专利名称：环化粘合抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及式I的新的环肽环-(nArg-nGly-nAsp-nD-nE) I，其中D和E各自分别表示Gly、Ala、β-Ala、Asn、Asp、Asp(OR)、Arg、Cha、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Lys(Ac)、Lys(AcNH2)、Lys(AcSH)、Met、Nal、Nle、Orn、Phe、4-Hal-Phe、高-Phe、Phg、Pro、Pya、Ser、Thr、Tia、Tic、Trp、Tyr或Val，这些氨基酸残基也可以被衍生化，R是具有1-18个碳原子的烷基，Hal是F、Cl、Br、I，Ac是具有1-10个碳原子的链烷酰基、具有7-11个碳原子的芳酰基或具有8-12个碳原子的芳链烷酰基，n表示在相应的氨基酸残基的α-氨基官能团上无取代基，或取代基为烷基R、苄基或具有7-18个碳原子的芳烷基，附带条件是，至少一个氨基酸残基有一个取代基n，而且，当涉及到合适的活性氨基酸和氨基酸衍生物的残基时，包括D型和L型，还有它的生理上可以接受的盐。
从诸如EP 0406428和FEBS Lett.291-、50-54(1991)的文献中可获知没有N-烷基化的类似化合物。
本发明的目的是去发现具有有用特性的化合物，尤其是可用于生产药剂的化合物。
业已惊奇地发现，式I化合物及其盐具有非常有价值的特性。具体地说，它可以作为整联蛋白抑制剂，就此而言，它特别是能够抑制β3-或β5-整联蛋白受体与配体的相互作用。这种化合物对整联蛋白αVβ3-、αVβ5和αIIβ3尤其有效，而且与αVβ1-、αVβ6-和αVβ8-受体有关。这些作用可根据诸如J.W.Smith等人的方法(J.Biol.Chem.265，12267-12271(1990))加以证实。此外，它还具有抗炎症作用。
P.C.Brooks，R.A.Clark和D.A.Cheresh公开了由于血管整联蛋白与胞外基质蛋白的相互作用而导致血管形成的依据(Science 264，569-71，1994)。
P.C.Brooks，A.M.Montgomery，M.Rosenfeld，R.A.Reisfeld，T.-Hu，G.Klier和D.A.Cheresh公开了环肽抑制这种相互作用以及相应的成血管细胞的细胞程序死亡的开始(Cell 79，1157-64，1994)。
式I的化合物在阻止肿瘤细胞因转移而发展方面可作为GPIIb/IIIa拮抗物，它可阻遏整联蛋白受体与配体的相互作用，例如，血纤维蛋白原与血纤维蛋白原受体(糖蛋白IIb/IIIa)的相互作用。以下的观察可以证实这一点该化合物能够抑制金属蛋白酶与整联蛋白的结合，从而避免细胞利用这种酶的活性。P.C.Brooks等人将此解释为由于环化RGD肽抑制了基质金属蛋白酶-2(MMP-2)与玻连蛋白受体αVβ3的结合(Cell，85，683-693，1996)。
局部肿瘤的肿瘤细胞向血管系统的扩散，是通过因肿瘤细胞与血小板的相互作用而导致的微聚体的生成(小血栓)而发生的。这种肿瘤细胞被微聚积物提供的保护所屏蔽，并不能被免疫系统的细胞所识别。
这种微聚物能够沉积在血管壁上，有利于肿瘤细胞进一步向组织中渗透。由于小血栓的形成是由血纤维蛋白原与血纤维蛋白原受体在激活的血小板上结合而促成的，因此，可将GPIIa/IIb视为有效的转移抑制剂。
还可在采用生物材料、植入物、导管或起博器的手术中将式I化合物用作抗菌物质。就此而言，它具有抗菌作用。这种抗菌作用的效果可以用P.Valentin-Weigund等人的方法加以证实，见Infection andImmunity，2851-2855(1988)。
由于式I的化合物可作为血纤维蛋白原和血纤维蛋白原受体配体在血小板上结合的抑制剂，可将其作为诊断剂在血管里进行体内使用，用于血栓的检测和定位，只要用同位素标记过的或UV-可检测到的基团对其进行取代即可。采用成像法还可以在有机体内检测并定位肿瘤(肿瘤显像，PET)。
作为血纤维蛋白原抑制剂的式I化合物，还可在血小板在不同的活化阶段的代谢研究或血纤维原白原受体的胞内信号机制代谢研究中用作有效的助剂。插入标记的可检测单元，如生物素基(biotinyl)，在与受体结合以后使得上述机制能被研究。
因此，该化合物具有抑制天然的或合成的配体与整联蛋白，尤其是整联蛋白αVβ3、αVβ5和αIIbβ3以及αVβ1、αVβ6和αVβ8结合的特性。
而且，与现有技术相比它还具有如下优点一个或一个以上肽键的N-烷基化会导致代谢的稳定化并提高脂溶性。由于N-烷基不能作为C＝O的氢供体，通过对可能的氢键的还原作用，其渗透细胞膜的能力得到改善，从而可获得较高的口服吸收力；而且会出现较高的血浆蛋白质结合能力。
肽键的N-烷基化可提高该化合物的抑制效力，并提高其对特定整联蛋白的抑制选择性。这种选择性尤其受N-烷基的位置和数目的影响。
可将该化合物作为药用活性成分用于人用和兽用药品中，特别是用于预防和治疗循环系统疾病、血栓形成、贲门梗塞、动脉硬化、炎症、中风、心绞痛、肿瘤疾病、骨溶性疾病，特别是骨质疏松、血管形成和由血管形成所致的疾病，例如，糖尿病所致的眼部视网膜病、斑状退化、近视、眼组织胞浆菌病、风湿性关节炎、骨关节炎、糖尿病性青光眼，以及溃疡性结肠炎、Crohn氏症、多发性硬化、牛皮癣以及成血管以后的再狭窄。该化合物还可在细菌感染和急性肾病的情下用于改善和支持伤口的愈合过程。
这些作用可借助在以下文献记载的方法加以验证，例如由P.C.Brooks等人在Ceu 79，1157-1164(1994)或Science 264，569-571(1994)中所公开的方法。在上文和下文中的氨基酸残基的缩写，表示以下的氨基酸的残基Abu4-氨基丁酸Aha6-氨基己酸Ala丙氨酸Asn天冬酰胺Asp天冬氨酸Asp(OR) 天冬氨酸(β酯)Arg精氨酸Cha环己基丙氨酸Cit瓜氨酸Cys半胱氨酸Dab2，4-二氨基丁酸Dap2，3-二氨基丙酸Gln谷氨酰胺Glu谷氨酸Gly甘氨酸His组氨酸Ile异亮氨酸Leu亮氨酸Lvs赖氨酸Lvs(Ac)Nε-链烷酰基赖氨酸Lys(AcNH2) Nε-氨基链烷酰基赖氨酸Lys(AcSH) Nε-巯基链烷酰基赖氨酸Met蛋氨酸Nal3-(2-萘基)丙氨酸Nle正亮氨酸Orn鸟氨酸Phe苯丙氨酸4-Hal-Phe 4-卤代苯丙氨酸Phg苯基甘氨酸Pro脯氨酸Pya3-(2-吡啶基)丙氨酸Sar肌氨酸(N-甲基甘氨酸)Ser丝氨酸Tia3-(2-噻吩基)丙氨酸Tic四氢异喹啉-3-羧酸Thr苏氨酸Trp色氨酸Tyr酪氨酸Val缬氨酸另外，以下缩写的含义如下BOC叔丁氧基羰基BZl苄基DCCI 二环己基碳二亚胺DMF二甲基甲酰胺EDCI N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺氢氯酸盐Et 乙基Fmoc 9-芴甲氧羰基HOBt 1-羟基苯并三唑Me 甲基Mtr4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基NMeN-甲基化α-氨基OBut 叔丁酯OMe甲酯OEt乙酯POA苯氧基乙酰iPr异丙基nPr正-丙基TBTU 2-(1H-苯丙三唑-1-基)-1，1，
3，3-四甲基脲四氟硼酸盐TFA 三氟乙酸上述氨基酸可以若干对映体的形式出现，而且所有这些形式及其混合物(例如DL型)可作为式I化合物的组分包括在其中。上述氨基酸，在作为式I化合物的组分时还可带有合适的保护基团，该保护基团本身是已知的。
另外，本发明还包括其氨基酸残基被完全或部分衍生化的肽类。“衍生化的”一词是指所谓的“药物前体”，例如Arg的N-胍基一酰基衍生物，Asp的β-酯，Nε-链烷酰基，Nε-氨基链烷酰基和赖氨酸的Nε-巯基链烷酰基衍生物也包括在内。另外，所述氨基酸残基可被部分C-α-烷基化，或为了诊断目的而被同位素标记。还包括这样的式I化合物在D和E单位的侧链中进一步被氨基、羧基或巯基基团衍生化，因为这类衍生物是用于制备较高分子量接合物的重要起始化合物，例如为了免疫目的和抗体生产。还可将官能团用于某些氨基酸残基或衍生化的氨基酸残基的侧链中，以便将肽固定在聚合体材料上用于亲和层析柱的生产，或用上述官能团对诊断用的辅助试剂，如荧光取代基进行衍生化。
本发明还涉及制备如权利要求1所述的式I化合物或它的一种盐的方法，其特征在于它是通过用一种溶剂分解剂或氢解剂处理而从它的一个功能衍生物中释放出来的，或者式II的一种肽H-Z-OH II其中，Z为-nArg-nGly-nAsp-nD-nE--nGly-nAsp-nD-nE-nArg--nAsp-nD-nE-nArg-nGly--nD-nE-nArg-nGly-nAsp-或-nE-nArg-nGly-nAsp-nD-或是这样一种肽的一种反应衍生物，通过环化处理而得到，或是与式I化合物相应但具有一个或一个以上游离氨基、酸基和/或活化α碳原子的一种环肽是通过烷基化、酰化或酯化来衍生的，和/或通过酸或碱的处理将碱式或酸式的式I化合物转化成它的一种盐。
本文中，基团D、E和n具有在式I和II中定义的含义，除非另有说明。用于代表各基团的字母与用于表示氨基酸的单个字母码没有关系。
在上式中，烷基最好是甲基、乙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。
基团D最好是Phe、D-Phe及4-Hal-Phe，尤其是4-I-Phe和Trp、Tyr、高Phe、Nal或Phg，D构型同样可取。
E最好是疏水的氨基酸残基，尤其是Gly、Ala、Val、Leu、Nle或Ile。可变的n最好是肽中由N-甲基-、N-乙基、N-丙基、N-苄基或N-异丙基取代的α-氨基基团，两个或两个以上氨基酸残基被相同或不同的烷基基团取代是可能的。
因此，本发明特别涉及这样的式I化合物，其中，至少一个上述基团具有上述优选的含义。
化合物的优选基团可以用亚化学式Ia表示，它与式I相应，不过，其中D是D-Phe、Phe、D-Trp、Trp、D-Tyr、Tyr、D-高Phe、高Phe、D-Nal、Nal、D-Pbg、Phg或4-Hal-Phe(D或L型)，和E是Val、Gly、Ala、Leu、Ile或Nle。
化合物的另一个优选基团可用亚化学式Ib表示，它与式I相应，不过，其中D是D-Phe而E是Gly、Ala、Val、Leu、Ile或Nle，而且氨基酸残基Arg、Gly或Asp中的一个在α-氨基基团上有一个烷基取代基。
化合物的再一个优选基团可用亚化学式Ic表示，它与亚化学式Ia、Ib及化学式I相应，只不过氨基酸残基D或E中的一个在α-氨基上被烷基化。
另外，特别优选以亚化学式Ia、Ib和Ic形式出现的该化合物的所有生理上相容的盐类。
式I化合物以及用于制备这类化合物的原料是按照文献中公开的已知方法(例如Houben-Weyl的标准方法，Methoden derorganischen Chemie(有机化学方法)，Georg-Thieme-Verlag，Stuttgart)制备的，特别是在已知的适合上述反应的条件下进行。在本文中，其用途还可做已知变化，这里不再对其作进一步描述。
如有必要，也可在现场生产原材料，这样它就不被从反应混合物中分离出来，而是马上进一步反应以生成式I化合物。
式I化合物可通过溶剂分解，特别是水解或氢解由其功能性衍生物释放而得到。
用于溶剂分解或氢解的优选原材料是含有合适的保护氨基和/或羟基以取代一个或多个自由氨基和/或羟基的材料，尤其是带有由氨基保护基团取代与氮原子结合的氢原子的材料，例如带有NHR′基因而不是NH2基团的式I化合物(其中R′是一个氨基保护基团，例如BOC或CBZ)。
其它的优选原材料是带有取代羟基里的氢原子的羟基保护基团的材料，例如，含有R″O-苯基而不是羟苯基的式I化合物(其中R″是一个羟基保护基团)。
在原材料的分子中存在两个或两个以上相同或不同保护氨基和/或羟基也是可能的。如果存在的保护基团彼此不同，在多数情况下它会被有选择地消除。
“氨基保护基团”这一说法通常是指用于防止(用于阻遏)氨基发生化学反应，而且在该分子的其它位置进行所需要的化学反应之后容易去掉的基团。具体地讲，这种基团通常为未取代的或取代的酰基、芳基、芳烷氧基甲基或芳烷基基团。由于在所需的反应(或反应序列)之后氨基保护基团要被除去，所以其性质和大小并不重要；不过，它最好具有1-20个，特别是1-8个碳原子。“酰基基团”在本发明方法中被理解成具有最广泛的含义。它包括由脂族羧酸、芳脂族羧酸、芳香羧酸或杂环羧酸或磺酸衍生的酰基基团，特别是烷氧基羰基、芳氧基羰基，尤其是芳烷氧基羰基。这种酰基基团的例子有链烷酰基，如乙酰基、丙酰基、丁酰基；芳链烷酰基，如苯乙酰基；芳酰基，如苯甲酰基或甲苯酰基；芳氧基链烷酰基，如POA；烷氧基羰基，如甲氧基羰基、乙氧基羰基、2，2，2-三氯代乙氧基羰基、BOC、2-碘代乙氧基羰基；芳烷氧基羰基，如CBZ(“苄氧羰基”)、4-甲氧基苄氧羰基、FMOC；以及芳磺酰基，如Mtr。优选的氨基保护基团有BOC和Mtr，以及CBZ、Fmoc、苄基和乙酰基。
“羟基保护基团”的说法通常也是指适用于防止羟基基团发生化学反应，而且在该分子的其它位置发生所需要的反应后易于除去的基团。这种基团通常是指上述未取代的或取代过的芳基、芳烷基或酰基基团，以及烷基基团。羟基保护基团的性质和大小并不重要，因为在所需的化学反应或反应序列完成之后它就又被除去；具有1～20个，尤其是1-10个碳原子的基团较理想。羟基保护基的例子包括苄基、对硝基苯甲酰、对甲苯磺酰、叔丁基和乙酰基，特别是苄基和叔丁基。天冬氨酸和谷氨酸里的COOH基团最好以其叔丁酯(例如Asp(OBut))的形式保护起来。
作为原材料的式I化合物的官能衍生物，可用氨基酸或肽合成的常规方法制备，例如在上文提及的专利申请和标准著作中公开的方法，例如包括Merrifield的固相法(B.F.Gysin和R.B.Merrifield，J.Am.Chem.Soc.94，3102ff.(1972))。
由其官能衍生物产生式I化合物，是根据所采用的保护基团，用诸如强酸，特别是TFA或高氯酸处理进行的，还可用其它的强无机酸如氢氯酸或硫酸，强有机羧酸如三氯乙酸，或磺酸如苯磺酸或对甲苯磺酸。添加另一种惰性溶剂是可能的，但并非总是必须的。适用的惰性溶剂最好是有机的羧酸，如乙酸；醚，如四氢呋喃或二噁烷；酰胺，如DMF；卤化烃，如二氯甲烷；以及醇，如甲醇、乙醇或异丙醇；还有水。也可采用上述溶剂的混合物。TFA最好过量使用而不添加其它溶剂；高氯酸以与乙酸混合的形式使用，乙酸与70％高氯酸的比例为9∶1。进行裂解的反应温度宜在0～50°；最好是在15～30°(室温)进行。
基团BOC、OBut和Mtr可被除去，例如，在15～30°用溶于二氯甲烷中的TFA或溶于二噁烷中的3～5N HCl处理。而FMOC可在15-30°用溶于DMF中的5～50％的二甲胺、二乙胺或吡啶溶液除去。
可通过氢解除去的保护基团(例如CBZ或苄基)，可以通过在有催化剂(例如贵金属催化剂，如钯，最好由活性炭支持着的)情况下用氢处理将其除去。本发明中适用的溶剂有上面提到的那些，特别是醇类，如甲醇或乙醇，或酰胺如DMF。氢解原则上讲是在0～100°的温度和1～200bar的压力下进行，最好是在20～30°和1～10bar的条件下进行。CBZ基团的氢解可于20～30°在溶于甲醇里的5-10％的Pd-C上进行，或在溶于甲醇/DMF的Pd-C上的甲酸铵(取代H2)处理。
还可以通过在肽合成条件下环化式II化合物以得到式I化合物。此时，该反应宜按照所述常规肽合成方法进行，例如，参见Houben-Weyl，1.c.，Vol.15/II，P1～806(1974)。
上述反应最好是在有脱水剂的条件下在惰性溶剂中进行，脱水剂的例子有碳化二亚胺，如DCCI或EDCI，还有丙膦酸酐(参见Angew.Chem.92，129(1980))，二苯磷酰基叠氮化物或2-乙氧基-N-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉；惰性溶剂的例子有卤化烃，如二氯甲烷，醚如四氢呋喃或二噁烷，酰胺如DMF或二甲基乙酰胺，腈如乙腈；或这些溶剂的混合物。反应温度为-10～40°，最好为0～30°。为了促进分子内环化超过分子间的肽结合，宜在稀释溶液中进行反应(稀释原理)。
在该反应中，也可采用这种物质的适用的反应衍生物以代替式II化合物，例如，其反应基团被保护基团居间保护起来的物质。氨基酸衍生物II可以其活性酯的形式使用，它宜在现场生成，例如，通过添加HOBt或N-羟基琥珀酰亚胺。
一般，式II的原材料是新的。它可以用已知的方法制备，例如，上文提及的肽合成方法和保护基团消除方法。
通常，首先合成被保护的化学式为R′-Z-OR″的五肽酯，如BOC-Z-OMe或BOC-Z-OEt。然后它被水解，得到化学式为R′-Z-OH的酸，如BOC-Z-OH；随后保护基团R′被从这种酸上除去，得到化学式为H-Z-OH(II)的游离肽。
与式I化合物相应的环肽的衍生化，是用已知方法完成的，像已知的胺的烷基化方法，羧酸的脂化方法或在脂族碳原子上的亲核取代方法，在任何一本有机化学课本中都记载有这种方法，例如，J.March，Adv.Org.Chem.，John Wiley & Sons N.Y.(1985)。
用一种酸可将式I的碱转化成相应的酸加成盐。适用于该反应的酸是那些能生成生理上可接受的盐的酸。因此，无机酸可以采用，其例子有硫酸、硝酸、氢卤酸如氢氯酸或氢溴酸、磷酸如正磷酸、氨基磺酸；有机酸也可采用，尤其是脂族酸、脂环族酸、芳脂族酸、芳族酸或杂环一元或多元羧酸、磺酸或硫酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、丁二酸、庚二酸、富马酸、马来酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、苯甲酸、水杨酸、2-或3-苯丙酸、柠檬酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲烷或乙烷磺酸、乙烷二磺酸、2-羟基乙烷磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘-一磺酸或萘-二磺酸、十二烷基硫酸.与生理上可接受的酸形成的盐，如苦味酸盐可用于分离和/或提纯式I化合物。
另外，式I的酸可通过与碱反应转化成它的生理上可以接受的一种金属盐或铵盐。在本发明中特别适用的盐有钠盐、钾盐、镁盐、钙盐和铵盐，以及取代过的铵盐，例如二甲基-、二乙基-或二异丙基铵盐、一乙醇铵盐、二乙醇铵盐、三乙醇胺盐、环己基铵盐、二环己基铵盐、二苄基乙二铵盐，还有与N-甲基-D-葡糖胺或精氨酸或赖氨酸形成的盐。
式I的新化合物及其生理上可以接受的盐可用于生产药品制剂，将其与至少一种赋形剂或辅助剂，必要时还有一种或一种以上其它活性成分一起制成适当的剂型。由此所获得的制剂可用作人体医学或兽医学的药品。适用的赋形物质是这样的它适于肠内使用(如口服或直肠使用)、肠胃外使用(如静脉注射)或局部使用(如表面、表皮、眼部或鼻腔使用)或以吸入雾剂的形式使用，而且不会与这种新的化合物反应。其例子有水或等渗盐水溶液、低级醇、植物油、苄醇、聚乙二醇、三乙酸甘油和其它的脂肪酸甘油酯、白明胶、大豆卵磷脂、碳水化合物如乳糖或淀粉，硬脂酸镁、滑石、纤维素和石油凝胶。用于口服时，普通片剂、包衣片剂、胶囊、糖浆、汁或滴剂特别适用；最有用的是包衣片剂和具有肠溶包衣或胶囊壳的胶囊。栓剂可用于直肠使用，溶液用于肠胃外使用，尤其是油成或水成溶液，以及悬浮液、乳液或植入物。适于表面施用的剂型举例来说有溶液，它可以以滴眼液的形式被采用，还有悬浮液、乳液、乳膏、软膏或浓缩液。为了以吸入雾剂的形式使用，可以采用含有活性成份的雾剂，该活性成分溶于或悬浮于推进气体或推进气体混合物(例如CO2或氟氯烃取代物)。在这种情况下，活性成分宜在存在一种或一种以上其它生理相容溶剂，如乙醇的条件下以微粒化的形式采用。吸入液可借助于常规吸入器使用。这种新的化合物也可被冷冻干燥，所得冻干物用于生产注射制剂。这种注射制剂可以快速浓注液或连续输液(例如静脉、肌内、皮下或鞘内)的形式使用。上述制剂可被消毒和/或含有辅助剂，如防腐剂、稳定剂和/或湿润剂、乳化剂、用于调节渗透压的盐、缓冲物质、着色剂和/或香味剂。如有必要，还可以含有一种或一种以上的活性成分，如一种或一种以上的维生素。
一般，本发明的物质可以与其它已知市售肽类似的方法使用，特别是以类似于US-A-4 472 305中所公开的化合物的形式使用，每剂量单位宜为0.05～500mg，最好是0.5～100mg。每公斤体重的每日剂量最好为0.01～2mg。不过，每个具体患者的特定剂量取决于多种因素，例如，所用化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、使用时间和方式、排泄时间、药物的组合形式和治疗对象的具体患病程度。以肠胃外使用为佳。
一种其中Arg或DArg被Orn或DOrn所取代的本发明的化合物可被用作合成本发明的肽的前体，因为通过与胍反应可将Orn转化成Arg。该方法特别适于将11C或14C同位素引入肽中，以得到放射性标记的Arg肽。
另外，式I的新化合物可用作生产亲和层析柱的整联蛋白配体，这种层析柱可用于生产纯的整联蛋白。
在这种情况下，上述配体即式I的肽衍生物通过锚定作用与高分子支承体共价结合。
适用的高分子支承材料是肽化学中已知的高分子固体表面，最好是具有亲水性能，例如交联的多糖，如纤维素、Sepharose或Sephadex、丙烯酰胺、聚乙二醇基聚合物或Tentakel聚合物。
连接高分子支承体的适用锚定官能团最好是具有2-12个碳原子的线性亚烷基链，其一端直接与上述高分子结合，在其另一端有一个官能团，如羟基、氨基、巯基、马来酰亚胺或-COOH，它适于与相应的肽的C-或N-末端部分连接。
在这种情况下，可将肽直接地或通过第二个锚定官能团结合在上述高分子的锚定官能团上。对于含有具有功能化侧链的氨基酸残基的肽来说，还可以通过这些侧链结合在上述高分子的锚定官能团上。
另外，可以对构成式I肽的某些氨基酸残基的侧链进行修饰，以使其能够通过SH、OH、NH2或COOH基与上述高分子的锚定基团锚固。
就此而言，不常见的氨基酸也可采用，其例子有苯丙氨酸衍生物，在苯环的位置4上带有巯基、羟基、氨基或羧烷基链，官能团位于该链的末端。
其侧链可被直接用作锚定官能团的氨基酸残基的例子有Lys、Orn、Arg、Dab、Dap、Asp、Asn、Glu、Gln、Ser、Thr、Cys、Cit或Tyr。
N-末端锚定官能团是诸如-CO-CnH2n-NH2，-CO-CnH2n-OH、-CO-CnH2n-SH或-CO-CnH2n-COOH之类的基团，其中n＝2-12，亚烷基链的长度并非关键，而且，如有必要还可用适当的芳基或烷芳基取代该链。
C-末端锚定基团可以是-O-CnH2n-SH-、-O-CnH2n-OH、-O-CnH2n-NH2、-O-CnH2n-COOH、-NH-CnH2n-SH、-NH-CnH2n-OH、-NH-CnH2n-NH2或-NH-CnH2n-COO，n和亚烷基链均与前一部分的解释相同。
上述N-和C-末端锚定基团，也可用作氨基酸残基的已经官能化的侧链的锚定部分。适用于这种情形的氨基酸残基有Lys(CO-C5H10-NH2)、Asp(NH-C3H6-COOH)或Cys(C3H6-NH2)，所述锚定基团总是与侧链的官能团结合。
用于用来纯化整联蛋白的亲和层析的材料是在诸如缩合氨基酸的常规已知条件下进行的，在有关式I化合物的制备部分对此已作阐述。
除了可将环肽固定在高分子材料上用于生产亲和层析柱外，还可以采用其官能化侧链用诊断用辅助试剂，如荧光取代基进一步衍生化的化合物。
另外，还可以把诸如氨基、巯基或羧基之类的官能团引入基团D和E的侧链中，这样就可将其与蛋白质或其它高分子本体材料一起制备成共轭物，用于免疫目的和/或抗体生产。
本文中所涉及的所有温度均为℃。在下面的实施例中，“常规处理”是指必要时加水，中和混合物并用乙醚或二氯乙烷提取，分离不同的相，有机相在硫酸钠上干燥，过滤并蒸发浓缩，通过在硅胶上层析和/或结晶提纯残余物。RT＝保留时间(分)。在LichrosorbRRP上进行HPLC分析，选择B(7μm)-250×4mm柱，洗脱液A溶于水的0.3％ TFA；洗脱液B溶于2-丙醇/水(8∶2)的0.3％ TFA，在50分钟时间内用梯度1～99％B以1ml/min的流速洗脱，并在215nm下检测。M＋＝通过“快速原子轰击”(FAB)法获得的质谱里的分子峰。例1用85ml二氯甲烷稀释溶于15ml DMF中的0.6g H-NMe-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Val-ONa〔可通过用哌啶/DMF除去Fmoc基并用TFA/CH2Cl2(1∶1)除去树脂的方法由Fmoc-NMe-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Val-O-Wang获得，-O-Wang是改进的Merrifield技术中所用4-羟甲基-苯氧甲基-聚苯乙烯树脂上的基团〕的溶液，并加入50mg NaHCO3。在干冰/丙酮混合物中冷却之后，加入40μl二苯基磷酰叠氮化物。在室温下放置16小时后将该溶液浓缩。对浓缩物进行凝胶过滤(Sephadex G10柱，在异丙醇/水8∶2中进行)，然后用常规方法通过HPLC纯化。用TFA/H2O(98∶2)处理，得到环-(NMe-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val)；RT＝18.1；FAB-MS(M＋H)589。
下面的产物是通过类似方法环化相应的线性肽并去掉保护基而获得的
环-(Arg-NMeGly-Asp-DPhe-Val)；RT＝17.9；FAB-MS(M＋H)589；环-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Val)；RT＝18.3；FAB-MS(M＋H)589；环-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Val)xTFA；RT＝15.4；FAB-MS(M＋H)589；环-(Arg-Gly-Asp-NMeDPhe-Val)；RT＝18.9；FAB-MS(M＋H)589；环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)；RT＝19.5；FAB-MS(M＋H)589；环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeLys)；RT＝11.1；FAB-MS(M＋H)618；环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeLys(苄氧基羰基)x TFA＝23.4；FAB-MS(M＋H)752；环-(NEtArg-Gly-Asp-DPhe-Val)；FAB-MS(M＋H)603；环-(Arg-NEtGly-Asp-DPhe-Val)；FAB-MS(M＋H)603；环-(Arg-Gly-NEtAsp-DPhe-Val)；FAB-MS(M＋H)603；环-(Arg-Gly-Asp-NEtDPhe-Val)；FAB-MS(M＋H)603；环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NEtVal)；FAB-MS(M＋H)603；环-(Arg-Gly-Asp-DPhe(4-I)-NMeVal)；RT＝23.5；FAB-MS(M＋H)715；环-(NPrArg-Gly-Asp-DPhe-Val)；FAB-MS(M＋H)617；环-(Arg-NPrGly-Asp-DPhe-Val)；FAB-MS(M＋H)617；环-(Arg-Gly-NPrAsp-DPhe-Val)；FAB-MS(M＋H)617；环-(Arg-Gly-Asp-NPrDPhe-Val)；FAB-MS(M＋H)617；环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NPrVal)；FAB-MS(M＋H)617；环-(NBzlArg-Gly-Asp-DPhe-Val)；FAB-MS(M＋H)665；环-(Arg-NBzlGly-Asp-DPhe-Val)；FAB-MS(M＋H)665；环-(Arg-Gly-NBzlAsp-DPhe-Val)；FAB-MS(M＋H)665；环-(Arg-Gly-Asp-NBzlDPhe-Val)；FAB-MS(M＋H)665；环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NBzlVal)；FAB-MS(M＋H)665；环-(Arg-Gly-Asp-Phe-DNMeVal)x TFA；RT＝18.2；FAB-MS(M＋H)589；环-(NMeArg-Gly-Asp-DPhe-Leu)；FAB-MS(M＋H)603；
环-(Arg-NMeGly-Asp-DPhe-Leu)；FAB-MS(M＋H)603；环-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Leu)；FAB-MS(M＋H)603；环-(Arg-Gly-Asp-NMeDPhe-Leu)；FAB-MS(M＋H)603；环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeLeu)；FAB-MS(M＋H)603；环-(NEtArg-Gly-Asp-DPhe-Leu)；FAB-MS(M＋H)617；环-(Arg-NEtGly-Asp-DPhe-Leu)；FAB-MS(M＋H)617；环-(Arg-Gly-NEtAsp-DPhe-Leu)；FAB-MS(M＋H)617；环-(Arg-Gly-Asp-NEtDPhe-Leu)；FAB-MS(M＋H)617；环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NEtLeu)；FAB-MS(M＋H)617；环-(NPrArg-Gly-Asp-DPhe-Leu)；FAB-MS(M＋H)631；环-(Arg-NPrGly-AsP-DPhe-Leu)；FAB-MS(M＋H)63l；环-(Arg-Gly-NPrAsP-DPhe-Leu)；FAB-MS(M＋H)631；环-(Arg-Gly-Asp-NPrDPhe-Leu)；FAB-MS(M＋H)631；环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NPrLeu)；FAB-MS(M＋H)631；环-(NBzlArg-Gly-Asp-DPhe-Leu)；FAB-MS(M＋H)679；环-(Arg-NBzlGly-Asp-DPhe-Leu)；FAB-MS(M＋H)679；环-(Arg-Gly-NBzlAsp-DPhe-Leu)；FAB-MS(M＋H)679；环-(Arg-Gly-Asp-NBzlDPhe-Leu)；FAB-MS(M＋H)679；环-(Arg-Gly-AsP-DPhe-NBzlLeu)；FAB-MS(M＋H)679；环-(NMeArg-Gly-Asp-DPhe-Ala)；环-(Arg-NMeGly-Asp-DPhe-Ala)；环-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Ala)；环-(Arg-Gly-Asp-NMeDPhe-Ala)；环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeAla)；RT＝16.2；FAB-MS(M＋H)561；环-(NEtArg-Gly-Asp-DPhe-Ala)；环-(Arg-NEtGly-Asp-DPhe-Ala)；环-(Arg-Gly-NEtAsp-DPhe-Ala)；环-(Arg-Gly-Asp-NEtDPhe-Ala)；环-(Arg-Gly-AsP-DPhe-NEtAla)；环-(NPrArg-Gly-Asp-DPhe-Ala)；环-(Arg-NPrGly-Asp-DPhe-Ala)；环-(Arg-Gly-NPrAsp-DPhe-Ala)；
环-(Arg-Gly-Asp-NPrDPhe-Ala)；环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NPrAla)；环-(NBzlArg-Gly-Asp-DPhe-Ala)；环-(Arg-NBzlGly-AsP-DPhe-Ala)；环-(Arg-Gly-NBzlAsP-DPhe-Ala)；环-(Arg-Gly-AsP-NBzlDPhe-Ala)；环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NBzlAla)；环-(NMeArg-Gly-AsP-DPhe-Gly)；环-(Arg-NMeGly-AsP-DPhe-Gly)；环-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Gly)；环-(Arg-Gly-Asp-NMeDPhe-Gly)；环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeGly)；RT＝14.3；FAB-MS(M＋H)547；环-(DArg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)x TFA；RT＝18.7；FAB-MS(M＋H)589；环-(NEtArg-Gly-Asp-DPhe-Gly)；环-(Arg-NEtGly-Asp-DPhe-Gly)；环-(Arg-Gly-NEtAsp-DPhe-Gly)；环-(Arg-Gly-Asp-NEtDPhe-Gly)；环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NEtGly)；环-(NPrArg-Gly-Asp-DPhe-Gly)；环-(Arg-NPrGly-Asp-DPhe-Gly)；环-(Arg-Gly-NPrAsP-DPhe-Gly)；环-(Arg-Gly-AsP-NPrDPhe-Gly)；环-(Arg-Gly-AsP-DPhe-NPrGly)；环-(NBzlArg-Gly-Asp-DPhe-Gly)；环-(Arg-NBzlGly-Asp-DPhe-Gly)；环-(Arg-Gly-NBzlAsp-DPhe-Gly)；环-(Arg-Gly-Asp-NBzlDPhe-Gly)；环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NBzlGly)；环-(NMeArg-Gly-Asp-Phg-Val)；环-(Arg-NMeGly-Asp-Phg-Val)；环-(Arg-Gly-NMeAsp-Phg-Val)；环-(Arg-Gly-Asp-NMePhg-Val)；环-(Arg-Gly-Asp-Phg-NMeVal)；环-(NEtArg-Gly-Asp-Phg-Val)；环-(Arg-NEtGly-Asp-Phg-Val)；环-(Arg-Gly-NEtAsp-Phg-Val)；环-(Arg-Gly-Asp-NEtPhg-Val)；环-(Arg-Gly-Asp-Phg-NEtVal)；环-(NPrArg-Gly-Asp-Phg-Val)；环-(Arg-NPrGly-Asp-Phg-Val)；环-(Arg-Gly-NPrAsp-Phg-Val)；环-(Arg-Gly-Asp-NPrPhg-Val)；环-(Arg-Gly-Asp-Phg-NPrVal)；环-(NBzlArg-Gly-Asp-Phg-Val)；环-(Arg-NBzlGly-Asp-Phg-Val)；环-(Arg-Gly-NBzlAsP-Phg-Val)；环-(Arg-Gly-Asp-NBzlPhg-Val)；环-(Arg-Gly-Asp-Phg-NBzlVal)；环-(NMeArg-Gly-Asp-Trp-Val)；环-(Arg-NMeGly-Asp-Trp-Val)；环-(Arg-Gly-NMeAsp-Trp-Val)；环-(Arg-Gly-Asp-NMeTrp-Val)；环-(Arg-Gly-Asp-Trp-NMeVal)；环-(NEtArg-Gly-Asp-Trp-Val)；环-(Arg-NEtGly-Asp-Trp-Val)；环-(Arg-Gly-NEtAsp-Trp-Val)；环-(Arg-Gly-Asp-NEtTrp-Val)；环-(Arg-Gly-Asp-Trp-NEtVal)；环-(NPrArg-Gly-Asp-Trp-Val)；环-(Arg-NPrGly-Asp-Trp-Val)；环-(Arg-Gly-NPrAsp-Trp-Val)；环-(Arg-Gly-Asp-NPrTrp-Val)；环-(Arg-Gly-AsP-Trp-NPrVal)；环-(NBzlArg-Gly-Asp-Trp-Val)；环-(Arg-NBzlGly-Asp-Trp-Val)；环-(Arg-Gly-NBzlAsp-Trp-Val)；环-(Arg-Gly-Asp-NBzlTrp-Val)；环-(Arg-Gly-Asp-Trp-NBzlVal)例2将0.28g溶于8.4mlTFA、1.7ml二氯甲烷和0.9ml苯硫酚的环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-NMePhe-Dval)〔可按例1的方法环化获得〕溶液在室温下放置4小时，然后浓缩，用水稀释残余物，再进行冷冻干燥。在Sephadex G10上进行凝胶过滤(乙酸/水1∶1)，然后在上述条件下用制备HPLC进行纯化，得到环-(Arg-Gly-Asp-NMePhe-DVal)；FAB-MS(M＋H)589。
下面的产物是用类似方法获得的由环-(Arg(Mtr)-Gly-NMeAsp-DPhe-Ile)环-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Ile)；FAB-MS(M+H)603；由环-(D-Arg(Mtr)-NMeGly-Asp(OBut)-DPhe-Nle)环-(D-Arg-NMeGly-Asp-DPhe-Nle)；由环-(NMeArg(Mtr)-Gly-D-Asp(OEt)-DPhe-Ile)环-(NMeArg-Gly-D-Asp-DPhe-Ile)；由环-(NMeArg(Mtr)-Gly-Asp-Phe-DIle)环-(NMeArg-Gly-Asp-Phe-DIle)；由环-(Arg(Mtr)-Gly-NMeAsp-Phe-DLeu)环-(Arg-Gly-NMeAsp-Phe-DLeu)；由环-(Arg(Mtr)-NMeGly-Asp-Phe-DSer)环-(Arg-NMeGly-Asp-Phe-DSer)；由环-(Arg(Mtr)-NMeGly-Asp-DNal-Leu)环-(Arg-NMeGly-Asp-DNal-Leu)；由环-(NMeArg(Mtr)-Gly-Asp-Nal-DIle)环-(NMeArg-Gly-Asp-Nal-DIle)；由环-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-NMePhg-DVal)环-(Arg-Gly-Asp-NMePhg-DVal)；由环-(Arg(Mtr)-Gly-NMeAsp-Trp-DVal)环-(Arg-Gly-NMeAsp-Trp-DVal)例3将80mg环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)溶于5～6倍的0.01m HCl中，在每次溶解操作之后进行冷冻干燥。接着进行HPLC提纯，得到环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)×HCl；FAB-MS(M+H)589。
下面的产物是通过类似方法获得的由环-(NMeArg-Gly-Asp-DPhe-Val)环-(NMeArg-Gly-Asp-DPhe-Val)x HCl；由环-(Arg-NMeGly-Asp-DPhe-Val)环-(Arg-NMeGly-Asp-DPhe-Val)x HCl；FAB-MS(M+H)589；由环-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Val)环-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Val)x HCl；由环-(Arg-Gly-Asp-NMeDPhe-Val)环-(Arg-Gly-Asp-NMeDPhe-Val)x Hcl；由环-(Arg-Gly-Asp-Phe-DNMeVal)环-(Arg-Gly-Asp-Phe-DNMeVal)x Hcl；RT＝18.2；FAB-MS(M+H)589.下面的产物是用乙酸(AcOH)进行类似处理而获得由环-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-val)环-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Val)x AcOH；RT＝15.4；FAB-MS(M＋H)589。类似地，下面的产物是用甲磺酸(MeSO3H)处理而获得的由环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)x MeSO3H；RT＝17，8；FAB-MS(M＋H)589；例4为了制备亲和相，将0.9g N-马来酰亚胺-(CH2)5-CO-NH-(CH2)3聚合物〔通过N-马来酰亚胺-(CH2)5-COOH与H2N-(CH2)3聚合物的缩合而获得〕悬浮在pH7的10ml 0.1M磷酸钠缓冲液中，并在4°加入等量的环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeLys(CO(CH2)2SH)。将反应混合物搅拌4小时，同时加热至室温，滤去固体残余物，并用10ml的每种缓冲液(pH7)洗涤2次，再用水洗涤3次，每次用水10ml。获得环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeLyse(CO(CH2)2S-3-(N-马来酰亚胺-(CH2)5-CONH-(CH2)3聚合物。例5与例4类似，通过缩合聚合物-O-(CH2)3-NH2(可由商业渠道获得)和环-(Arg-Gly-Asp-NMe-DPhe-Lys(CO(CH2)4COOH)〔通过在上述条件下缩合己二酸和环-(Arg-Gly-Asp-NMe-DPhe-Lys而获得〕得到下面的聚合相环-(Arg-Gly-Asp-NMe-DPhe-Lys-(CO-(CH2)4-CO-NH-(CH2)3-O-聚合物)。
类似地，通过环-(NMe-Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys-(CO-(CH2)5-NH2))与HOOC-CH2-O-聚合物的缩合得到以下产物环-(NMe-Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys-(CO-(CH2)5-NH-CO-CH2-O-聚合物))。
以下实施例涉及药用制剂。例A注射药瓶将100g式I的环肽和5g Na2HPO4溶于3升双蒸馏水中，并用2N的氢氯酸将pH调整至6.5，进行无菌过滤，分装到注射药瓶中并在无菌条件下冷冻干燥，以无菌方式密封药瓶。每个注射药瓶含有5mg活性成分。例B栓剂将20g式I活性成分的混合物与100g大豆卵磷脂和1400g可可脂一起熔化，再将该混合物倒入模具中并使其冷却。每个栓剂含有20mg活性成分。例C溶液将1g式I的活性成分、9.38g NaH2PO4×2H2O、28.48gNa2HPO4×12H2O和0.1g氯化苄烷铵溶于940ml双蒸馏水中制成溶液。将pH调整至6.8，使溶液达到1升体积，并通过辐射灭菌。该溶液可以滴眼液的形式使用。例D软膏在无菌条件下将500mg的式I活性成分同99.5g石油凝胶混合。例E片剂由100g式I的环肽、1kg乳糖、600g微晶纤维素、600g玉米淀粉，100g聚乙烯吡咯烷酮、80g滑石和10g硬脂酸镁组成的混合物压制成常见形式的片剂，使每个片剂含有10mg的活性成分。例F包衣片剂按例E方法压制片剂，然后再按常规方法用由蔗糖、玉米淀粉、滑石、黄著胶和着色剂组成的包衣剂包衣。例G胶囊用常规方法将式I的活性成分装入硬明胶囊中，使每个胶囊含有5mg的活性成分。例H吸入雾剂将14g式I的活性成分溶于10升等渗NaCl溶液中，将该溶液用于装入可由商业途径得到的带有泵出机构的喷雾罐中。可将这种溶液喷入口腔和鼻腔。喷一下(约0.1ml)相当于约0.14mg的剂量。
权利要求
1.式I的环肽环-(nArg-nGly-nAsp-nD-nE)I，其中D和E各自分别表示Gly、Ala、β-Ala、Asn、Asp、Asp(OR)、Arg、Cha、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Lys(Ac)、Lys(AcNH2)、Lys(AcSH)、Met、Nal、Nle、Orn、Phe、4-Hal-Phe、高Phe、Phg、Pro、Pya、Ser、Thr、Tia、Tic、Trp、Tyr或Val，这些氨基酸残基也可以被衍生化，R是具有1-18个碳原子的烷基，Hal是F、Cl、Br、I，Ac是具有1-10个碳原子的链烷酰基、具有7-11个碳原子的芳酰基或具有8-12个碳原子的芳链烷酰基，n表示在相应的氨基酸残基的α-氨基官能团上无取代基，或取代基为烷基R、苄基或具有7-18个碳原子的芳烷基，附带条件是，至少一个氨基酸残基有一个取代基n，而且当涉及适合的活性氨基酸和氨基酸衍生物的残基时，包括D型和L型，还有它的生理上可以接受的盐。
2.一种如权利要求1中式I所示化合物的对映体或非对映体。
3.如权利要求1的环肽及其生理上可以接受的盐(a)环-(NMeArg-Gly-Asp-D-Phe-Val)；(b)环-(Arg-Gly-Asp-Dphe-NMeVal)；(c)环-(Arg-NMeGly-Asp-DPhe-Val)；(d)环-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Val)；(e)环-(Arg-Gly-Asp-NMeDPhe-Val)；(f)环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeGly)。
4.生产如权利要求1所述的式I化合物及它的一种盐的方法，其特征在于它是通过用溶剂分解剂或氢解剂处理由它的一种官能衍生物中释放出来的，或者由式II的一种肽H-Z-OH II，其中Z为-nArg-nGly-nAsp-nd-ne--nGly-NAsp-nD-nE-nArg--nAsp-nD-nE-nArg-nGly--nD-nE-nArg-nGly-nAsp-或-nE-nArg-nGly-nAsp-nD-或是这种肽的反应衍生物，通过环化剂处理而得到，或是本身与式I相应但具有一个或一个以上游离氨基、酸基和/或活化α碳原子的一种环肽是通过烷基化、酰化或酯化来衍生的，和/或是通过酸或碱处理将式I的碱式或酸式化合物转化成它的一种盐。
5.生产药用制剂的方法，其特征在于将权利要求1所述式I化合物和/或它的一种生理上可接受的盐与至少一种固体、液体或半液体赋形剂或辅助剂一起制成适当剂型。
6.药用制剂，其特征在于含有至少一种如权利要求1所述的通式II的化合物和/或它的一种生理上可以接受的盐。
7.将权利要求1所述式I化合物或其生理上可接受的盐用于生产用来控制疾病的药物的用途。
8.将权利要求1所述式I化合物或其生理上可接受的盐用于控制疾病的用途。
9.将权利要求1所述式I化合物用于生产用于亲和柱层析的固定化配体的用途。
10.将权利要求1所述式I化合物用于通过亲和层析来纯化整联蛋白的用途。
全文摘要
本发明涉及式I的新型环肽#环-(nArg-nGly-nAsp-nD-nE)I，其中，D、E、R、Hal、Ac和n如权利要求1所定义。附带条件是，至少一个氨基酸残基有一个取代基n，而且当涉及适当的活性氨基酸和氨基酸衍生物的残基时，包括D型和L型，还有它的生理上可以接受的盐。这种化合物是整联蛋白抑制剂，特别是可用于预防和治疗循环系统疾病、血管原疾病、细菌感染和肿瘤的治疗。
文档编号C07K1/00GK1149588SQ9611259
公开日1997年5月14日 申请日期1996年9月12日 优先权日1995年9月15日
发明者A·约克兹, S·古德曼, B·迪费巴奇, A·舒特尔, G·霍兹曼 申请人:默克专利股份有限公司