专利名称：P16表达构建物及其在癌治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明大体涉及肿瘤生物学领域。具体地说，本发明涉及编码肿瘤抑制基因的核酸及其在抑制肿瘤生长中的应用。在一个实施方案中，本发明涉及编码p16的表达构建物及其在抑制癌中的应用。
癌是人类疾病的主要病因之一，在美国每年有526,000人死于癌症(Boring等，1993)。仅肺癌的致死人数在美国每年就有140,000人以上。近年来，在适龄妇女中肺癌的死亡率高于乳腺癌。尽管实行减少抽烟的措施已减弱了抽烟的盛行，但进入21世纪后肺癌死亡率仍会很高。遗憾的是，已知目前医治癌的方法，包括放射疗法、外科术和化学疗法都疗效有限。合理开发肺癌的新疗法大致取决于在分子水平更好地了解癌的生物学。
随着分子遗传学和生物学的进展，人们认识到正常基因表达的改变会导致引发转化作用，于是致使产生癌细胞。恶性肿瘤的惯常疗法例如化学疗法和放射疗法，集中于大量杀伤细胞而不是专一的导向，常产生损伤性副作用。癌疗法的一个新发展方向是递送正常基因以置换或修正突变基因，于是改变转化细胞的恶生表型。业已开发了数种表达构建物以高效递送基因至体细胞。
细胞是依正调节方式(刺激性的)和负调节方式(抑制性的)而被调节的。细胞生长中负调节的丧失常见于恶性细胞中。累积的分子遗传作用揭示，正常细胞中负调节物的减少或正调节物的增加会使细胞生长出现异常。业已发现，被称为肿瘤抑制因子的多数负调节物(Marx，1993；Grunicke和Maly，1993)包括于细胞周期的直接控制(direct control)中(例如，Rb，p53，WT-1)或导致细胞生长和分化的信号途径中(例如NF-1)。此外，近期资料认为，与维持细胞结构和极性相关的基因也可起肿瘤抑制因子的作用(Marx，1993；Fearon等，1990；Trofatter等，1993)。
真核细胞周期的主要转变是由依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶或CDK′s引发的。一种CDK，即依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶4(CDK4)，调节G1期间的进展。该酶的活性可使Rb在G1后期磷酸化。CDK4的活性由活性亚单位D型细胞周期蛋白和抑制性亚单位p16INK4蛋白控制。业已由生化鉴定p16INK4为蛋白质，它专一性地结合和抑制CDK4，因而能调节Rb磷酸化(Serrano等，1993；Serrano等，1995)。由于p16INK4蛋白是CDK4抑制剂(Serrano，1993)，所以缺失该基因会提高CDK4的活性，导致Rb蛋白的过磷酸化。已知p16也调节CDK6的功能。
p16INK4属于新近被描述的CDK抑制蛋白类，这类蛋白质还包括p15B、p21WAF1和p27KIP1。p16INK4基因定位至9p21，它是许多种肿瘤中常缺失的染色体区。p16INK4基因的纯合性缺失和突变常见于人肿瘤细胞系中。该现象启示p16INK4基因是一种肿瘤抑制因子。然而这种解释受到如下观测结果的挑战即，初生未培养肿瘤中p16INK4基因变化的频率远远小于培养的细胞系中p16INK4基因变化的频率(Caldas等，1994；Cheng等，1994；Hussussian等，1994；Kamb等，1994；Kamb等，1994；Mori等，1994；Okamoto等，1994；Nobori等，1995；Orlow等，1994；Arap等，1995)。用质粒表达载体转染而恢复野生型p16INK4功能减少某些人癌细胞系集落形成(Okamtot，1994；Arap，1995)。
本发明通过提供含编码p16的核酸的表达构建物阐述对肺癌和与p16相关的其它癌的改进疗法的需要。本发明的又一个目的在于提供应用这种组合物的方法，具体地说，其中的应用是指在治疗癌中的应用。在另一个实施方案中，本发明包括利用表达构建物中的p16核酸转化细胞的方法。
本发明还包括这种表达构建物，它含有在真核细胞中起作用的启动子和编码p16的核酸，该核酸受该启动子的转录控制。
在一个优选的实施方案中，该表达构建物进一步包括聚腺苷酸化信号。在另一个实施方案中，该构建物进一步包括一个选择性标记。在进一步的实施方案中，该表达构建物是腺病毒。在一个优选的实施方案中，该表达构建物是至少缺少部分E1区的腺病毒。
在一些实施方案中，该核酸是cDNA。在其它实施方案中该核酸是基因组DNA。还有其它实施方案包括cDNA和基因组DNA例如在小基因构建物中的组合。在一个实施方案实例中，该核酸以相对于所述启动子的有义取向定位。在另一个实施方案中，该核酸以反义取向定位。
本发明还包括药物组合物，它包含表达构建物，该构建物中包含有在真核细胞中起作用的启动子和编码p16的核酸，同时包含药物上可接受的缓冲剂、溶剂或稀释剂。在一些实施方案中，以试剂盒提供表达构建物和药物上可接受的缓冲剂、溶剂和稀释剂。
本发明还提供这种方法它使缺乏p16功能的或者表达被不适当地区室化的功能性p16的细胞恢复合适的p16功能。该方法包括使这种细胞与上述表达构建物接触，其中的核酸以有义取向定位。在本发明的一个实施方案实例中，该细胞是转化细胞，且该接触使转化的表型反向。在进一步的实施方案中，该细胞是肺、膀胱、白血病或黑素瘤癌细胞和，在又一个进一步的实施方案中，表达构建物是腺病毒。
本发明还包括抑制细胞中p16功能的方法。该方法包括使这种细胞与上述表达构建物接触，其中的核酸以反义取向定位。在进一步的实施方案中，表达构建物是腺病毒。
本发明的另一个实施方案提供治疗患癌哺乳动物的方法。该方法包括向动物施用含表达构建物的药物组合物，该表达构建物具有在真核细胞中起作用的启动子和编码p16、以有义取向定位的核酸，该组合物于药物上可接受的缓冲剂、溶剂或稀释剂中。在本发明的特定实施方案中，哺乳动物是指人。在另一个实施方案中，施药方式是静脉注射。在又一个实施方案中，癌是指肺癌。
在进一步实施方案中，本发明包括通过检测p16或者编码p16的核酸而检测样品中癌细胞的方法。
对图的简要描述
图1A-p16的核苷酸序列。(SEQ ID NO1)图1B-p16的氨基酸序列。(SEQ ID NO2)图2-Ad-p16感染的细胞系的细胞生长曲线。在感染24小时前，于60mm培养皿中以5×104的密度接种细胞，再在50PFU/细胞下用Ad-p16或Ad5CMV-lacZ感染细胞。单独用培养基模拟感染。从感染后第1天至第6天每天计数各次处理后每个细胞系的三联体培养物。根据三次试验的代表性分析结果标绘曲线(平均值±标准偏差)。
图3A-D-肿瘤内注射Ad-p16、对照病毒AD5CMV-lacZ或PBS后小鼠内肿瘤生长情况(每组5只小鼠)。将5×106个H460细胞于0.1ml PBS中的悬浮液注入裸鼠背侧胁腹而形成皮下肿瘤结。在细胞植入16天后处理肿瘤结(180～220mm3)。进行直接肿瘤内注射Ad-p16、Ad5CMV-lacZ或PBS。对于每个肿瘤结，将分成3个相等剂量、1010PFU的Ad-p16或Ad5CMV-lacZ隔天注射达6天。PBS注射用作对照。注射后隔天用线型测径器在两个正交方向测定肿瘤大小并计算肿瘤体积(平均值±标准偏差)。(A)H322细胞；(B)HBL100细胞；(C)H460细胞；(D)H226Br细胞。
现在累积迹象表明，细胞周期的控制中包括的某些基因调节异常归因于细胞的恶性发展。例如，细胞过早进入下一个细胞周期阶段会导致不完全修复DNA损伤和后续的基因组不稳定性。如前所述，依赖于细胞周期蛋白的蛋白激酶在细胞周期调节中起重要作用。已知p16INK4蛋白能与细胞周期蛋白D1-CDK4复合而抑制其与Rb的相互作用，于是推迟通过细胞周期。在高百分率的癌细胞系中点突变和纯合性缺失的存在进一步启示p16INK4可能起肿瘤抑制因子的作用。
业已报道了初生人食管癌和胰腺癌、膀胱癌、黑素瘤和NSCLC转移瘤中的突变，不过初生肿瘤中的突变速率小于细胞系的那些(Mori等，1994；Okamoto等，1994；Okamoto等，1995；Zhou等，1994；Cairns等，1994；Hussussian等，1994；Kamb等，1994；Gruis等，1995)。然而，缺失和突变可能不是p16INK4失活的最初方式，因为与转录沉默相关的p16INK4的过甲基化(hypermethylation)常见于肺癌、头和颈癌、神经胶质瘤细胞系和新肿瘤，并没有缺失或突变(Herman等，1995)。
本文的资料首次说明p16作为活体内肿瘤抑制因子。这样，本发明阐述了对于有关肺癌和与p16相关的其它疾病的改进疗法的需要。具体而言，能表达功能性p16产物的表达构建物可用于抑制肿瘤细胞增生。此外，本发明包括将针对p16的反义方法用于转化细胞系或提高细胞生长的速率或程度。下列描述更详细地解释本发明的这些和其它方面。
还有证据表明，p-16定向的处理在抗血管形成的研究中有治疗意义。对于很多种疾病希望减少脉管系统。此外，p16处理还有益于过量增生类疾病如再狭窄。
A.p16和与p16相关的核酸本发明的核酸能编码整个p16基因，功能性p16蛋白区，或任意p16多肽，足以抑制CDK4的肽或片段。p16核酸可得自基因组DNA，即直接从特定的有机体基因组克隆而得。然而，在优选的实施方案中，编码p16的核酸应包括互补DNA(cDNA)或cDNA加一个内含子即小基因。
术语“cDNA”表示应用信使RNA(mRVA)作模板制备的DNA。应用cDNA，而不用基因组DNA或者从基因组的、未处理或部分处理的RNA模板聚合的DNA，优点在于cDNA不含任何非编码序列，而只含有相应蛋白质的编码区。有时完整的或部分的基因组序列是优选的，例如当需要供最佳表达的非编码区或者当例如内含子的非编码区将在反义方法中导向时。
本申请中，术语“p16”与其别名-MTS1、CDK4I和CDKN2同义。术语“p16”还表示得自除指定的那些之外其它种的所有p16同源物。
还考虑到，给定的p16可由这种天然变体代表即，它们的一级序列略有不同，而相互间的生物功能相同(见下文)。为了起依本发明的作用，所要求的是p16与CDK4结合。为测试这种结合作用，只需简单地分析由p16核酸编码的体外结合蛋白质或者应用由Serrano等，1993，描述、并入本文作参考的转染方法。
在本申请中用到的术语“编码p16的核酸”表示无全部细胞核酸、分离到的核酸分子。在优选的实施方案中，本发明涉及大致如图1A提出的核酸序列(SEQ ID NO1)。术语“如图1A提出的”表示核酸序列基本相当于图1A的部分且具有较少几个密码子，这几个密码子不同于图1A的密码子或功能上与其相当。本文所用的术语“功能上相当的密码子”表示编码相同氨基酸的密码子，例如对于精氨酸或丝氨酸的6个密码子，还表示编码生物等效氨基酸(如下文的表1所示)的密码子。
表1氨基酸 密码子丙氨酸Ala AGCA GCC GCG GCU半胱氨酸 Cys CUGC UGU天冬氨酸 Asp DGAC GAU谷氨酸Glu EGAA GAG苯丙氨酸 Phe FUUC UUU甘氨酸Gly GGGA GGC GGG GGU组氨酸His HCAC CAU异亮氨酸 Ile IAUA AUC AUU赖氨酸Lys KAAA AAG亮氨酸Leu LUUA UUG CUA CUC CUG CUU蛋氨酸Met MAUG天冬酰胺 Asn NAAC AAU脯氨酸Pro PCCA CCC CCG CCU谷氨酰胺 Gln QCAA CAG精氨酸Arg RAGA AGG CGA CGC CGG CGU丝氨酸Ser SAGC AGU UCA UCC UCG UCU苏氨酸Thr TACA ACC ACG ACU缬氨酸Val VGUA GUC GUG GUU色氨酸Trp WUGG酪氨酸Tyr YUAC UAU
考虑到遗传密码的简并性，具有约50％～约75％，或者更优选约76％～99％与图1A核苷酸相同的核苷酸的序列将是“如图1A中提出的”。基本上与图1A中提出的那些相同的序列也可在功能上定义为能与含有图1A的补体(complement)的核酸区段在标准条件下杂交的序列。
合适的杂交条件是本领域技术人员熟知的。例如在某些应用中，通过定点诱变取代氨基酸，希望要求严格性更低的条件。在这些条件下，甚至当探针序列和靶链序列不完全互补，而在一个或多个位置上错配时也能产生杂交。增大盐浓度或降低温度可使条件的严格性更低。例如，中等的严格条件可由在约37℃～约55℃的温度下约0.1～0.25M NaCl提供，而低的严格条件可由在约20℃～约55℃的温度范围内约0.15M～约0.9M盐提供。因此，杂交条件易于操纵，而且通常成为一种依赖于所需结果的选择方法。
在其它实施方案中，例如可在下述条件下完成杂交50mMTris-HCl(pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇，在约20℃～约37℃的温度下进行。用到的其它杂交条件包括大约10mMTris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5μM的MgCl2，在约40℃～约72℃的温度范围内。也可用甲酰胺和SDS来改变杂交条件。
当然，本发明也包括与图1A中提出的序列互补或基本上互补的DNA区段。“互补的”核酸序列是能依标准的沃森-克里克互补法则进行碱基配对的那些。本文用到的术语“互补序列”表示实际上互补的核酸序列，可通过前面提出的相同核苷酸比较来估测，或定义为能与图1A的核酸区段在较严格的条件(如本文所述的那些)下杂交的核酸序列。这类序列可编码整个p16分子或其功能性片段。
备择地，杂交区段可以是更短的寡核苷酸。长为17个碱基的序列在人基因组中应只出现一次，因而足以规定单一的靶序列。虽然更短的低聚体更易于制备并提高活体内可及性，但测定杂交的特异性包括许多其它因子。寡核苷酸与其互补靶的结合亲和性和序列特异性都随着长度的增长而增大。预期应用8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个碱基对的寡核苷酸。这种寡核苷酸例如可用作扩增反应中的探针和引物。
本发明的DNA区段包括编码生物功能相等的p16蛋白质和肽的那些。这种序列可由已知在核酸序列和由此编码的蛋白质中自然出现的密码子丰余性和功能等效性而产生。备择地，功能上等效的蛋白质或肽可通过应用重组DNA技术来产生，其中可基于被交换氨基酸的性能而改造蛋白质结构。人工设计的改变可通过应用定点诱变技术引入或者随机引入随后筛选所需的功能。
如果需要的话，也可制备融合蛋白和肽，例如，将p16编码区与其它蛋白质或肽的编码区融合而具有所要求的功能，例如用于纯化、免疫检测、稳定化或导向。此外，这些融合蛋白或融合肽可含有将会指导其转运至选定的细胞区室、特别是细胞核的细胞内导向序列。这些融合蛋白或融合肽可从已被递送至动物细胞的DNA构建物而得以表达。
还应明白，氨基酸和核酸序列可包括其它残基，例如其它的N端或C端氨基酸或者5′或3′序列，而仍基本上如本文公开的序列之一中提出的那样，只要序列符合前面提出的准则，包括保持与蛋白质表达相关的生物蛋白质活性。末端序列的加入特别适用于这样的编码核酸序列它们例如可包括编码区的5′部分或3′部分的各种非编码序列侧翼，如启动子。此外，亲和部分或者检测部分，例如异羟洋地黄毒甙元或亲和素，可被加入核酸序列。
如前所述，可对p16的一级结构作修饰和改变(如图1B所例举的)而仍可获得具有类似特性或所需特性的分子。例如，在蛋白质结构中可用其它氨基酸取代某些氨基酸而不会明显损失例如下列结构的活性结合能力抗体的抗原结合区或者底物分子、受体、或信号转导物(transduction)上的结合位点。由于是蛋白质的活性能力和性质限定蛋白质的生物功能活性，所以可在蛋白质序列(当然也可以是其隐含的DNA密码序列)中取代某些氨基酸序列仍然得到具有类似(拮抗)性能的蛋白质。同样，可采用相同的考虑方法产生具有补偿(例如拮抗)性能的蛋白质或多肽。因此，发明人预计可对p16蛋白或肽(或隐含的DNA)的序列作各种改变而不会明显损失其生物效用或活性。
熟练的技术人员也很清楚生物功能相等的蛋白质或肽的本身意义是指，可在分子的限定部分内作出改变的量是有限的，且所得分子仍具有可接受的相等生物活性。因此生物功能相等的肽在本文定义为这些肽其中某些而不是大部分或全部氨基酸可被取代。具体地说，如果涉及p16蛋白的N端，希望在给定的肽中只有约16个或者更优选约5个氨基酸可被改变。当然，易于制备具有不同取代的许多各不相同的蛋白质/肽，并将其用于本发明。
氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等等。对于氨基酸侧链取代基的大小、形状和类别的分析表明精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸都大小相似；而且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸都具有大致相似的形状。因此，基于这些考虑事项，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；在本文被定义为生物功能相等物。
进行改变时，可考虑氨基酸的水疗指数(hydropathicindex)。基于它们的疏水性和电荷特征而确定了每种氨基酸的水疗指数，它们是异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域一般懂得氨基酸水疗指数在赋与蛋白质活性生物功能中的重要性(Kyte & Doolittle，1982，并入本文作参考)。已知某些氨基酸可取代具有相似水疗指数或分数的其它氨基酸而仍然保持类似的生物活性。在基于水疗指数进行改变时，水疗指数在±2以内的氨基酸的取代是优选的，在±1以内的那些是特别优选的，而在±0.5以内的那些是最优选的。
应懂得，一个氨基酸可取代另一个具有相似亲水性值(hydrophilicity value)的氨基酸而仍得到生物上相等的蛋白质。如美国专利4,554,101中详述，对于如下氨基酸残基确定了亲水性值精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0+1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
在基于类似的亲水性值进行改变时，亲水性值在±2以内的氨基酸的取代是优选的，在±1以内的那些是特别优选的，而在±0.5以内的那些是最优选的。
虽然前述讨论已集中于由氨基酸改变而产生的功能相等的多肽，但应懂得这些改变可通过编码DNA的改变而实现，还应考虑到遗传密码是简并的，而且两个或更多个密码子可以编码相同的氨基酸。
除了本文所述的肽基化合物之外，发明人们还期望能配制立体结构相似的其它化合物以模拟肽结构的关键部分。可称为肽模拟物(peptidomimetics)的这类化合物，能以本发明肽的相同的方式应用，因而也是功能相等物。可通过本领域技术人员已知的制作模型和化学设计技术产生结构功能相等物。应懂得，所有这些立体结构类似的构建物均属于本发明的范围。
B.反义构建物在另一个实施方案中，p16核酸可编码任意前述全长或片断核酸的反义形式(antisense version)。有义构建物或编码构建物通常可用于抑制肿瘤增生的方法中，其中p16功能缺乏成为问题并需要置换p16功能。然而，在超量表达p16成为问题的实施方案中，例如当需要抑制p16表达时，可应用反义分子。
术语“反义核酸”表示与p16-编码DNA或RNA的碱基序列互补的寡核苷酸。当反义寡核苷酸被引入靶细胞后，就会与它们的靶核酸特异性地结合并干扰转录、RNA加工、转运、翻译和/或稳定性。导向双链(ds)DNA与寡聚体(oligos)或寡核苷酸一起可形成三股螺旋；导向RNA将导致形成双螺旋。
反义构建物可被设计成与下列物质结合启动子和基因的其它控制区、外显子、内显子甚或外显子-内显子边界。反义RNA构建物，或者编码这种反义RNA的DNA，可被用于在体外或者活体内抑制宿主细胞内的基因转录或翻译或二者，例如在包括人的宿主动物内。包括“互补核苷酸”的核酸序列是能依标准的沃森-克里克互补规则进行碱基配对的那些。也就是说，更大的嘌呤将与更小的嘧啶进行碱基配对而形成如下组合与胞嘧啶配对的鸟嘌呤(GC)和就DNA而言为与胸腺嘧啶配对的腺嘌呤(AT)，或者就RNA而言为与尿嘧啶配对的腺嘌呤(AU)。杂交序列中包含较少见的碱基例如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤和其它碱基不会干扰配对。
本文中用到的“互补的”或“反义序列”表示其全长是基本互补的和具有很少碱基错配的核酸序列。例如，长度为15个碱基的核酸序列，当它们在13个或14个位置上有互补核苷酸、只有1个错配碱基时就可称为互补的。当然，“完全互补的”核酸序列应是这种核酸序列即在其全长是完全互补的且没有碱基错配。
同源性程度更低的其它序列也考虑在内。例如，可设计具有有限的高同源性区、但还包含一个非同源区的反义构建物(例如核酶)。这些分子，虽然具有小于50％的同源性，但能在合适的条件下结合靶序列。
虽然基因序列的全部或部分可被用于反义构建情形中，但据统计，在人基因组中，长度为17个碱基的任何序列应只出现一次，因此，足以确定独特的靶序列。尽管更短的寡聚物易于制备并可提高活体内可及性，但在测定杂交特异性中包括许多其它因子。寡核苷酸与其互补靶的结合亲和性和序列特异性都随长度的增长而增大。考虑应用8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个碱基对的寡核苷酸。只简单地测试体外构建物以确定内源基因的功能是否受影响或者具有互补序列的相关基因的表达是否受影响，就易于测定给定的反义核酸在导向相应的宿主细胞基因时是否有效。
在一些实施方案中，可能希望应用包括其它元件的反义构建物，例如包括C-5丙炔嘧啶的那些。业已证实，含有尿苷和胞苷的C-5丙炔同源物的寡核苷酸能高亲和性地结合RNA并有可能成为基因表达的反义抑制剂(Wagner等，1993)。
作为定向反义送递的替代物，可应用定向核酶。术语“核酶”表示能导向和裂解p16DNA与RNA中特定碱基序列的基于RNA的酶。核酶或者以结合核酶序列的RNA寡核苷酸的形式被直接定向至细胞，或者作为编码所需核酶RNA的表达构建物被引入细胞。可依与所述对于反义核酸几乎相同的方法应用核酶。也可依与所述对于反义核酸几乎相同的方法修饰核酶序列。例如，可以掺和非沃森-克里克碱基，或制备混合的RNA/DNA寡核苷酸，或修饰磷酸二酯主链。
C.表达构建物在本申请书中，术语“表达构建物”表示含有编码基因产物的核酸的任意基因构建物，其中部分或者全部核酸编码序列可被转录。该转录物可被翻译成蛋白质，但它不需翻译。所以，在某些实施方案中，表达包括p16基因的转录和p16mRNA被翻译成p16基因产物。在其它实施方案中，表达只包括编码p16的核酸的转录。
在优选的实施方案中，编码p16衍生产物的核酸受启动子的转录控制。“启动子”表示由细胞的合成机构(syntheticmachinery)识别的DNA序列，或是引入合成机构、需要引发基因的特异性转录的DNA序列。“受转录控制”这一短语表示启动子相对于核酸处于正确位置和取向以控制RNA聚合酶引发和基因的表达。
本文所用的启动子这一术语表示一组转录控制组件，这些组件聚集在RNA聚合酶II的引发位点周围。有关启动子是如何组构的很多想法得自对于数种病毒启动子的分析，包括关于HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单位的那些。这些研究，加上最近的工作，业已证实启动子由分立的功能组件构成，每一个包括大约7-20bp的DNA，并包含用于转录激活蛋白或阻抑蛋白的一个或多个识别位点。
在每个启动子中至少有一个组件起定位RNA合成的起始位点的作用。这里最熟悉的实例是TATA框，但某些启动子中缺乏TATA框，例如用于哺乳动物的末端脱氧核糖酸转移酶基因的启动子和用于SV40晚期基因的启动子，压在起始位点上的分立元件自身帮助固定引发位置。
其它启动子元件调节转录引发频率。它们通常位于起始位点上游的区30-110bp中，不过最近业已证实一些启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隙经常是可变的，所以当元件内翻或相互间运动时，启动子功能得以保持。在tk启动子中，在活性下降前，启动子元件之间的间隙可增大至相距50bp。视启动子而定，似乎各元件能协同作用或者单独作用以激活转录。
用于控制编码p16的核酸表达的特定启动子不是很重要，只要它能在定向细胞中表达核酸即可。因此，当人细胞被定向时，优选使核酸编码区的位置毗邻启动子并受启动子的控制，该启动子能在人细胞中被表达。通常说来，这种启动子可包括人启动子或病毒启动子。
在各实施方案中，人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子和Rous肉瘤病毒长末端重复序列可用于获得p16的高水平表达。应用其它本领域熟知的病毒启动子或哺乳动物细胞启动子或细菌噬菌体启动子来实现p16的表达也是预期的，只要表达水平满足给定的目的即可。
通过应用具有熟知性能的启动子，就可优化转染后P16的表达水平和模式。例如，选择在肺细胞中具有特异活性的启动子，如酪氨酸酶(黑素瘤)、甲胎蛋白和白蛋白(肝肿瘤)、CC10(肺肿瘤)和前列腺特异性抗原(前列腺肿瘤)，将允许组织特异性表达p16。而且，选择响应特异性生理信号而被调节的启动子可允许诱导型表达p16。例如，由人PAI-1启动子表达编码p16的核酸，表达可由肿瘤坏死因子诱导。表2和3列出了几种因子/启动子，它们可用于本发明以调节p16的表达。该表并不想穷举启动p16表达中包括的所有可能的因子，而仅仅是举例而已。
增强子最初被检测为遗传因子，它们位于相同DNA分子中较远位置上，通过启动子来增强转录。这种长距离上起作用的能力在惯常的原核转录调节研究中甚少有先例。随后的工作证明，具有增强子活性的DNA区都很象启动子那样组构。也就是说，它们由很多独立的因子构成，每个因子结合一个或多个转录蛋白。
增强子和启动子之间的基本特性是可操纵的。增强子区整体上必须能远距离刺激转录；而对于启动子区或其组件不需这么严格要求。另一方面，启动子必须具有直接引发特定位点上依特定取向RNA合成的一个或多个因子，而增强子缺少这些规定。启动子和增强子通常是重叠和毗连的，通常似乎具有很相似的模件结构。
下述是病毒启动子、细胞启动子/增强子和诱导型启动子/增强子的表(表2和3)，它们可在表达构建物中与编码p16的核酸组合使用。其它任意启动子/增强子组合(按照真核启动子数据库EPDB)也可用于驱动p16的表达。T3、T7或SP6胞质表达系统的应用则是另一个可能的实施方案。如果作为部分递送复合体或者作为其它基因表达构建物提供合适的细菌聚合酶，真核细胞就能支持从某些细菌启动子的胞质转录。
表2
表2(续
<p>表2(续)
表3
在本发明的一些实施方案中，通过在表达构建物中包括标记物而在体外或者活体内鉴定细胞内核酸的递送。该标记物将对转染细胞产生可鉴定的变化，从而能容易地鉴定表达。通常地，包括的药物选择标记物有助于克隆化和选择转化体。备择地，可应用酶例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)(真核的)或者氯霉素乙酰转移酶(CAT)(原核的)。还可应用免疫标记物。所应用的选择性标记不很重要，只要它能与编码p16的核酸同时被表达即可。选择性标记的进一步实例是本领域技术人员熟知的。
如果要用到cDNA插入片段，通常需要包括聚腺苷酸化信号以实现p16转录物合适的聚腺苷酸化。聚腺苷酸化信号的性质对于成功地实施本发明并非至关重要，故可应用任意这种序列。本发明人考虑应用了SV40聚腺苷酸化信号，因为它易得，并且已知它在应用的靶细胞内起良好的作用。还考虑表达盒的一种元件是终止子。这些元件能用来提高信息量和将从该盒到其它序列的阅读减至最少。
在本发明优选的实施方案中，表达构建物包括病毒和得自病毒基因组的工程构建物。某些病毒经由受体介导的胞吞作用进入细胞的能力和整合入宿主细胞基因组并稳定且有效地表达病毒基因的能力，使它们成为将外源基因转移入哺乳动物细胞的良好候选物(Ridgeway，1988；Nicolas和Rubenstein，1988；Baichwal和Sugden，1986；Temin，1986)。最初用作基因载体的病毒是DNA病毒，它们包括乳多空病毒(猴病毒40、牛乳头瘤病毒和多瘤)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)和腺病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986)。这些病毒对于外源DNA序列具有较低容量且具有受限的宿主范围。此外，它们在允许细胞中的致癌可能性和致细胞病变效应会引起安全问题。它们只能容纳至多8千碱基的外源基因材料但易于被引入很多细胞系和实验动物(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986)。
(i)逆转录病毒逆转录病毒是一类单链RNA病毒，其特征在于能在感染的细胞中通过逆转录过程将它们的RNA转变为双链DNA(Coffin，1990)。然后所得DNA作为原病毒稳定地整合入细胞染色体并指导病毒蛋白的合成。这种整合作用导致病毒基因序列保留于受体细胞及其后代细胞中。逆转录病毒基因组含有三种因基gag、pol和env，它们分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜成分。从gag基因上游发现的、被称为Ψ的序列，起基因组包装入病毒颗粒用的信号的作用。有两种长末端重复序列(LTR)存在于病毒基因组的5′端和3′端。它们含有强启动子序列和增强子序列，并且也被要求整合入宿主细胞基因组(Coffin，1990)。
为了构建逆转录病毒载体，将编码p16的核酸插入病毒基因组内某些病毒序列中以产生复制缺损型病毒。为了产生病毒颗粒而构建其中含有gag、pol和env基因但没有LTR和Ψ组分的包装细胞系(Mann等，1983)。当含有人cDNA、逆转录病毒LTR序列和Ψ序列的重组质粒被引入该细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)后，Ψ序列允许重组质粒的RNA转录物被包装入病毒颗粒，然后病毒颗粒被分泌入培养基(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。接着收集含有重组逆转录病毒的培养基，也可以浓缩，再用于基因转移。逆转录病毒载体能感染很多种细胞。然而，整合和稳定表达需要分裂宿主细胞(Paskind等，1975)。
近期开发了一种旨在允许特异性导向逆转录病毒载体的新方法，该方法基于通过化学法往病毒包膜中加入乳糖残基而对逆转录病毒进行化学修饰。这种修饰允许经由唾液酸糖蛋白受体对肝细胞进行特异性感染。
设计了一种不同的、导向重组逆转录病毒的方法，其中用到抗逆转录病毒包膜蛋白和抗特异性细胞受体的生物素化抗体。应用抗生蛋白链菌素借助于生物素组分使这些抗体偶合(Roux等，1989)。应用抗主要组织相容性复合体I型和II型抗原的抗体，他们阐述了多种人细胞的感染，其中的细胞具有那些表面抗原与体外亲嗜性病毒(Roux等，1989)。
本发明各个方面中逆转录病毒载体的应用有一定的限制。例如，逆转录病毒载体通常整合入细胞基因组中的随机位点。这就会导致通过间断宿主基因或者通过插入能干扰侧翼基因功能的病毒调节序列而插入诱变(Varmus等，1981)。有关缺损型逆转录病毒载体的应用的另一个问题是，有可能在包装细胞中出现野生型可复制病毒。这可产生于重组过程，其中来自重组病毒的完整Ψ序列插入整合入宿主细胞基因组中的gag、pol、env序列的上游。不过，现在可得到新的包装细胞系，它们应能大为降低重组的可能性(Markowitz等，1988；Hersdorffer等，1990)。
活体内逆转录病毒载体的应用的一个限制因子是产生大于106感染U/ml的逆转录病毒载体滴度的能力有限。而很多活体内应用场合需要高出10～1000倍的滴度。
逆转录病毒的如下一些性能限制了它在肺癌治疗中的应用(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991)；(i)由逆转录病毒的感染依赖于宿主细胞分裂。在人癌中，肿瘤损伤内很少见到有丝分裂细胞(Warner和Heston，1991)。(ii)逆转录病毒整合入宿主基因组会对于靶细胞产生不利影响，因为恶性细胞都具有高度的基因不稳定性。(iii)逆转录病毒感染常受一定的宿主范围限制。(iv)逆转录病毒与哺乳动物和脊椎动物内的许多恶性肿瘤有关。(v)逆转录病毒的滴度通常比腺病毒的小100～1000倍。
(ii)腺病毒了解了腺病毒的基因结构即36kB、线型和双链DNA病毒，就能用多达7kB的外源序列取代大段的腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。与逆转录病毒相反，腺病毒DNA在宿主细胞中感染不会导致染色体整合，因为腺病毒DNA能以附加型方式复制而没有潜在的基因毒性。而且，腺病毒是结构稳定的，在彻底扩增后检测不出基因组重排。腺病毒实际上能感染全部上皮细胞而不管其细胞周期阶段如何。迄今，腺病毒感染似乎只与轻度疾病如人急性呼吸疾病有关。
腺病毒特别适用作基因转移载体，这是由于它中等大小的基因组、易于操纵、高滴度、宽靶细胞范围和高感染性。该病毒基因组两端均含有100～200个碱基对(bp)的末端反向重复序列(ITR)，它们是病毒DNA复制和包装所需的顺式元件。该基因组的早期(E)区和晚期(L)区含有不同的转录单位，它们受病毒DNA复制启动而被分开。E1区(E1A和E1B)编码的蛋白质负责调节该病毒基因组和少量细胞基因的转录。E2区(E2A和E2B)的表达导致合成用于病毒DNA复制的蛋白质。这些蛋白质包括于DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞切断中(Renan，1990)。该晚期基因的产物，包括该病毒衣壳蛋白的主要部分，只是在有效加工由主要晚期启动子(MLP)产生的单一初级转录物后被表达。该MLP(位于16.8m.u.)在感染晚期特别有效，而且由该启动子产生的所有mRNAs都具有5′三联前导(TL)序列，后者使它们成为适于翻译的优选mRNAs。
在现有系统中，重组腺病毒产生于穿梭载体和原病毒载体之间的同源重组。由于两种原病毒载体有可能重组，所以野生型腺病毒可产生于该过程。因此，极重要的是从单个噬斑分离病毒的单克隆并检测其基因组结构。YAC系统的应用是产生重组腺病毒的另一种方法。
现有复制缺损型腺病毒载体的产生和增殖，依赖于被称为293的独特辅助细胞系，它是用Ad5 DNA片段从人胚胎肾细胞转化的，能组成型地表达E1蛋白(Graham等，1977)。由于E3区不是腺病毒基因组必需的(Jones和Shenk，1978)，所以在293细胞协助下现有腺病毒载体可在E1区、E3区或者两个区中携带外源DNA(Graham和Prevec，1991)。在性质上，腺病毒能包装大约105％的野生型基因组(Ghosh-Choudhury等，1987)，提供约另外的2kB DNA的容量。在E1区和E3区结合大约5.5kB可置换的DNA后，则现有腺病毒载体的最大容量在7.5kB以内，或者约为载体全长的15％。在载体主链中保持80％以上的腺病毒病毒基因组，它是载体带有的细胞毒性的起源。还有，缺失E1的病毒的复制缺损并不完全。例如，对于目前可获得的腺病毒载体在高感染复数下已观测到病毒基因表达的渗漏(Mulligan，1993)。
辅助细胞系可得自人细胞如人胚胎肾细胞、肌细胞、造血细胞或者其它的人胚胎间充质细胞或上皮细胞。辅助细胞也可得自容许人腺病毒的其它种类哺乳动物细胞。这种细胞例如包括Vero细胞或其它的猴胚胎间充质细胞或上皮细胞。如前所述，优选的辅助细胞系是293。
除了要求腺病毒载体是复制缺损型，或者至少是条件缺损之外，认为腺病毒载体的性质对于成功地实施本发明不是至关重要。腺病毒可以是42种不同的已知血清型或亚组A-F的任意一种。亚组C的5型腺病毒是优选的起始原料以获得用于本发明的方法中的条件复制缺损型腺病毒载体。这是由于5型腺病毒是一种人腺病毒，业已了解有关它的很多生化信息和遗传信息，而且它已用于以腺病毒为载体的大多数构建场合中。
如前所述，本发明的典型载体是复制缺损型且不具有腺病毒E1区。所以，将会很方便地在除去E1编码序列的位置上引入编码p16的核酸。然而，在腺病毒序列中p16编码区的插入位置对于本发明来说不很重要。编码p16转录单位的核酸也可如先前Karlsson等(1986)所述那样作为缺失的E3区的替代物被插入E3置换型载体中或者被插入其中辅助细胞系或辅助病毒补充E4缺失的E4区。
在体外和活体内，腺病毒易于生长和操纵且表现宽的宿主范围。这类病毒可在很高的滴度例如109～1011个噬斑形成单位(PFU)/ml下获得，而且它们是高度感染性的。腺病毒的生命周期不要求整合入宿主细胞基因组。由腺病毒载体递送的外源基因都是附加型基因，所以对宿主细胞具有低的基因毒性。在用野生型腺病毒接种的研究中未报道过有副作用(Couch等，1963；Top等，1971)，说明它们作为活体内基因转移载体时具有安全性和治疗可能性。
腺病毒载体业已用于真核基因表达(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗开发(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1992)。近来，动物研究表明，重组腺病毒可用于基因治疗(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991，Stratford-Perricaudet等，1990；Rich等，1993)。对不同组织施用重组腺病毒的实验包括气管滴注法(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)，肌肉注射(Ragot等，1993)，外周静脉注射(Herz和Gerard，1993)，和定向接种入大脑(Le Gal La Salle等，1993)。
(iii)作为表达构建物的其它病毒载体其它病毒载体可用作本发明中的表达构建物。可应用得自下列病毒的载体痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)，腺伴随病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Hermonat和Muzycska，1984)和疱疹病毒。它们为各种哺乳动物细胞提供数个有吸引力的特性(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。
随着近期对缺损型乙肝病毒的识别，获得了对于不同病毒序列的结构与功能之间关系的新认识。体外研究表明，尽管缺失其多达80％的基因组，该病毒能保持依赖于辅助病毒的包装和逆转录。(Horwich等，1990)。这说明大部分基因组可被外源基因物质代替。亲肝性和持久性(整合)都是适于肝定向基因转移的特别引人注意的性能。Chang等人近来将氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因引入鸭乙肝病毒基因组中聚合酶、表面和前表面编码序列的位置中。它与野生型病毒被共转染入禽肝癌细胞系中。含有高滴度的重组病毒的培养基被用于感染幼鸭初级肝细胞。至少在转染24天后检测到稳定的CAT基因表达(Chang等人，1991)。
D.基因转移的方法为了有效表达有义或反义p16构建物，表达构建物必须被递送入细胞。这种递送可在体外完成，如在转化细胞系的实验操作过程中；或者在活体内或来自体内(见下文)，如在某些疾病的治疗中。如上所述，递送的优选机制是经由病毒感染，其中表达构建物在感染病毒粒子中被衣壳化。
将表达构建物转移入培养的哺乳动物细胞中的几种非病毒方法也是本发明预期的。这些方法包括磷酸钙沉淀(Graham和VanDer Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)，DEAE-葡聚糖(Gopal，1985)，电穿孔法(Tur-Kaspa等，1986；Potter等，1984)，直接显微注射(Harland和Weintraub，1985)，DNA-负载的脂质体(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979)和脂质转染胺-DNA复合体，细胞超声处理(Fechheimer等，1987)，用高速微粒进行的基因轰击(Yang等，1990)，和受体介导的转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)。这些方法的某几种可成功地适合于活体内或来自体内应用。
一旦表达构建物已被递送入细胞，编码p16的核酸就可被定位和在不同位点被表达。在某些实施方案中，编码p16的核酸可被稳定地整合入细胞的基因组。这种整合可以经由同源重组在同源位置和方向上进行(基因置换)或者它可被整合入随机的非特异性位置(基因添补)。在进一步的实施方案中，该核酸可作为DNA的单独附加型区段而被稳定地保持在细胞内。这种核酸区段或“附加体”编码这些序列，它们足以允许不依赖于宿主细胞周期的或与之同步化的维持和复制。表达构建物是如何被递送至细胞的和核酸保留于细胞中何处，取决于所应用的表达构建物类别。
在本发明的一个实施方案中，表达构建物可以只由裸重组DNA或质粒构成。构建物的转移由上述的任意方法进行，它们通过物理或化学法透化处理细胞膜。这特别适合于体外转移，但也可用于活体内。Dubensky等(1984)成功地在成熟的和新生小鼠肝和脾内注射了呈CaPO4沉淀形式的多瘤病毒DNA，证实了活性病毒复制和急性感染。Benvenisty和Neshif(1986)也证明直接腹膜内注射CaPO4沉淀的质粒导致表达转染的基因。预计编码p16的DNA也可在活体内依类似方式被转移并表达p16。
用于将裸DNA表达构建物转移入细胞的本发明的另一个实施方案可以包括粒子轰击。该方法依赖于如下能力即将DNA涂覆的微粒加速至高速度而使它们穿入细胞膜并进入细胞又不会杀伤它们(Klein等，1987)。已设计出几种加速小粒子的装置。一种装置借助于高压放电以产生电流，它反过来提供驱动力(Yang等，1990)。所用微粒由生物惰性物质如钨或金粒组成。
在活体内被轰击的器官选自大鼠和小鼠的肝、皮肤和肌肉组织(Yang等，1990；Zelenin等，1991)。这可能要求外科暴露(Surgical exposure)组织或细胞，以消除介于注射器(thegun)和靶器官之间的任何组织，即来自体内处理。又一次地，编码p16的DNA也可由该方法递送且仍并入本发明。
在本发明的另一个实施方案中，表达构建物可被包载于脂质体中。脂质体都具有泡囊结构，其特征在于磷脂双层膜和内部含水介质。多层状脂质体具有由含水介质分开的多层脂质。当磷脂被悬浮于过量水溶液时，它们就自动形成多层状脂质体。在形成封闭结构之前，脂质组分经历自身重排并且在脂质双层之间包载水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。还考虑了脂质转染胺-DNA复合体。
脂质体介导的核酸递送和表达外源DNA已在体外完全获得成功。Wong等(1980)证明了有可能在培养的鸡胚胎细胞、Hela细胞和肝癌细胞内由脂质体介导的递送和表达外源DNA。Nicolau等(1987)成功地完成了在静脉内注射后大鼠体内脂质体介导的基因转移。
在本发明的一些实施方案中，脂质体可与血细胞凝集病毒(HVJ)复合。业已证实这样有利于与细胞膜融合和促使脂质体包囊化DNA进入细胞(Kaneda等，1989)。在其它实施方案中，脂质体可与细胞核的非组蛋白染色体蛋白质(HMG-1)复合或一同应用(Kato等，1991)。在更进一步的实施方案中，脂质体可与HVJ和HMG-1二者复合或一同应用。由于这种表达构建物已成功地用于在体外和活体内转移和表达核酸，所以它们适于本发明。如果细菌启动子被用于DNA构建物中，还希望在脂质体中包括合适的细菌聚合酶。
可用于将编码p16的核酸递送入细胞的其它表达构建物有受体介导的递送载体。这些载体的优点在于通过在几乎所有真核细胞中受体介导的胞吞作用可选择性地摄入大分子。由于各种受体的细胞类型特异性分布，递送可以是高度特异性的(Wu和Wu，1993)。
受体介导的基因导向载体通常包括两部分细胞受体特异性配体和DNA结合剂。有数个配体业已用于受体介导的基因转移。最深入鉴定的配体有脱唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)(Wu和Wu，1987)和运铁蛋白(Wagner等，1990)。近来，一种识别与ASOR相同的受体的合成新糖蛋白已用作基因递送载体(Ferkol等，1993；Perales等，1994)而且表皮生长因子(EGF)也已被用于将基因递送至多鳞的癌细胞(Myers，EPO 0273085)。
在其它实施方案中，递送载体可包括配体和脂质体。例如，Nicolau等(1987)将乳糖基神经酰胺即一种半乳糖末端无唾液酸神经节苷脂(asialganglioside)掺入脂质体，并观察到肝细胞摄取胰岛素基因量增加。因此，有可能通过任意数量、有或无脂质体的受体-配体系统将编码p16的核酸也特异性地递送入例如肺细胞、上皮细胞或肿瘤细胞等类细胞。例如，表皮生长因子(EGF)可作为受体用于在表现为正调节EGF受体的许多肿瘤细胞内介导递送编码p16的核酸。甘露糖可用于在肝细胞上导向甘露糖受体。而且，抗CD5(CLL)、CD22(淋巴瘤)、CD25(T细胞白血病)和MAA(黑素瘤)的抗体可类似地用作导向部分。
在某些实施方案中，基因转移在来自体内的条件下更易于进行。来自体内基因治疗涉及从动物分离出细胞，再在体外将核酸递送入细胞，然后将已修饰的细胞返回入动物。这可能包括外科去除动物的组织/器官或者细胞和组织的原代培养。全文并入本文作参考的、Anderson等的美国专利5,399,346公开了来自体内的治疗方法。
原代哺乳动物细胞培养物可用多种方法制备。为了使细胞在体外能存活并同表达构建物接触，要求保证细胞与恰当比率的氧气和二氧化碳和营养物保持接触但要防止微生物污染。细胞培养技术在文献(Freshner，1992)中有详细记载且并入本文作参考。
在体外培养条件下，表达构建物就可以将编码p16的核酸递送和表达入细胞。最后，可将细胞再引入原来的动物，或者以药物上可接受的形式通过下述任意方法施药给不同的动物。因此，对患病的哺乳动物提供来自体内的疗法属于本发明的范围。
E.与其它疗法组合的p16表达构建物肿瘤细胞对DNA损伤剂的抗性反映了临床肿瘤学中的主要问题。现在癌研究中的一个目的是寻找方法以通过与基因治疗组合提高化学疗法和放射治疗的疗效。例如，当将单纯疱疹-胸苷激酶(HS-tK)基因通过逆转录病毒载体系统递送至脑瘤时，成功地引起了对于抗病毒剂9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤的易感性(Culver等，1992)。在本发明中，考虑到p16置换疗法可类似地与化学疗法或放射治疗的介入组合使用。
为杀伤细胞如恶性细胞或转移细胞，应用本发明的方法和组合物，一般就可使“靶”细胞与p16表达构建物和至少一种DNA损伤剂接触。这些组合物被提供的量应能终止或抑制细胞增殖。处理方法可包括将细胞同时与p16表达构建物和DNA损伤剂或因子接触。这可通过如下方法而完成将细胞与包括这两种物质的单一组合物或药物配制剂接触；或者使细胞同时与两种不同的组合物或配制剂接触，其中一种组合物包括p16表达构建物而另一种包括DNA损伤剂。
备择地，p16处理可以在从数分钟至数周的时间间隔中先于或后于DNA损伤剂处理。在其中DNA损伤因子和p16表达构建物被分别应用于细胞的实施方案中，通常应保证在每次递送之间的有效时间段不能终止，这样DNA损伤剂和p16表达构建物就仍能对细胞施加有利的结合效应。在这种情况下，希望细胞与两种物质相互在约12～24小时内接触，更优选相互在约6～12小时内，仅约12小时的延时时间是最优选的。在某些场合中，希望延长有效处理的时间段，然而，每次施药后如果相隔数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)就会失效。
还可设想，不止一次地施用p16或者DNA损伤剂将是所需的。可采用各种组合方式，其中p16表示为“A”，而DNA损伤剂表示为“B”A/B/AB/A/B B/B/A A/A/BB/B/B/A B/B/A/BA/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/BA/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B为了杀死细胞，将可杀死细胞的结合有效量的这两种物质递送至细胞。
DNA损伤剂或因子在本文是指当应用于细胞时可引起DNA损伤的任意化学物质或处理方法。这种物质和因子包括引起DNA损伤的辐射和波例如γ-照射、X-射线、UV-照射、微波、电子发射等等。有很多化合物，也称为“化疗剂”，起诱导DNA损伤的作用，所有这些化合物可用于本文公开的结合处理方法。预期应用的化疗剂例如包括阿霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、鬼臼亚乙苷(VP-16)、喜树碱、放射菌素-D、丝裂毒素C、顺式铂氨(CDDP)和甚至过氧化氢。本发明还包括一种或多种DNA损伤剂的组合应用，或是基于辐射的或是实际的化合物，例如X-射线与顺式铂氨的应用或者顺式铂氨与鬼臼亚乙苷的应用。在某些实施方案中，顺式铂氨与p16表达构建物组合应用特别优选作为该化合物。
在依本发明治疗瘤时，应将肿瘤细胞与除p16表达构建物之外的DNA损伤剂接触。这可通过用DNA损伤辐射线如X-射线、UV光、γ-射线甚或微波对局部肿瘤部位进行照射来完成。备择地，可通过对受治疗者施用治疗上有效量的药物组合物使肿瘤细胞与DNA损伤剂接触，其中的药物组合物包括DNA损伤化合物如阿霉素、5-氟尿嘧啶、鬼臼亚乙苷、喜树碱、放射菌素-D、丝裂霉素C，或更优选为顺式铂氨。DNA损伤剂可以组合的治疗组合物或试剂盒形式制备和应用，是通过将它与p16表达构建物如上述那样结合。
本文设想并给出直接交联核酸，特别是DNA的物质，最后产生DNA损伤导致协同的抗肿瘤组合效果。可用的试剂例如有顺式铂氨和其它DNA烷基化试剂。顺式铂氨业已广泛用于治疗癌，临床应用的有效剂量为每隔两周20mg/m2(5天)，共三个疗程。顺式铂氨不是经口吸收的，因而必须经过静脉注射、皮下注射、肿瘤内注射或腹膜内注射递送。
损伤DNA的试剂也包括干扰DNA复制、有丝分裂和染色体分离的化合物。这类化疗化合物包括阿霉素(adriamycin)，也称为阿霉素(doxorubicin)，鬼臼亚乙苷，异博定、鬼臼毒素等等。广泛用于临床治疗肿瘤时，这些化合物以静脉内药团注射液形式施药，剂量范围从对阿霉素来说以21天间隔为25～75mg/m2至对鬼臼亚乙苷来说静脉注射35～50mg/m2或者经口服用2倍于静脉注射的剂量。
破坏核酸前体和亚单位的合成和保真性的试剂也导致DNA损伤。照此研制了一些核酸前体。特别适用的试剂是已经过全面测试和易于获得的试剂。这样，试剂例如5-氟尿嘧啶(5-FU)优选适用于肿瘤组织，使该试剂特别适用于导向至肿瘤细胞。尽管有相当大的毒性，但5-FU适用于宽范围的载体，包括表面的载体，不过，常用的是剂量范围是3～15mg/kg/天的静脉内施药。
能引起DNA的损伤并业已广泛应用的其它因子包括通常已知的如γ-射线、X-射线和/或将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。其它形式的DNA损伤因子例如微波和UV辐射也是期望的。所有这些因子最有可能宽范围地影响到损伤DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复和染色体的装配和维护。X-射线的剂量范围从在延长的时间段(3～4周)日剂量为50～200伦琴，至单次剂量为2000～6000伦琴。放射性同位素的剂量范围变化很大，且依赖于同位素半衰期、放射射线的强度和类型和肿瘤细胞摄取能力。
熟练的技术人员可参考“Remington′s PharmaceuticalSciences”15th Edition(第15版)，chapter33(第33章)，特别是624～652页。视受治疗者病况而定，有必要对于剂量作某些改变。负责施药的人员无论如何应决定各位受治疗者的合适剂量。此外，对人施药时，制剂应符合FDA Office of Biologics Standard所要求的无菌、致热性、一般的安全性和纯度标准。
本发明人建议，将p16表达构建物局部递送至患有与p16相关的癌的病人，将是递送治疗上有效的基因以消除临床疾病的很有效方法。类似地，化学疗法或放射治疗可定向于受治疗体特定的、疾病侵袭区。备择地，系统性递送p16表达构建物或DNA损伤剂可适合于某些情况，例如当发生广泛的转移时。
除了将p16定向治疗与化学疗法和放射治疗结合之外，还考虑到它与其它基因治疗结合将会有益。例如，同时导向p16和p53突变体可以增进抗癌治疗。可能以该方式导向的任何其它与肿瘤相关的基因例如有p21，Rb，APC，DCC，NF-1，NF-2，WT-1，MEN-I，MEN-II，BRCAl，VHL，FCC，MCC，ras，myc，neu，raf，erb，src，fms，jun，trk，ret，gsp，hst，bcl and abl.
F.作为标记物的编码p16的核酸或p16在某些实施方案中，编码p16的核酸或p16肽可用于诊断目的。编码p16的p16核酸不存在或其含量减小/增大可预示例如癌的病况。所以，本发明还包括把编码p16的核酸或p16用作标记物。有多种本领域技术人员熟知的方法可被用于检测编码p16的核酸或者p16。两种检测编码p16的核酸的常见方法是DNA分析和RNA分析及其变化形式。p16信息的量可用作预示致瘤性的标记物。
实施例I中还描述了用免疫测定检测p16的其它方法，其中在蛋白质印迹法和FACS分析中应用与p16结合的抗体。两种方法均被用于检测细胞表面的p16表达。人们易于懂得检测并不限于上述方法，而且有很多其它方法可包括于本发明中。
优选的其它免疫测定法有本领域已知的各种酶联免疫吸附测定(ELISA′s)和放射免疫测定(RIA′s)。应用组织切片的免疫组织化学检测也特别有用。
在ELISA′s中，抗p16的抗体(例如本文公开的Ab669)被固定于表现出蛋白质亲和性的被选表面例如聚苯乙烯微量滴定板的孔。然后，将含细胞或细胞物质的测试组合物例如临床样品加入孔中。在结合并洗涤以除去非特异性结合的免疫复合体之后，就可检测结合的p16。检测过程一般是通过加入另一种与可检测标记物连接的抗p16抗体而完成的。这种ELISA是简单的“夹心式ELISA”。检测过程也可通过加入第二种抗p16抗体，接着加入对第二种抗p16抗体具有结合亲和性的第三种抗体而完成，其中第三种抗体与可检测的标记物连接。
在另一个ELISA实例中，含待测定p16含量的细胞物质的样品被固定于孔表面然后与抗p16抗体接触。在结合和适当洗涤之后，检测结合的免疫复合体。如果初始抗p16抗体与可检测的标记物连接，则可直接检测该免疫复合体。又一次地，该免疫复合体可应用对第一种抗p16抗体具有结合亲和性的第二种抗体来检测，其中第二种抗体与可检测的标记物连接。
竞争ELISA′s也有可能，其中测试样品竞争结合已知量的已标记p16抗原或抗体。未知样品中活性物质的量可通过在与涂覆孔温育之前或期间将样品与已知的标记物混合而测定。样品中存在的活性物质可减少与孔结合的已标记物质的量，从而减少基本的信号。
不管采用的形式如何，ELISA′s具有某些常见特征例如涂覆，温育或结合，洗涤以除去非特异性结合的物质，和检测结合的免疫复合体。这些被描述如下在用抗原或抗体涂覆板时，一般可将板孔与抗原或抗体的溶液保温一夜或规定的小时数。然后洗涤板孔以除去不完全吸附的物质。残余的任何有效孔表面再用对于待测抗血清呈抗原中性的非特异性蛋白质“涂覆”。这些包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、明胶和奶粉溶液。封闭溶液通常还含有去污剂吐温20，它大大有助于减弱非特异性结合。涂层能封闭固定表面上的非特异性吸附位点，于是减小由抗血清非特异性结合在表面上而引起的背景。
在ELISA′s中，更习惯于用二级或三级检测方法而不是直接方法。例如，当p16或抗p16抗体与孔结合、用非活性物质涂覆以减小背景、洗涤以除去未结合物质之后，在可以形成免疫复合体(抗原/抗体)的条件下使固定表面与待测临床样品或生物样品接触。于是免疫复合体的检测需要标记的二级结合配体或抗体，或者与标记的三级抗体或第三结合配体连接的二级结合配体或抗体。
“在可以形成免疫复合体(抗原/抗体)的条件下”是指优选包括如下处理的条件即，用例如BSA、牛丙种球蛋白(BGG)和磷酸盐缓冲的盐水(PBS)/吐温20这样的溶液稀释抗原和抗体。这些添加剂还意在有助于减小非特异性背景。
合适的条件还意味着在足以使之有效结合的温度和时间下温育。温育步骤通常为在温度优选大约为25℃～27℃下培养约1～2～4小时，或者在4℃左右培养一夜。
在ELISA中所有温育步骤之后，洗涤接触的表面以除去未复合的物质。洗涤过程通常包括用PBS/吐温20的溶液或者硼酸盐缓冲液洗涤。当测试样品和初始结合物质形成特异性免疫复合体和相继洗涤之后，即使只产生微量的免疫复合体也能检测到。
为提供检测方法，第二或第三抗体应具有相关的标记物以便于检测。它优选是这种酶当同适当的显色底物温育时，它能显色。这样，例如，可能希望将第一或第二免疫复合体与脲酶、葡糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶缀合的抗体接触和温育一段时间，其中温育是在有利于进一步形成的免疫复合体显色的条件(例如，在室温下于含PBS的溶液如PBS/吐温20中温育2小时)下进行。
在与标记抗体温育和洗涤以除去未结合物质之后，就定量分析标记物含量，例如当以过氧化物酶作酶标记时，通过与显色底物如脲和溴甲酚红紫或2，2′-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸ABTS)和H2O2温育。然后通过测定生色度，例如利用可见分光光度计，而进行定量分析。
F.药物组合物和施药途径如果想要临床应用包括编码p16的核酸的表达构建物，则需要制备作为药物组合物适用于预期应用的复合体。通常必须制备基本上不合致热原以及其它任何对人体或动物有害的杂质的药物组合物。我们一般还想应用合适的盐和缓冲剂使复合体稳定和使复合体可被靶细胞摄取。
本发明的含水组合物包括有效量的表达构建物和核酸，它们溶于或悬浮于药物上可接受的载体或含水介质中。这种组合物还可称为接种物。短语“药物上或药理上可接受的”表示当分子实体和组合物需要施药给动物或人时，它们不会产生不利的、变应性的或其它不适反应。本文应用的“药物上可接受的载体”包括任意和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸附延迟剂等等。用于药物活性物质的这类介质和试剂是本领域中熟知的。除了与活性组分不相容之外，任何常用介质或试剂都可以考虑它们在治疗组合物中的应用。组合物中还可掺入其它活性组分。
游离碱或药理上可接受的盐形式的活性化合物溶液可在与表面活性剂如羟丙基纤维素适当混合的水中配制而成。分散剂也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和在油中配制。在通常的贮存和应用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
本发明的表达构建物和递送载体可包括传统的药物制剂。施药本发明的治疗组合物可通过任何常见途径进行，只要靶组织可通过该途径获得即可。它包括经口、经鼻、经颊、经直肠、经阴道或者局部用药。治疗皮肤癌时局部施药尤为有效，这样可防止化疗引起的脱发或者其它皮肤过量增生的疾病。也可通过常位的、真皮内皮下的、肌内的、腹膜内的或静脉内注射等方式施药。这类组合物通常应作为药物上可接受的组合物施药，该组合物包括生理上可接受的载体、缓冲剂或其它赋形剂。
本发明的治疗组合物最好以作为液体溶液或悬浮液的可注射组合物形式而施药；也可制备在注射前能溶于或悬浮于液体的固体制剂形式。这类制剂也可被乳化。这样应用的典型组合物包括药物上可接受的载体。例如，这种组合物在每毫升磷酸盐缓冲的盐水中可含有10mg、25mg、50mg或多达约100mg人血清白蛋白。其它药物上可接受的载体包括水溶液，无毒赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲剂等等。非水溶剂的实例有丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水，醇/水溶液，盐水溶液，肠胃外载体如氯化钠、林格葡萄糖等。静脉载体包括流体和营养补充剂。防腐剂包括抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。pH和药物组合物各组分的准确浓度依熟知参量调节。
其它配制剂适于经口施药。口服配制剂包括这种典型赋形剂如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。组合物形式为溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释配制剂或粉状物。如果是局部施药，则药物形式可以是乳油、软膏、油膏或喷雾剂。
治疗剂的有效量基于预期的目的而确定，例如(i)抑制肿瘤细胞增生或(ii)消除肿瘤细胞。术语“单位剂量”表示适用于受治疗者的物理独立的单位，每个单位含有预定量的治疗组合物，计算的组合物量可产生上述预期响应，与其施药即合适的途径和治疗方案有关。待施药的量依治疗数量和单位剂量取决于受治疗者、受治疗者状态和希望的防护。治疗组合物的准确量还依赖于医师的诊断且因人而异。
G.试剂盒抑制肿瘤细胞增生、转化细胞或检测癌细胞所需的所有基本物质和试剂可一起装于试剂盒内。它一般将包括选择的表达构建物。还包括复制该表达构建物的各种介体和用于这种复制的宿主细胞。这类试剂盒包括盛放每种试剂的不同贮器。
当试剂盒的组分以一种或多种液态溶液形式提供时，则液态溶液优选是水溶液，而无菌水溶液是特别优选的。活体内应用时，表达构建物可被配制成药物上可接受的可注射组合物。此时，贮器工具本身可以是吸入器、注射器、滴管、眼滴管或其它类似器械，配制剂可从这些器械被应用于身体的感染区例如肺，被注入动物，或者甚至应用于试剂盒的其它组分并混合。
试剂盒的组分也可以干燥的或冻干的形式被提供。当试剂或组分以干燥的形式提供时，通常加入适当的溶剂来重新配制。预计该溶剂也可以另一个贮器工具提供。
本发明的试剂盒一般还包括盛装小瓶的器械，其中的小瓶处于密封状态以供商售，例如注射或吹塑成型的塑料贮器，其中装有所需小瓶。
无论贮器的数量或类别如何，本发明的试剂盒还可包括或包装有一个工具以便协助将最终复合体组合物注射/施药或放置于动物体内。这种工具可以是吸入器、注射器、滴管、钳子、测试匙(measured spoon)、眼滴管或任意这类医疗上许可的递送工具。
下述实施例旨在阐述本发明优选的实施方案。本领域技术人员会懂得，在代表本发明人所发现技术的实施例中公开的技术能很好地实施本发明，因而可视为构成其实施时优选的方式。但是，本领域技术人员根据本说明书应明白，可对于公开的具体实施方案作很多改变仍能获得相同的或类似的结果而不会脱离本发明的精神实质和范围。
实施例A.原料和方法细胞系。细胞系293被保存于Eagle′s改进的基本培养基中，其中补加10％热灭活的马血清。人NSCLC细胞系H226Br、H322生长于含有5％胎牛血清的RPMI培养基中。人正常乳腺细胞系HBL100生长于补加10％胎牛血清的F12培养基中。
p16INK4cDNA亚克隆化。利用引物5′-ATGGAGCCTTCGGC TGACTGG-3′(SEQ ID NO3)和5′-CCTGTAGGACCTTCGGTGACT-3′(SEQID NO4)通过RT-PCRTM从正常人淋巴细胞的总RNA扩增初始的p16INK4cDNA。PCRTM产物在pCRTM载体(Invitrogen，SanDiego，CA)中被亚克隆化并由双链DNA测序而检定。因为p16INK4cDNA序列在GenBank中的校正，有42个碱基对的另一序列后来通过两个PCRTM步骤被加入已克隆的p16INK4cDNA的5′端。第一个PCRTM步骤用到引物A(5′-GATCCGGCGG CGGGGGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGG-3′；SEQ ID NO5)和引物C(5′-GCCTCTCTGGTTCTTTCA-3′；SEQ ID NO6)。第二个PCRTM步骤用到引物B(5′-CGGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCGG CGGCGGGGAGC-3′；SEQ ID NO7)和引物C。pCRTM载体(pCR-p-16)中的最后的野生型p16INK4cDNA序列也由双链DNA测序而检定。
pAd-p16构建。穿梭载体pEC53(Zhang等人，1994)被限制酶HinDIII和Hpa I消化。载体主链从p53 cDNA分离是通过使消化的DNA穿过1％琼脂糖凝胶而进行的并由该凝胶纯化。p16INK4cDNA从pCR-p16切除后被连接到纯化的穿梭载体主链上。最终产物pAd-p16携带p16INK4表达盒，该表达盒中包含人CMV启动子(Boshart等，1985)野生型p16INK4cDNA，和SV40早期聚腺苷酸化信号。
重组p16INK4腺病毒的产生。重组Ad5CMV-lacZ腺病毒DNA用限制酶XbaI和ClaI消化，且32kb部分腺病毒DNA片段用0.3％琼脂糖凝胶纯化。该DNA片段和pAd-p16质粒DNA由CaPO4介导的转染共转染入293细胞。转染后的细胞被保持在培养基中直至开始出现致细胞病变效应。新产生的p16INK4重组腺病毒(Ad-p16)通过对从细胞培养物上清液制备的DNA样品进行PCRTM分析而得以鉴定。携带大肠杆菌(E.coli)的lacZ基因的重组腺病毒Ad5CMV-lacZ，具有类似于Ad-p16的结构，所以用作这些研究中的对照物。
病毒贮存物，滴度和感染。Ad-p16和Ad5CMV-lacZ病毒各自的克隆均得自噬斑纯化并按Graham和Prevec(1991)的方法在293细胞内增殖。病毒滴度由噬斑分析测定。细胞系是这样感染的将病毒溶液加入细胞单层，再在室温下培养30min，其间每5min略微搅动一次。然后加入培养基，再将感染后的细胞返回到37℃培养箱中。
致瘤性分析。在MOI为50PFU/细胞下用Ad-p16或Ad5CMV-lacZ感染H460细胞。用培养基只作为模拟感染处理等量细胞。感染24小时之后，收集处理过的细胞并用PBS清洗两次。每次处理时，将在0.1ml PBS中的5×106个细胞经皮下注入BALB/c nu/nu小鼠(Harlan Sprague-Dawley Co.，Houston，TX)的背侧。注射后每周检查处理过的小鼠。3周周期结束时评估肿瘤生长情况。假设肿瘤为球形，由肿瘤平均直径计算肿瘤体积；其中肿瘤平均直径是作为正交直径的乘积的平方根计算而得。
B.结果Ad-p16重组病毒的产生。腺病毒作为基因转移载体的优点之一在于它在宽范围的宿主细胞内具有高感染性(Berkner，1988)。用于人癌基因治疗、得自腺病毒的一种穿梭载体pEC53是以前构建的(Zhang等人，1994)。得自该载体的重组病毒Ad5CMV-p53，在包括H460、H322和H226Br的几种肺癌细胞系中感染性为97％-100％(Zhang等人，1994)。在该研究中，pEC53中的p53基因由全长p16INK4cDNA置换。最终产物pAd-p16携带p16INK4基因表达盒，其中含有人CMV启动子(Boshart等，1985)、野生型p16INK4cDNA、和SV40早期聚腺苷酸化信号。通过Xba I消化重组病毒Ad5CMV-lacZ的DNA生成的腺病毒DNA的32kB部分片段，与pAd-p16质粒一起被共转染入293细胞供同源重组。重组病毒产物Ad-p16的基因组结构类似于Ad5CMV-lacZ的结构，只是lacZ基因被p16INK4基因置换了。由于重组腺病毒的E1区被p16INK4基因或lacZ基因表达盒取代了，所以它们只能在补充E1缺失的293细胞内增殖。Ad5CMV-lacZ被用作Ad-p16的病毒对照物。
在人肺癌细胞中表达外源p16INK4蛋白质。选取3种人NSCLC细胞系用于该研究H460、H322和H226Br。H460携带纯合性p16INK4基因缺失(Kamb等，1994)，但p53基因(Takahashi等，1989)和Rb基因(Harbour等，1988)都是野生型。H322携带纯合性p16INK4基因缺失(Okamoto等，1994)，野生型Rb基因(Harbour等，1988)，和在密码子248上的纯合性p53突变(Mitsudomi等，1992)。H226Br携带p16INK4基因，该基因由DNA印迹法和PCRTM分析检测，它未曾被测序，但不在蛋白质水平表达p16INK4。它在密码子254上具有纯合性p53突变(Fujiwara等，1994)并表达野生型Rb蛋白质(Harbour等，1988)。培养的正常人乳腺上皮细胞系HBL100，表达野生型p16INK4、野生型p53和野生型RB基因，而且在本研究中用作正常细胞系对照物。只有细胞系HBL100在病毒感染前表达p16INK4蛋白质。为达到高水平表达外源p16INK4蛋白质，将人CMV启动子(Boshart等，1985)用于驱动p16INK4基因的表达。在用Ad-p16感染后的H460、H322和H226Br细胞内实现了高水平外源p16INK4蛋白质表达。在Ad-p16感染后，HBL100中p16INK4的含量要高得多，指示该细胞系内的外源p16INK4蛋白质表达。然后，在如下分析中检验该引入的p16INK4蛋白质对肿瘤细胞系的效应。
p16INK4蛋白质对肺癌细胞生长的影响。NSCLC细胞系H460、H322和H226Br以及正常乳腺细胞系HBL100在50PFU/细胞下用Ad-p16或Ad5CMV-lacZ感染。对于三组感染的和模拟感染的细胞每天计数达6天，计算每天的平均细胞数。如图2所示，Ad-p16感染的H460、H322和H226Br细胞生长速度与Ad5CMV-lacZ感染的细胞相比分别被抑制94％、85％和97％。但是，用Ad-p16感染的HBL100生长速度与Ad5CMV-lacZ感染的HBL100细胞相比被抑制小于3％。这表明，将p16INK4基因引入这些细胞系会通过恢复p16INK4表达而特异性地抑制细胞增殖。对于所有细胞系来说，Ad5CMV-lacZ处理的细胞的生长速度小于模拟感染的细胞，指示由表达的病毒蛋白质和lacZ基因引起的细胞毒性。当应用更高的MOI时，该病毒相关的细胞毒性得以增大。这些细胞系对于该效应有不同的敏感性。
由Ad-p16介导的细胞周期停滞。已知p16INK4蛋白质能抑制CDK4和CDK6的活性，因而封阻增殖细胞从G1阶段进入S阶段(Serrano等，1993；Serrano等，1995)。为了研究由Ad-p16介导的生长速度抑制机理，如生长速度分析中所述那样感染H460、H322、H226Br和HBL100细胞，再在感染24小时后收集细胞用于由流式细胞计量术进行的细胞周期分析。如表4所示，Ad-p16介导的p16INK4蛋白质的表达，显著增大p16INK4缺失的肿瘤细胞系内G1阶段中的细胞数并减少S阶段和(G2+M)阶段中的细胞数，表明引起了G1停滞。反之，在p16INK4蛋白质阳性的正常乳腺细胞系HBL100中未观测到G1停滞。这些结果说明，p16INK4蛋白质通过在不表达p16INK4的细胞系内介导G1停滞而抑制肿瘤细胞的生长。
表4流式细胞计量术分析由Ad-p16介导的p16INK4的细胞周期效应各阶段中细胞百分数细胞类别 & 感染的病毒G0/G1S G2/MHBL100/Ad-p1636 4222HBL100/Ad5CMV-lacZ 31 4425HBL100/培养基31 4227H460/Ad-p16 88 9 3H460/Ad5CMV-lacZ 41 3227H460/培养基 39 3526H322/Ad-p16 80 6 14H322/Ad5CMV-lacZ 30 3634H322/培养基 30 3634H226Br/Ad-p1680 119H226Br/Ad5CMV-lacZ 20 5327H226Br/培养基26 4430给出了代表性分析的结果。按细胞生长速度测定分析中相同的方法感染细胞。感染24小时之后，用1％吐温20处理细胞，并用碘化丙锭(propidium iodide)染色，然后由流式细胞计量术分析DNA合成和细胞周期状况。用装有空气冷却的15mW 488nm氩激光的FACScan(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞计量分析。红色荧光是通过长通滤波器(long pass filter)(截止波长650nm)测定的。
由Ad-p16介导的致瘤性的抑制。为了确定Ad-p16病毒是否能抑制人NSCLC细胞的致瘤性，对BALB/c nu/nu小鼠皮下注射H460细胞以导致形成肿瘤。每只小鼠接受5×106个细胞的一次注射，这些细胞已经用Ad-p16或Ad5CMV-lacZ在50PFU/细胞下感染达24小时。只用培养基处理过的H460细胞用作模拟感染的对照物。每次处理4只小鼠。观测这些小鼠，当出现肿瘤后对它们进行为期3周的测试。进行了两个独立的研究以确证再现性，两次研究的数据归纳于表5中。Ad-p16处理的细胞显著抑制了活体内肿瘤生长。接受了培养基处理过的细胞的100％小鼠和接受了Ad5/CMV-lacZ处理过的细胞的87.5％小鼠长出了肿瘤。另一方面，在两个研究中，接受了Ad-p16处理过的细胞的小鼠只有50％长出肿瘤，而且肿瘤的平均体积只有Ad5CMV-lacZ病毒处理过的小鼠肿瘤的11％和培养基处理过的小鼠肿瘤的6％(p＜0.001，由双侧学生T-检验检定)。因此，肺癌细胞的致瘤性通过预先用Ad-p16处理而得以抑制，说明p16INK4蛋白质能具有治疗功效。
表5.p16INK4对裸鼠内H460细胞系致瘤性的影响处理方法肿瘤数/小鼠数 平均体积(％) (mm3±SD)培养基 4/4(100％)1047.3±104.7实验1Ad5/CMV-LacZ4/4(100％)740.5±205.5Ad-p16 0/4(0％) -培养基 4/4(100％)1158.6±200.2实验2Ad5/CMV-LacZ3/4(75％) 658.3±144.3Ad-p16 4/4(100％)71.2±19.6在MOI为50PFU/细胞下用病毒感染H460细胞24小时，以5×106个细胞/小鼠进行皮下注射。在3周结束后测定肿瘤大小。
研究了Ad-p16在BALB/c nu/nu小鼠模型中的治疗潜能。用5×106个H460细胞皮下注射小鼠20天之后长出了皮下肿瘤小结。用Ad-p16(1010PFU/肿瘤)、Ad5CMV-lacZ(1010PFU/肿瘤)或PBS直接注射产生的肿瘤。如图3所示，注射18天后，Ad-p16处理过的肿瘤平均体积只有对照病毒处理过的肿瘤的49％和用PBS注射过的肿瘤的34％(p＜0.001，由双侧学生T-检验检定)。
参考文献下列参考文献为本文提出的内容提供了操作程序实例或其它详细补充，都逐一并入本文作参考。
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序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称BOARD OF REGENTS，THE UNIVERSITY OF TEXASSYSTEM(B)街名201 West 7th Street(C)城市Austin(奥斯汀)(D)州名Texas(得克萨斯)(E)国别美国(F)邮政编码(ZIP)78701(ii)发明名称p16表达构建物及其在癌治疗中的应用(iii)序列数7(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MC-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(vi)优先申请资料(A)申请号US 08/502,881(B)申请日期1995.7.17(C)分类未知(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度987个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线型(xi)序列描述SEQ ID NO1CGGAGAGGGG GAGAACAGAC AACGGGCGGC GGGGAGCAGC ATGGAGCCGG CGGCGGGGAG 60CAGCATGGAG CCTTCGGCTG ACTGGCTGGC CACGGCCGCG GCCCGGGGTC GGGTAGAGGA120GGTGCGGGCG CTGCTGGAGG CGGGGGCGCT GCCCAACGCA CCGAATAGTT ACGGTCGGAG180GCCGATCCAG GTCATGATGA TGGGCAGCGC CCGAGTGGCG GAGCTGCTGC TGCTCCACGG240CGCGGAGCCC AACTGCGCCG ACCCCGCCAC TCTCACCCGA CCCGTGCACG ACGCTGCCCG300GGAGGGCTTC CTGGACACGC TGGTGGTGCT GCACCGGGCC GGGGCGCGGC TGGACGTGCG360CGATGCCTGG GGCCGTCTGC CCGTGGACCT GGCTGAGGAG CTGGGCCATC GCGATGTCGC420ACGGTACCTG CGCGCGGCTG CGGGGGGCAC CAGAGGCAGT AACCATGCCC GCATAGATGC480CGCGGAAGGT CCCTCAGACA TCCCCGATTG AAAGAACCAG AGAGGCTCTG AGAAACCTCG540GGAAACTTAG ATCATCAGTC ACCGAAGGTC CTACAGGGCC ACAACTGCCC CCGCCACAAC600CCACCCCGCT TTCGTAGTTT TCATTTAGAA AATAGAGCTT TTAAAAATGT CCTGCCTTTT660AACGTAGATA TAAGCCTTCC CCCACTACCG TAAATGTCCA TTTATATCAT TTTTTATATA720TTCTTATAAA AATGTAAAAA AGAAAAACAC CGCTTCTGCC TTTTCACTGT GTTGGAGTTT780TCTGGAGTGA GCACTCACGC CCTAAGCGCA CATTCATGTG GGCATTTCTT GCGAGCCTCG840CAGCCTCCGG AAGCTGTCGA CTTCATGACA AGCATTTTGT GAACTAGGGA AGCTCAGGGG900GGTTACTGGC TTCTCTTGAG TCACACTGCT AGCAAATGGC AGAACCAAAG CTCAAATAAA960AATAAAATAA TTTTCATTCA TTCACTC987(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度156个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线型(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Glu Pro Ala Ala Gly Ser Ser Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu1 5 10 15Ala Thr Ala Ala Ala Arg Gly Arg Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu20 25 30Glu Ala Gly Ala Leu Pro Asn Ala Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro35 40 45Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu50 55 60Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg65 70 75 80Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val85 90 95Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg100 105 110Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg115 120 125Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg130 135 140Ile Asp Ala Ala Glu Gly pro Ser Asp Ile Pro Asp145 150 155(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线型(xi)序列描述SEQ ID NO3ATGGAGCCTT CGGCTGACTG G 21(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线型(xi)序列描述SEQ ID NO4CCTGTAGGAC CTTCGGTGAC T 21(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度42个碱基对(B)类型核酸
(C)链型单链(D)拓扑学线型(xi)序列描述SEQ ID NO5GATCCGGCGG CGGGGAGCAG CATGGAGCCT TCGGCTGACT GG42(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线型(xi)序列描述SEQ ID NO6GCCTCTCTGG TTCTTTCA 18(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线型(xi)序列描述SEQ ID NO7CGGGCGGGGA GCAGCATGGA GCCGGCGGCG GGGAGC 3
权利要求
1.包括在真核细胞中起作用的启动子和编码p16的核酸的表达构建物，其中所述核酸受所述启动子的转录控制。
2.权利要求1的表达构建物，它进一步包括聚腺苷酸化信号。
3.权利要求1的表达构建物，它进一步包括选择性标记。
4.权利要求1的表达构建物，其中所述核酸是cDNA。
5.权利要求1的表达构建物，其中所述核酸是基因组DNA。
6.权利要求1的表达构建物，其中所述核酸是cDNA/基因组DNA杂交体。
7.权利要求1的表达构建物，其中所述表达构建物是复制缺损型腺病毒。
8.权利要求7的表达构建物，其中所述腺病毒至少缺乏一部分E1区。
9.权利要求1的表达构建物，其中所述核酸以相对于所述启动子的有义取向定位。
10.权利要求1的表达构建物，其中所述核酸以相对于所述启动子的反义取向定位。
11.一种药物组合物，它包括(i)包含在真核细胞中起作用的启动子和编码p16的核酸的表达构建物，其中所述核酸受所述启动予的转录控制，和(ii)药物上可接受的缓冲剂、溶剂或稀释剂。
12.使缺乏p16功能的细胞恢复p16功能的方法，该方法包括如下步骤(i)提供包含在真核细胞中起作用的启动子和编码p16的核酸的表达构建物，所述核酸受所述启动子的控制而且核酸以相对于所述启动子的有义取向定位；和(ii)将所述表达构建物与缺乏p16功能的所述细胞接触。
13.权利要求12的方法，其中所述细胞是转化的细胞且所述接触使所述转化的表型反向。
14.权利要求13的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
15.权利要求14的方法，其中所述肿瘤细胞是肺癌、膀胱癌或黑素瘤细胞。
16.权利要求12的方法，其中所述表达构建物是复制缺损型腺病毒。
17.抑制细胞中的p16功能的方法，该方法包括(i)提供包含在真核细胞中起作用的启动子和编码p16的核酸的表达构建物，所述核酸受所述启动子的控制而且以相对于所述启动子的反义取向定位；和(ii)将所述表达构建物与所述细胞接触。
18.权利要求17的方法，其中所述细胞通过所述接触被转化。
19.权利要求17的方法，其中所述表达构建物是复制缺损型腺病毒。
20.治疗患癌的哺乳动物的方法，它包括(i)提供药物组合物，该组合物包括(a)包含在真核细胞中起作用的启动子和编码p16的核酸的腺病毒，所述核酸受所述启动子的控制且以相对于所述启动子的有义取向定位，和(b)药物上可接受的缓冲剂、溶剂或稀释剂；和(ii)对所述哺乳动物施药该药物组合物。
21.权利要求20的方法，其中所述哺乳动物是人。
22.权利要求21的方法，其中所述施药是通过静脉注射进行的。
23.权利要求21的方法，其中所述施药是通过常位注射进行的。
24.权利要求20的方法，其中所述癌是肺癌、膀胱癌或黑素瘤。
25.一种试剂盒，它以合适的贮器方式包括含有在真核细胞中起作用的启动子和编码p16的核酸的表达构建物，其中所述核酸受所述启动子的转录控制，和药物上可接受的缓冲剂、溶剂或稀释剂。
26.通过检测编码p16的核酸而检测样品中癌细胞的方法。
27.通过检测p16而检测样品中癌细胞的方法。
全文摘要
公开了多种基因构建物,它们可在体外或活体内用于肿瘤生物学领域中癌的治疗。具体地说,提供了含有p16编码区和表达p16转录物所需的其它调节元件的表达构建物。表达构建物的一个型式是复制缺损型腺病毒载体。还提供了转化细胞系和抑制癌细胞增殖的方法。
文档编号C07K14/435GK1203632SQ9619653
公开日1998年12月30日 申请日期1996年7月17日 优先权日1995年7月17日
发明者X·金, J·罗斯 申请人:德克萨斯州立大学董事会