调控水稻花期的蛋白OsEFL1及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了调控水稻花期的蛋白OsEFL1及其编码基因与应用。本发明提供了抑制OsEFL1蛋白编码基因表达的物质在调控植物花期中的应用；所述OsEFL1蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。本发明利用反义核酸沉默水稻体内OsEFL1基因表达，得到不育水稻，从而证明OsEFL1基因可以调控水稻花期，创建不同生育期的育种材料，对水稻的遗传改良具有深远的实际应用意义。
【专利说明】调控水稻花期的蛋白OsEFU及其编码基因与应用
【技术领域】
[OOOU 本发明设及生物【技术领域】，尤其设及调控水稻花期的蛋白化EFL1及其编码基因 与应用。
【背景技术】
[0002] 抽穗期是决定水稻品种的地区和季节适应性的重要农艺性状，抽穗期遗传研究对 指导育种实践、品种改良和品种推广均具有重要的意义。抽穗期是水稻育种家在育种过程 中重点关注的农艺性状，该性状受主效基因位点和微效多基因位点的共同控制。因此，水稻 抽穗期的遗传方式既有质量性状遗传特性，也有数量性状遗传特点。同时，不同类型品种由 于遗传背景不同会表现出不同的遗传特性，而同一品种的抽穗期也会由于光温条件的不同 而表现各异。
[0003] 对于水稻抽穗期遗传的分子机制已有较深入的研究。目前的研究表明水稻的 抽穗由化ading date 3a 出d3a，主要的 short-day (SD)成花素]和 Flowering locus T1[RFT1，Hd3a 最近的同源物，主要的 long-day(LD)成花素]促进（Tamaki et al. , 2007 ; Komiya2009)。在该些成花素基因的上游基因中，Heading date l(Hdl)和Early heading date UEhdl)作为两个主要的开花信号集成者，接受来自其它基因的多种信号，如 OsGIGANTEA(OsGI), Rice IndeterminateKRIDl,也即 0sIDl/Ehd2), Early heading date 3 (Ehd3), OsMADSSO, OsMADSSl, Ghd7(for Grain number, plant height and heading date 7),和DT服（for days to heading on c虹omosome 8,也即化d8)，来调控成花素基因的 表达（Tsuj i et al. , 2011 ;Yano et al. , 2000 ;Doi et al. , 2004 ;化yama et al. , 2003 ; Wu et al. , 2008 ；Park et al. , 2008 ；Matsubara et al. , 2008 ；Matsubara et al. , 2011 ； Lee et al. , 2004 ;Kim et al. , 2007 ;Xue et al. , 2008 ;Wei et al. , 2010b ;Yan et al.，2010)。分析该些开花时间基因对于研究水稻的地区适应提出了许多借鉴。例如，有研 究表明，Hdl和化dl等位基因的组合对水稻的开花性状是十分重要的（Izawa，2007)。另外 化d7等位变异的序列分析表明该位点对于栽培稻在全球范围的适应性起重要作用狂ue et al.，2008)。然而，根据该些基因的等位基因对地区适应性的不同表型，栽培稻的开花时间 表型和大多数开花时间基因单倍型之间的关联需要深入研究。
[0004] 通过对水稻突变体库进行细致的筛选，获得一个花期提前的水稻突变体efll，研 究证实了突变体efll是由于水稻逆转座子Tosl7插入到L0C_0s02巧5080基因3' UTR区 域所致（TIGR:ht1:p://;rice. plan忧iology. msu. edu)，OsEFLl基因在突变体植株中的正常 mRNA表达量比对照显著降低，导致该基因编码的蛋白质表达明显降低。
【发明内容】
[0005] 本发明一个目的是提供抑制化E化1蛋白编码基因表达的物质的用途。
[0006] 本发明提供的抑制化E化1蛋白编码基因表达的物质在调控植物花期中的应用；
[0007] 所述化EFL1蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
[000引上述应用中，所述调控植物花期为提前植物花期或促进植物开花。
[0009] 上述应用中，所述调控植物花期为促进植物开花和/或抽穗。
[0010] 上述应用中，所述抑制化E化1编码基因表达的物质为DNA分子A，所述DNA分子A 的序列为序列表中序列1自5'末端第78-1074位核巧酸的反向互补序列或含有所述DM 分子A的重组载体或含有所述DM分子A的重组菌。
[001U 上述应用中，所述重组载体为将所述DNA分子A插入表达载体pCambial390-化i 中得到的重组载体；
[0012] 所述重组菌为将所述重组载体导入目的菌中得到的重组菌。
[0013] 上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0015] 本发明提供的方法，包括如下步骤：将抑制化E化1编码基因表达的物质导入目的 植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的开花时间早于所述目的植物；
[0016] 上述方法中，所述抑制化E化1编码基因表达的物质为DNA分子A，所述DNA分子A 的序列为序列表中序列1自5'末端第78-1074位核巧酸的反向互补序列；
[0017] 所述DNA分子A具体通过上述重组载体中导入目的植物中。
[0018] 上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。
[0019] 本发明第S个目的是提供一种DNA分子A。
[0020] 本发明提供的DNA分子A，为如下1)或2):
[0021] 1)序列为序列表中序列1自5'末端第78-1074位核巧酸的反向互补序列的DNA 分子；
[002引 2)在严格条件下与1)杂交且编码相同蛋白的DNA分子。
[002引 上述严格条件可为用0. 1XSS阳（或0. 1XSSC)，0. 1%SDS的溶液，在DNA或者RNA 杂交实验中65°C下杂交并洗膜。
[0024] 本发明的实验证明，本发明利用反义核酸沉默水稻体内化EFL1基因表达，得到不 育水稻，从而证明化EFL1基因可W调控水稻花期，创建不同生育期的育种材料，对水稻的 遗传改良具有深远的实际应用意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为野生型与突变体efll的植株与开花期比较图
[0026] 图la ;成熟期野生型植株与突变体efll植株形态比较：左为野生型，右为突变体 efll ;图化：不同光周期下野生型与突变体的开花时间比较。
[0027] 图2为化EFL1基因的结构和Tosl7插入位点分析及化EFL1在突变体efll中的 表达
[002引 图2a为化EFL1基因的结构和Tosl7插入位点分析，起始密码（ATG)和终止密码 (TGA)已经标出，黑色方框表示化EFL1基因的外显子，白色方框表示基因的内含子；两个倒 S角形分别表示efll中Tosl7插入的位置。P1，P2,表示位于两个外显子的引物；
[0029] 图化为是RT-PCR分析化E化1在野生型（WT)和突变体ef 11中的表达
[0030] 图3为互补试验图
[003U 图4为利用RNAi技术抑制野生型水稻内源化EFL1的表达可W提高水稻开花期
[003引 图5为干设载体0sEFLli-pCambial390-UBI的示意图 [003引 图6为干设株系中化E化1基因的定量表达分析
【具体实施方式】
[0034] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0035] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0036] 实施例1、化E化1基因突变体ef 11获得及表型
[0037] 一、ef 11突变体的获得
[003引 l、efll突变体的获得
[0039] 所用的水稻T-DNA插入突变体库由中国农业科学陆军生物技术研究所利用载 体炸X-E24. 2-15R构建而成（突变体库的创建方法已经公开发表论文，见等见Wan等， Activation tagging，an efficient tool for functional analysis of the rice genome。Plant Mol Biol. 2009Jan;69(l-2):69-80).挑选出 10000 份水稻转基因品种"日 本晴（为中国农业科学院生物技术所保持的梗稻测序品种，W下也称为野生型水稻）"的种 子，经浸种、催芽后播于秩田，35天后移栽至大田。每份材料种两行，每行10株，为一个家 系，种植地点为河北廊坊万庄中国农科院高新技术产业园内的试验田，按常规的水稻种植 方法进行田间管理。经过大田筛选共获到100个花期提前的突变株系。其中，一个原始编 号为E78的突变体表型为抽穗期显著提前（如图la),将突变体命名为efll。
[0040] 北京自然光照条件ND每年4月下旬播种，1个月后插秩，田间管理同大田生产。光 照培养箱控制的短日照条件（S化1化光，30°C /I化暗，25°C )，光照培养箱控制的长日照条 件（LD，1化光，30°C /I化暗，25°C )。光照培养箱用巧光灯照明（300 y mol m-2s-i)，湿度为 70%。图化显示各个材料的开花时间。
[0041] 2、分离efll突变体T-DNA插入位点的侧翼序列
[0042] 利用 PCR Wa化ing 方法（Siebe;rt 等，An improved PCR method for wa化ing in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Res, 1995, 23:1087-1088),分离了该个突变体的侧 翼序列。根据侧翼序列与水稻基因组的匹配位置确定插入位点，结果显示该侧翼序列位于 水稻的第2染色体上，插入位点对应于水稻基因组注释网站化ttp://;rice. plan忧iology. msu.e化/)上的一个基因命名为Os邸Ll，其核巧酸序列为序列表中序列1，编码区为序列表 中序列1自5'末端第292至921位脱氧核糖核巧酸，该基因编码的蛋白命名为化EFL1，该 蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。Tosl7插入到该基因的第3' -UTR区域（见图2a)。
[0043] PCR Wa化ing方法分离得到的efll突变体Tosl7插入位点的侧翼序列如序列3所 /J、- 〇
[0044] 3、0sEFLl基因在突变体的表达检测
[0045] 为了证实花期提前的突变表型是由于化EFL1基因内的Tosl7插入引起，对3个突 变体和野生型同时进行半定量分析，检测的具体步骤为；（1)在化EFL1基因Tosl7插入位 点上游设计一对基因组引物PU5' ATT TGG GAC CTC AGC GAA GC 3')和P2巧'TGA CTC AAG GGC TCT GTT GC 3')，提取突变体和野生型的RNA，进行反转录，结果表明化E化1基 因在突变体efll中表达量显著降低（图化）。
[0046] 二、OsEFLl基因的互补突变体验证功能
[0047] 根据预测基因的编码框，从起始密码子与终止密码子两侧设计引物：
[0048] 正向引物：5-GG GCC CCT CTC TTC TCG CCG TCC TAG，
[0049] 反向引物：5-TCT AGA CAG CAA ACA GAA CCC CTT CA ;下划线所示为 Smal 和甜al 酶切位点。
[0化0] 提取野生型水稻日本晴叶片RNA，反转录cDNA为模板，用上述正向引物和反向引 物进行PCR扩增，得到95化pPCR产物，即为化E化1基因。
[0化^ 将该PCR产物连入祀ASY-Tlsimple载体，经测序正确后，再用Smal和甜al酶 切，得到的酶切产物连入pCambia23A植物双元表达载体，构建成互补重组载体，命名为 化E化l-l-Pcambia2300A，经过测序，该重组载体为将序列表中序列1所示的化E化1基因插 入pCambia23A载体的Smal和甜al酶切位点，得到的载体。
[0化引 将化E化l-l-Pcambia2300A导入农杆菌EHA105菌株，转化水稻突变体efll，经过 一系列的组培过程，获得再生的转基因植株，即转化EFLl-l-Pcambia2300A水稻（回补），通 过鉴定转OsE化l-l-Pcambia2300A水稻（回补）。
[0化引 播种转化EFLl-l-Pcambia2300A水稻（回补）株系#1、#4、水稻突变体efll、野生 型水稻（WT)，培育，在播种第120天观察生长表型，统计开花时间。
[0化4] 结果如图3所示，图3a为种第120天观察生长表型，看出，与野生型水稻相比，水 稻突变体efll抽穗时间早，而回补得到的转化EFLl-l-Pcambia2300A水稻（回补）与野生 型表型无显著差异；
[005引图3b为开花时间统计，ND、SD、LD分别代表自然生长状态、短日照条件、长日照条 件。可W看出在自然生长状况下，互补系#1、#4开花期恢复到了野生型状况。在SD短日照 下，差异不显著。在LD条件下，开花期与在自然生长状况下相似。
[0056] 上述结果表明，化邸L1基因能够互补突变体efll的突变表型。
[0057] 实施例2、抑制化EFL1基因的物质在培育花期提前水稻中的应用
[0化引 1、DNA分子的制备
[0059] 根据OsE化1基因的CDS序列（序列1)设计引物，如下正向引物：5-ACT AGT CAG CAA ACA GAA CCC CTT CA，反向引物：5-GGA TCC CTC TCT TCT CGC CGT CCT AG。
[0060] 提取野生型日本晴水稻总RNA，用逆转录酶反转录合成cDNA作为模板，用上述正 向引物和反向引物进行PCR扩增，得到99化pPCR产物，与预期结果相符。将上述PCR产物与 PMD19-T Simple(Takara)连接，将连接产物转化大肠杆菌D册a感受态细胞，根据PMD19-T Simple载体上的駿卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。W该 重组质粒载体上的通用引物M13对其进行核巧酸序列测定，测序结果表明，上述PCR产物为 序列表中序列1自5 ^末端第78至1074位脱氧核糖核巧酸，为化EFL1基因的部分片段。
[0061] 2、化iquitin启动子的获得
[0062] W玉米基因组 DNA 为模板 5'-AAG CTT TCT AGT GCA GTG CAG CGT GAC-3' 和 5'-CTG CAG CCT CTA GTG CAG AAG TAA CACCA-3'为引物，进行 PCR 扩增，得到 2肺P 的 PCR 产物即为化iquitin启动子，核巧酸序列为序列表中序列4。
[006引 3、抑制化E化1基因表达的重组载体的获得
[0064] 将上述2得到的序列表中序列4所示的化iquitin启动子插入植物双元表达载体 pCambial390 (该载体可购自 Gambia, Queensland. Australia)的 Hindlll 和 PstI 位点间， 构成中间载体pCambial39〇-Ubi ;
[00化]再将上述1得到的序列表中序列1自5 ^末端第78-1074位核巧酸的反向互补片 段（OsE化li)替换中间载体pCambial390-化i的Spel和BamHI位点间的片段，得到重组载 体，命名为 OsE化li-pCambial390-UBI (图 5)。
[0066] 4、干扰化EFL1基因表达的转基因水稻的获得
[0067] 构建好的OsE化li-pCambial390-UBI重组载体电转入（电转化仪为 eppendo计公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明 书）农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105，转化后的菌株命名为 OsEFLli-pCambialSgO-UBI。
[0068] 将〇3邸1^1-口〔3111扣3139〇-册1转入水稻梗稻品种日本晴（4 0^^ Sequence of the Rice Genome(Oryza sativa L. ssp. japonica)Stephen A. Goff, et al. Science296, 92(2002)，W下也称为野生型水稻）种子诱导的愈伤组织中，得到再生株 系。具体如下：
[0069] 1)种子愈伤组织诱导如下；选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳（注 意保持胚完整），将脱谷壳米粒转到50mL无菌S角瓶一加适量无菌水洗一次一弃水，倒入 75%酒精适量，摇动揽拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）一弃酒精一加适量无菌水 洗一次一弃水一倒入适量2%化化0,不时摇动揽拌，共处理30分钟一弃化化0 -用无菌水 洗3次，每次停留1分钟一倒去无菌水，将种子从=角瓶转到带无菌滤纸的无菌培养皿中吸 干。诱导培养基；MS+2, 4-D 2mg/L+庶糖30g/L+3. 6g/L植物凝胶（P册.8)。
[0070] 2)农杆菌介导的转化
[0071] (1)挑选继代约7天的胚性愈伤组织作为转化受体材料。
[0072] (2)收集上述农杆菌重组菌体化EFLli-pCambial390-UBI，重悬于液体共培养培 养基（在YEP液体培养基的基础上添加终浓度为lOOmg/L AS (己酷了香酬），调P册.2得到 的液体培养基）中，28°C，200巧m震荡培养1-2小时；调整0D值至0. 2。
[0073] (3)将步骤（2)获得的胚性愈伤组织浸泡步骤2)获得的农杆菌菌液，然后进行菌 液浸泡，处理30min。
[0074] (4)将愈伤组织在无菌滤纸上吸干，转移到铺有一层灭菌滤纸的固体共培养培 养基（在MS基本培养基的基础上添加5mg/L 2,4-D、0. 4g/L CH(水解酢酪素）、0. Img/ L6-节氨基腺嚷岭化-BA)、10g/L葡萄糖、20mg/L As (己酷了香酬）和3.6g/L植物凝胶 (地^agel)，调PH至5. 2灭菌得到的固体培养基）上，19°C暗培养2-3天。
[007引 （5)将步骤（4)培养得到的愈伤组织转出，无菌水漂洗3-4次，再用含50mg/L Cef (头胞唾响霉素）的无菌水漂洗，然后将愈伤组织放到灭菌的滤纸上。
[0076] (6)将步骤（5)得到的用无菌滤纸吸干的愈伤组织转移到选择培养基（在MS基 本培养基的基础上添加5mg/L 2,4-D、0.4g/L CH (水解酢酪素）、250mg/L Cef (头胞唾响霉 素）、50mg/L HPT和3. 6g/L植物凝胶（phytagel)，调PH至5. 8灭菌得到的固体培养基） 上，25°C暗培养，每两周转至继代培养基上继代一次。
[0077] (7)经步骤（6)所述3次继代培养后，将生长旺盛的抗性愈伤组织转移到分化培养 基（在MS基本培养基的基础上，添加Img/L 6-节氨基腺嚷岭化-BA)、0. Ig/L CH(水解酢酪 素）、250mg/L Cef (头胞唾响霉素）、50mg/L HPT 和 3. 6g/L 植物凝胶（phytagel)，调 PH 至 5. 8灭菌得到的固体培养基）上，25°C、1化、2000LX光照培养，两周左右新鲜的愈伤组织上 开始有绿色芽点出现，每15天继代一次，两次继代后，长出小苗，转移到生根培养基（在MS 基本培养基基础上添加3g/L植物凝胶（phytagel)，调PH至5. 8灭菌得到的固体培养基） 进行生根培养。
[007引 （8)待生根培养长出完整小苗，将小苗转入到壮苗培养基（1/2MS基本培养基的添 加3g/L植物凝胶（phytagel)，调PH至5. 8灭菌得到的固体培养基）上培养获得到幼苗。
[0079] (9)将步骤（8)壮苗培养基上的幼苗，炼苗一周，在清水中将培养基漂洗干净，先 移栽到温室，再移栽到大田中得到转化EFLl-pCambial390-UBI TO代植株。共得到60株独 立转化苗。
[0080] 表1为所用培养基为MS基本培养基添加不同成分，具体如下：
[0081]
【权利要求】
1. 抑制OsEFLl蛋白编码基因表达的物质在调控植物花期中的应用； 所述OsEFLl蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于： 所述调控植物花期为提前植物花期或促进植物开花。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于： 所述调控植物花期为促进植物开花和/或抽穗。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于： 所述抑制OsEFLl编码基因表达的物质为DNA分子A，所述DNA分子A的序列为序列表 中序列1自5'末端第78-1074位核苷酸的反向互补序列或含有所述DNA分子A的重组载 体或含有所述DNA分子A的重组菌。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于： 所述重组载体为将所述DNA分子A插入表达载体pCambial390-Ubi中得到的重组载 体； 所述重组菌为将所述重组载体导入目的菌中得到的重组菌。
6. 根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于： 所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。
7. -种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将抑制OsEFLl编码基因表达的物质导 入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的开花和/或抽穗时间早于所述目的植 物。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述抑制OsEFLl编码基因表达的物质为 DNA分子A，所述DNA分子A的序列为序列表中序列1自5'末端第78-1074位核苷酸的反 向互补序列； 所述DNA分子A具体通过权利要求5中的所述重组载体中导入目的植物中。
9. 根据权利要求7-8中任一所述的应用，其特征在于： 所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为水稻。
10. 一种DNA分子A，为如下1)或2): 1) 序列为序列表中序列1自5'末端第78-1074位核苷酸的反向互补序列的DNA分子； 2) 在严格条件下与1)杂交且编码相同蛋白的DNA分子。
【文档编号】C07K14/415GK104447970SQ201410645279
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月11日 优先权日:2014年11月11日
【发明者】吴金霞, 孙学辉, 张治国, 路铁刚 申请人:中国农业科学院生物技术研究所