金花茶皂苷a标准品及其制备方法
【专利摘要】本发明以金花茶叶、枝、花为原料，乙醇-水为浸提剂，通过超声波浸提、大孔吸附树脂柱吸附、柱层析分离、液相色谱分离等步骤制成金花茶皂苷A标准品。本发明制得的标准品性能稳定，检测精度高，可作为化学对照品，用于金花茶系列产品品质鉴别指标性成分，为质量监督、产品的真伪鉴别提供技术支撑。
【专利说明】金花茶皂苷A标准品及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然产物分离纯化领域，具体涉及一种从金花茶叶中提取金花茶皂苷 A标准品及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 金花茶（Camellia chrysanth(Hu)Tuyama)是山茶科，山茶属，金花茶组，金花茶系 植物。为常绿灌木或小乔木。主产于中国广西防城港市境内，金花茶是防城港市特色资源 之一，素有"茶皇后"、"植物界大熊猫"的美誉，2009年防城港市防城区被命名为"中国金 花茶之乡"，2010年被国家质量监督检验检疫局授权为国家地理标志保护产品，防城港市立 足本地金花茶资源优势，扎实推进金花茶产业经济发展，促进农民增收。近年来金花茶产业 发展取得了明显成效，人工种植金花茶面积达到3万亩，育苗300万株，有十几家企业利用 金花茶花和叶研制有金花茶袋包茶、饮料、口服液等近30多个系列产品，产值达6个多亿。
[0003] 在金花茶皂苷【技术领域】， 申请人:检索到如下两篇相关的技术文献：
[0004] 文献1 :题名：《金花茶叶皂苷类成分研究》，作者：苏琳，莫建光，韦英亮等；刊物： 《中草药》，2012, 43 (5)，877-879。
[0005] 该文献研究了金花茶Camellia  ;euphlebia叶阜苷类成分。方法利用超声提 取、大孔树脂富集以及制备色谱对金花茶叶水溶性部分进行分离纯化，运用NMR、MS、IR等 光谱手段进行结构鉴定。结果分离得到3个单体化合物，分别为人参皂苷Rgl(I)、人参皂 苷Fl (2)和人参皂苷F5 (3)。结论化合物1?3均为首次从该植物中分离得到的人参皂苷， 其中人参皂苷Rgl、F5为首次从山茶属中分离得到。金花茶为国家一级保护的珍稀药用植 物，这些成分的分离鉴定对其进一步的活性研究、开发利用和推广种植具有重要意义。但 该文献分离得到的人参皂苷Rgl(I)、人参皂苷Fl (2)和人参皂苷F5 (3)三种化合物均是前 人研究已经定性的化合物，其药理活性和用途已有很多报道。
[0006] 文献2 :题名：《金花茶皂甙的分离纯化及化学结构研究》；作者：曾秋文；刊物：广 东海洋大学硕士论文，2010年。
[0007] 该文献研究以金花茶叶为实验材料提取其中的皂甙成分，然后筛选分离纯化树 月旨，对皂甙进行分离纯化。通过抗氧化指标比较皂甙组分的抗氧化活性，并对抗氧化活性 最高的皂甙组分进行进一步的分离纯化，分析其理化性质，为金花茶皂甙的构效关系研究 提供理论依据。
[0008] 研究的主要内容及结果如下：
[0009] 1、以新鲜金花茶叶为原料，经过微波灭酶后进行组织破碎，采用超声波浸提及纳 米超滤等方法进行提取和浓缩，得到金花茶浓缩液。金花茶浓缩液经过乙醇沉淀去杂、乙 醚脱色得到粗皂甙提取液。试验结果显示金花茶粗皂甙提取液中主要含有皂甙并含有少量 的茶多酚，皂甙含量约为茶多酚的10倍。
[0010] 2、通过静态吸附率和解吸率等指标比较了聚酰胺树脂、XAD16、DM130和XAD1600 等4种树脂对金花茶粗皂甙分离的效果，并选择XAD16作为分离树脂对金花茶粗皂甙进 行分离纯化。分离纯化结果：在水以及和30%异丙醇洗脱液处分别得到了 WS、 151、 IS2、IS3等4个皂甙组分。各皂甙组分的得率分别为34. 8%、9. 1%、20. 3%、31.8%， 皂甙总得率达96.0%。高效液相色谱分析结果显示，相对于粗皂甙，各皂甙组分的吸收峰 数量明显减少，表明XAD16大孔吸附树脂层析柱可以有效将金花茶粗皂甙分离出极性不同 的皂甙组分。
[0011] 3、以维生素 C为参照物，通过羟基自由基清除试验、超氧阴离子清除试验、 DPPH ?自由基清除试验、磷钥络合物法等4种不同的抗氧化试验，比较了粗皂甙、WS、IS1、 152、 IS3等皂甙组分的抗氧化活性。结果显示，各皂甙组分均有明显的抗氧化活性，在 清除羟基自由基实验中，ISl的清除率为66. 5 %，比维生素 C及其他三个皂甙组分高；在 DPPH ?自由基清除试验中，ISl的清除率为96. 3%，接近同浓度维生素 C的清除率100% ; 在清除超氧阴离子的实验中，ISl的清除率达到64. 7%，比皂甙组分IS2、IS3高；在磷钥 络合物法实验中，ISl的抗氧化活性比皂甙组分IS2、IS3高37. 1%、39. 8%，可以看出ISl 的抗氧化活性较为显著。
[0012] 4、通过XAD1600柱层析和聚酰胺柱层析对抗氧化活性最高的皂甙组分ISl进行 进一步的分离纯化，得到ISlA皂甙组分。高效液相色谱分析结果显示，ISlA出现唯一一 个尖锐的峰，表明ISlA为单一化合物。抗氧化活性分析结果显示，ISlA的抗氧化活性较 ISl高出10%左右，表明ISlA是主要的功效因子。颜色反应及构成糖薄层层析分析结果 显示，ISlA是含有葡萄糖和半乳糖的三萜类皂甙。对于具体的化学结构有待进一步分析。
[0013] 但是该文献的研究因其工艺比较粗糙，虽然得到了 WS、ISl、IS2、IS3等4个皂甙 组分，但因其组分比较复杂，纯度不够，无法确定其组分的具体成分和结构。
[0014] 但金花茶系列产品的质量标准仍然参照茶叶的技术参数来监控，没有建立起特征 的指标性成分来鉴别金花茶产品的技术标准。针对目前没有金花茶产品质量技术标准缺指 标性成分的现状，我们对金花茶的化学成分进行了深入研究，首次从金花茶叶分离出了 30 多个化学成分，从中筛选出一个具有生物活性的新化合物-金花茶皂苷A，该新化合物可作 为化学对照品，用于金花茶系列产品品质鉴别指标性成分，为质量监督、产品的真伪鉴别提 供技术支撑。
【发明内容】
[0015] 申请人:同日申请的另一个发明专利《金花茶皂苷A及其制备方法和抗肿瘤用途》 公开了从金花茶（Camellia chrysanth(Hu)Tuyama)中分离出的新的金花茶阜苷A化合物 及其制备方法，但该方法获得的金花茶皂苷A纯度不够高，无法将其用作标准品来鉴别金 花茶系列产品的品质和进行质量监控，本发明的目的是针对前述问题，提供了一种金花茶 皂苷A标准品及其制备方法。
[0016] 本发明是这样实现的：
[0017] 金花茶皂苷A标准品，其化学名称为：（3 P，6 a，12 P )-3, 6, 12-三羟基 达玛烷-24-烯-20-甲基-2H -D-吡喃葡萄糖-(2 - DH -D-吡喃葡萄 糖-(2 - I) -0- a -L-吡喃鼠李糖苷，其化学结构式为：
[0018]
【权利要求】
1. 一种金花茶皂苷A标准品，其特征在于：所述的金花茶皂苷A化学名称为： (3 3,6a，123) -3, 6，12-二轻基达玛烧-24-稀-20 -甲基K- P 批喃甸萄 糖-(2 - 1) -0- P -D-吡喃葡萄糖-(2 - 1) -0- a -L-吡喃鼠李糖苷，其化学结构式为：
该金花茶皂苷A标准品为白色针状晶体；其纯度彡98. 5%;溶解性：溶于甲醇、乙醇， 微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；灰分：彡〇. 1% ;重金属（以pb计）：彡5. 0 mg/Kg ;水分： 彡0. 4% ;熔点范围：192. 3°C?195. 6°C ;有关物质：彡2. 0% ;其分子式为：C48H82018 ;分子量 为：946。
2. -种如权利要求1所述的金花茶皂苷A标准品的制备方法，其特征在于：将新鲜金 花茶原料预处理后，按照金花茶原料：纯净水：复合果浆酶物料比为1:4?6 :0. 0005进行 超声波提取得到金花茶超声波提取液；然后将金花茶超声波提取液浓缩得到金花茶浸膏， 湿法上担体进行层析柱分离，收集130?150流分自然挥去溶剂，结晶后得到金花茶皂苷A 粗品；最后将金花茶皂苷A粗品用液相色谱进行程序分离纯化得到富含金花茶皂苷A组分 纯化液，浓缩、静止结晶、冷冻干燥处理后，即可得到纯度> 98. 5%的白色针状的金花茶皂 苷A晶体，即金花茶皂苷A标准品。
3. 根据权利要求2所述的金花茶皂苷A标准品的制备方法，其特征在于：所述的层析 柱分离选用的层析柱为14 cm X 100 cm，担体为200目?300目，用体积比为15?25:2? 4氯仿-甲醇洗脱。
4. 根据权利要求2或3所述的金花茶皂苷A标准品的制备方法，其特征在于：所述的液 相色谱进行程序分离纯化为将金花茶皂苷A粗品溶解于有机溶剂中制备得到金花茶皂苷A 供试液，然后将供试液用液相色谱进行程序分离纯化，所述的程序分离纯化条件为：紫外吸 收波长203nm ;流动相：A为乙腈，B为水；梯度洗脱条件：0?5 min，A:B体积比为25:75 ; 5 ?28 min，A:B 体积比为 40:60 ;28 ?37 min，A:B 体积比为 40:60 ;37 ?42 min，A:B 体 积比为50:50 ;42?60 min，A:B体积比为50:50 ;60?65 min，A:B体积比为25:75 ;65? 70 min，A:B体积比为25:75 ;金花茶皂苷A色谱峰的保留时间为23分钟。
5. 根据权利要求4所述的金花茶皂苷A标准品的制备方法，其特征在于：所述柱层析 分离所用的担体为硅胶。
6. 根据权利要求4所述的金花茶皂苷A标准品的制备方法，其特征在于：所述的浓缩 为真空浓缩，其条件为：真空度为620?660mmHg，蒸汽压为0. 05?0. IMpa。
7. 根据权利要求5或6所述的金花茶皂苷A标准品的制备方法，其特征在于：所述的 超声波提取条件为：温度为65°C?75°C，频率为20KHZ?30KHZ，时间50分钟?70分钟。
8. 根据权利要求7所述的金花茶皂苷A标准品的制备方法，其特征在于：所述的金花 茶浸膏为固形物含量浓度35 %?45 %的金花茶浸膏。
9. 根据权利要4所述的金花茶皂苷A标准品的制备方法，其特征在于：所述的有机溶 剂为甲醇、乙醇、甲醇-水或乙醇-水；所述的金花茶原料预处理为将采采摘的新鲜金花茶 的花、枝、叶原料去杂物，用自来水冲洗干净，浙干水分，切为〇. 5cm?3cm长。
10. 金花茶皂苷A标准品在鉴别金花茶产品中的应用，其特征在于：所述的金花茶皂苷 A标准品作为化学对照品，用于鉴别金花茶系列产品金花茶花茶、叶茶、袋泡茶、金花茶口服 液、金花茶胶囊、花茶浓缩饮液品质。
【文档编号】C07J9/00GK104277090SQ201410439637
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】黄艳, 莫建光, 杨克迪, 陈秋虹, 张思敏, 林国友, 徐慧, 覃祖前 申请人:广西壮族自治区分析测试研究中心