专利名称：免疫调节剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种为白介素10(IL-10)激动剂的物质的药物用途，具体地说涉及本发明的物质在制备用于预防和/或治疗疾病的药物组合物中用途，其中发病机理涉及免疫抑制介体(mediator)尤其是细胞因子的产生减少和/或功能下降，和/或涉及特定的免疫炎症介导因素，尤其是细胞因子的产生增加和/或功能增强。具体地说，本发明涉及本发明的物质在用于制备预防和/或治疗如下疾病药物组合物中的应用自身免疫疾病(I型糖尿病；胃肠道炎症疾病，风湿性关节炎)，痛风性(urica)关节炎(痛风)，皮肤变态反应；皮肤、肺和呼吸道变态反应(包含支气管哮喘)；由缺氧/局部缺血所造成的组织损伤(梗死，再灌注(reperfusion))；动脉粥样硬化；牛皮癣；肉芽肿病；慢性髓性白血病；急性髓性白血病；癌症；移植物抗宿主反应和移植物排斥相关疾病；肺纤维化；肝脏纤维化；肺慢性非感染性炎症；肾小球性肾炎；早产(pre-term Labour)；牙周炎；由病毒感染引起的炎症反应，骨质疏松症，败血性休克和/或用于制备一种避孕药。
背景技术：
最近二十年的研究表明炎症反应的起始，调控和结束以及哺乳动物组织的生长和分化的调控都是处在一组通常称为细胞因子的特殊的信号多肽的严谨调控之下的。细胞因子是由有核细胞产生的并且可在细胞之间传递调控信号的多肽，因此在组织的相同的或不同的细胞类型之间形成了一个通信网。细胞因子是特别有效的介体并且可在低致10-15M的浓度下都有活性。细胞因子还是细胞免疫反应进展的关键因子，它本身形成了对由感染，变态反应，哮喘，移植物抗宿主反应和自身免疫疾病引起的炎病的临床治疗的基础。变态反应和自身免疫疾病一般解释为免疫系统尤其是T淋巴细胞介导的免疫性不正常，但一般来说这些疾病的发病机理并不清楚。体外研究，动物实验和临床实验研究表明细胞因子在涉及自身免疫疾病，变态反应，局部缺血，再灌注损伤，哮喘，感染的炎症反应中起到重要的病理生理学作用。并且对癌症的发育，动脉粥样硬化，妊娠和胚胎发育，骨稳态是重要的。细胞因子可能与下面将要详细描述的其它的免疫炎症和增殖疾病。
所述疾病通常是慢性的并且治疗是治标不治本的；即针对所述疾病的所开处方中的绝大多数药物仅仅减缓症状，通常不具备治疗效果。其它的治疗是所谓的替代治疗，其中包括在患者的生活中长期供给某些如激素的由于患者内部产生减少/不足而需要的物质。所说的治疗通常是不令人满意的、产生了不需要的而且通常是很严重的副作用，并且仅仅是延迟而不是防止了疾病的发展。因此，极需要改进的治疗方法和改进的药物组合物。
白介素-10(IL-10)是最近描述的在小鼠和人组织中部已鉴定的天然内源的免疫抑制细胞因子。小鼠白介素-10(mIL-10)最初被描述为一个由TH2辅助T细胞克隆释放的细胞因子合成抑制因子，但也对各种淋巴细胞亚系具有增殖效果，包含对小鼠CD4-8+脾T细胞的克隆效率的增强作用(4)。人白介素10最近已被测序并被揭示在DNA序列水平以及氨基酸水平与mIL-10具有很高的同源性。而且，豚鼠IL10最近已被测序并发现与人IL10在DNA序列水平以及氨基酸水平见有很高的同源性(88)，还可参见图2。还有，hIL-10同Epstein-Barr病毒基因组的一个可读框BCRF1有很高的同源性，并且病毒性IL-10的确有一些活性与hIL-10相似，参看图1(5)。
人IL-10由激活的T细胞克隆和不死的B细胞产生，除具有细胞因子合成抑制因子的活性(CSIF)，抑制因子一些促炎症细胞因子和集落刺激因子的产生外，它还抑制单核细胞天然白介素-1受体拮抗剂蛋白/肽(IRAP)的产生，从而间接抑制了IL-1的活性。IL-10还下调单核细胞对其自身的产生，并抑制II型MHC的表达(12)。而且，IL-10减少了当用单核细胞作为抗原呈递细胞时，人T细胞和CD4+T细胞克隆抗原特异性的增殖。在小鼠中的体内实验表明，利什曼原虫的感染的出现依赖来自应答CD4+T淋巴细胞中细胞因子的类型(13)。在抗利什曼原虫感染的C57BL/6小鼠中，来自导管(draining)淋巴结的CD4+T细胞表现为IFN-γ和IL-2细胞因子的上调，而敏感的BALB/C小鼠在其导管淋巴结中含释放IL-4和IL-10的CD4+应答T细胞，它可证实与疾病的进展相关(13)。因此，IL-10在可体内和体外的免疫反应中表现出很强的调节作用。而且IL-10强烈影响化学激活(Chemokine)生物学，因为人白介素10是对CD8+T细胞特异的趋化因子，尽管IL-10抑制CD4+，而不是CD8+，T细胞由于应答T细胞趋化细胞因子，而迁移的能力(14)。IL-10还抑制其它化学因子MCP-1/MCAF和RANTES的趋化效应(75)。由于IL-10是一个单核细胞巨噬细胞功能的去活化因子(deactivator)和Th1活性的抑制因子，含全部或部分IL-10类似活性的药物可对以细胞因子产生和/或活性不平衡为特征的疾病具有治疗效果。
在例如WO93/02693和WO94/04180中已建议制备含hIL-10或VIL-10的药物组合物，并已公开了将hIL-10或rIL-10用于制备治疗如败血性或毒性休克，风湿性关节炎，移植物抗宿主疾病，组织排斥，糖尿病、自身免疫病，白血病和癌症的各种疾病的药物组合物。而且，在例如EP405980和WO94/06473中已公开了例如当IL-10特异结合的抗体的IL-10的拮抗剂，并期望这类抗体能用于对HIV感染患者的治疗。
发明概述根据本发明，发现了人白介素10之外的具有的一种或多种特征的一种物质a)诱导对人单核细胞自发的IL-8的产生的抑制，b)诱导对人外周血单核细胞(PBMC)IL-Iβ诱导的IL-8的产生的抑制，c)诱导人单核细胞白介素-1多体拮抗剂蛋白(IRAP)的产生，d)诱导人CD8+淋巴细胞体外的趋化迁移，e)脱敏人CD8+T细胞导致其对rhIL-10的非应答性，f)抑制人CD4+T淋巴细胞对IL-8的趋化应答，g)抑制人单核细胞对MCAF/MCP-1的趋化应答，h)不同于人IL-10，不抑制人单核细胞II型MHC分子的表达，i)诱导培养的正常人CD4+T细胞IL-4的产生，j)减少人混合白细胞反应中TNFα的产生，这样一种多肽，以及其衍生物可被用于预防和/或治疗一些类型的炎症过程，特别是与免疫和/或激素系统相关的类型；其中该多肽包含Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn的氨基酸序列或其类似物或所述序列的变异性(一种同hIL-10序列同源的九肽，称为IT9302)。期望(正如下文对免疫机制所详细描述的)作用机制是通过对免疫系统介体作用的干扰，特别是如单核因子，淋巴因子，化学因子和单核因子爱体拮抗剂等细胞因子，即本发明的物质干扰/抑制特定细胞因子的产生和/或作用，由此抑制了导致组织损伤的病理过程，以及本发明的物质诱导天然单核因子受体拮抗剂的产生，并由此干扰/抑制特定细胞因子的作用，因此抑制导致组织损伤的病理过程。
因此本发明的一个重要实施方案涉及包含本发明的一种物质和为其活性组份的药物组合物。本发明的其它实施方案是一种能中和上述a)到g)所提到一种或多种活性的物质，例如一种抗体或包含该物质的药物组合物。
另一方面，本发明涉及本发明的物质在制备用于基本抑制一种与细胞因子相关的生物作用的药物组合物中的应用，即将本发明的物质用作一种IL-1受体拮抗剂蛋白/肽，淋巴因子，单核因子，白介素，干扰素，化学因子或集落刺激因子。另一方面涉及本发明的物质如制备用于预防或治疗与细胞因子系统即IL-1受体拮抗剂蛋白/肽，淋巴因子，单核因子白介素，干扰素，化学因子或集落刺激因子系统的失调相关的疾病的药物组合物中的应用。在另一方面，本发明还涉及一种治疗与人细胞因子系统失调相关的疾病的方法，其中该方法包括给受试验者施用有效量的本发明的物质。
细胞免疫系统在例如感染，炎症和肿瘤疾病的疾病的发育中起作用。免疫活性细胞及其产物在炎症疾病的起始，发展和可能的慢性特征的发展可起到重要作用。这些疾病通常发病机理不清楚，并包括例如糖尿病，风湿性关节炎，胃肠道和皮肤炎疾病等常见病。除了这些例子之外，细胞介导的免疫或促炎症介体，也可引起许多其它的炎症和增殖疾病(参见表2)。
表2巨噬细胞/T淋巴细胞介导的免疫反应被认为在其发病机理中重要的一些疾病皮肤病牛皮癣特应性皮炎接触性皮炎皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)白细胞增多并发异型单核细胞综合症寻常天疱疮大疱天疱疮结节(nodosum)红斑硬皮病自身免疫(包含风湿性)疾病眼色素层炎生殖器溃疡肉样瘤泪腺诞腺干燥病风湿性关节炎青少年关节炎非淋病性关节炎、结膜炎、尿道炎痛风骨关节炎系统性红斑狼疮多肌炎心肌病原发性胆汁性肝硬变节段性回肠炎溃疡性结肠炎多发性硬化和其它脱髓鞘疾病再生障碍性贫血特发性血小板减小性紫癜多发性骨髓瘤和B细胞淋巴留垂体性全垂体机能减退突眼性甲状腺肿和格雷夫斯眼病亚急性甲状腺炎和慢性甲状腺炎慢性肾上腺皮质功能减退症胰岛素依赖的糖尿病(I型)其它疾病各种血管的临床综合症(例如多动脉结节，韦氏肉芽肿，巨细胞性动脉炎发烧，不适)厌食(例如在急性和慢性炎症和感染性疾病中)扩散性血管内凝血(DIC)动脉硬化(动脉粥样硬化)休克(例如在格兰氏阴性脓毒症中)恶病质(例如在癌症，慢性感染和慢性炎症疾病中)移植排拆和移植物抗宿主疾病细胞因子T淋巴细胞协调细胞介导的免疫反应，T细胞的细胞因子产物(淋巴因子)启始和控制免疫应答(1，2)。由抗原呈递细胞产生的淋巴细胞激活介体(淋巴因子)属于一组称为细胞因子的多肽。细胞因子是在生理和病理条件下细胞-细胞间通讯的递质，并且可以作为激素提供免疫系统和其它组织和器官之间的信号。细胞因子还可由免疫系统之外的细胞产生，并且通常认为所有的有核细胞都能产生一种或几种细胞因子。因此，例如角化细胞和成纤维细胞是细胞因子的潜在的产生者并且在该系统中细胞因子可以作为不依赖于免疫系统的自分泌或旁分泌激素(3)。白介素-10小鼠白介素-10(mIL-10)最初被描述为由TH2辅助T细胞克隆释放的一种细胞因子合成抑制因子(CSIF)，它还有对各种亚系的淋巴细胞的增殖效应，包括对小鼠脾CD4-8+T细胞克隆效率的增强效应。人白介素-10(hIL-10)最近已被描述(5)并且与Epstein-Barr病毒基因组的一个可读框，BCRF1具有高度的同源性，并且病毒IL-10并不表现出一些当hIL-10相似的活性。在下文中，将概括IL-10的生物化学，生物学，生理学和可能的病理生理学作用。IL-10的结构小鼠(mIL-10)和hIL-10在贯穿其整个长度上在其一级结构上其就高度的核苷酸序列同源性(80％)(4，5)。唯一明显的不同是在hIL-10cDNA克隆的31非翻译区中人Alu重复序列单元的插入。mIL-10和hIL-10cDNA编码非常相似的178个氨基酸的可读框(ORF)，包括亲水先导序列并相应于73％的氨基酸同源性。mIL-10对小鼠细胞有活性，但并不明显地与人细胞起交叉反应hIL-10是一个18KDa的缺乏可检测的糖类的多肽，但mIL-10在靠近其N末端的一个位点被N-糖基化，其中该位点在hIL-10中是缺失的。mIL-10和重组hIL-10(rhIL-10)二者都以非共价的同源二聚体表达。mIL-10或hIL-10单体的生物活性程度如何尚未确定。含至少N末端8个氨基酸和(末端21个氨基酸“标签”多肽的mIL-10和hIL-10根据首次对hIL-10测序的Moore等人的公开不显现可检测的活性减少(b)。全长IL-10的标签C和N末端并不一定引起功能改变，因为标签是偶然的或随机的。如在下文中将要详细描述的高级目的可能氨基酸的取代也可解释为什么标签不能显示功能丧失。重组mIL-10和hIL-10已在CDST细胞，N-鼠骨髓瘤细胞，中国仓鼠卵巢细胞，一种杆状病毒表达系统，和大肠杆菌中表达。这些IL-10蛋白的生物活性至今未能辨别。
mIL-10基因包含5个线性排列在约5.1kb的DNA上的外显子。基因组克隆本身编码一个可表达的mIL-10蛋白。mIL-10和hIL-10基因位于小鼠和人染色体1上(6，7)。
mIL-10和hIL-10表现出与EPstein-Barr病毒基组中的一个可读框，BCRF1的高的DNA和氨基酸序列同源性，并且同源性限于成熟蛋白编码序列，在信号序列或5′和3′非翻译序列未检测到(5)。在三个序列当中，在DNA序列水平mIL-10和hIL-10是最相近的相关配对(81％)，而编码成熟hIL-10和BCRF1蛋白的DNA序列具有71％的同源性。hIL-10和BCRF1之间在氨基酸水平的同源性为84％。假设认为mIL-10和hIL-10基因由一个共同祖先进化而来，而BCRF1代表一个被先前处理，捕获的细胞的细胞因子基因，并且BCRF1蛋白被限制成与hIL-10类似。BCRF1在EBV的裂解循环中表达。BCRF1 ORF编码一个17kD的与hIL-10相似的含较少的或不含糖基化位点的分泌多肽。BCRF1表现出IL-10的一些活性并且被称为病毒IL-10(VIL-10)，尽管它只有hIL-10活性的10％。IL-10在细胞因子产生中的活性hIL-10抑制单核细胞/β噬细胞或T淋巴细胞的多种细胞因子的产生，其中细胞因子包含干扰素-γ(IFN-γ)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-C5F)，粒细胞-CSF-(G-CSF)、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和单核趋化多肽-1(MCP-1/MCAF)。IL-10还抑制作为单核细胞对化学因子MCP-1/MCAF的应答的迁移能力(75)。而且，hIL-10诱导一种内源的、天然的白介素-I受体拮抗剂(IRAP)的产生，其中该拮抗剂可通过与受体竞争结合而抑制IL-4α和IL-1β。由于IL-4α和IL-4β强烈诱导IL-8的产生，IL-10可通过刺激IL-1受体拮抗剂IRAP的产生而发挥其对IL-8产生的部分抑制效应。下文描述和例证的最后一种机制对本发明来说是相当重要的。IRAP具有抗炎症活性(9)，并且已表明它对风湿性关节炎有治疗效果(10)。还有，已证明IRAP对治疗脓毒源综合症有效并且在Fisher等人的一项研究中已证明一个剂量依赖的，28天的存活优势(benefit)与IRAP的治疗相关(p＝0.015)(11)。IRAP可通过抑制如IL-8的化学因子的产生而发挥其部分抗炎症效应。IL-10和抗原表达IL-10抑制人单核细胞II型MHC的表达(8)。组成性的和IL-4或IFN-γ诱导的HLA-DR/DP和DQ的表达被hIL-10抑制(12)。另外，用IL-10预保温的单核细胞抗后续的IL-4或IFN-γ诱导的II型MHC的表达。IL-10抑制用LPS激活后人单核细胞II型MHC的表达(12，76)。用致死剂量LPS感染的BALB/c小鼠的施用1～10mg IL-10后可免于死亡(6)。
IL-10抑制氮中间体和超氧化物阴离子。IL-10还可在IFN-γ激活之后由巨噬细胞抑制活性氮中间体(NO)以及活性氧中间体(H2O2)(13)。IL-10和T细胞活性IL-10还对T细胞的功能/活性具调节作用。因此，hIL-10对CD8+T淋巴细胞是一个有效的趋化因子，而hIL-10并不表现针对CD4+T细胞对β-化学因子RANTES以及α-化学因子IL-8等趋化信号的应答能力。hIL-10还直接抑制了人外周血T细胞和CD4+T细胞克隆的增殖(14)。IL-10和B淋巴细胞hIL-10共刺激由表面Ig和固定化的抗IgM抗体交联而诱导的B淋巴细胞增殖，并且当B细胞被其CD40抗原和抗CD40抗体以及小鼠L细胞表达的人FcγRII/CD32交联刺激时，该效应可被增强(15)。IL-10对激活的人B细胞的增殖和分化效应表明该细胞因子可能是T细胞表达hIL-10为B细胞应答提供帮助的某些高效率的原因。作为免疫系统的一种稳态因子的IL-10如上所述，IL-10功能的生理后果据信可维持免疫系统一定程度的稳态。因此，IL-10明确地抑制T辅助细胞的功能并可能刺激具有抑制功能的T细胞。因此，和IL-4类似，据信IL-10可以调节T细胞的Th1和Th2细胞因子类型之间的平衡。特别是，据认为IL-10抑制了Th1细胞的分化。由于Th1细胞的特征在于产生有利于细胞介导的免疫应答的细胞因子(IFN-γ和IL-2)的产生，而Th2细胞产生有利于体液应答并抑制细胞介导的免疫应答的细胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)，IL-10可抑制T细胞介导的免疫反应如延迟型的超敏反应，而却有益于体液反应。
作为上述的IL-10的特征所得到的结果，IL-10的活性已被描述为巨噬细胞和Th1细胞因子合成的抑制因子。因此已经研究是否IL-10的产生和/或活性的缺乏在疾病中起了作用，据信在这些疾病如自身免疫疾病和炎症中增强的细胞介导的免疫反应起了作用。用抗IL-10抗体处理的小鼠对单核因子诱导的炎症表现出较强的炎症应答，并且对LPS诱导的脓毒性休克，一种单核因子介导的炎症反应诱导的死亡明显地较为敏感(16)。而且，IL-10缺失(knock-out)小鼠自发引起类似于结肠炎溃疡(ulcerosa)的内脏炎症反应(17)。另外，已经研究是否IL-10是否在不同的寄生虫，分枝杆菌和病毒感染中起作用，并且已表明IL-10在与曼氏血吸虫相关的免疫麻痹中起病理生理学作用(18)。还提示在麻风分支杆菌感染中起作用。最近，已发现在预后不好的爱滋病患者的血浆中IL-10的水平较高，并提示这是由于爱滋病引起的免疫麻痹(19)。治疗建议这些体内的结果/数据明显的提示IL-10在控制细胞介导的单核因子放大的免疫炎症中的作用，并表明IL-10或IL-10类似活性的药物在治疗疾病中的广泛的治疗用途，其中疾病的特征在于IL-10产生和/或活性的减少/不足。由于本发明的物质以IT9362代表通过如下方面表现IL-10类的活性1)诱导人单核细胞IRAP的产生，2)抑制人单核细胞自发的IL-8的产生，3)抑制外周血单核细胞(PBMC)IL-Iβ刺激的IL-8的产生；4)刺激人T淋巴细胞CD8+，但不是CD4+的趋化迁移，5)脱敏人CD8+T细胞对rhIL～10诱导的趋化迁移，6)抑制IL-8介导的人CD4+T细胞的趋化作用，和7)抑制MCP-I/MCAF介导的人单核细胞趋化作用，8)诱导培养的正常人CD4+T细胞IL-4的产生，9)减少人混合白细胞反应中TNFα的产生，该多肽和其类似物可能因此具有同IL-10相同的治疗可能性。表3列出了一些疾病，其中IL-10类的免疫调节剂或具有IL-10类似活性的免疫调节剂可能具有治疗重要性表3其中具有IL-10类似活性的免疫调节剂可具有治疗重要性的一些疾病，这是由于该免疫调节剂可诱导IRAP的产生和/或抑制细胞因子的产生和/或活性(参考文献20-74)由感染或其它疾病引起的早产风湿性关节炎感染性关节炎痛风败血综合症高温溃病性结肠炎或小肠结肠炎骨质疏松细胞肥大病毒牙周病肾小球肾炎肺慢性，非感染性炎症(例如，肉样瘤病和烟(smoker’s)肺)肉芽瘤形成肝纤维化肺纤维化移植排斥移植物抗宿主病慢性髓性白血病急性髓性白血病其它肿瘤疾病支气管哮喘I型糖尿病(胰岛素依赖的)动脉硬化/动脉粥样硬化牛皮癣慢性B细胞白血病普通变异的免疫缺陷使用其它生物反应调节剂(modifier)的副作用扩散性血管内凝血系统性硬化脑脊髓炎肺炎症高IgE综合症小肠结肠炎癌症转移和生长过继免疫疗法获得性呼吸窘迫综合症败血症再灌注(reperfution)综合症手术后炎症器官移植脱发发明详述具有IL-10类似活性的IL-10同源九肽的开发根据其序列应该具有vIL-10和hIL-10之间的高的同源性但如与mIL-10具有尽可能低的同源性的原则，筛选了具有9个氨基酸长度的hIL的部分序列。该策略酸是基于这样一个事实即vIL-10同hIL-10部分交叉反应而mIL-10不与hIL-10交叉反应(参见上文)。因此，hIL-10的在人器官中起特定活性的序列应该位于那些在hIL-10和vIL-10之间高度同源性但却与mIL-10相关程度较低的区域中。
hIL-10的信号多肽被推测由最初的18个氨基酸组成。成熟蛋白质从第19位氨基酸开始(功能蛋白的第1位是一个丝氨酸)，并且整个蛋白包含160个氨基酸。通过观察人和病毒IL-10羧基末端的序列及特定的含赖氨酸和精氨酸的157和159位点，发现该结构域对部分参与受体的结合是有利的(图1和2)。
在筛选通过化学合成获得的一些代表物的IL-10类似活性之间，发现了合成的九肽IT9302，具有一些模拟hIL-10的免疫抑制活性，这将在下面的实施例中详细介绍。IT9302对应于hIL-10C末端的一个具有如下氨基酸序列的九肽NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn-COOH(SEQ ID No1)IT9302当对应于C末端的152～160位氨基酸的hIL-10片段有100％的同源性。而且，该多肽序列在相应区域与病毒vIL-10具有6个氨基酸相同，参见图1和2，即意味着如本文所定义氨基酸有6/9或66％同源，而与mIL-10有4个氨基酸相同，即4/9或44％。该九肽是唯一获自或衍生自hIL-10的序列并且具有至今检测到的由下文实施例所证明的特征。除了本发明人研究之外，无人指出过该序列是一个功能性结构域。
因此从最广泛的方面来讲，本发明涉及一种表现出hIL-10激动剂活性的物质，即一种不同于人白介素10的具有如下一种或多种特性的物质a)诱导对人单核细胞自发的IL-8产生的抑制，b)诱导对IL-Iβ诱导的人外周血单核细胞IL-8产生的抑制，c)诱导人单核细胞白介素-1受体拮抗剂蛋白(IRAP)的产生，d)诱导体外CD8+人T淋巴细胞的趋化迁移，e)脱敏人CD8+T细胞导致其对hIL-10的非应答性，f)抑制CD4+人T淋巴细胞对IL-8的趋化应答，g)抑制人单核细胞对MCAF/MCP-1的趋化应答，h)与人IL-10不同，不抑制人单核细胞上II型MHC分子的表达，i)诱导培养的正常人CD4+T细胞IL-4的产生，j)减少人混合白细胞反应中TNFα的产生。
在这些活性中，d)～g)被认为是独一无二的。本发明的一个重要实施酸方案是一种表现出如下所述的hIL-10激动剂活性的物质，该物质包含氨基酸序列Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn或一种类似物或所说序列的变异体。除非特别指出，该序列和所有本发明的说明书和权利要求书中的其它多肽序列，都是按常规从N末端写向C末端的。
该九肽是非常有效的可诱导不同的功能并且是稳定的。并且假设它不能被不正确地与受体结合。选择了一个九肽是因为通常一个9个氨基酸的多肽序列对于蛋白质是独一无二的。但是，应该看到在hIL-10最末端的6个氨基酸是最重要的。因此在本发明的范围之内是一种包含氨基酸序列NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn(SEQ ID No1)的物质或多肽。
一些氨基酸取代被认为可能不会对hIL-10的如本文所定义的激动剂活性具有不利影响，只要苏氨酸，赖氨酸和精氨酸存在，并在其之间无一个氨基酸的插入。
在其最广泛的方面，本发明涉及一种具有如下通式的多肽Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6(SEQ ID NO19)其中X4和X5分别选自Met，Ile，Leu和Val；并且X6选自Asp，Gln和Glu。
在另一方面，本发明涉及一种具有如下通式的多肽X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6(SEQ ID NO20)其中X3，X4和X5独立地选自Met，Ile，Leu和Val；并且X6选自Asp，Gln和Glu。
在另外的方面，本发明涉及一种具有通式X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6(SEQ ID NO21)的多肽，其中X2是Tyr或Phe，
X3，X4和X5分别选自Met，Ile，Leu和Val；并且X6选自Asp，Gln和Glu。
本发明的优选实施方案是具有通式X1-X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6(SEQ ID NO22)的多肽，其中X1是Ala或Gly，X2是Tyr或Phe，X3，X4和X5分别选自Met，Ile，Leu和Val；并且X6选自Asp，Gln和Glu。
如下是假设具有如上所定义的hIL-10激动剂活性的特定的多肽的实施例1. NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Met-Arg-Asn-COOH (SEQ ID NO2)2. NH2-Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lys-Leu-Arg-Asn-COOH (SEQ ID NO3)3. NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Glu-COOH (SEQ ID NO4)4. NH2-Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO5)5. NH2-Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO6)6. NH2-Ala-Tyr-Ile-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO7)7. NH2-Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO8)8. NH2-Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO9)9. NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO10)10.NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO11)11.NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO12)12.NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO13)13.NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO14)14.NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO15)15.NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Asp-Gln-COOH (SEQ ID NO16)16.NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Asp-Glu-COOH (SEQ ID NO17)为了比较，合成了另一个称为IT9301的与hIL-10序列具有100％同源性的九肽。该多肽IT9301对应于hIL-10 N末端的开始的九肽序列(氨基酸序列19～27位，即成熟蛋白的最初9个氨基酸)并具有如下氨基酸序列NH2-Ser-Pro-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Ser-Glu-COOH (SEQ ID NO18)
应用下述的技术该多肽表现IL-10类似的活性，仅仅是因为它在hIL-10的另一末端而选择了它，其主要是作为阴性结果的对照。在当vIL-10的序列同源性，和有利于受体结合的氨基酸方面，它不具有C末端的特征。在IL-1β诱导的外周血单核细胞系统中测试了IT9301对IL-8产生的影响，但是并不真正诱导这些细胞的IL-8的产生的抑制。
根据本发明，术语“本发明的一种hIL-10激动剂”包括任何与IT9302相同或结构相似的并表现出与IT9302相似的生物作用的有药理活性的和药理上可接受的化合物，包括IT9302的衍生物，特别是药学上可接受的盐，酯和融合物以及IT9302的结合物或包含肽模拟物(peptido-mimetics)的IT9302衍生物。IT9302在N末端当合适的载体的如聚乙二醇或糖的共价偶联可延长该多肽在体内的半寿期。
在本文中采用如下的定义“细胞因子”是主要但不是仅仅由免疫系统的细胞群体在应答特异的刺激原如特异的抗原或同种抗原或非特异的多克隆激活因子，如一种内毒素或其它格兰氏阴性菌的细胞壁的成份时而释放的蛋白组成的介体的总称。
“淋巴因子”是致敏的淋巴细胞做为对刺激原的应答、其中刺激原包括例如一种特异的抗原或一种同种抗原；或者由多克隆激活因子，如内毒素或其它的格兰氏阴性菌的细胞壁成份攻击的淋巴细胞而释放的由蛋白组成的介体的总称。
“白介素”一类是主要由但并不仅仅是巨噬细胞，T，B或NK细胞作为对刺激原例如特异的抗原或同种抗原的应答；或由被多克隆激活因子，如内毒素或其它的格兰氏阴性细胞的细胞壁的成份所攻击的淋巴细胞所释放的蛋白组成的介体的总称。“单核因子”是主要但不是仅仅由单核吞噬细胞(例如单核细胞或巨噬细胞或枯胚氏细胞(肝)或郎格尔汉氏细胞(皮肤)作为对任意刺激原的应答的而释放的一类由蛋白组成的介体的总称。“化学因子”是主要但并不仅仅由免疫系统的细胞群体释放的蛋白组成的趋化和/或白细胞激活介体的总称，这些是作为对特异的刺激原例如特异的抗原或同种抗原；或非特异的多克隆刺激因子，例如内毒素或其它格兰氏阴性菌的细胞壁成份的应答而释放的并且该“化学因子”属于特定的或者是化学因子-α基因家庭酸或化学因子β基因家族的基因家族。“干扰素”是主要由但不仅仅是由免疫系统的细胞群体作为对病毒或干扰素诱导因子，如多核苷酸的应答而释放的由蛋白组成的抗病毒和/或单核细胞激活介体；具体地说是免疫系统的细胞对特异的刺激原的应答；如对特异的抗原或同种抗原；或非特异的多克隆的激活因子如内毒素或其它的格兰氏阴性细菌的细胞壁的成份的应答。“集落刺激因子”是主要但不是仅由免疫系统的细胞群体释放的由蛋白组成的造血生成集落刺激介体，这是对特异的抗原或同种抗原或对非特异的多克隆激活因子如内毒素或其它的格兰氏阴性细菌的细胞壁组份的应答。“多肽”在本文中既指至少只有酸两个氨基酸残基，至多只有10个氨基酸残基的短肽，寡肽(11～100氨基酸残基)，和长肽(通常解释的“多肽”，即大于100个氨基酸残基的长度)以及蛋白(功能完整性包括至少一种肽，寡肽，或多肽，其可通过被糖基化，脂化或通过包含辅基而被化学修饰)。多肽的定义还包括天然形式的人肽/蛋白以及在转化任何类型的宿主的任何类型的表达载体中的重组蛋白或肽，和化学合成的肽。
本发明的一种实施方案涉及一种包含人IL-10序列的一个亚序列的多肽该多肽与vIL-10有66％的同源性程度，同mIL-10有44％的同源性程度，尤其是SEQ ID NO1。术语“同源性”指当对多肽的氨基酸的一致性和位置进行匹配时两个或多个氨基酸的片段中氨基酸序列的一致性。
因此本文所用的同源性是对两个氨基酸(或核苷酸)序列之间相似性的度量。同源性被表达为在两个序列(可能是不等长的)被校准之后相匹配(matching)的(氨基酸或碱基)的分数和或百分数。术语排序的使用的定义如(76)中所述。粗略来讲，两个序列的校准是通过对两序列之间匹配的碱基(或氨基酸)的数目的最大化，而将最小数目的“空白”或“无义”碱基插入任一序列中以获得最大的重叠来进行的。
此处所用术语“同源的”特别用于说明所给多肽的氨基酸序列和IT9302的氨基酸序列之间的一致性的程度。用于同IT9302的氨基酸序列相比较的氨基酸序列可由如DNA或DNA序列等的核苷酸序列，例如下文所述通过杂交获得的推导而来，或者由常规的氨基酸测序方法获得。优选确定成熟多肽的氨基酸序列的同源程度，即不将任何先导序列考虑在内。一般说来，为了确定其内在的同源性而比较核苷酸序列时，仅采用编码区。
尽管hIL-10和vIL-10基本程度的同源性被期望是有益的，并不是说hIL-10序列的表现为与vIL-10较低程度同源性，比如说50％，55％或100％的亚序列也可表现出一种或多种有益的hIL-10激动剂活性。而且，如上所讨论的，并不认为与hIL-10的同源程度绝对必须是100％。在本发明的范围之内还包括与hIL-10具有较低同源程度如75％，80％，85％，90％或95的多肽，尽管优选100％。
这样的多肽可认为同该九肽类似。因此术语“一种其类似物或变异体”指一种并不完全具有Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn(SEQ ID NO1)的氨基酸序列的多肽，但如上所说却仍具有“hIL-10激动剂活性”。通常来说同实施例中描述的IT9302相比，这类多肽可为例如在氨基酸组成或翻译后修饰如糖基化或磷酸化中发生一定程度的变化的多肽。
因此本上下文中所用的术语“类似物”或“变异体”指一种具有与IT9302的氨基酸序列有一定程度的不同，但却仍相似的氨基酸序列的蛋白或多肽，允许改变氨基酸序列的轻微变异，如缺失，定点突变，额外氨基酸的插入，或其组合，以产生IT9302的多肽类似物。
定点突变提供了一种方便地在天然蛋白序列中进行保守的氨基酸置换等的途径。另外，可利用多肽序列的单独的氨基酸的连续偶联的已为熟知的液相或固相多肽合成方法制备类似物，或者该多肽的合成可通过偶联单独的氨基酸以形成多肽序列的片段，该片段后来被偶联以形成所需的多肽。
本文所用的“保守的”指(1)改变尽可能是构象上中性的，即，与天然蛋白相比，设计在突变蛋白的三级结构上产生尽可能少的改变，并且(ii)该改变在抗原性上尽可能是中性的，即与天然蛋白相比，设计在突变蛋白的抗原决定簇上产生尽可能少的变化。构象上中性是保持生物活性所需的，而抗原性中性是在用本发明的物质处理的患者或动物中避免引起免疫原性反应所需的。尽管很难用绝对的确定性来选择哪种改变是构象和抗原性中性的，但存在可指导本领域的技术人员去做有最大可能性的构象和抗原性中性的改变的准则，参见例如(77)和(78)。一些较重要的准则包括(1)疏水残基的置换很小可能产生抗原性改变，因为它们更可能位于蛋白质的内部，例如Bergofsky(上文引用)和Bowie等(上文引用)；(2)置换物理化学类似的即同义的残基产生构象改变的可能性较小，因为置换的氨基酸残基可起到被置换的氨基酸残基同样的结构作用；和(3)进化上保守的序列的改变可能产生有害的构象作用因为进化上保守意味着序列在功能上是重要的。在这些筛选突变蛋白序列的基本准则之外，可对所操作的分子进行测定以确定其生物活性和构象。对本发明的物质的生物测定在实施例中有更全面的描述。可用至少两种已知的测定对其构象变化进行检测微补体(microcomplement)固定方法，例如(79)和(80)所用的蛋白质三级结构的研究中所广泛采用的方法；和对一系列构象特异的单克隆抗体的亲和性，例如(81)。
因此本发明的一个重要实施方案涉及一种多肽，其中至少一个氨基酸残基被不同的氨基酸残基置换和/或其中至少一个氨基酸残基被缺失或增加，以便得到一种包含与下面定义的所说的氨基酸序列或氨基酸序列的亚序列不同的氨基酸序列的多肽，但如上所述，该多肽却具有基本的hIL-10激动剂活性。
本发明的一个有趣的实施方案涉及一种多肽，该多肽是一种类似物和/或包含本发明的多肽的至少一部分，总数为10～100个氨基酸残基，例如至少12个氨基酸，至少15个氨基酸，至少20个氨基酸或至少30个氨基酸。
在本发明优选的实施方案中，使用基本为纯化形式的物质或多肽，为得到这些，可能需要多肽的纯化。用于纯化多肽的方法的实施例如下(i)用抗体进行免疫沉淀或亲和层析；(ii)用合适的配基进行亲和层析，(iii)其它的层析方法如凝胶过滤，离子交换或高效液相色谱或上述任一项的衍生方法，(iv)电泳方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳和等电聚焦，(v)任何其它的特定的增溶溶解和/或纯化技术。
在本发明的范围内还有编码上述多肽的核苷酸序列，具体地是一种编码包含或者即是SEQ ID NO1的氨基酸序列的核苷酸序列，例如一种包含序列GCC TAC ATG ACA ATG AAG ATA CGA AAC(SEQID NO23)的核苷酸序列或编码具有所述氨基酸序列的一个亚序列的一种多肽的核苷酸序列。而且，一种修饰的与上述的核苷酸序列不同的核苷酸序列中至少一个核苷酸被缺失，置换或修饰或已被插入至少一个额外的核苷酸，以便得到一个编码一种在本发明的范围之内的具有hIL-10激动剂活性的多肽的多核苷酸序列。
在本发明的说明书和权利要求书中，术语“亚序列”指一个优选大小为至少18个核苷酸，更优选21个核苷酸，最优选24个氨基酸的序列。在本发明的几个实施方案中，本发明的核苷酸序列的亚序列或类似物将包含至少27个核苷酸，例如至少30个核苷酸或至少45个核苷酸。由“亚序列”编码的多肽应该符合上述a)-g)至少一个标准和/或该核苷酸“亚序列”应该在高度严谨条件下与包含SEQ ID NO23序列的核苷酸核苷酸序列杂交。
术语“高度严谨”，当与杂交条件结合使用时，为如文献中所定义的比熔解温度Tm低5-10℃，参考Sambrook等，1989，11.45-11.49页。
与本发明的DNA片段相应的术语“类似物”包含一种核苷酸序列，它所编码的多肽与上面DNA所编码的多肽一致或基本一致。公知可由不同密码子编码相同的氨基酸，密码子的使用，与特别是表达核苷酸的所研究的生物的优选有关。因此，本发明的DNA片段的一个或多个核苷酸或密码子可被其它的核苷酸或密码子交换，它们而多被表达时，可得到与上述所表明的DNA片段所编码的多肽一致或基本一致的多肽。
而且，术语“类似物”和“亚序列”指在允许在序列中有如一个或多个核苷酸的置换，插入(包含内含子)，添加和重排的变化，该改变对该DNA片段或其亚序列所编码多肽的hIL-10激动剂活性基本上不具任何的副作用。因此本发明还包含一种编码具有氨基酸序列SEQ IDNO1的一个亚序列的多肽的核苷酸序列。
本发明的多肽可由重组DNA技术来产生。本发明的一个重要的实施方案涉及一种包含本发明的核苷酸序列的表达系统。因此在本发明的范围内还有一种包含本发明的核苷酸序列的表达系统，例如一种带有并可介导上述的核苷酸序列的表达的可复制的表达载体。
用于产生本发明的多肽的生物体可以是高等生物例如动物或低等生物如微生物如大肠杆菌、酵母、原生动物、或来源自多细胞生物如真菌的细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞或一种细胞系，其中如上所述携带如上所述的表达系统。
不管所用生物的类型如何，本发明的DNA片段被直接或以合适的方式导入该生物体中。另外，通过直接或通过表达载体的方法将本发明的DNA片段或其类似物或其亚序列导入哺乳动物细胞系中而产生该多肽。如上面所讨论的，本发明的多肽还可由化学合成产生。
本发明还涉及一种如本文所述包含编码本发明的多肽或融合多肽的质粒载体。在一个特别重要的实施方案中，如本文所述本发明的DNA片段或其类似物或其亚序列或本发明的融合DNA片段可被一种可在宿主生物或细胞系中复制的可复制的表达载体携带。
具体地该载体可以是质粒、噬菌体、柯斯质粒、微染色体或病毒。在本发明的一个感兴趣的实施方案中，该载体可以是这样一种载体当其被导入宿主细胞中时，它与宿主细胞细胞基因组整合。
如上所述所产生的多肽可进行翻译后和合成后修饰而作为热处理，化学处理(甲醛、戊二醛等)或酶处理(肽酶、蛋白酶和蛋白修饰酶类)的产物。当与其天然产生环境相比，被在十个生物体中产生时，该多肽可不以不同的方式被处理。作为一种实施例，当多肽由一种高等生物如酵母或优选哺乳动物的细胞表达时常被糖基化。通常糖基化与Asn、Ser、Thr或羟基赖氨酸的氨基酸残基有关。
因此，本发明的一个具体实施方案涉及产生一种如上所述的多肽的方法，包括如下步骤(a)将如上所述的核苷酸序列插入一个表达载体中，(b)用步骤(a)中产生的载体转化合适的宿主生物，(c)在合适的条件下培养步骤(a)中产生的宿主生物以表达该多肽，(d)收获该多肽，并且(e)可任选地对该多肽做翻译后修饰。
预期尤其是通过使用与九肽IT930Z特异性结合的抗体可实现对hIL-10或VIL-10的拮抗剂效果，并且可将此用于治疗中以中和高浓度的IL-10。
另一方面，因此本发明涉及一种与本发明的多肽结合的抗体。
术语“抗体”指一种由哺乳动物产生的动物或更具体地由哺乳动物来源的属于免疫系统的细胞在接触本发明的多肽抗原之后做为应答而产生。在本说明书和权利要求书中“一种抗体”被定义为基本由特异性结合的基本单位组成，其中基本单位由两条重链和两条轻链组成。但是从其最宽的方面来说，抗体概念还应该包括如基本单位的二聚体或五聚体。
抗体的变异结构域由可变和恒定序列组成。将结构域的变异部分称为抗体的独特型。抗体的这一部分负责与抗原相互作用，与抗原结合。在本文中，将术语“抗体”理解为完整的抗体分子或其任意片段。在产生过程之中和/或之后抗体可被片段化。抗体可以在开始时以片段形式产生并使用其片段形式或者在将不同的片段连接之后再使用。特别感兴趣的是本发明抗体的结合片段，例如Fab或Fab′片段。
抗体的独特型(抗原结合)结构是有抗原性的并且因此能产生抗独特型结构的特异抗体。得到的抗独特型抗体叫抗独特型抗体。这类抗体可模拟原始抗原的结构并且因此可做为原始抗原使用。这类抗体可置换本发明原始多肽的原始抗原的部分或全部功能，可用性和特征。
本发明的抗体包括多克隆抗体以及单克隆抗体。
抗体或其片段可以是单特异(多克隆)类型的。可通过给合适的动物注射本发明的多肽的基本纯化的制剂来制备单特异性抗体。可在第一次采血之后以合适的间隔接着进行强化(booster)注射。在每次免疫之后5-7天对动物采血。可选择性地用标准的抗体纯化技术从血清中分离抗体。
用于制备与本发明的多肽结合的抗体的动物优选自兔、猴、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、猪、马和豚鼠。产生抗体细胞可以是脾细胞或外周血淋巴细胞。
可获得针对该多肽的一个基本组分即一个表位的单克隆抗体或其片段。可使用杂交瘤细胞系，或通过其克隆或亚克隆或通过携带来自杂交瘤细胞系的产生所说单克隆抗体的遗传信息的细胞来用传统技术制备单克隆抗体(Kohler和Milstein，1975)。可将产生所说单克隆抗体的细胞与合适的细胞系融合，并克隆得到的产生所说单克隆抗体的杂交瘤细胞而制备该单克隆抗体。另外，可通过将一个未融合的产生所说单克隆抗体的细胞系不死化而制得该单克隆抗体。最后从细胞生长培养基中收获单克隆抗体。用于制备单克隆抗体的杂交瘤细胞可生长于体外或动物的体腔中。也可用重组DNA技术制备单克隆抗体或其片段(Huse等，1989)。
也可通过用本发明的多肽的未纯化制剂来免疫合适的动物来制备单克隆抗体。应该对得到的分泌单克隆抗体的杂交瘤克隆的与该多肽或其类似物的结合能力进行筛选。
在不需要高的特异性时，该抗体可以是多克隆抗体。例如，如上文Harboe和Ingild所述可获得多克隆抗体。更具体地说，当想得到多克隆抗体时，优选在加入了合适的佐剂如弗氏完全或不完佐剂之后，将本发明的多肽或其类似物注射入动物体内。对动物定期采血，例如每周一次，并将得到的血液分离成含血清级分的抗体，并可任选地将级分进行常规的抗体纯化步骤，和/或进行包含使用该纯化多肽或其类似物的纯化步骤。
该抗体还可以是一种针对抗独特型抗体的抗-抗独特型抗体，它是针对一种可与抗原上的表位反应的抗体的位点的。可用如上所说的制备单克隆或多克隆抗体的类似方法制备抗独特型抗体。
本发明范围之内的抗体是可与如上所定义的物质或多肽结合的抗体，具体地是一种与具有氨基酸序列Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn的多肽特异结合的抗体。
因此从较大的方面说，本发明涉及一种能中和一种或多种a)到j)的hIL-10活性的物质，即具有hIL-10拮抗剂活性，如具有这些特征的一种抗体。业已知一种能与IL-10-特异结合，并能阻断LPS刺激的单核细胞内源性的IL-10的产生的单克隆抗体19F1(82)，参见表1(82)。该抗体识别天然折叠的IL-10，但并不必需是完整的功能性的结构域；但是该抗体不与IT9302特异性地结合。
本发明的范围内还有一种包含这类物质的药用组合物以及包含本发明的物质或多肽的药用组合物。
本发明的一个重要方面涉及一种包含一种具有如上所述的hIL-10，激动剂或hIL-10拮抗剂活性的物质的药用组合物以及一种药学上可接受的赋形剂。该组合物可包含如纯化的合成蛋白质或纯化的重组多肽，单克隆或多克隆抗体或任何其它的满足a)-j)标准的物质，或如果具有hIL-10拮抗剂活性，能中和a)-j)的一种或多种hIL-10活性的物质。
本发明所用的IL-10激动剂或拮抗剂可在药学上可接受的载体中制成制剂，如盐溶液，硫酸缓冲盐溶液(PBS)，林格氏溶液，左旋糖/盐溶液，Hank’s液，和葡萄糖等。该组合物可含药学上可接受的辅助物质以接近生理环境，如缓冲剂，张力调节剂，湿润剂和去污剂等。添加剂还可包括另外的活性成分如杀菌剂，或稳定剂。给患者的给药量将根据给药的种类，给药的目的如治疗或预防宿主的状态，给药方式等而变化。
一般来说该药用组合物是用于透皮或胃肠外给药的，如静脉内、皮下、或肌内。也需要口服给药方式并或通过改进该组合物以通过胃环境而提供组合物可用于预防和/或治疗处理。优选地，该药用组合物是通过静脉内给药的。因此，本发明提供了包含IL-10激动剂或拮抗剂的物质，其中这些物质是溶解或悬浮于可接受的载体，优选含水载体中的。这些组合物可用常规的灭菌技术灭菌或者可过滤除菌。
得到的水溶液可被包装以供使用，或冻干在给药之前将冻干制品与无菌水性载体结合。IL-10激动剂或拮抗剂也可与第二种生物活性剂一起施用，如常规的化疗剂、这类药剂包括但不限于长春新碱、柔红霉素、L-门冬酰胺酶，米托蒽酮和安吖啶。
在治疗应用中，给患者施用有效量的药用组合物以得到所希望的效果，称为“治疗有效剂量”。IL-10激动剂或拮抗剂的治疗有效剂量可根据，例如治疗的特殊用途，用药方式，患者的健康状况，以及临床医生的判断而变化。例如，对于70公斤的患者来说，连接输注的典型剂量是约500ng～800μg/天，优选约10～300μg。典型剂量在700ng/kg/天和10μg/kg/天之间。
药物制剂中IL-10激动剂或拮抗剂的浓度变化很大，即从约10μg到约5mg/ml，优选在约100μg和约2mg/ml之间。通常根据所选定的给药方式，而根据流体体积，粘度等选择浓度。因此，一个典型地静脉内输注的药用组合物可制成在250ml右旋糖/盐溶液中含2.5mg IL-10激动剂或拮抗剂。
对固体组合物，可使用传统的非毒性固体载体，例如包括药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对口服给药来说，可通过掺入通常用的赋形剂如上面列的这些载体，和通常10～95％的活性组分，即IL-10激动剂或拮抗剂物质，优选75～25％来形成药学上可接受的非毒性的组合物。
对气雾剂给药来说，优选提供的IL-10激动剂或拮抗剂是与表面活性剂和推进剂(propellant)一起精确分装的形式。IL-10激动剂或拮抗剂的典型百分比是0.01-20％(重量)，优选1-10％。表面活性剂当然必需是无毒性的，优选可溶于推进剂中。这类药剂的代表是含6-22个碳原子的脂肪酸的酯或部分酯，如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬脂酸(olesteric)和油酸同脂肪族多元醇或其环酐例如乙二醇，甘油、赤藓醇、arbitol、甘露醇、山梨糖醇、由山梨糖醇衍生而来的壬醇酐的酯，以及这些酯的聚氧乙烯和聚氧丙烯衍生物。可使用混合酯如混合的或天然的甘油酯。
表面活性剂占组合物的0.1-20％(重量)，优选为0.25-5％。通常用推进剂来平衡(补足)组合物。通常液化的推进剂在周围环境下是气体，并在一定力下被压缩。在合适的液化推进剂中有含至多5个碳原子低级链烷，例如丁烷和丙烷，并优选氟代的或氟氯代的链烷。也可使用上述物质的混合物。在生产气雾剂时，在带有合适的阀门的容器中充满适宜的推进剂，其中含有细碎的多肽和表面活性剂。因此将组分保持在高压下，直到通常阀门的作用将其释放。
为了增大血清半寿期，可将IL-10拮抗剂或激动剂囊化，导入脂质体的腔中，制成胶体，或者应用其它常规技术以延长多肽的半寿期。因此，在特定的实施方案中，IL-10的激动剂或拮抗剂可被包于脂质体中。如例如(83)、(84)、(85)和(86)中所述，有多种方法可制备脂质体。
因此，本发明的一个重要实施方案涉及该物质在减少或中和hIL-10和/或VIL-10的高浓度中的应用，例如该具有IL-10拮抗剂牲的物质在用于治疗或预防卵巢癌和/或艾滋病的药用组合物的制备的应用(87、19)。
在本发明的范围之内还有治疗和/或预防卵巢癌和/或艾滋病的方法，该方法包括，如果患者需要，给其施用治疗或预防有效量的hIL-10拮抗剂物质以及一种具有hIL-10拮抗剂活性的化合物在制备用于治疗或预防卵巢癌和/或艾滋病的药用组合物中的应用。
根据本发明的该物质的应用根据本发明，如上所述已发现IT9303以及其类似物和变异体在抑制细胞因子的作用中有用，而已知这些因子与前述病理情况病理性地有关。
因此，期望运用本发明的多肽或其类似物或其衍生物的治疗有效性，并且应该研究在所有期望hIL-10和/或IPAP的治疗有效性中的疾病中的其治疗的有效性(参见上文表3)。
本发明的非常重要的多个实施方案涉及本发明的物质或多肽在治疗或预防一种或多种上述表3中的疾病中用途，涉及根据本发明的物质或多肽在制备用于治疗或预防上述表3中的一种或多种疾病的药用组合物中的用途，以及涉及治疗和/或防治一种或多种上面表3中的疾病的方法，该方法包括给有需要的患者施用根据本发明的治疗上或预防上有效量的物质或多肽。
因此本发明的一个重要方面是IT9302或其功能性的衍生物在制备用于基本抑制中的细胞因子相关生物效应的用于预防或治疗与细胞因子系统的紊乱相关的疾病的药用组合物中的应用，细胞因子有例如，淋巴因子、白介素、单核因子、化学因子、干扰素、集落刺激因子、前列腺素和/或白三烯，其中细胞因子系统的紊乱有例如淋巴因子、白介素、单核因子、化学因子、干扰素或集落刺激因子系统的紊乱和/或前列腺素和/或白三烯系统的紊乱。如本文所采用的术语“药用组合物包括上文所详述的任何适于人用的组合物。
本发明特别涉及IT9302或其功能性衍生物的如下用途。- 基本抑制人细胞因子相关的生物效应以预防或治疗与细胞因子系统紊乱相关的疾病；和/或- 基本抑制人淋巴因子相关的生物效应以预防或治疗由淋巴因子系统紊乱相关的疾病；和/或- 基本抑制人白介素相关的生物效应以预防或治疗与白介素系统紊乱相关的疾病；和/或- 基本抑制人单核因子相关的生物效应以预防或治疗与单核因子系统紊乱相关的疾病；和/或- 基本抑制人化学因子相关的生物效应以预防或治疗与化学因子系统紊乱相关的疾病；和/或- 基本抑制人淋巴因子相关的生物效应以预防或治疗与淋巴因子系统紊乱相关的疾病；和/或- 基本抑制人干扰素相关的生物效应以预防或治疗与干扰素系统紊乱相关的疾病；和/或- 基本抑制人集落刺激因子相关的生物效应以预防或治疗与集落刺激因子系统紊乱相关的疾病；和/或- 基本抑制人前列腺素相关的生物效应以预防或治疗与前列腺素系统紊乱相关的疾病；和/或- 基本抑制人白三烯相关的生物效应以预防或治疗与白三烯系统紊乱相关的疾病；和/或
图1示对推测的mIL-10、hIL-10和BCRF1的氨基酸序列的比较。相一致的氨基酸序列用坚伐标出。
图2示含9个氨基酸的IL-10的羧基末端多肽序列，并比较了猪，人，BCRF1和小鼠的蛋白质。
图3是证明IT9302通过纯化的培养的人单核细胞抑制的IL-8的自发产生的图解。
图4是表明IT9302抑制IL-1(1ng/ml)诱导的人外周血单核细胞IL-8的产生的图解。
图5示IT9302刺激的人单核细胞IRAP的产生。
图6示IL-10刺激的人单核细胞IRAP的产生。
图7示IT9302对CD8+T细胞的趋化活性。
图8示IT9302对DC8+T细胞的脱敏作用，结果导致CD8+T细胞对IL-10(10ng/ml)诱导的趋化作用的不应答性。
图9示IT9302对IL-8活性的抑制。
图10图解表明IT9302抑制MCAF/MCP-1诱导的单核细胞趋化作用。
图11用ECL-Western印迹表明CD4+T细质部分中IL-4的产生。
图12用ECL-Western印迹表明在人混合淋巴细胞培养物细胞质部分中TNF-α的产生。TNF-α的Western印迹如在材料和方法中描述的IL-4那样进行，但是使用兔抗人TNF-α抗体(Pepro Tech.Inc.，London，England)和辣根过氧化物酶标记的二抗(产品号P217，DakoDenmark)。
图13示IT9302对LPS诱导的休克和白细胞减少症的调节，以总白细胞计数表示。
实施例材料和方法细胞因子和化学引诱物重组hIL-10购自Pepro Tech.Inc.，NJ(目录号200 10)。重组hIL-1β和重组hIL-8由Dainippoa pharmaceutical Company，Osaka，Japan赠送。根据鲎变形细胞溶解物试验(Sigma E-TOXATEKit Cat.No.210-A1)，培养用培养基是不含LPS的RPMI 1640GBCO。rhMCAF/MCP-1由Japan Kanazawa Kouji Matsushima教授赠送。
白细胞趋化作用试验T细胞趋化作用以表达CD4或CD8抗原为特征的CD4+和CD8+T淋巴细胞系纯化自正常供体的肝素血。因此，通过将100ml血液与Hanks平衡盐溶液(HBSS)1∶1稀释，并且然后将细胞置于LmphopaeTM(NycomedPharma，Oslo，Norway)上，接着2000rpm梯度离心20分钟以从肝素中纯化外周血单核细胞(PBMC)。将单核细胞在HBSS中洗3次并将细胞沉淀稀释在4ml含1％胎牛血清的HBSS中，并且通过使用用抗CD4或CD8抗原的单克隆抗体包被的Dynabeads(Dynabeads M-450 CD4.Cat，No.111，16，Dynabeads M-450.CD8 Cat No.111，08，DETACHa 13EHD Cat.No.125.04)在4℃分选。珠子细胞比是10∶1，温育时间是1小时。根据生产商的说明用加入多克隆抗小鼠抗体将珠子解离下来。
如已前所描述的(74；参见参考文献13和14)趋化作用试验为48孔的微室技术(Neuroprobe Rockville，MD)。用含1％过滤除菌的胎牛血清将化学引诱物稀释在RPMI 1640中(GIBCO.Cat.No.61870-010)，并放于下面的25μl的室中。在测定T细胞趋化作用时，将T细胞(5×106/ml)悬浮在培养基中并取50μl放于上面的室中，该室通过一个5μm大小孔的包被有IV型胶原(Sigma.Cat.No.C0543)的不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯滤膜与下面的室相隔离。让细胞在37℃5％CO2下迁移2小时。小心取出滤膜并将其固定于70％甲醇中，在考马斯亮兰中染色5分钟。通过一个与一个数字分析用的计算机系统相连的显微镜上的视频相机(Video Camera)测定其面积而计数吸附到滤膜下表面上的细胞数，并且该计算机系统由客观确定趋化迁移的软件支持。在12,000和13,000细胞之间有约5％T细胞自发迁移；这在冬天之间有变化，但在同一天的实验中变化很小。如前所述(参考文献3和14，因此选择样品中迁移相细胞数和阴性对照中反映自发迁移的细胞的之间的比率作为报告结果。该比率称为趋化指数(CI)。所有的样品分析重复三次而且在估测面积的中间值之前在三个区域中测定每孔中的细胞迁移。在一些实验中趋化作用膜未用胶原包被，并且在本试验系统中因此迁移细胞将会掉到趋化作用室的下面的孔的底部。
在一个实验中，如上所述通过检测加入到下室中的一系列稀释的IT9302并评测趋化作用对IT9302对CD8+T细胞的趋化活性进行了测定。
在第二个实验中，通过在趋化作用之前30分钟向靶细胞中加入IT9302以研究IT9302对CD8+T细胞作为对rhIL-10(10ng/ml)的应答迁移作用的脱敏作用。IT9302以系列浓度加入并如上所述对rhIL-10的趋化反应进行评测。
在第三个实验中，在进行趋化作用之前30分钟通过向靶细胞中加入IT9302而研究了其抑制CD4+T细胞对rhIL-8(10ng/ml)的趋化反应的能力。如上所述加入系列浓度的IT9302并评测rhIL-8的趋化反应。单核细胞趋化作用使用如上述T细胞中所描述的同样的Boyden室设备对单核细胞的趋化作用进行测定。将化学引诱物MCAF/MCP-1稀释在含0.5％BSA的RPMI 1640培养基中并以10ng/ml的浓度加入到下室中。如上所述从正常人PBMC用常规的塑料粘附技术纯化获得的单核细胞被悬浮在含0.5％BSA的RPMI1640培养基中，并且然后在不同浓度的IT9302存在下温育30分钟。接下来，以106细胞/ml的浓度将细胞加入到上面的趋化作用室中。上面的和下面的室被一个有8μm大小的孔的不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯滤膜(Nucleopore，Pleasanton，CA)隔离开。将该等室在37℃温育90分钟。如上所述处理含迁移细胞的滤膜并根据上述的方法计算趋化指数。
正常人外周单核细胞(PBMC)IL-8的产生PBMC纯化自肝素化的正常人供体血。接着用LymphoprepTM(Nycomed Pharma，Oslo，Norway)进行梯度离心，单核细胞被在不含LPS的RPMI1640培养基(Gibco.Cat.No.6187-010)中稀释为2×106细胞/ml，其中培养基中含有1％的过滤除菌的热灭活的胎牛血清和青霉素(10,000IE/ml)、链霉素(10mg/ml)以及庆大霉素(2.5mg/ml)。将细胞培养在24孔Nunc Micro板(Nunc，Oenmark)上并在不同浓度的IT9302(1，1μg，100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.01ng/ml)的存在下培养24小时。在培养24小时后，再加入1个剂量的IT9302并在1小时后向细胞培养物中加入r-hIL-1β(1ng/ml)。在总共培养48小时后收集上清，并用IL-8 ELISA试剂盒(DainipponPharmaceutical Co.Ltd.Osaka，Japan)对分泌的IL-8的浓度进行测定。简单地说，在20℃在一个微板振荡器上(micro-plate shaker)将标准和细胞温育1小时并重复一次。然后在清洗之后，加入二抗1小时，接着与过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG保温1小时。在洗涤之后，用邻苯二胺显色。30分钟后用1.6N磺酸终止反应。在ELISA读数仪(reader)中在490nm测定光密度(OD)。通过一个未知的对IL-8标准浓度的光吸收的标准曲线计算出IL-8的浓度。
IRAP浓度的测定如上所述纯化PBMC。将PBMC培养在RPMI 1640，10％无菌的热灭活的胎牛血清中(含青霉素10,000IE/ml，链霉素10mg/ml，庆大霉素2.5mg/ml)并且细胞浓度是5×106细胞/ml。然后用标准的塑料粘附技术纯化单核细胞。然后在含2％FCS(2.5×106细胞/ml)和不同稀释度的rhIL-10或IT9302 RPMI1640中培养单核细胞。将细胞刺激24小时并收集上清供IRAP测定之用。使用购自R&D SystemsEurope Ltd.(Cat.No.DRA00，Abingdon，Oxon，UK)的人IL-lra Quantikin免疫测试试剂盒进行IRAP ELISA。
单核细胞上表达的II型MHC抗原的测定如上所述纯化PBMC并用塑料粘附技术分离单核细胞。然后将单核细胞以3×106细胞/ml的浓度·培养在含10,000IE/ml青霉素，10mg/ml链霉素，2.5mg/ml庆大霉素的含2％FCS的RPMI1640培养基中。在微孔中(Nunc，Denmark)用100ng/ml rhIL-10，或IT9302，1μg/ml，100ng/ml，10ng/ml刺激40小时。刺激结束后，除去上清并在-20分选、分选是用包被HLA II型β链的单克隆抗体(Cat.No.210.03)的50μl/ml Dynakeads M450进行的。在温育20分钟后，将细胞用含1％FCS的冷的HBSS洗3次并在一个磁性分离装置上收集。将细胞稀释在上述的缓冲液中并用甲烯兰染色，并计数玫瑰样细胞(含带有HLAII型mAb的Dynkeads的细胞)。
CD4+T淋巴细胞IL-4产生的测定细胞培养物CD4+T淋巴细胞纯化自肝素化的正常人血。在LymphoprepTM(Nycomed.pharma，Oslo，Norway)梯度离心之后，进一步在4℃将单核细胞用包被有抗CD4的单抗的Dynabeads(Dynal As，Norway)分选。加入多克隆抗小鼠抗体将磁珠脱离下来(Dynal A，Norway)。用FACS分析所筛选的阳性细胞纯度大于99％。当检测IL-8刺激的T细胞中IL-4的从头产生时，T细胞被以5×106细胞/ml培养在不含UPS的RPMI1040中(Gibco.Cat.No.61870-010)，其中培养基含1％过滤除菌的热灭活牛血清(FCS)，青霉素(10,000.IU/ml)，链霉素(10mg/ml)和庆大霉素(2.5mg/ml)。用rIL-8(100ng/ml)，rIL-10(100ng/ml)，IT9302(10ng/ml)和IFN-γ(10ng/ml)将T细胞刺激3天。重组人IL-8(rhIL-8)由Dainippon PharmaceuticalCo.Ltd.Osaka，Japan)赠送，而IFN-γ购自BoehringerIrgelheim Am.Rhein，Germary.为了获得对IL-8刺激的特异抑制，使用了一个抗IL-8的中和单克隆抗体(WS.4)由Or.k.Matsushimn赠送。(重组IL-10购自Pepro.Teeh.Ine.(London，England))。
凝胶电泳用的细胞材料和培养上清的制备在2000rpm离心5分钟分离培养的T细胞和培养基。将上清冷冻干燥并溶于100μl裂解缓冲液中。将细胞直接重悬于100μl凝胶裂解缓冲液(9)中。将该材料保存在-80℃直到再次使用。
CD4+T细胞来源的蛋白质的ECL-Western印迹细胞或冷冻干燥的细胞培养上清被用于IL-4蛋白含量测定。通过印迹将来自单向15％SDS-PAGE凝胶的蛋白质转移到Hybond-ECL醋酸纤维素膜上(Amersham.RPN 2020D，UK)并用含0.1％Tweer-20的5％牛血清的蛋白(Sigma)的Tris缓冲盐溶液(pH7.8)封闭。然后用多克隆水平抗人IL-4抗体(R&D.Systems，UK)温育该印迹并接着使用辣根过氧化物酶标记的二抗(Cat.No.RPN 2106 ECL，Amersham，UK)，并，将胶片(Kodak X-OMAT-S，USA)曝光90秒钟检测免疫染色。
IT9302氨基酸序列的特异性对IT9302序列与其它已知蛋白的可能的同源性的检索是在EM130蛋白数据库上进行的，这得到了Institute for Medical Biochemistry，University of Aarnus，Denmark，Dr.Henrik.Leffers的热情帮助。
IT9302的氨基酸序列的特异性根据1994年6月10日做的来自EMBO蛋白数据库的信息，IT9302与人IL-10的序列有100％的同源性，并与Epstein-Barr病毒来源的与vIL-10类似的蛋白的序列有75％的同源性。其它的病毒蛋白如噬菌体T7和蕃茄黄叶卷曲病毒分别发现有75％和85％的一致性。结果本发明的概念产生于1992年10月和12月，当时根据如上所述的策略设计了一个称为IT9302的九肽，并且在1992年11月27日确定并订了每个原型(IT9302)的化学合成订单。期望该九肽能表现出模拟IL-10类似活性的免疫调节剂活性，并在这期间计划了下面的对照实验(实施例)。由发明人付费订货由Carlbiotech.Ltd.A/s，Denmark用自动多肽合成内进行IT9302的化学合成。然后在HPLC对该蛋白进行纯化并确定纯度大于95％、这就证实了合成的产物与发明人在1992年10和11月设计的IT9302是一致的。实施例1IT9302诱导的对人单核细胞自发的IL-8的产生的抑制测试的操作如“正常人外周血单核细胞(PBMC)IL-8的产生”中所述。用塑料粘附技术纯化单核细胞并被以3×106细胞/ml刺激40小时。如图3所示，IT9302抑制单核细胞IL-8的产生，并且0.1ng/mlIT9302抑制了体外IL-8自发产生的35％。在培养1天后细胞的存活性通常超过80％并且在本实施例和下面的实施例中加入0.1到1000ng/ml之间任意浓度的IT9302(IT9302分子量1,127道尔顿，rhIL-10推测分子量，18,4000道尔顿)不影响存活性。实施例2IT9302诱导的抑制IL-1β诱导的人外周血单核细胞(PBMC)IL-8的产生该测试的操作如“正常人外周血单核细胞(PBMC)IL-8的产生”中所述。如图4所示，IT9302以剂量依赖的方式抑制IL-1β体外诱导的人外周血单核细胞IL-8的产生。IT9302对IL-8产生的抑制在浓度0.01到100ng/ml之间达到平台期。实施例3IT9302诱导的人单核细胞白介素-1受体拮抗剂蛋白(IRAP)的产生该测试的操作如“IRAP浓度的测定”中所述。如图5所示，IT9302以剂量依赖的方式诱导人单核细胞IRAP的产生。当IT9302浓度大于10ng/ml时产量急剧增加。图6示rhIL-10对IRAP的诱导，并且因为hIL-10比IT9302高大约20倍，等摩尔的10ng/mlIT9302等于200ng/mlIL-10。因此在较低的浓度时IT9302和rhIL-10的效力是相仿的并且对IRAP的诱导是大约相等的。当IT9302浓度超过10ng/ml，IRAP的诱导急剧增加并且达到了约700ng/ml的水平。实施例4IT9302对人CD8+T淋巴细胞的趋化效应实验的操作如“白细胞趋化作用测试”中所述。如图7所示，IT9302诱导CD8+T淋巴细胞体外的趋化迁移，但对CD4+T细胞却无作用(数据未出示)。而且，本实验中所表明的IT9302的效力与前面所示的rhIL-10的效力相仿(参考文献14)。实施例5IT9302脱敏人CD8+T细胞导致对rhIL-10的非应答性实验的操作如“白细胞趋化作用测试中所述。在测试CD8+T细胞对rhIL-10的趋化应答之前30分钟向其悬液中加入IT9302。如图8中所示，用IT9302预保温细胞导致CD8+T细胞对rhIL-10应答的抑制。这表明IT9302可影响IL-10与IL-10受体的结合。实施例6IT9302抑制CD4+T淋巴细胞对IL-8的趋化应答实验的操作如“白细胞趋化作用测试”中所述。如图9所示，将IT9302在加入人CD4+T淋巴细胞的悬液之后以剂量依赖的方式抑制CD4+T细胞对IL-8的应答。实施例7IT9302抑制人单核细胞对MCAF/MCP-1的趋化应答实验如“单核细胞趋化作用”中所述的操作进行。如图10所示，IT9302在被加入到人单核细胞的悬液中之后以剂量依赖的方式抑制单核细胞对MCAF/MCP-1的趋化应答。实施例8IT9302不抑制人单核细胞上II型MHC分子的表达该试验的操作如材料和方法中所述并如下文表4所示rhIL-10抑制II型MHC的表达但IT9302却不抑制。
表4刺 激 玫瑰样单核细胞的数目0 12.0±1.0×104100ng/mlrhIL-10 4.6±1.4×1041μg/mlIT9302 11.0±3.0×104100ng/mlIT9302 14.4±2.4×10410ng/mlIT9302 11.2±3.2×104与试验相关的讨论本数据证明了合成的九肽IT9302对反映促炎症活性的过程；包括IL-8的产生以及单核细胞和/或T细胞迁移的剂量依赖的抑制效应。因此，IT9302能抑制过夜培养的人单核细胞自发的IL-8的产生。这可解释为对IL-8 MRNA产生和/或后续的蛋白产生和或释放的直接的抑制效应。另外的解释机制可基于这样一个事实体外培养的单核细胞表达并产生IL-1，并因此引起IL-8的产生。这一点得到已证明的IT9302强烈诱导单核细胞IRAP的产生的事实的支持。因此IT9302还可通过干扰IL-1的活性而抑制自发的IL-8的产生。IT9302诱导的观察到的IRAP看来诱导具有生物活性的IRAP。因为加入到培养物中的IT9302可拮抗IL-1诱导的IL-8的产生，但只有在IL-1加入培养物之前至少16小时加入才有效。这即意味着IT9302通过诱导IRAP的产生而抑制IL-1诱导的IL-8的产生，IRAP可接着通过其受体阻断IL-1的活性。如果IT9302直接引起IL-8的产生，那么可预期在加入IL-1之前1小时向培养物中加入IT9302应该能抑制IL-8的产生，但事实不是这样(数据未出示)。因此所观察到的IT9302对IL-8产生的抑制更可能是对IRAP产生的诱导而不是对IL-8产生的直接抑制。hIL-10也具有IT9302的这些功能表明IT9302具有IL-10类似的活性。IT9302还通过抑制CD4+T细胞应答IL-8的迁移的能力而模拟IL-10的活性。由于IL-8与多种不同状态的炎症相关，并且由于CD4+T细胞在T细胞介导的免疫炎症如皮肤过敏反应的侵入早期出现，这些特征可被证明在对T细胞介导的免疫炎症中有显著的治疗价值。
所证明的IT9302对CD8+T细胞趋化活性也是与IL-10的这样的活性一致的，并且因此IT9302可通过其结束T细胞介导的免疫炎症的抑制子活性而激活T细胞群体。因此根据上述实施例所证明的，IT9302在IL-10和/或IRAP具有治疗价值的疾病中也具有治疗价值。另外IT9302可对据信其中IL-8和/或MCAF和/或IL-1病理作用的疾病中具有治疗价值。实施例9IT9302和IL-10诱导CD4+T淋巴细胞中IL-4的产生背景和IL-10一样，IL-4也是TH2型CD4+T细胞的产物。据观察重组的人IL-10诱导培养的人CD4+T细胞IL-4的产生。这意味着IL-10，除了其自身的免疫抑制功能之外，还可诱导另一种免疫抑制细胞因子，IL-4的产生。因此检测了是否IT9302也诱导CD4+T细胞IL-4的产生。因此，如“T细胞趋化作用方法”中所述纯化，并且如“CD4+T淋巴细胞IL-4产生的测定”一书中所述培养的CD4+T细胞，被IT9302(10ng/ml)或IL-10(100ng/ml)刺激3天。收集胞质部分并用Western印迹(图11)和山羊抗人IL-4多克隆抗体分析其IL-4含量。
如图11中所示，发现IL-10以及IT9302都诱导培养的人CD4+T细胞IL-4的产生。实施例10IT9302抑制混合白细胞反应(MLR)中TNF-α的产生已经证明混合白细胞反应部分依赖反应中TNF-α的产生。已证明IT9302不明显降低MLR，但却发现在MLR中，TNF-α的产量显著减少。
因此，MLR的操作是纯化人白细胞并将来自同源供体的一百万细胞/ml培养4天。在建立培养物之前，将一组细胞用β射线照射2分钟。如“CD4+T淋巴细胞IL-4产生的测定”一节中所述纯化胞质蛋白部分，并用兔抗人TNF-α抗体进行Western印迹。
如图12所示，在人混合白细胞反应中观察到明显地的TNF-α产量的减少。实施例11IT9302对LPS诱导的猪休克和白细胞减少症的调节由于发现IT9302调节细胞因子的产生，包括TNF-α和IL-8，并得到发表物的猪IL-10序列的支持(Blancho等，1995)(参见图2羟基末端肽的同源性)，因此测试了IT9302是否能调节LPS诱导的猪白细胞减少症(图13)。
在预实验中，检测了静脉内注射0.1mg/kg IT9302对猪静脉内注射的2μg/kg LPS的效应的调节情况(N＝3)。在注射LPS之前30分钟注射IT9302，并如图13所述采血样。对总白细胞计数及不同的细胞计数进行确定，并以这些结果为基础计算出总的嗜中性白细胞的数目。
如已证明的，已观察到注射LPS引起暂时的白细胞减少症。但如图所示，注射IT9302可防止白细胞减少症。实施例12抗合成多肽IT9302的抗体合成多肽IT9302购自Kem-En-Tec A/S，Copenhagen，Denmark，高纯度大于95％。该多肽也由制造商将其与钥孔_血蓝素(KLH)相结合。可溶的IT9302/KLH比多肽单用更具免疫原性，并且还可被用作ELISA或Western印迹的对照蛋白。
兔的免疫将250μg与KLH偶联的IT9302，并作为完全弗氏佐剂的乳液，用于皮内或皮下注射。每隔两周注射一次共重复4次并在其后8天和12天对兔采血。在间隔一个月后皮下注射后来的加强剂量的注射250μgIT9302/KLH与不完全弗氏佐剂被施用。和斑点印迹免疫分析或Western印迹检测IT9302抗体的形成。
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序列表(1)一般的信息(i)申请人(A)姓名Nycomed DAK A/S(B)街道P.O.Box 1911，Lergraversvej 59(C)城市哥本哈根(E)国家丹麦(F)邮政编码(邮区)2300(ii)发明题目免疫调节剂(iii)序列数23(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatertIn Release #1.0，版本#1.3(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO1Ala Tyr Met Thr Met Lys ILe Arg Asn1 5(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO2Ala Tyr Met Thr Ile Lys Met Arg Asn1 5(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度9个(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO3Ala Phe Met Thr Leu Lys Leu Arg Asn1 5(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO4Ala Tyr Met Thr Met Lys Val Arg Glu1 5(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型
(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO5Gly Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO6Ala Phe Met Thr Met Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO7Ala Tyr Ile Thr Met Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO8Ala Tyr Leu Thr Met Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO9Ala Tyr Val Thr Met Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO10Ala Tyr Met Thr Leu Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸
(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO11Ala Tyr Met Thr Leu Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO12Ala Tyr Met Thr Val Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO13Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征
(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO14Ala Tyr Met Thr Met Lys Met Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO15Ala Tyr Met Thr Met Lys Val Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO16Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Asp Gln1 5(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO17Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Asp Gln1 5(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO18Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu1 5(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO19Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa1 5(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO20Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa1 5(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO21Xaa Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa1 5(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO22Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa1 5(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假设无(xi)序列描述SEQ ID NO23GCCTACATGA CAATGAAGAT ACGAAAC
权利要求
1.一种不同于人白介素10的是有至少如下特征之一的多肽a)诱导对人单核细胞自发的IL-8产生的抑制，b)诱导对IL-1β诱导的人外周血单核细胞(PBMC)IL-8的产生的抑制，c)诱导人单核细胞白介素-1受体拮抗剂蛋白(IRAP)的产生，d)诱导体外CD8+人T淋巴细胞的趋化迁移，e)脱敏人CD8+T细胞导致其对rhIL-10的非应答性，f)抑制CD4+人T淋巴细胞对IL-8的趋化应答，g)抑制人单核细胞对MCAF/MCP-1的趋化应答，h)与人IL-10不同，不抑制人单核细胞上II型MHC分子的表达，i)诱导培养的正常人CD4+T细胞IL-4的产生，j)减少人混合白细胞反应中TNFα的产生。
2.一种具有如下通式的多肽Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6(SEQ ID NO19)其中X4和X5分别选自Met，Ile，Leu和Val；和X6选自Asp，Gln和Glu。
3.一种具有如下通式的多肽X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6(SEQ ID NO20)其中X3，X4和X5分别选自Met，Ile，Leu和Val；和X6选自Asp，Gln和Glu。
4.一种具有如下通式的多肽X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6(SEQ ID NO21)其中X2是Tyr或Phe，X3，X4和X5分别选自Met，Ile，Leu和Val；和X6选自Asp，Gln和Glu。
5.一种具有如下通式的多肽X1-X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6(SEQ ID NO22)其中X1是Ala或Gly，X2是Tyr或Phe，X3，X4和X5分别选自Met，Ile，Leu和Val；和X6选自Asp，Gln和Glu。
6.根据权利要求2-5任一项的多肽，其中X1是Ala。
7.根据权利要求2-5任一项的多肽，其中X1是Gly。
8.根据权利要求2-7任一项的多肽，其中X2是Tyr。
9.根据权利要求2-7任一项的多肽，其中X2是Phe。
10.根据权利要求2-9任一项的多肽，其中X3是Met。
11.根据权利要求2-9任一项的多肽，其中X3是Ile。
12.根据权利要求2-9任一项的多肽，其中X3是Leu。
13.根据权利要求2-9任一项的多肽，其中X3是Val。
14.根据权利要求2-13任一项的多肽，其中X4是Met。
15.根据权利要求2-13任一项的多肽，其中X4是Ile。
16.根据权利要求2-13任一项的多肽，其中X4是Leu。
17.根据权利要求2-13任一项的多肽，其中X4是Val。
18.根据权利要求2-17任一项的多肽，其中X5是Met。
19.根据权利要求2-17任一项的多肽，其中X5是Ile。
20.根据权利要求2-17任一项的多肽，其中X5是Leu。
21.根据权利要求2-17任一项的多肽，其中X5是Val。
22.根据权利要求2-21任一项的多肽，其中X6是Asp。
23.根据权利要求2-21任一项的多肽，其中X6是Gln。
24.根据权利要求2-21任一项的多肽，其中X6是Glu。
25.一种包含如权利要求2-24任一项所定义的氨基酸序列或多肽。
26.一种多肽，它包含hIL-10序列的一个亚序列并且与vIL-10有66％的同源程度以及当mIL-1044％的同源程度。
27.Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn。
28.一种选自如下序列的多肽Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Met-Arg-Asn (SEQ ID NO2)，Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lys-Leu-Arg-Asn (SEQ ID NO3)，Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Glu (SEQ ID NO4)，Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO5)，Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO6)，Ala-Tyr-Ile-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO7)，Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO8)，Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO9)，Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO10)，Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO11)，Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO12)，Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO13)，Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-Asp (SEQ ID NO14)，Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp (SEQ ID NO15)，Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Gln (SEQ ID NO16)，和Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Glu (SEQ ID NO17).
29.一种根据权利要求1-28任一项的基本纯化形式的物质或多肽。
30.一种编码权利要求2-29任一项的多肽的核苷酸序列。
31.一种与权利要求2-29任一项的物质或多肽结合的抗体。
32.一种与具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的多肽特异结合的抗体。
33.一种根据权利要求31或32的为多克隆抗体的抗体。
34.一种根据权利要求31或32的为单克隆抗体的抗体。
35.一种根据权利要求31-34任一项的抗体，它能中和权利要求1所述的a)到g)活性中的一项或多项。
36.一种能中和权利要求1所述a)到g)活性中的一项或多项活性的单克隆19F1之外的其它物质。
37.一种包含权利要求36的物质的药用组合物。
38.权利要求36的物质在减少或中和高浓度的hIL-10和/或vIL-10中的用途。
39.权利要求36的物质在制备用于治疗或预防卵巢癌和/或艾滋病药用组合物中的用途。
40.一种治疗和/或防止卵巢癌和/或艾滋病的方法，该方法包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的权利要求36的物质。
41.具有hIL-10拮抗剂活性的化合物在制备用于治疗或预防卵巢癌和/或艾滋病的药用组合物中的用途。
42.一种治疗和/或防止卵巢癌和/或艾滋病的方法，该方法包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的具有hIL-10抑制剂活性的化合物。
43.一种包含权利要求1-29任一项的物质或多肽的药用组合物。
44.权利要求1-29任一项的物质或多肽在治疗或预防表3中所述的一种或多种疾病中的应用。
45.权利要求1-29任一项的物质或多肽在制备用于治疗或预防表3中所述的一种或多种疾病的药用组合物中的用途。
46.一种治疗和/或防止表3中所述的一种或多种疾病的方法，该方法包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的权利要求1-29任一项的物质或多肽。
全文摘要
本发明涉及不同于人白介素(10)的具有至少如下特征之一的一种多肽a)诱导对人单核细胞自发的IL-8的产生的抑制，b)诱导对IL-1β诱导的人外周血单核细胞(PBMC)IL-8产生的抑制，c)诱导人单核细胞白介素-1受体拮抗蛋白(IRAP)的产生，d)诱导体外CD8+人T淋巴细胞的趋化迁移，e)脱敏人CD8+T细胞，导致其对rhIL-10的非应答性，f)抑制人CD4+T淋巴细胞对IL-8的趋化反应，g)抑制人单核细胞对MCAF/MCP-1的趋化反应，h)与人IL-10不同，不抑制人单核细胞中MHC Ⅱ类分子的表达，i)诱导培养的正常人CD4+T细胞的IL-4的产生，j)减少人混合白细胞反应中TNF-α的产生。更具体地说，本发明涉及一个九肽Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn和其类似物以及其变异体。
文档编号C07K16/24GK1159830SQ95194787
公开日1997年9月17日 申请日期1995年6月7日 优先权日1994年7月5日
发明者C·格龙霍拉森, B·杰泽 申请人:史廷诺研究集团有限公司