一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法
【专利摘要】本发明涉及一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，包括以下步骤：1，病人痰液的收集与保存；2，向痰液标本中加乙酸制备匀浆，搅拌浸提，匀浆离心，取上清液制备粗提物；3，向粗提物中加入DTT，混匀，获得混合物；4，将混合物上样于Pullulan凝胶柱，用乙酸常温下洗脱纯化，制备洗脱曲线，监测洗脱液收集，并提取物取样送质谱检测；5，超滤浓缩，真空冻干保存；6，对提取物进行蛋白质氨基酸测序，并琼脂糖弥散法检测提取物对大肠杆菌的抗菌活性。本发明的优点为制备简便，成本低，产量高，所得产品为高纯度、高抗微生物生物活性的天然α防御素，明显优于常用的化学合成及重组蛋白方法。
【专利说明】一种从病人痰液中提取小分子0防御素多肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从病人痰液中提取具有抗病原原发性免疫生物活性小分子肽0防御素的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]防御素是广泛存在于包括植物、无脊椎动物和脊椎动物在内的多种生物体的一种抗微生物肽。人类嗜中性粒细胞肽(?册)是人类最主要的抗微生物多肽，主要表达在中性粒细胞刺中，占细胞总蛋白的5%，细胞内嗜天青颗粒蛋白50%以上。順？是一种活性肽，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌具有广谱的抗菌作用，还具有抗病毒以及抗某些特异性的细胞毒性物质的作用。人体内已知的0-防御素有6种，分别为人类中性粒细胞防御素1-4和人类防御素5-6。人类中性粒细胞防御素1主要存在与中性粒细胞中，在单核细胞、自然杀伤细胞、I'淋巴细胞、8淋巴细胞和幼树突状细胞中也有分布。健康情况下，含量极低，一旦机体发生病原体感染后，体内浓度就会迅速升高，发挥抗病原微生物的作用。人类中性粒细胞0防御素1通过形成电荷依赖性膜通道，改变病原体膜的通透性，导致其胞内物质泄漏，胞体崩解，从而引起病原体死亡。另外，人类中性粒细胞防御素1还能中和病菌释放的致死毒素，保护机体细胞免于因为细菌毒素而引起的细胞凋亡。
[0003]人类中性粒细胞0防御素1发挥抗病毒作用则是通过与靶向作用于病毒包膜、糖蛋白等、抑制病毒与细胞膜的融合、对入侵病毒毒力的中和以及干扰病毒复制等多种机制实现的。人中性粒细胞防御素1能通过作用于靶细胞激活蛋白激酶￠:信号通路使病毒失活而抑制病毒的复制，最终发挥抗艾滋病的作用(0118118 11, 6^ &1.了 01111 1^68^, 2005，115:765-773)。对于甲型流感病毒(00881，6七 3,1.^ 1111111111101, 2009, 192:7878-7887) ? 单纯疱疫病毒￡, 61: &1.了1臟皿01，2006，177:8658-8666)等病原体，人中性粒细胞防御素1也证明有效。与任何其他抗生素不同的是，采取完全不同的杀菌机制，直击微生物壁，并导致微生物裂解。因此，
代表一类新的抗生素，其独特的杀菌机制，导致目标微生物无法产生耐药性。
[0004]荧光显微镜观察发现，防御素抗癌新药对病原体和癌细胞3期过程具有阻抑作用，这种阻抑作用对癌细胞和正常细胞有选择性，并且可诱导0嫩单链断裂，即这种阻抑作用只选择性地杀死癌细胞，而对正常细胞没有阻抑杀伤作用。研究成果表明，防御素抗癌新药疗效显著，生物技术制备工艺稳定，具有较高的开发价值。
[0005]目前市场上的0防御素主要依赖于化学合成或细菌表达重组蛋白，虽然具有天然多肽的氨基酸序列，但由于缺乏适当的细胞内表达翻译后的蛋白折叠与修饰，所以其活性均不及天然蛋白，而且生产成本高，产量低。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种新颖简便的从病人痰液中直接提取纯化天然小分子0防御素多肽的提取方法，以克服现有技术中的不足。
[0007]由于本方法是直接从废弃的病人痰液标本中提取天然中性粒细胞α防御素，并通过优化痰液匀浆制备及乙酸提取条件，建立监控洗脱曲线从而获得最佳提取方案。其方法简便直接、成本低廉、产量高，终产物为生物活性极高的天然蛋白。
[0008]鉴于其极高的生物活性与纯度，本发明的另一目的是为α防御素的抗体制备、检测试剂盒开发以及科学研究提供优质的免疫原，标准品与高效试剂。
[0009]本发明的最终目的是利用本方法提取出可开发为具有临床抗微生物效价的α防御素多肽。
[0010]本发明提供的一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，包括以下步骤:
[0011](I)收集病人的痰液，并用低温或超低温保存，直至提取应用；
[0012](2)向步骤(I)得到的痰液中加乙酸匀浆，4°C过夜搅拌浸提，离心，弃沉淀，取上清，制备粗提物；
[0013](3)向步骤⑵中得到的粗提物中加入DTT，混匀；
[0014](4)将步骤(3)得到的混合物上样于Pullulan P-1O凝胶柱，用乙酸洗脱，用自动收集器直接收集洗脱液到各收集管内，每管1mL ;经蛋白质检测仪监测在波长620nm的吸光度，并制作出洗脱曲线；根据洗脱曲线，选取从开始点和第一个高峰点的洗脱液样本进行蛋白分子质谱分析定性；
[0015](5)将步骤(4)收集到的洗脱液超滤浓缩，得到小分子多肽，真空冻干保存；
[0016](6)用步骤(5)得到的小分子多肽做蛋白氨基酸测序，并通过琼脂糖弥散方法检测其对大肠杆菌的抗菌活性。
[0017]在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0018]进一步，步骤(I)中，收集病人痰液过程时，一直用干冰保持痰液在冰水混合物状态，并于_80°C超低温冰箱保存。
[0019]采用上述进一步技术方案的有益效果为:干冰使得痰液样本一直保持低温，可以防止α防御素被痰液样本中的蛋白酶水解。
[0020]进一步，步骤⑵的具体步骤为:向步骤⑴得到的痰液中按体积比为1:1的比例加入体积分数为10%的乙酸冰水混合物，用干净无菌移液管和匀浆器搅拌混匀，接着4°C冰箱旋转过夜，再14000rpm离心30min,去沉淀，留上清。
[0021]采用上述进一步技术方案的有益效果为:加入的乙酸为弱酸，腐蚀性小，且提供的酸性环境能使得小分子α防御素多肽更加稳定并增大其溶解度。
[0022]进一步，步骤⑶中，向步骤⑵得到的粗提物中按体积比为1:10加入0.2X 1-3MDTT，混匀。
[0023]采用上述进一步技术方案的有益效果为:超低浓度的DTT —方面不会还原α防御素的二硫键，另一方面还会保护该二硫键，使其不被还原。
[0024]进一步，步骤(4)中，将步骤(3)得到的混合物上样于Pullulan Ρ_10凝胶柱，用乙酸冲洗凝胶柱，所述P-1O凝胶柱的尺寸为2.5cmX 120cm。
[0025]进一步，步骤(4)中，用于洗脱的乙酸体积分数为5%，洗脱过程于室温下，利用重力自然完成，并保持自然流速。
[0026]采用上述进一步技术方案的有益效果为:同步骤(I)相同，使得小分子α防御素多肽更加稳定。
[0027]进一步，步骤(4)中，选取的洗脱液样本经质谱分析确定，分子量为3442.57奶，等同于0防御素的分子量。
[0028]进一步，步骤(6)中，用超滤浓缩后得到的小分子多肽经琼脂糖弥散法检测，测得其对大肠杆菌具有很高的抗菌活性。
[0029]进一步，步骤￠)中，所述蛋白氨基酸测序的具体步骤为:将步骤(5)得到的有抑菌作用的洗脱液进行膜，采用'水解逐段分析法做氨基酸分析，得出的氨基酸序列为八
78，与小分子0防御素多肽的氨基酸序列完全契合，则证明提取出的小分子多肽即为小分子0防御素多肽。
[0030]进一步，所述八⑶纯化的浓缩胶为5% 1,3% (^807,20111111,分离胶为15% 1,6% 0、1007、211，并将大于3诎小于5诎的蛋白条带转印至？乂0？膜。
[0031]本发明的创新优点是:本发明提供的制备方法，采用废弃的病人废液为提取原料，成本低廉，纯度可达99%以上，可用作检测用标准品，且本发明制得的防御素属于天然产物，在功能活性上优于化学合成与重组蛋白产品，可作为优质科研试剂；用本发明提取的防御素作免疫原，可得到特异性与敏感度均优异的兔多克隆抗，应用此抗体组装成的酶联免疫吸附检测试剂盒，灵敏度和精确度有显著提高。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图匕为本发明实施例1中135#样本洗脱曲线图。
[0033]图为本发明实施例2中136#样本洗脱曲线图。
[0034]图化为本发明实施例3中137#样本洗脱曲线图。
[0035]图23为本发明实施例1中135#样本质谱分析图。
[0036]图26为本发明实施例2中136#样本质谱分析图。
[0037]图2。为本发明实施例3中137#样本质谱分析图。
[0038]图3为本发明琼脂糖扩散方法检测135#、136#、137#纯化洗脱液对大肠杆菌的抗菌作用图。大肠杆菌浓度:6父105(:1--匕0防御素剂量为八1:39，八2: 78，八3: 156，八4: 312，八5:625，81:1250，82:2500 (叩)。
【具体实施方式】
[0039]以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0040]实施例1:
[0041]一种从病人痰液中提取小分子0 -防御素多肽的方法，包括以下步骤:
[0042]步骤一:收集病人痰液15此，迅速放入干冰盒中低温保持痰液的冰水混合物状态，并保存于-801冰箱中直至提取应用，做好标记135#。
[0043]步骤二:向上一步15此痰液中加入15此10% (乂八)的乙酸溶液，用匀浆器匀浆51111110收集痰液匀浆约30111匕置41冰箱内旋转过夜。
[0044]步骤三:将上一步骤中经乙酸搅拌浸提所得到的痰液匀浆取出，于4 °C，14000rpm,离心30min,去沉淀，留上清作为粗提物。
[0045]步骤四:向上述上清粗提物中按体积比为1:10的比例加入0.2mM的DTT (取保存于-20°C冰箱中的IM DTT,临用前用纯水稀释5000倍，例如将IM DTT 15 μ L加入75mL纯水，混匀即可)，充分混匀。
[0046]步骤五:将步骤四所得的DTT-防御素粗提混合物上样于Pullulan(P-1O)凝胶柱(2.5cmX120cm)，用IL 5% (V/V)乙酸室温下利用重力进行洗脱，丢弃初始洗脱液约520mL后，开启自动收集器收集洗脱液，以15min/管速率共收集48管洗脱液。
[0047]步骤六:采用Bradford蛋白测定法，从收集到的48管洗脱液中，每管取出50 μ L样品到96孔板中，每孔分别加入50 μ L皮尔斯蛋白检测液，经蛋白质检测仪在620nm下读取每孔吸光度，并将数据登记在Excel上，制备洗脱曲线，见图la。
[0048]步骤七:依据蛋白检测所获得的洗脱曲线(图1a)，从开始点和第一个高峰点分别取10 μ L样品洗脱液到同一无菌试管(0.5mL)中，4°C保存作为质谱分析样品，从获得的质谱图谱(图2a)中可以清楚看出，该多肽分子量为3442.57kD，与α防御素分子量等同。
[0049]步骤八:将步骤五中收集的洗脱液共约480mL，进行超滤浓缩，得到48mL超滤浓缩液，分装后真空冻干保存。
[0050]步骤九:将步骤八中得到的超滤浓缩液进行Tricine-PAGE纯化，其中浓缩胶为5% T,3% C、80V、20min，分离胶为15% T,6% C、100V、2h，并对电泳凝胶进行分析，将大于3kD小于1kD的蛋白条带转印至PVDF膜,采用sanger水解逐段分析法做氨基酸分析。得到病人痰液中主要以α防御素为主，氨基酸序列为:Ala-Cys-Tyr-Cys-Arg-1le-Pro-Ala-Cys-1le-Ala-Gly-Glu-Arg-Arg-Tyr-Gly-Thr-Cys-1le-Tyr-Gln-Gly-Arg-Leu-Trp-Ala-Phe-Cys-CySo
[0051]步骤十:通过琼脂糖弥散方法检测步骤八中得到的超滤浓缩液对大肠杆菌的抗菌活性(见图 3 中 135#), α 防御素剂量分别为 Al:39，Α2:78，A3:156，Α4:312，Α5:625，B1: 1250, Β2:2500 (ng)。
[0052]实施例2:
[0053]一种从病人痰液中提取小分子α -防御素多肽的方法，包括以下步骤:
[0054]步骤一:收集病人痰液20mL，迅速放入干冰盒中低温保持痰液的冰水混合物状态，并保存于_80°C冰箱中直至提取应用，做好标记136#。
[0055]步骤二:向上一步20mL痰液中加入20mL 10% (V/V)的乙酸溶液，用匀浆器匀浆5min。收集痰液匀浆约40mL，置4°C冰箱内旋转过夜。
[0056]步骤三:将上一步骤中经乙酸搅拌浸提所得到的痰液匀浆取出，于4 °C，14000rpm,离心30min,去沉淀，留上清作为粗提物。
[0057]步骤四:向上述上清粗提物中按体积比为1:10的比例加入0.2mM的DTT (取保存于-20°C冰箱中的IM DTT,临用前用纯水稀释5000倍，例如将IM DTT 15 μ L加入75mL纯水，混匀即可)，充分混匀。
[0058]步骤五:将步骤四中所得的DTT-防御素粗提混合物上样于Pullulan(P-1O)凝胶柱(2.5CmX120Cm)，用IL 5% (V/V)乙酸室温下利用重力进行洗脱，丢弃初始洗脱液约500mL后，开启自动收集器收集洗脱液，以15min/管速率共收集55管洗脱液。
[0059]步骤六:采用8以壯01x1蛋白测定法，从收集到的55管洗脱液中，每管取出50 ^ I样品到96孔板中，每孔分别加入50^ I皮尔斯蛋白检测液，经蛋白质检测仪在620=0下读取每孔吸光度，并将数据登记在2x^1上，制备洗脱曲线，见图1匕
[0060]步骤七:依据蛋白检测所获得的洗脱曲线(图化)，从开始点和第一个高峰点分别取10^ [样品洗脱液到同一无菌试管(0.501)中。41保存作为质谱分析样品，从获得的质谱图谱(图24中可以清楚看出，该多肽分子量为:3442.57奶，与0防御素分子量等同。
[0061]步骤八:将步骤五中收集的洗脱液共约5001，进行超滤浓缩，得到50此超滤浓缩液，分装后真空冻干保存。
[0062]步骤九:将步骤八中得到的超滤浓缩液进行八⑶纯化，其中浓缩胶为5% 1,3%分离胶为15% 1,6% 0、1007、211，并对电泳凝胶进行分析，将大于3匕0小于101^0的蛋白条带转印至膜，采用水解逐段分析法做氨基酸分析。得到病人痰液中主要以?！防御素为主，氨基酸序列为
116—八 1&—617—6111—八！'8—八！'8—丁71'—617—丁匕!'—116—丁71'—6111—617—八！'8—160—丁！'口―八 1&—？
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[0063]步骤十:通过琼脂糖弥散方法检测步骤八中得到的超滤浓缩液对大肠杆菌的抗菌活性(见图3中136幻，0防御素剂量分别为八1:39，八2:78,43:156,44:312，45:625,81:1250，82:2500 (11?)。
[0064]实施例3
[0065]一种从病人痰液中提取小分子0 -防御素多肽的方法，包括以下步骤:
[0066]步骤一:收集病人痰液25此，迅速放入干冰盒中低温保持痰液的冰水混合物状态，并保存于-801冰箱中直至提取应用，做好标记137#。
[0067]步骤二:向上一步25此痰液中加入25此10% (乂八)的乙酸溶液，用匀浆器匀浆51111110收集痰液匀浆约50111匕置41冰箱内旋转过夜。
[0068]步骤三:将上一步骤中经乙酸搅拌浸提所得到的痰液匀浆取出，于41，1400011)111，离心30111111，去沉淀，留上清作为粗提物。
[0069]步骤四:向上述上清粗提物中按体积比为1:10的比例加入0.2禮的017 (取保存于-201冰箱中的11 011，临用前用纯水稀释5000倍，例如将11 011 15^1加入75此纯水，混匀即可)，充分混匀。
[0070]步骤五:将步骤四中所得的011-防御素粗提混合物上样于？凝胶柱(2.120(^),用5%議乙酸室温下利用重力进行洗脱，丢弃初始洗脱液约500此后，开启自动收集器收集洗脱液，以15-11/管速率共收集64管洗脱液。
[0071]步骤六:采用8以壯01x1蛋白测定法，从收集到的64管洗脱液中，每管取出50 ^ I样品到96孔板中，每孔分别加入50^ I皮尔斯蛋白检测液，经蛋白质检测仪在620=0下读取每孔吸光度，并将数据登记在2x^1上，制备洗脱曲线，见图化。
[0072]步骤七:依据蛋白检测所获得的洗脱曲线(图化)，从开始点和第一个高峰点分别取10 样品洗脱液到同一无菌试管(0.54)中，41保存作为质谱分析样品，从获得的质谱图谱(图20中可以清楚看出，该多肽分子量为:3442.57奶，与0防御素分子量等同。
[0073]步骤八:将步骤六收集的洗脱液共约5001，进行超滤浓缩，得到501超滤浓缩液，分装后真空冻干保存。
[0074]步骤九:将步骤八中得到的超滤浓缩液进行八⑶纯化，其中浓缩胶为5% 1,3%分离胶为15% 1,6% 0、1007、211，并对电泳凝胶进行分析，将大于3匕0小于101^0的蛋白条带转印至膜，采用水解逐段分析法做氨基酸分析。得到病人痰液中主要以?！防御素为主，氨基酸序列为
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[0075]步骤十:通过琼脂糖弥散方法检测步骤八中得到的超滤浓缩液对大肠杆菌的抗菌活性(见图3中137幻，0防御素剂量分别为八1:39，八2:78,43:156,44:312，45:625,81:1250，82:2500 (11?)。
[0076]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)收集病人的痰液，并保存在冰水混合物状态； (2)向步骤(I)得到的痰液中加乙酸匀浆，4°C过夜搅拌浸提，离心，弃沉淀，取上清，制备粗提物； (3)向步骤⑵中得到的粗提物中加入DTT，混匀； (4)将步骤(3)得到的混合物上样于PullulanP-1O凝胶柱，用乙酸洗脱，用自动收集器直接收集洗脱液到各收集管内，每管1mL ;经蛋白质检测仪监测在波长620nm的吸光度，并制作出洗脱曲线；根据洗脱曲线，从开始点和第一个高峰点收集到的洗脱液中取样进行蛋白分子质谱分析定性； (5)将步骤(4)收集的洗脱液超滤浓缩，得到小分子多肽，真空冻干保存； (6)用步骤(5)得到的小分子多肽做蛋白氨基酸测序，并用琼脂糖弥散法检测其对大肠杆菌的抗菌活性。
2.根据权利要求1所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步骤(I)中，收集病人痰液过程中，一直用干冰保持痰液在冰水混合物状态，并在_80°C下保存至纯化提取。
3.根据权利要求1所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步骤(2)的具体步骤为:向步骤(I)得到的痰液中按体积比为1:1的比例加入体积分数为10%的乙酸冰水混合物，用匀浆器制备痰液匀浆，搅拌混匀，并于4°C冰箱内旋转过夜，然后在4°C下，HOOOrpm离心30min，去沉淀，留上清为粗提物。
4.根据权利要求1所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步骤⑶中，向步骤⑵得到的粗提物中按1:10的体积比加入0.2mM DTT，混匀。
5.根据权利要求1所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步骤(4)中，将步骤(3)得到的混合物上样于Pullulan Ρ_10凝胶柱，用乙酸冲洗凝胶柱，所述Pullulan P-1O凝胶柱的尺寸为2.5cmX 120cm。
6.根据权利要求1所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步骤(4)中，用于洗脱的乙酸体积分数为5%，洗脱过程于室温下，利用重力自然完成。
7.根据权利要求1所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步骤(4)中，选取洗脱液样本，经质谱分析确定其分子量为3442.57kD，等同于α防御素多肽的分子量。
8.根据权利要求1所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步骤(6)中，用步骤(5)中超滤浓缩后得到的小分子多肽经琼脂糖弥散法检测，测得其对大肠杆菌具有抗菌活性。
9.根据权利要求1至8任一项所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述蛋白氨基酸测序的具体步骤为:将步骤(5)得到的有抑菌作用的洗脱液进行Tricine-PAGE纯化,蛋白条带转印至PVDF膜,采用sanger水解逐段分析法做氨基酸分析；若得出氨基酸序列为Ala-Cys-Tyr-Cys-Arg-1Ie-Pro-Ala-Cys-1Ie-AIa-Gly-Glu-Arg-Arg-Tyr-Gly-Thr-Cys-1le-Tyr-Gln-Gly-Arg-Leu-Trp-Ala-Phe-Cys-CyS，则证明提取出的小分子多肽即为α防御素。
10.根据权利要求9所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，所述Tricine-PAGE纯化的浓缩胶为5% T,3% C、80V、20min，分离胶为15% T,6% C、100V、2h，并将大于3kD小于5kD的蛋白条带转印至PVDF膜。
【文档编号】C07K1/16GK104327177SQ201410608665
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】韩兵, 王烁, 万君花 申请人:王烁