶解分离:将三次沉淀加入溶解液(0.15mol/LNaCL)，搅拌至完全溶解，并离心分离出上清液；
9、将步骤8得到的上清液进行一次层析纯化精制，得到用于制备人凝血因子珊制品的人凝血因子VDI精制液:将溶解液上DEAE-Fractogel TSK 650M柱，再经平衡液(0.1lMNaCl)、洗涤液(0.15M NaCl)、洗脱液(0.25M NaCl)洗涤；
10、将步骤9得到的人凝血因子VDI精制液透析、超滤、配液、分装。 【具体实施方式】
[0007]在本发明【具体实施方式】在
【发明内容】
中得以体现，
【发明内容】
可以直接用于实施例。
[0008]实施例1:不同分离方法对人凝血因子VDI最终产品参数比较:
【权利要求】
1.一种从血浆中提取人凝血因子珊的工艺，其特征在于:包括以下步骤: ①将新鲜血浆进行一次沉淀:将新鲜冷冻血浆通过O~4°C水浴融化，并控制血浆温度在O~4°C，进行离心分离得到一次沉淀，离心时的进液速度≤2000mL/min，分离出液温度应不高于4.(TC ； ②将步骤①得到的一次沉淀进行悬浮:将一次沉淀粉碎投入溶解液，水浴至26.0~`29.(TC，搅拌溶解0.5小时，用浓度为0.25~0.3mol/L盐酸调pH为6.80~7.00，调整后加入2500IU/L的肝素钠溶液，速度200~400mL/分钟，使之终含量为60IU/L，向溶液中以500~600mL/min的速度加入溶液A(含31.56%聚乙二醇3350，0.32%枸橼酸钠，用1.0mol/L盐酸调pH为6.20~6.60，温度25.0 ± 5.(TC )使制品中聚乙二醇浓度达到3.0 %~5.0 %，用0.5mol/L的醋酸溶液(加液速度控制在小于200mL/min)调整制品pH至6.50±0.20，降温至10.0~20.(TC后反应30分钟，静置I~2小时； ③将步骤②得到的悬浮液进行离心分离出上清液:虹吸静置后的制品上清液进行离心分离，出液速度控制在1000~1500mL/min，温度控制在12.0~18.(TC，收集离心出液，离心出液应澄清，使用0.15~0.45mol盐酸调整制品pH至7.00 ±0.20，过滤离心后的上清，过滤制品压力不得高于0.3Mpa，速度不得高于5.0L/分钟，检查出液应澄清，滤液温度`12.0 ~18.(TC ； ④将步骤③中的上清液进行病毒灭活:根据过滤后制品体积加入10%S/D溶液，至终溶液含S/D浓度为1.2%，终溶液含Triton X-100为1.2%，含磷酸三丁酯0.4% ;搅拌均匀后升温至23~25°C，连续搅拌3~5小时； ⑤将步骤④灭活后的制品进行悬浮:灭活结束前使用平衡液(配方:0.02mol/L三羟甲基氨基甲烷、3.5%的聚乙二醇3350，0.032%枸橼酸钠，pH为6.40~6.60)，平衡装有澄清滤材的滤器及制品输送管道，将灭活后的制品澄清过滤入制作罐，滤液温度应在16~25°C;开启搅拌，搅拌转速控制在40~80转/分钟(频率为30%~50%)，加入溶液III (配方:含31.56%聚乙二醇3350，0.32%枸橼酸钠，pH 5.60~5.80)，添加速度在500~600mL/min，使制品中聚乙二醇浓度达到12.0±1.0%，加完后用0.5mol/L的醋酸溶液(加液速度控制在小于200mL/min)，调整制品pH至5.80±0.10，再降温制品至7.0±2.(TC后搅拌反应30~60分钟，关闭搅拌静置60~90分钟； ⑥将步骤⑤中的悬浮液进行离心分离出二次沉淀:离心分离蛋白沉淀，离心进出液速度控制在1000~2500mL/min，温度保持在6~9 °C，收集沉淀，上清液废弃； ⑦将步骤⑥离心分离出的二次沉淀物进行两次洗涤，两次离心分离出三次沉淀:用注射用水配制甘氨酸洗涤液(配制量为冷沉淀量的0.5~I倍体积)，内含甘氨酸13.14%，枸橼酸钠?.53%，肝素钠80.5 μ g/L，用1.0 mol/L盐酸溶液调pH为6.65~6.75，降温至-1.0~1.(TC备用，进行两次洗涤(加11~14倍沉淀量的洗涤液溶解沉淀，将沉淀切碎，切割搅拌速度控制在3000~4500rpm，台式离心机转速在3000~4000rpm，温度为0.0~`4.5°C，分离时间为20分钟)，得三次沉淀； ⑧将步骤⑦中分离出的三次沉淀进行溶解分离:将三次沉淀加入溶解液(0.15mol/LNaCL)，搅拌至完全溶解，并离心分离出上清液； ⑨将步骤⑧得到的上清液进行一次层析纯化精制，得到用于制备人凝血因子珊制品的人凝血因子VDI精制液:将溶解液上DEAE-Fractogel TSK 650M柱，再经平衡液(0.1lMNaCl)、洗涤液(0.15M NaCl)、洗脱液(0.25M NaCl)洗涤；⑩将步骤⑨得到的人凝血因子珊精制液透`析、超滤、配液、分装。
【文档编号】C07K14/755GK103864920SQ201410045492
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年2月8日 优先权日:2014年2月8日
【发明者】吕献忠, 苏峰 申请人:新疆德源生物工程有限公司