Axmi-il5、axmi-113、axmi-005、axmi-163 和axmi-184∶vip3a 杀虫蛋白及其使用方法
【专利摘要】本发明提供了赋予宿主细胞杀虫活性的组合物和方法。提供了含有δ-内毒素多肽的编码序列的组合物。该编码序列可用于DNA构建体或表达盒中，用于宿主细胞中的转化和表达。组合物还包括转化的宿主细胞。特别地，提供了分离的δ-内毒素核酸分子。另外，包含与多核苷酸对应的氨基酸序列，和特异性结合这些氨基酸序列的抗体。尤其是，本发明提供了分离的核酸分子，所述核酸分子含有编码SEQ ID NO:4、5、6、13或14中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或SEQ ID NO:1、2、3、11或12中陈列的核苷酸序列，及其变体和片段。
【专利说明】AXM 卜 IL5、AXM 卜113、AXM 卜005、AXM 卜163 和 AXM卜184 : VIP3A杀虫蛋白及其使用方法
[0001] 本申请为2009年7月2日提交的、发明名称为"AXMI-IL5、AXMI-113、AXMI-005、 AXMI-163 和 AXMI-184 : VIP3A 杀虫蛋白及其使用方法"的 PCT 申请 PCT/US2009/049527 的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2010年12月17日，申请号为 200980123077. 5。 发明领域
[0002] 本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫蛋白的新基因。这些蛋白质和编码 它们的核酸序列可用于制备杀虫制剂以及生产转基因的抗害虫植物。
[0003] 发明背景
[0004] 苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis)是形成孢子的革兰氏阳性土壤细菌，其特 征在于它能产生对某些目和种的昆虫有特异性毒性，但是对植物和其他非靶向生物体无害 的晶状包含体。因此，包含苏云金杆菌菌株或它们的杀虫蛋白的组合物可用作环境可接受 的杀虫剂以控制农业虫害或针对多种人或动物疾病的昆虫媒介。
[0005] 来自苏云金杆菌的晶体（Cry)蛋白（δ-内毒素）具有主要针对鳞翅目，双翅 目和鞘翅目幼虫的有效杀虫活性。这些蛋白质还显示出抗膜翅目，同翅目，虱目，食毛目 和螨害虫目，以及如线虫，扁形动物和Sarcomastigorphora等其他无脊椎动物目的活性 (Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis family tree.In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc.，New York, N. Y.)。这些蛋白质主要基于它们的杀虫活性 而最初被划分为CryI到CryV。这些主要的类别是鳞翅目特异性的（I)，鳞翅目和双翅目 特异性的（II)，鞘翅目特异性的（III)，双翅目特异性的（IV)，以及线虫特异性的（V)和 (VI)。所述蛋白质被进一步划分为亚家族；各个家族内更密切相关的蛋白质被指派上分类 字母，如CrylA，CrylB，CrylC等等。在各亚类内更紧密相关的蛋白质则命名为如CrylCl， CrylC2 等等。
[0006] 最近出现了一种针对Cry基因的新命名法，其基于的是氨基酸序列同源性而非昆 虫革巴特异性（Crickmore 等人（1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813)。在该新的分 类法中，每种毒素被分配了一个独特的名称，其中合并了第一分类（阿拉伯数字）、第二分 类（大写字母）、第三分类（小写字母）和第四分类（另一个阿拉伯数字）。在该新的分类 法中，罗马数字被转换成第一分类的阿拉伯数字。序列同一性小于45%的蛋白质具有不同 的第一分类，而对于第二和第三分类而言这一标准分别为78%和95%。
[0007] 晶体蛋白在已经被摄取和在昆虫中肠溶解前不显示杀虫活性。被摄取的前毒素在 昆虫消化道内经蛋白酶水解成活性的毒性分子。（Hdf te和Whiteley (1989)Microbiol. Rev. 53:242-255)。此毒素与靶幼虫中肠内的顶端刷状缘受体结合并插入顶端膜中，产生离 子通道或孔，导致幼虫死亡。
[0008] δ -内毒素通常具有5个保守的序列结构域和3个保守的结构性结构域（参见，例 如，de Maagd等人（2001) Trends Geneticsl7:193-199)。第一个保守的结构性结构域由7 个α螺旋组成，并涉及膜插入和孔形成。结构域II由排列成"希腊语key"构型的3个β 折叠片组成，而结构域III由"薄卷饼型（非同源蛋白质折叠）"形式的两个反向平行β折 叠组成（de Maagd等人，2001，同上文）。结构域II和III涉及受体识别和结合，并因此被 认为是毒素特异性的决定簇。
[0009] 除了 δ-内毒素以外，还有几种其他已知类型的杀虫蛋白毒素。VIP1/VIP2毒素 (见，例如，美国专利5, 770, 696)为二元杀虫毒素，认为其通过类似其他二元（"Α/Β"）毒 素的作用模式的、涉及受体介导的胞吞和之后的细胞毒化机制对昆虫展示强活性。Α/Β毒素 例如VIP、C2、⑶T、CST或炭疽杆菌（B. anthracis)水肿和致命毒素首先通过特异性受体介 导的与单体形式的"B"组分结合与靶细胞发生相互作用。这些单体之后形成同型七聚体。 之后"B"七聚体-受体复合物作为对接平台接着结合"A"酶组分并通过受体介导的胞吞将 其运输至胞浆。一旦进入细胞的胞浆，"A"组分通过例如G肌动蛋白的ADP核糖基化或提 高环腺苷酸（cAMP)的胞内水平抑制正常细胞功能。见Barth等人（2004)Microbiol Mol Biol Rev68:373-402。
[0010] 基于苏云金杆菌的杀虫剂的密集使用已经在小菜蛾（Plutella xylostella)的野 生种群中引起了抗性（Ferr6and Van Rie(2002)Annu. Rev. Entomol. 47:501-533)。产生抗 性最通常的机制是毒素与其特异性中肠受体的结合降低。这也会引起共享相同抗体的其他 毒素的交叉抗性（Ferr6and Van Rie(2002))。
[0011] 发明概述
[0012] 提供了赋予细菌，植物，植物细胞，组织和种子昆虫抗性的组合物和方法。组合物 包括编码S-内毒素多肽的核酸分子，包含那些核酸分子的载体，和包含这些载体的宿主 细胞。组合物还包括内毒素多肽序列和针对那些多肽的抗体。该核苷酸序列可用于DNA构 建体或表达盒中，用于转化生物体和在生物体中表达，该生物体包括微生物和植物。核苷酸 或氨基酸序列可以是已经被设计成用于在生物体中表达的合成序列，包括但不限于，微生 物或植物。组合物还包括转化的细菌，植物，植物细胞，组织和种子。
[0013] 特别地，提供了对应δ-内毒素核酸序列的分离的核酸分子。另外，包含该多核 苷酸对应的氨基酸序列。尤其是，本发明提供了下述分离的核酸分子，其含有编码SEQ ID Ν0:4、5、6、13或14任一条中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，和SEQ ID N0:l、2、3、ll或 12中任一条所示的核苷酸序列，及其变体和片段。还包含与本发明的核苷酸序列互补或与 本发明的序列杂交的核苷酸序列。
[0014] 本发明的组合物和方法用于产生具有杀虫剂抗性的生物体，具体是细菌和植物。 这些生物体和来源于其的组合物是农业用途所需的。本发明的组合物也用于产生具有杀虫 活性的经改变或改良的S-内毒素蛋白质，或用于检测产品或生物体中δ-内毒素蛋白或 核酸的存在。
[0015] 附图简述
[0016] 图 IA 和 IB 显示了 AXMI-113(SEQ ID N0:5)、AXMI-005(SEQ ID Ν0:4)和 AXMI-115(SEQ ID Ν0:6)的比对。左和右箭头标记了蛋白质C端1/3区域的边界。
[0017] 图2描绘了 ΑΧΜΙ-005和ΑΧΜΙ-115中被替换以产生新毒素的结构域。
[0018] 详细说明
[0019] 本发明涉及用于调控生物体，尤其是植物或植物细胞中昆虫抗性的组合物和方 法。该方法包括用编码本发明的δ-内毒素蛋白的核苷酸序列转化生物体。具体而言，本 发明的核苷酸序列可用于制备具有杀虫活性的植物和微生物。因而，提供了转化的细菌，植 物，植物细胞，植物组织和种子。组合物是苏云金杆菌的S-内毒素核酸和蛋白质。所述 序列发现用于构建表达载体，其用于随后转化入目的生物体内，作为探针用于分离其他的 S -内毒素基因，以及通过本领域已知的方法产生改变的杀虫蛋白，如结构域交换或DNA改 组。见例如表2和图2。所述蛋白质发现用于控制或杀死鳞翅目，鞘翅目，和其他昆虫种群， 以及用于产生具有杀虫活性的组合物。
[0020] " δ -内毒素"指来自苏云金杆菌的对一种或多种害虫具有毒性的毒素，或者与这 种蛋白质具有同源性的蛋白质，所述害虫包括但不限于，鳞翅目，双翅目和鞘翅目或线虫门 的成员。在一些情况下，已经从其他生物体包括双酶梭菌（Clostridium bifermentans)和 Paenibacilluspopilliae中分离出δ-内毒素蛋白。杀虫蛋白包含由这里公开的全长核 苷酸序列推导出来的氨基酸序列，以及由于使用可选择的下游起始位点或者由于产生具有 杀虫活性的较短蛋白质的加工所造成的比全长序列短的氨基酸序列。加工可发生在表达所 述蛋白质的生物体内，或者在摄取所述蛋白质后的害虫体内。
[0021] δ -内毒素包括被确认为cryl到cry43、cytl和cyt2的蛋白质，以及Cyt-类毒 素的蛋白质。目前有超过250种具有广泛特异性和毒性的已知δ-内毒素。更全面的名单 参见 Crickmore 等（1998) ,Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813,而定期的更新参见 WWW. biols. susx. ac. uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index 上的 Crickmore 等（2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature，'。
[0022] 这里提供了赋予杀虫活性的新的分离的核苷酸序列。还提供了 δ -内毒素蛋白的 氨基酸序列。由该基因的翻译而产生的蛋白质可使细胞控制或杀死摄取它的昆虫。
[0023] 分离的核酸分子及其变体和片段
[0024] 本发明的一个方面是关于含有编码δ-内毒素蛋白和多肽或其生物学活性部分 的核苷酸序列的分离的或重组核酸分子，以及足以用作杂交探针来鉴定编码S -内毒素的 核酸。如这里使用的，术语"核酸分子"意在包括DNA分子（例如，重组DNA，cDNA或基因组 DNA)和RNA分子（例如，mRNA)和利用核苷酸类似物产生的所述DNA或RNA的类似物。核 酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链DNA。
[0025] "分离的"或"纯化的"核酸分子或蛋白质或者其生物学活性部分，指当通过重组 技术生产时基本上无其他的细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上无化学前体或其 他的化学物质。优选的，"分离的"核酸中没有在该核酸来源的生物体的基因组DNA内天然 状态下处于该核酸两侧（即，位于所述核酸的5'和3'末端的序列）的序列（优选蛋白质 编码序列）。就本发明的目的而言，"分离的"当用于描述核酸分子时，并不包括分离的染色 体。例如，在多种实施方案中，分离的编码S-内毒素的核酸分子可包含天然存在于所述核 酸来源的细胞的基因组DNA中该核酸分子两侧的小于大约5kb，4kb，3kb，2kb，Ikb，0. 5kb或 〇. Ikb的核苷酸序列。基本上无细胞物质的δ-内毒素蛋白包括具有少于大约30^,20%, 10%或5% (干重）的非δ-内毒素蛋白（这里也称为"污染蛋白质"）的蛋白质制品。
[0026] 编码本发明蛋白质的核苷酸序列包括SEQ ID NO : 1，2, 3,11或12中所示的序列 及其变体，片段和互补序列。"互补"意指足以与给定核苷酸序列互补以致可与该给定核苷 酸序列杂交从而形成稳定的双螺旋的核苷酸序列。由该核苷酸序列编码的S-内毒素蛋白 的相应氨基酸序列在SEQ ID NO:4, 5, 6, 13或14中所示。
[0027] 作为编码δ-内毒素的这些核苷酸序列的片段的核酸分子也包括在本发明内。 "片段"指编码S-内毒素蛋白的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可编码δ-内 毒素蛋白的生物学活性部分，或者它可以是可以用作下面公开的方法中杂交探针或PCR引 物的片段。为编码S-内毒素核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少大约50, 100, 200, 3 00, 400, 500, 600, 700, 800, 900,1000, 1050,1100,1150, 1200,1250, 1300,1350, 1400,1450 ，1500,1550, 1600,1650, 1700,1750, 1800,1850,1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200， 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3 000, 3050, 3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350个连续核苷酸，或者至多编码这里公开的编 码S-内毒素的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数目，这取决于目的用途。"连续"核苷酸 指彼此紧密相邻的核苷酸残基。本发明的核苷酸序列的片段将编码保留S-内毒素蛋白 的生物学活性，并从而保持杀虫活性的蛋白质片段。"保留活性"指所述片段具有δ-内毒 素蛋白的杀虫活性的至少大约30%，至少大约50%，至少大约70%，80%，90%，95 %或更 高。用于测定杀虫活性的方法是本领域公知的。参见，例如，Czapla和Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485 !Andrews 等（1988)Biochem. J. 252:199-206 ;Marrone 等（1985) J·ofEconomicEntomology78:290-293;和美国专利
【发明者】K·S·桑普森, S·阿加瓦尔, C·坎贝尔, B·麦克纳尔蒂, D·J·汤姆索, N·卡罗兹, T·哈吉斯, M·G·科兹尔, N·B·达克, V·海因里希斯 申请人:阿森尼克斯公司