专利名称：器官病预防、治疗或改善剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预防、治疗或改善器官病的试剂，所述器官病是因在器官如肝、肾、心脏、肺、胰腺、血管和小肠中再灌注，局部缺血或血液流动障碍而引起的，本发明特别适于那些因器官移植和保存以及因移植后血液再灌注引起的器官病，和那些外科手术后引起的器官病。
近年来，器官移植已广泛用于外科治疗各种类型的器官机能不全。在器官移植中，当将器官从一个提供它的个体身上(下文中称之供体)摘除，并将它移植到另一个接受它的个体身上(下文中称之受体)时，该器官处于局部缺血状态，直到血液再灌注。在局部缺血状态下保存器官(下文称之保存)和移植后血液再灌注(下文称之再灌注)过程中引起的器官病是器官移植最困难的问题之一，它影响移植后器官的愈合和外科手术的效果。在这种情形下，需要有一种在器官移植中非常有用的预防、治疗或改善因保存或再灌注而引起的器官病的试剂。
例如，在肝切除术中，为了减少出血量而阻断肝的血液循环。在阻断的血液循环中，常常因如肝切除或肝转移这样的手术处理引起局部血流障碍。这种由血流障碍引起的器官病严重地影响术后的预合。因此，本领域需要有一种非常有用的术后器官病预防、治疗或改善剂。
尽管因保存、再灌注、局部缺血或血流障碍引起的器官病的发病机理尚未被完全阐明，但已确信，各种化学介质，如活性氧，胞质分裂素(Cytokine)、蛋白酶、花生酸酶(eicosanoid)和血小板激活因子(PAF)都与此相关。
例如，Surgery，102(5)，821-827，1987描述抗氧化的辅酶Q10在预防器官病的鼠肝移植实验中是有效的。
另外，Transplant，50(1)，14-20，1990描述了下列药物在预防器官病的鼠肝移植实验中都是有效的(1)钙拮抗剂尼索地平，(2)蛋白酶抑制剂二异丙基氟磷酸、苯甲磺酰基氟化物、胃酶抑素A和亮肽素的混合物，及(3)药物(1)和(2)的混合物。
更进一步，美国专利第5，002，965号描述了来源于植物中的银杏苦内酯A，B，C，M(ginkgolidie)(为含有20个碳原子的环状化合物)对预防移植器官病是有效的。
关于Surgery，102(5)，821-827，1987中所述的辅酶Q10的效果，一组供体鼠在外科手术前，按10mg/kg的量静脉给予辅酶，并将肝脏在局部缺血状态下放置60分钟，然后移植;另一组供体鼠不给药，使肝脏在局部缺血状态下保持60分钟，然后移植到受体鼠上(该受体小鼠在外科手术前已静脉给予同样量的辅酶)，以上两组均显示大约50%的一周存活率(与未处理的0%比较)然而，因为辅酶Q10是一种油状物质，所以在制成静脉给药的注射剂时受浓度的限制。因此，用增加辅酶Q10浓度或给药量的方法来改进外科手术后的存活率已是不适宜的了。
另外，将尼索地平，亮肽素和其他蛋白酶抑制的混合物，或尼索地平和Transplant，50(1)，14-20，1990中所述混合物的混合物加到供体保存液中，显示各组术后存活率均延长至约10-20天(与未处理组的约1-2天比较)然而，由微生物产生的亮肽素和胃酶抑素A及合成的化合物苯甲磺酰基氟化物都是未被确证的药物，并且，它们在临床应用中安全性是十分可疑的。尽管二异丙基氟磷酸在临床上作为胆碱能(拟副交感神经的)缩瞳药使用，但因它是非常有毒的，并且在移植中直接影响器官功能，所以是不适宜的。
美国专利第5，002，965号中所述的银杏苦内酯A，B，C，M(ginkgolidie)属于从植物中提取的一系列化合物。然而，它也是未被确证的药物，并且，它在临床应用中的安全性是十分可疑的。
在这种情形下，需要有一种预防、治疗或改善因保存、再灌注、局部缺血或血流障碍而引起的器官病的试剂，它是非常安全和非常有用的(在存活率、预防和治疗效果方面)因此，本发明人已在符合上述要求的化合物方面做了大量研究。结果发现，上述甘油衍生物能达到作为器官病预防、治疗和改善剂的理想目标。在以上发现的基础上已完成了本发明。因此，本发明的一个目的是提供一种试剂，它能预防、治疗或改善产生于局部缺血状态下器官保存期间的移植后血液再灌注的和外科手术引起血流障碍的器官病，并因此在临床是相当有用的。
本发明的甘油衍生物是一种在日本专利公开第131467/1990号中所述的化合物，它是一种用于预防和治疗蛛网膜下出血时的播散性血管内凝血(DIC)、休克、变态反应、急性胰腺炎和大脑抽搐的试剂并具有抗血小板激活因子(PAF)的作用。本发明人进一步的研究，导致一意想不到的发现，即甘油衍生物也具有器官病预防、治疗或改善活性，在此基础上，完成了本发明。
本发明的甘油衍生物用下面通式表示
且X代表可变成阴离子的原子或原子团。
此外，本发明通过给予器官病患者药理学有效剂量的以上定义的甘油衍生物或其药理学上可接受的盐，来提供一种预防、治疗或改善因再灌注，局部缺血或血流障碍而引起的器官病的方法。
优选地，该器官至少是肝、肾、心脏、肺、胰腺、血管和小肠中一个。该器官至少可以是肝、肾、心脏、肺、胰腺和小肠中的一个，且所述器官病是移植或术后移植。
优选的甘油衍生物是1-乙基-2-[N-(2-甲氧基)苯甲酰基-N-｛2-甲氧基-3-(4-十八烷基氨基甲酰氧基)吡啶子基羰基氧基丙氧基｝羰基]氨甲吡啶鎓氯化物(1-ethyl-2-[N-(2-methoxy)benzoyl-N-｛2-methoxy-3-(4-octadecylcar-bamoyloxy)piperidinocarbonyloxy-propoxy｝carbonyl]aminomethylpyridinumchloride)。
另外，本发明提出将上述定义的甘油衍生物或其药理学上可接受的盐用于制造一种药物，它能有效地预防、治疗、治愈或改善因再灌注、局部缺血或血流障碍引起的器官病;一种含有上述定义的甘油衍生物或其药理可接受的盐的药用试剂，它能预防、治疗或改善因再灌注、局部缺血或血流障碍引起的器官病;和一种含有上述定义的药理学有效量的甘油衍生物或其药理学上可接受的盐和药理学上可接受的载体的药物组合物。
本发明甘油衍生物的实例包括下列化合物(1)1-乙基-2-[N-(2-甲氧基)苯甲酰基-N-｛2-甲氧基-3-(4-十八烷基氨甲酰氧基)吡啶子基羰基氧基丙氧基｝羰基]氨甲吡啶鎓氯化物，(2)1-乙基-2-[N-｛3-(2-芴氨基)羰基氧基-2-甲氧基丙氧基｝羰基-N-(2-甲氧基)苯甲酰基]-氨甲吡啶鎓氯化物，(3)1-乙基-2-[N-(2-甲氧基)苯甲酰基-N-｛2-甲氧基-3-(4-十八烷酰基哌嗪基羰基)-氧化丙氧基｝羰基]氨甲吡啶鎓碘化物，(4)1-乙基-2-[N-｛3-(4-环己基甲基氨磺酰)苄基氨基甲酰氧基-2-甲氧丙氧基｝-羰基-N-(2-甲氧基)苯甲酰基]氨甲吡啶鎓氯化物，(5)1-乙基-2-[N-(2-甲氧基)苯甲酰基-N-｛2-甲氧基-3-(4-十八烷基氨磺酰)苄基氨基甲酰氧基丙氧基｝羰基]氨甲吡啶鎓氯化物，和(6)1-乙基-2-[N-(2-甲氧基)苯甲酰基-N-｛2-甲氧基-3-(3-十八烷基氨基甲酰氧基)丙基氨基甲酰氧基｝丙氧基羰基]氨甲吡啶鎓氯化物。
上述化合物优选的是，1-乙基-2-[N-(2-甲氧基)-苯甲酰基-N-｛2-甲氧基-3-(4-十八烷基氨基甲酰氧基)-哌啶子基羰基氧基丙氧基｝羰基]氨甲吡啶鎓氯化物。
本发明提供一种器官病预防、治疗或改善剂，它含有上述甘油衍生物或其药理学上可接受的盐作为活性成分。本发明药理学上可接受的盐取决于化学式所示上述甘油衍生物中X的种类。在化学结构中，X代表可转变成阴离子的一个原子或原子团，特别地，它代表季铵盐对应的离子，其例子包括氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、高氯酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对一甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐和氢氧化物形成的离子。尽管氯化物形成的离子是优选的、但这些离子都不受特别限制。
本发明甘油衍生化合物可按上述日本专利公开131467/1990中实施例2、11、12、13、14和15所述的方法生产。显示治疗组和未治疗组的AKBR值随时间推移而变化的曲线(数值以平均值±标准误差表示)。显示处理组和未处理组的动脉血乳酸水平值随时间推移而变化的曲线(数值以平均值±标准误差表示)。显示处理组和未处理组的血细胞比容值随时间推移而变化的曲线(数值以平均值±标准误差表示)。显示处理组和未处理组的血小板数值随时间推移而变化的曲线(数值以平均值±标准误差表示)。显示处理组和未处理组的白细胞数值随时间推移而变化的曲线(数值以平均值±标准误差表示)。显示处理组和未处理组的谷草转氨酶(GOT)值随时间推移而变化的曲线(数值以平均值±标准误差表示)。显示处理组和未处理组的谷丙转氨酶(GPT)值随时间推移而变化的曲线(数值以平均值±标准误差表示)。作为本发明甘油衍生物代表性实例的1-乙基-2-[N-(2-甲氧基)苯甲酰基-N-｛2-甲氧基-3-(4-十八烷基氨基甲酰氧基)哌啶子基羰基氧基丙氧基｝羰基]氨甲吡啶鎓氯化物[下文称“化合物(Ⅰ)”]，其急性毒性实验结果显示如下。通过静脉注射(溶媒生理盐水)给予一组5雄和5雌7到8周龄SLCSD鼠和一组5雄和5雌7到8周龄SLCICR小鼠来进行一次给药的毒性试骊。所得LD50值概括于下表中。1-乙基-2-[N-(2-甲氧基)苯甲酰基-N-｛2-甲氧基-3-(4-十八烷基氨基甲酰氧基)哌啶子基羰基氧基丙氧基｝-羰基]氨甲吡啶鎓氯化物[化合物(Ⅰ)]的急性毒性(LD50mg/kg) 上述LD50值至少约为临床静脉注射剂量的50倍大，从而表明具有相当高的安全性。
为了证明本发明的效果，下面就猪肝移植模型提出一实验例，以检查化合物(Ⅰ)作为预防或改善移植器官病代表性化合物的功能(实验方法)(1)实验设计用一个模型，其中所用各猪体重为30-40kg，摘除其肝脏并于低温保存8小时，然后进行同区(sympatric)肝移植。更具体地，将这些猪禁食24小时并随机分成两组。组1由9个供体和9个受体组成，将其用本发明上述化合物处理，在供体的外科手术中，将化合物(Ⅰ)加到灌注液和保护液中(1mg/l)。此外，将化合物(Ⅰ)连续静脉输入受体中(0.3mg/kg)并在外科手术时加到冲洗液中以洗掉每个移植肝内部的保护液(1mg/l)。
组2作为对照组未经本发明化合物处理，它由9个供体和9个受体组成，除不加入化合物(Ⅰ)外，用与组1相同的液体同样连续静给药。使用一种用简化的方法制备的Wisconsin大学(以下称“UW”)来灌注和保存移植肝。该液体是通过除去常用于肝保存的UW液中的羟乙基淀粉而获得的。
(2)供体的手术对每一个供体，术前给予氯胺酮(100mg/kg)，耳静脉插套管后开始给予生理盐水。静注氯胺酮(5mg/kg)和巴夫龙(0.2mg/kg)此后保护气道。在手术中，通过吸入3升氧、4升笑气和1.5%乙烷使供体保持麻醉。
将肝下的下方腔静脉剥离到肾静脉下方，结扎并切除胆总管，剥离并暴露门静脉和肝动脉。静脉注射肝素(10，000IU)，此后将肾下的腹侧主动脉插套管。结扎脾静脉，并经过肠系膜上静脉实施套管插入术。此后在隔膜处立即将主动脉横向夹紧(cross-clamp)，并开始用由简单方法制备的UW液体通过主动脉(500ml)和肠系膜上静脉(1500ml)灌注肝脏。解剖胆囊并用生理盐水冲洗。取出所得的肝，使之浸泡在UW液浴中。从下方腔静脉切除右肾上腺，切口(cuff)与门静脉和肝下的下方腔静脉打结。将移植的肝在4℃保存8小时。
(3)受体的手术每个受体猪也用上述供体外科手术时所述的相同的方法麻醉。将右颈动脉和右锁骨下静脉插套管，以便于监测血压和取血样以及便于静脉注射。切开腹部，分开并取出肝脏。在无肝(ahepatic)期间，通过插入门静脉和右颈外静脉的分流管强制分流来自门静脉的血。对肝上的下方腔静脉(5-0聚丙烯纺织纤维，连续缝合)，门静脉(袖口技术)，肝下的下方腔静脉(袖口技术)和肝动脉(7-0聚丙烯纺织纤维间断缝合)进行移植肝的头尾相接吻合术，以便由此重新建成一个肝脏。门静脉吻合术完成后，用来自门静脉的血再灌注移植的肝。
通过一胆汁外瘘管将胆管引流到体外。
门静脉吻合术前，用含葡萄糖(5%重量)，甘露醇(1.25%重量)和碳酸氢钠(0.21%重量)的乳酸林格溶液灌注移植的肝，由此除去保存液。保持冲洗液在30-37℃。热冲洗3分钟内，再灌注移植的肝。
在外科手术开始时的无肝期，通过耳静脉给予含葡萄糖(2.5%重量)的生理盐水(500ml)。对于组1，将化合物(Ⅰ)(0.3mg/kg)混合于盐水中。在无肝期间，将500-750ml含碳酸氢钠(0.21%重量)的生理盐水快速注入以防止血压降低。在移植肝再灌注前静脉给予碳酸氢钠(1.05g)和葡萄糖酸钙(0.1g)。在外科手术期间，不输血，给予总量为1.5-2.0升的输入液。外科手术后的最初12小时，输入0.5-1.0升5%葡萄糖溶液。根据需要用碳酸氢钠纠正代谢酸中毒。根本不使用免疫抑制剂。
(4)试验化合物化合物(Ⅰ)可溶于水和生理盐水中，使用前，将其溶解在生理盐水中制成化合物(Ⅰ)的溶液(1.5mg/ml)。
(5)试验项目测量在右颈动脉套管插入时(初值)和再灌注后1，2，4和12小时动脉血3-羟基丁酸盐和乙酰乙酸盐的水平，并计算它们的比值/(乙酰乙酸盐/3-羟丁酸盐，下文称为“AKBR”)用KetorexBit和Keto-340(二者都由SanwaKagakuKenkyusho有限公司生产)来完成AKBR的测量。测量动脉血中乳酸水平和血像(血细胞比容、血小板数和白细胞数)的初值和再灌注后2，4和12小时的值。
在相同的时间点，也测量GOT和GPT，并在外科手术后1，2和3天进一步测量。
(6)组织学状况于再灌注后1小时(腹部缝合前)采集楔状肝组织，为了光学显微镜观察，标本用10%甲醛固定并用苏木精一曙红或高碘酸席夫染剂染色。
(7)统计学分析试验数据用“平均值±标准误差”表示。用Student′st-检验(未配对的)比较组1和组2之间的平均差，通过X2检验评价再灌注后12小时或再晚些时候两组之间存活率的差别，当P值小于0.05时，断定二者之间有显著的差异。
(结果)各组术后的进程显示如下[表2]移植后的进程两组受体猪在外科手术后全部恢复，并于再灌注4小时内去掉插套管。然而，组2中(未处理组)9个猪中的4个于外科手术后4-12小时内死亡。相对地，组1中(处理组)，全部9个猪至少存活4天(见表1)。组1的12小时或更长时间的存活率为100%(9/9)，而组2为56%(5/9)。
AKBR是表示肝细胞性能的参数，它适宜于追踪随着时间的推移肝脏状况的变化情况，通常，(在正常情况下)它保持1.0或再高。然而，当肝休克或引起其它方面失调时，AKBR减小。当AKBR值减小到0.4或更小时，大多数肝脏坏死(见masanobuTamakuma，RyuOgawa和NaokiAikawa编辑，HideoYamamura监制和MedicalReview出版的“Rinsho-inotamenohando-bukku(Handbookforclinician)，ShockQ＆A”，141-149页)。
图1显示本实验的AKBR的变化情况。
再灌注后4小时期间，组1的AKBR仅略高于组2。然而，随后组1的AKBR快速增高并于12小时后恢复到正常状态水平，与组2的AKBR相比，具有显著高的值(P＜0.05)。
由此证明给予供体和受体化合物(Ⅰ)能预防或改善移植时因保存和再灌注引起的器管病。
图2显示动脉血中乳酸水平的变化情况。
再灌注后2小时时组1和组2的乳酸水平分别增到9.9±1.0和11.2±1.8mmol/l。然而，再灌注后4小时时，组1的乳酸水平快速降至6.2±1.1mmol/l(P＜0.05)，而组2的乳酸水平仅降至9.4±1.0mmol/l。再灌注的12小时时，两组的乳酸水平都恢复至初始水平。
图3、4和5分别显示两组血细胞比容、血小板数和白细胞数的变化情况。
再灌注后2小时时两组的血细胞比容值快速增加，随后逐渐降低(见图3)。
一方面，组1的血小板数从294.4±19.8(初值，×103/μl)略增至309.8±21.6(2小时后，×103/μl，并随后降至227.8±13.4(12小时后，×103/μl)。另一方面，组2的血小板数从300.1±27.5(初值，×103/μl)降低至240.0±33.4(2小时后，×103/μl)，此后进一步降低至172.6±45.1(12小时后，×103/μl)。尽管两组之间无显著差别，但用本发明化合物处理的组1的血小板数的降低是小的(见图4)。
一方面，组1的白细胞数从11.5±1.1(初值，×103/μl)略增至14.3±1.8(2小时后，×103/μl)，并随后进一步增加。另一方面，组2的白细胞数从15.3±1.8(初值，×103/μl)降低至8.3±0.9(2小时后，×103/μl)，并随后增加，灌注后2小时所显示的白细胞数组1明显高于组2(P＜0.01，见图5)。
图6和图7分别显示术后GOT和GPT的变化情况。
GOT和GPT是从受损害的肝细胞中渗出的酶。两组的GOT水平于再灌注后的24小时之内都有所增加。再灌注后4小时显示的GOT水平组2明显高于组1(组1712±97，组2461±59U/l，P＜0.05)。此后，组2的GOT水平仍高于组1(见图6)。
组2的GPT水平也高于组1，并且于再灌注后4小时看出明显的差异(组165±4U/l，组282±5U/l，P＜0.05)(见图7)。
下面进行另一组药理试验
(实验方法)(1)实验设计在8小时冷藏后进行常位的肝移植。禁食24小时后使用重35-40kg的Large-White猪。将猪随机分成两组。组1为PAF对抗剂处理组，它由9个供体和9个受体组成，将PAF对抗剂-化合物(Ⅰ)加到供体手术时用来外部冲洗和保存的溶液中(1mg/l)。也可作为一种输液给予受体(0.3mg/kg体重)和加到受体手术时用于移植物再灌注(RPF)前冲洗的溶液中(1mg/l)。组2为未处理组，它由9个供体和9个受体组成，除没有化合物(Ⅰ)外，它们接受同样的溶液或静脉输液。用于移植肝外部冲洗和保存的溶液是简化的UW溶液，其中，从用于肝保存的UW溶液的原始处方中除去羟乙基淀粉。据报道，羟乙基淀粉在UW溶液中不是必需成分。
(2)供体手术术前给予氯胺酮(10mg/kgi.m)后，将耳静脉插套管并开始灌注盐水。注射氯胺酮(5mg/kgi.v.)和巴夫龙(0.2mg/kgi.v)后，动物处于潜伏状态。通过吸入3升氧，4升一氧化氮和1.5%的乙烷维持麻醉。
解剖肝下的下方腔静脉至肾静脉下方后，结扎并切断胆总管，解剖并暴露出门静脉和肝动脉。静脉注射肝素(10，000IU)后，将肾下腹主动脉插套管。结扎脾静脉并经肠系膜上静脉插套管后，立即在隔膜处横向夹紧主动脉并通过主动脉(500ml)和肠系膜上静脉(1，500ml)用简化的UW溶液(4üA)进行肝脏的外部冲洗。切开胆囊用盐水冲洗。取出肝脏并浸泡在4üA的UW溶液中，从下方腔静脉切下右肾上腺，将切口与门静脉和肝下的下方腔静脉连接后，将肝移植物4üA下贮存8小时。
(3)受体手术受体猪按供体手术中所述的方法麻醉、右颈动脉和右锁骨下静脉插套管，分别用于监测血压、取血样和用于静脉灌注液体。剖腹后，分开并取出肝脏。在无肝(anhepatic)期间，门静脉的血通过门静脉和右颈外静脉之间的管子而被动分流。通过肝上的下方腔静脉(5-0聚丙烯纺织纤维，连续缝合)，门静脉(袖口技术)，肝下的下方腔静脉(袖口技术)，和肝动脉(7-0聚丙烯纺织纤维，间断缝合)，头尾相接吻合术，如此正位值入移植肝，门静脉吻合术完成后，用门静脉血再灌注移植的肝。通过外部瘘管将胆管引流。在门静脉吻合术前，为了去掉保存液，立即按前面所述方法，用500ml含葡萄糖(5g%)，甘露醇(1.25g%)和碳酸氢钠(0.21g%)的乳酸林格液冲洗移植肝。保持灌注液在30-37üA之间，因为已提出用湿热的缓冲液短暂地冲洗肝移植物可显著地改善肝的微循环，导致移植物存活的显著提高。在我们的手术中，由于在门静脉吻合术中使用了袖口技术，使温冲洗的RPF之间的持续时间小于3分钟。
手术中如下输入液体在手术开始和无肝期内，通过耳静脉输入500ml含葡萄糖(2.5g%)的生理盐水。组1中，将化合物(Ⅰ)(0.3mg/kg)混合于此溶液中，在无肝期，快速输入500-750ml含碳酸氢钠(0.12g%)的生理盐水以防止低血压，在再灌注(RPT)前，静脉注射碳酸氢钠(1.05g)和葡萄糖酸钙(0.1g)。在手术期间，不输入任何血，输入液体的总量为1.5-2升。术后的最初12小时输入0.5-1.0升5%葡萄糖溶液。需要时用碳酸氢钠纠正代谢酸中毒，未给予免疫抑制剂。
(4)试验化合物化合物(Ⅰ)(1-乙基-2-[N-(2-甲氧基)苯甲酰基-N-[(2R)-2-甲氧基-3-(4-十八烷基氨基甲酰氧基)哌啶子基羰基氧基丙氧基]羰基]氨甲吡啶鎓氯化物，分子量860.5)由Eisai有限公司(日本)以粉剂形式供给。它溶于水和生理盐水并于使用前用生理盐水配制成1.5mg/ml的溶液。据报道，IC50值为0.66nm的化合物(Ⅰ)抑制由PAF诱导的人血小板的聚集。
(5)参数在右颈动脉吻合术时前和RPF后1，2，4和12小时时测量AK-BR。AKBR为动脉血中乙酰乙酸盐与3-羟基丁酸盐的比值，如前所述，其值使用ketorex试剂盒(Sanwa化学制品，Nagoya日本)和Keto-340(一种为测定酮体而设计的半自动分光光度计。IharaElectricCo.， Kasugai，日本)进行酶促测定。RPF前和2，4，12小时后，测定动脉血中乳酸水平和分析血球计数(血细胞比容、血小板和白细胞数)，于同样时间和术后1(24小时)，2，和3天(POD)也测定GOT和GPT。
(6)组织学(观察)所见RPF后1小时(腹部闭合前)，通过楔状切除法取出肝组织用于组织学检查。为了光学显微镜观察，标本用10%甲醛固定并用苏木精-曙红(HE)染色，电子显微镜则用高碘酸席夫(PAS)染色。
(7)统计学分析数值用均值±标准误差(SEM)表示，用Student′st-测验比较组1和组2之间平均值的差异。用X2测验分析RPF后两组之间超过12小时存活的差异，P值小于0.05则认为有显著性差异(结果)两组中所有的受体猪都从手术中恢复并能于RPF后4小时内除管。然而，在4-12小时之间组2(未处理的)9个猪中的4个死掉。相对地，组1(处理的)的9个猪存活都超过4天(表1)。甚至组2中，能从急性危急期恢复过来的剩余的猪，除一个猪在术后第2天(POD)死于出血性胃溃疡外，存活超过6天。组1超过12小时的存活率为100%(9/9)而组2为56%(5/9)(P＜0.05)。相应地，比较了组1中的9个和组2中的5个存活猪之间12小时后下列参数的差异。
图1显示AKBR的变化。RPF后4小时，尽管不明显，但组1的AKBR显示高于组2的趋势。以后，在12小时时，组1的AKBR快速增至1.54±0.15并且它明显高于组2(0.95±0.09，P＜0.05)。
图2显示动脉血中乳酸水平的变化。在再灌注后2小时，组1和组2的乳酸水平分别增至9.9±1.0和11.2±1.8mmol/L，然而，在4小时时，与组2降至9.4±1.0mmol/L相比，组1的乳酸水平快速降至6.2±1.1mmol/L。在12小时时，两组的乳酸水平都恢复至初始水平。
图3，4和5分别显示血细胞比容，血小板数和白细胞数的变化。在图3中，两组的血细胞比容值在RPF后2小时明显增加，然后逐渐降低。在图4中，一方面组2的血小板数在2小时时，从300.1±21.6(如前)降至240.0±33.4(u103/ml)，并随后进一步降低。另一方面，尽管其随后降低且与组2之间无显著性差异，但组1的血小板数在2小时时略有增加，图5表明，组2的白细胞数在2小时时从15.3±1.8(如前)降至8.3±0.9(ü103/ml)。对比之下，组1在2小时略增至14.3±1.8(ü103/ml)并且它与组2有更显著的差异(P＜0.01)。
此后，两组的白细胞数都增加。
图6显示术后GOT的变化。RPF后24小时内，两组的GOT连续增加。在4小时时，组2的GOT明显高于组1(712±97v.s.461±59U/L，P＜0.05)。之后尽管不显著，但组2的GOT保持高于组1。图7中显示，在4小时时，术后GPT增加方面具有组2高于组1的趋势，并有显著性差异(组1，65±4U/Lv.s.组2，82±5U/L，P＜0.05)。
通过光学显微镜(HE染色)组织学观察揭示在组2猪的再灌注肝中，有一些不规则或区域状肝细胞坏死、沉积于窦状隙的严重的炎性细胞(中性白细胞)渗出物和一些肝细胞的微囊状改变，而这些现象在组1猪的再灌注肝中很少看见。PAS染色观察显示组2肝细胞糖原含量少于组1。
结果见表4。
表4肝移植后存活情况存活时间死亡原因4POD气泡栓塞组1(n=9)5POD未知(处理组)6POD肠梗阻6POD出血性胃溃疡7POD出血性胃溃疡>7POD 处死#>7POD处死>7POD处死>7POD处死组2(n=9) <12小时##代谢酸中毒(未处理组) <12小时##代谢酸中毒<12小时##代谢酸中毒
<12小时##代谢酸中毒2POD出血性胃溃疡6POD出血性胃溃疡>7POD处死>7POD处死>7POD处死＃;当猪存活超过7POD时，将其处死。
＃;＃组1超过12小时的存活率为100%(9/9)，组2为56%(5/9)(P＜0.05)。
通过使用光学显微镜进行组织学研究显示组2中的各再灌注肝都有一些点状或区域状肝细胞坏死，肝窦状隙炎性细胞(中性白细胞)的成团和郁积以及在某些肝细胞中发现空泡变性。这些情况在组1中很少发现。染色结果发现，组2肝细胞的糖原含量小于组1。
由上述毒性试验结果和论证实例效果可见，本发明化合物具有极好的预防或治疗在移植中因保存、再灌注和血流障碍引起的器官病的活性，并因此在临床上作为器官病预防、治疗或改善剂是有益的。
本发明化合物作为器官移植病的治疗或改善剂的使用中，尽管给药途径和剂量依赖于病人的状况、严重性、移植器官的种类、年龄和心、肝和肾的功能，且它们并不受特别限制，但通常每天通过静脉、口服、鼻腔、作为一个栓剂或经皮给予成年受体的量为0.1-100mg，优选0.3-30mg，还优选0.5-20mg，更优选1-10mg。另外，通常按10mg/ml，优选1mg/ml的量，将其加入每一份用于供体器官灌注和保存的液体中。
按照习惯的步骤生产注射用药物制剂，其中，根据需要，将常规的药物载体如pH调节剂、缓冲剂、稳定剂和溶解剂加到主剂中。
下面将叙述用于生产注射用药物制剂的工作实例，该制剂包含作为本发明代表性化合物的活性成分化合物(Ⅰ)，该工作实例不应该解释为本发明的限定实例。实施例1注射用药物制剂，其中包含1-乙基-2-[N-(2-甲氧基)苯甲酰基-N-｛2-甲氧基-3-(4-十八烷基氨基甲酰氧基)哌啶子基羰基氧基丙氧基｝羰基]氨甲吡啶鎓氯化合物。
将下列组分溶解在注射用蒸馏水或生理盐水中，用枸橼酸调节pH。将混合物过滤细菌，并冷冻干燥，由此得到注射用药物制剂。1小瓶组合物(单位:mg)化合物(I)1.0甘露醇1.0枸橼酸适量
权利要求
1.一种用于预防、治疗、治愈或改善因再灌注、局部缺血或血流障碍而引起的器官病的方法，该方法是给予器官病患者药理学有效剂量的具有结构式(Ⅰ)的甘油衍生物或其药理学可接受的盐 其中R为选自具有化学式(2)-(7)的基团 且X为原子或原子团的阴离子基。
2.权利要求1的方法，其中，器官为至少选自肝、肾、心脏、肺、胰腺、血管和小肠中的一个。
3.权利要求1的方法，其中，器官为至少选自肝、肾、心脏、肺、胰腺和小肠中的一个，而器官病是移植或术后移植。
4.权利要求1的方法，其中，甘油衍生物为1-乙基-2-[N-(2-甲氧基)苯甲酰基-N-｛2-甲氧基-3-(4-十八烷基氨基甲酰氧基)哌啶子基羰基氧基丙氧基｝羰基]氨甲吡啶鎓氯化物。
5.将权利要求1中所定义的甘油衍生物或其药理学可接受的盐用于生产一种对预防、治疗、治愈或改善因再灌注、局部缺血或血流障碍而引起的器官病有效的药物。
6.一种含有权利要求1中所定义的甘油衍生物或其药理学可接受的盐用于预防、治疗、治愈或改善因再灌注、局部缺血或血流障碍引起的器官病的药物。
7.一种包含药理学有效量的权利要求1中定义的甘油衍生物或其药理学可接受的盐和药理学可接受的载体的药物组合物。
全文摘要
提供一种用于预防、治疗、治愈或改善因器官如肝、肾、心脏、胰腺、血管和小肠的再灌注、局部缺血或血液障碍而引起的器官病的试剂，特别是那些因器官的移植和保存和因移植后血液再灌注引起的器官病和那些外科手术后引起的器官病。一种用于预防、治疗或改善因器官如肝、肾、心脏、肺、胰腺、血管或小肠的再灌注、局部缺血或血流障碍而引起的器官病的试剂，它包括作为活性成分的上列通式所示的甘油衍生物或其药理学可接受的盐。
文档编号C07D401/12GK1112920SQ95102298
公开日1995年12月6日 申请日期1995年2月22日 优先权日1994年2月22日
发明者高田泰次 申请人:卫材株式会社