专利名称：活力高于天然酶的含硒抗体酶的制备方法
技术领域：
本发明属于高活力含硒抗体酶的制备方法。
含硒谷胱甘肽过氧化物酶(简称GPX)的催化基团为硒代半胱氨酸(Sec)，它以还原型谷胱甘肽(GSH)为底物，可将过氧化氢(H2O2)或脂氢过氧化物(ROOH)还原成水或醇(ROH)，体内缺乏该酶时会引起心脑血管疾病、癌症、克山病、老年性疾病(如白内障)等。目前人们都是用含硒小分子化合物模拟该酶的生物功能，如Ebselen，Glutaselenone等，但催化效率仅为天然GPX的千分之一左右。八十年代后期才出现的抗体酶研究领域为GPX的人工模拟开辟了一条新途径。
目前抗体酶所能催化的反应有近百种，但催化效率要比天然酶普遍低2～3个数量级。中国专利94102481.4公开了题为“化学突变具有底物结合部位的单克隆抗体制备含硒抗体酶的方法”，该方法的制备过程为GSH与2，4-二硝基氯苯(DNCB)反应，制得S-二硝基苯取代的谷胱甘肽(GSH-S-DNP)作为半抗原；用戊二醛将半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联在一起作为全抗原；将全抗原加入福氏佐剂免疫小鼠，用标准单抗制备方法得到对GSH-S-DNP具有特异结合能力的单克隆抗体被命名为4A4。用苯甲基磺酰氟(PMSF)活化单抗可变区丝氨酸残基(Ser)上的羟基，再用硒化氢(H2Se)处理，则将Ser变成Sec，从而得到具有GPX活力的含硒抗体酶Sec-4A4(为了与没引入催化基团的单抗相区别，将含有Sec的抗体酶名前加Sec)，活力为1239酶活单位/微摩尔(U/μmol)，是天然兔肝GPX(5780U/μmol)的0.21倍，与天然酶相比催化效率还有一定差距，因此如何提高抗体酶活力、使其接近甚至超过天然酶并具有应用价值是抗体酶研究的关键所在。含硒抗体酶Sec-4A4活力不高主要有两个原因首先是半抗原结构设计的不合理，所用的半抗原为GSH-S-DNP，只是将GSH中较活泼的巯基用2，4-二硝基苯基团(DNP)进行了保护，从而提高了半抗原的稳定性和免疫原性。而用该半抗原免疫得到的单克隆抗体4A4对底物GSH的束缚作用过强，不利于底物向产物的转化；且抗原结合部位的空间相对较窄，不利于脂氢过氧化物进入活性中心，引起催化部位的有效空间窄小，使得催化基团不能充分发挥催化作用。另外天然酶的活性中心是一个位于分子表面扁平低凹处的疏水腔，而该半抗原带有两个负电荷的羧基，因此该半抗原的设计具有一定的片面性。在含硒抗体酶Sec4A4的制备中另一个需要创新的地方就是催化基团的引入。天然GPX中每个活性中心上只有一个Sec，而该发明中引入GPX催化基团Sec的主要步骤为先用PMSF活化单抗4A4可变区中Ser上的羟基，再通入过量的H2Se气体，使得Ser变成Sec。其中PMSF和H2Se都是大过量的，特别是H2Se不能够定量加入，使得反应体系中有单质硒析出，吸附在抗体分子表面上，很难除去，同时还引起Sec-4A4中Sec的引入过多、过乱，用5，5-二硫基双-2-硝基苯甲酸法测得每分子Sec-4A4上有五个Sec，而一个抗体分子上只有两个活性中心，说明Sec-4A4上不仅活性中心有Sec，而且非活性中心也含有Sec，这些非活性中心的Sec不仅催化效率极低，而且有可能影响活性中心的Sec发挥催化功能，对研究活性中心的催化机理还具有干扰作用，因此引入催化基团的方法还应进一步的改进，这对提高抗体酶的活力也是非常重要的一步。
本发明的目的在于提出一种新的抗体酶设计理论，设计系列结构合理的半抗原，通过单克隆抗体制备技术得到由底物结合部位和催化部位共同组成疏水腔的单抗，然后用NaHSe代替H2Se将催化基团定量引入到疏水腔中，从而得到活力高于天然酶的抗体酶。
本发明是在天然酶结构信息的基础上，以底物为蓝本，用系列疏水性修饰剂修饰底物，屏蔽底物带电基团，包括羧基、氨基、巯基等，增强半抗原的疏水性，从而诱导出在抗原结合部位上具有由底物结合部位和催化部位共同组成疏水腔的单抗，降低抗体对底物过强的亲和力，使得单抗对底物的亲和力与天然酶对底物的亲和力相当，再通过化学修饰方法将催化基团Sec引入，即用PMSF活化单抗可变区中丝氨酸上的羟基，选用液体NaHSe作为亲和试剂与活化的羟基反应，使得每个抗体分子上疏水腔内定量引入一个Sec，其它非活性部位不含有Sec，并且单质硒不易析出。
本发明合成步骤I.半抗原的设计与合成选择一组制备具有GPX活性含硒抗体酶的系列半抗原，结构如下
其中R为碳个数1～4的疏水性基团，包括甲基、乙基、丙基、正丁基、异丁基。
合成分两步首先GSH的巯基与2，4-二硝基氯苯(DNCB)在0℃反应，合成出含硒抗体酶Sec-4A4的半抗原GSH-S-DNP，然后再与1-4碳相应的醇包括甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、异丁醇等反应，将0.5～3.0ml 1-4碳的醇冷却至0～-10℃，分批加入0.1～0.3ml SOCl2，加入0.2～0.4克GSH-S-DNP室温放置2～4小时，补加3～10ml醇溶液，70～130℃回流30～60分钟，反应液在4～-30℃冷却，有固体析出，再用相应醇溶液重结晶，即得到疏水性较强的纯品半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯。
II.全抗原的合成6～12mg BSA与4～10mg半抗原溶于磷酸钠缓冲液中(pH7.2，0.2mol/L)，慢慢滴入0.3～1.0ml戊二醛溶液，反应10～15小时，加入6～15mg甘氨酸终止反应，用pH7.5，0.05mol/L磷酸钠平衡的交联葡聚糖凝胶(Sephadex G-25)层析柱分离，收集第一峰为全抗原。
III.单克隆抗体的制备将全抗原1.0～3.0mg/ml与福氏完全佐剂以体积比1∶1混合，每只BALB雌鼠注射0.2ml，两周后进行第二次免疫，四周后换成福氏不完全佐剂，第六周不加佐剂免疫，融合前三天不加佐剂加强免疫；鼠脾细胞与骨髓瘤细胞10∶1比例混合，在聚乙二醇/二甲亚砜作用下融合一分钟，播种在已加入巨噬细胞的培养板上，用含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷培养基(HAT培养基)在37℃二氧化碳培养箱中培养，用酶联免疫标记方法(ELISA)检测，两次呈阳性的细胞株进行克隆，将腹水经过预处理、45％硫酸铵沉淀、二乙基氨基乙基-纤维素(DEAE-52)离子交换柱层析(5mmol/L，pH 7.5Tris-HCl含20mmol/L NaCl缓冲液平衡，100mmol/L NaCl缓冲液洗脱)、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel P-200)过滤(0.2mol/L Tris-HCl，0.2mol/L NaCl)、蛋白G(HiTrapproteinG)亲和层析(pH 7.0 20mmol/L磷酸钠平衡，0.1mol/L pH 2.7甘氨酸-HCl缓冲液)将单抗纯化，经电泳检验为一条带，分子量为15万道尔顿。
IV.催化基团的引入0.5～1.0×10-8mol/L单抗溶在pH 7.0磷酸钠缓冲液中，加入3.0～6.1×10-8mol/L PMSF，室温振荡1～1.5小时，在高纯氮保护下加入1.0～2.1×10-7mol/L NaHSe溶液，35～40℃保温36～40小时，将反应液经过Sephadex G-25除盐后，冻干即得在单抗可变区上既有GSH结合部位、又有Sec的催化部位、活力达到天然GPX的含硒抗体酶的1.6到10倍。
由于本发明采用了一组结构合理的半抗原，制得的抗体酶不仅有底物GSH的结合部位，还具有Sec的催化部位，并且为GPX的另一底物脂氢过氧化物接近GSH和催化基团提供了所需的空间。因此制得的含硒抗体酶活力均高于天然兔肝GPX，属于世界首例活力高于天然酶的抗体酶。同时这一新的抗体酶设计理论不仅使得今后抗体酶的制备更加有规律可借鉴，而且还能得到一组系列的抗体酶，为揭示天然酶和抗体酶的空间结构和催化机制提供一整套的实验数据。
本发明用液体NaHSe代替H2Se气体，不仅使得用化学方法引入催化基团Sec变得更加方便、容易，而且还能将Sec个数固定在每个活性中心疏水腔中只含有一个Sec，从而方便了含硒抗体酶的结构研究和催化动力学研究。
由于单克隆抗体纯化容易，可大规模制备，因此利用本发明不仅可以较大规模生产含硒抗体酶，克服天然GPX纯化步骤繁琐、不能较大规模制备、来源有限等缺点，而且所制得含硒抗体酶稳定性普遍高于天然酶三倍以上，这为今后含硒抗体酶作为抗氧化型单抗治疗药物创造了良好的条件。
本发明制得的含硒抗体酶对超氧阴离子的抗性是天然GPX的一万倍，且已证实对老年性白内障、心肌坏死等都具有明显的防护作用，为今后的实际应用打下了坚实的基础。
本发明提供的实施例如下实施例12.0克GSH溶在20ml NaOH(1mol/L)中，在0℃条件下将溶在20ml乙醇中的2，4-二硝基氯苯1.4克逐滴加入到GSH溶液中，反应10分钟后，用盐酸调pH值在2左右，有黄色固体析出，用热水重结晶，70℃烘干，得到GSH-S-DNP 2.6克，产率90％。
0.8ml甲醇冷却至-10℃，分批加入0.1ml SOCl2，然后加入0.26克GSH-S-DNP，20℃放置两小时，再补加5ml甲醇，70±5℃水浴30min。冷却后淡黄色固体析出，用甲醇重结晶即得到纯品半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二甲酯(GSH-S-DNP Methyl Ester)，产率87％。
10mg牛血清白蛋白(BSA)与6.5mg半抗原溶于磷酸钠缓冲液中(pH7.2，0.2mol/L)，慢慢滴入0.7ml戊二醛溶液，反应10小时，加入10mg甘氨酸终止反应。然后用Sephadex G-25柱分离，收集第一峰为全抗原。
将全抗原2.0mg/ml与福氏完全佐剂以体积比1∶1混合，每只BALB雌鼠注射0.2ml，两周后进行第二次免疫，四周后换成福氏不完全佐剂，第六周不加佐剂免疫，融合前三天不加佐剂加强免疫；鼠脾细胞与骨髓瘤细胞10∶1比例混合，在聚乙二醇/二甲亚砜作用下融合一分钟，播种在已加入巨噬细胞的培养板上，用HAT培养基在37℃二氧化碳培养箱中培养，用酶联免疫标记方法(ELISA)检测，两次呈阳性的细胞株进行克隆，得到阳性细胞株命名为4G3。将腹水经过预处理、45％硫酸铵沉淀、DEAE-52纤维素离子交换柱层析、Bio-gel P-200凝胶过滤、HiTrap proteinG亲和层析将4G3单抗纯化，经电泳检验为一条带，分子量为15KDa。1.0×10-8mol/L单抗4G3溶在pH7.0磷酸钠缓冲液中，加入6.1×10-8mol/L PMSF，室温振荡1小时，在高纯氮保护下加入2.1×10-7mol/L NaHSe溶液，40℃保温36小时，将反应液经过Sephadex G-25除盐后，冻干即得含硒抗体酶Sec-4G3，其GPX活力为9337U/μmol，是天然兔肝GPX(5780U/μmol)的1.6倍。
实施例23.0ml正丁醇冷却到0℃，加入0.3ml SOCl2和0.4克GSH-S-DNP，室温放置3小时，补加5ml正丁醇，120～130℃回流一小时。反应液在-30℃冷却，有乳白色固体析出，用正丁醇重结晶，即得到半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二丁酯(GSH-S-DNP Butyl Ester)，产率92％。
6mg BSA与4mg半抗原溶于磷酸钠缓冲液中，滴入0.3ml戊二醛溶液，反应15小时，加入6mg甘氨酸终止反应，用pH 7.5，0.05mol/L磷酸钠缓冲液平衡的Sephadex G-25层析柱分离，流速为0.15ml/min，第一峰为全抗原。
将全抗原1.0mg/ml与福氏完全佐剂混合进行免疫，制得与半抗原GSH-S-DNP Butyl Ester特异结合的单抗命名为K8。0.5×10-8mol/L单抗K8溶在缓冲液中，加入3.0×10-8mol/LPMSF，室温振荡1.5小时，高纯氮下加入1.0×10-7mol/L NaHSe溶液，35℃保温40小时，除盐后即得含硒抗体酶Sec-K8，其GPX活力为49315U/μmol，是天然兔肝GPX的8.5倍。
实施例30.5ml乙醇冷却至-6℃，加入0.1ml SOCl2，加入0.2克GSH-S-DNP室温放置4小时，补加3ml乙醇溶液，80～90℃回流40min。用乙醇重结晶即得半抗原S-二硝基取代的谷胱甘肽二乙酯(GSH-S-DNP Ethyl Ester)。
12mg BSA与10mg半抗原溶于缓冲液，滴入1.0ml戊二醛，反应12小时，加入15mg甘氨酸终止反应。将全抗原3.0mg/ml与福氏完全佐剂混合进行免疫，用单抗制备技术制得单抗2B7。其它步骤与实施例2相同，得含硒抗体酶Sec-2B7，其GPX活力为15000U/μmol，是天然兔肝GPX的2.6倍。
实施例42.0ml丙醇冷却到-4℃，加入0.2ml SOCl2，加入0.35克GSH-S-DNP，室温放置3小时，补加10ml丙醇，110～120℃回流50分钟，用丙醇重结晶即得半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二丙酯。
其它与实施例1相同，筛选出单抗5C8，通过PMSF和NaHSe处理，最终得到含硒抗体酶Sec-5C8，其GPX活力为35000U/μmol，为天然兔肝GPX的6.0倍。
实施例5用异丁醇作为GSH的羧基保护剂合成半抗原，其它步骤与实施例2一致，得含硒抗体酶Sec-H9，活力为58000U/μmol，是天然酶的10倍。
权利要求
1.一种活力高于天然含硒谷胱甘肽过氧化物酶(简称GPX)的含硒抗体酶的制备方法，其特征在于选择一组GPX底物谷胱甘肽的衍生物作为制备含硒抗体酶的系列半抗原，结构入下
其中R为碳个数1～4的疏水性基团，包括甲基、乙基、丙基、正丁基、异丁基；合成分两步1)首先GSH的巯基与2，4-二硝基氯苯(DNCB)在0℃反应，合成出含硒抗体酶Sec-4A4的半抗原GSH-S-DNP，然后再与1-4碳相应的醇包括甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、异丁醇等反应，将0.5～3.0m 1-4碳的醇冷却至0～-10℃，分批加入0.1～0.3ml SOCl2，加入0.2～0.4克GSH-S-DNP室温放置2～4小时，补加3～10ml醇溶液，70～130℃回流30～60分钟，反应液在4～-30℃冷却，有固体析出，再用相应醇溶液重结晶，即得到疏水性较强的纯品半抗原S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯；2).全抗原的合成6～12mg BSA与4～10mg半抗原溶于磷酸钠缓冲液中(pH7.2，0.2mol/L)，慢慢滴入0.3～1.0ml戊二醛溶液，反应10～15小时，加入6～15mg甘氨酸终止反应，用pH7.5，0.05mol/L磷酸钠平衡的交联葡聚糖凝胶(Sephadex G-25)层析柱分离，收集第一峰为全抗原；3).单克隆抗体的制备将全抗原1.0～3.0mg/ml与福氏完全佐剂以体积比1∶1混合，每只BALB雌鼠注射0.2ml，两周后进行第二次免疫，四周后换成福氏不完全佐剂，第六周不加佐剂免疫，融合前三天不加佐剂加强免疫；鼠脾细胞与骨髓瘤细胞10∶1比例混合，在聚乙二醇/二甲亚砜作用下融合一分钟，播种在已加入巨噬细胞的培养板上，用含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷培养基(HAT培养基)在37℃二氧化碳培养箱中培养，用酶联免疫标记方法(ELISA)检测，两次呈阳性的细胞株进行克隆，将腹水经过预处理、45％硫酸铵沉淀、二乙基氨基乙基-纤维素(DEAE-52)离子交换柱层析(5mmol/L，pH7.5 Tris-Hcl含20mmol/L NaCl缓冲液平衡，100mmol/L NaCl缓冲液洗脱)、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel P-200)过滤(0.2mol/L Tris-HCl，0.2mol/L NaCl)、蛋白G(HiTrapproteinG)亲和层析(pH7.0 20mmol/L磷酸钠平衡，0.1mol/L pH 2.7甘氨酸-HCl缓冲液)将单抗纯化，经电泳检验为一条带，分子量为15万道尔顿；4).催化基团的引入0.5～1.0×10-8mol/L单抗溶在pH 7.0磷酸钠缓冲液中，加入3.0～6.1×10-8mol/L PMSF，室温振荡1～1.5小时，在高纯氮保护下加入1.0～2.1×10-7mol/L NaHSe溶液，35～40℃保温36～40小时，将反应液经过Sephadex G-25除盐后，冻干即得在单抗可变区上既有GSH结合部位、又有Sec的催化部位、活力达到天然GPX的含硒抗体酶的1.6到10倍。
全文摘要
本发明属于高活力含硒抗体酶的制备方法。本发明提出一种新的抗体酶设计理论,设计系列结构合理的半抗原,通过单克隆抗体制备技术得到由底物结合部位和催化部位共同组成活性中心疏水腔的单抗,然后用NaHSe代替硒化氢将催化基团定量引入到疏水腔中,从而得到活力高于天然含硒谷胱甘肽过氧化物酶的抗体酶。
文档编号C07K5/00GK1176307SQ96112628
公开日1998年3月18日 申请日期1996年9月10日 优先权日1996年9月10日
发明者丁兰, 赵大庆, 倪嘉缵, 罗贵民, 刘仔 申请人:中国科学院长春应用化学研究所