化合物的制作方法

专利名称：化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及ADEPT系统中与药物前体一起使用的突变体CPB酶。
缩写Ac 乙酰基ADEPT抗体定向的酶药物前体治疗BOC叔-丁氧基羰基CPB羧肽酶BDCCI 1，3二环己基碳化二亚胺DMAP 4-二甲胺基吡啶DMFN，N-二甲基-甲酰胺DMSO二甲亚砜Et 乙基EDCI 1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基-碳化二亚胺HCPB 人CPBHOBT 1-羟苯并三唑PCR多聚酶链反应TFA三氟乙酸THF四氢呋喃药物选择性杀伤病人体内的癌细胞的导向一直是医学研究的一个问题。ADEPT是克服这个难题的一个方法。ADEPT使用肿瘤选择性试剂如与酶结合的抗体。给病人施用该结合物(通常静脉施用)使之集中在肿瘤部位并通过全身循环清除出去。结果，给病人施用的药物前体被酶(集中在肿瘤部位)转变成细胞毒性的药物，后者杀伤肿瘤细胞。由于酶的一个分子可催化产生许多细胞毒药物分子而产生放大作用。而且，不显示被抗体识别的抗原的肿瘤细胞(肿瘤通常表现微不均一性)也被酶促放大产生的细胞毒药物杀灭。一种已知的系统使用原核生物酶羧肽酶G2(CPG2)作为酶成分(见WO88/07387)。
用已知系统的问题是反复施用这种结合物导致宿主免疫反应而使该治疗效果减小。该抗体成分一般是小鼠单克隆抗体，用已知技术可使其人源化而减轻免疫原性。然而，酶成分的免疫原性的减轻已证实问题更多。这是因为酶成分必须是天然条件下人宿主循环中不存在的，否则将发生药物前体过早转化成为细胞毒药物并会观察到对肿瘤的减小的选择毒性。
这些问题已由国际专利申请WO95/13095部分的提了出来(Wellcome Foundation)。这个申请提出了使用突变型哺乳动物酶以激活不被相应天然酶激活的药物前体的ADEPT。然而在这项公开中仅使用羧肽酶A的ADEPT系统是可行的。
按照本发明的一个方面，其中提供的一种结合物在人体中基本上是非免疫原性的包括能与肿瘤相关抗原结合的导向部分(例如抗体)，该导向部分与突变型羧肽酶B(CPB)相连，后者能将药物前体转变成抗肿瘤药物，其中所述药物前体在人体中不被天然的非突变酶有效转变成抗肿瘤药物。
优选所述导向部分是抗体。
优选所述抗体是F(ab′)2抗体片段。
优选所述酶突变包括在其活性部位中的极性改变以至它可转变具有互补极性的药物前体。
优选所述酶是胰腺人CPB突变体的任何一种胰腺人CPB具有的253位氨基酸Asp被Arg，Asn，Gln，或Lys中的任何一种取代，非强制性地与任何一种或多种的氨基酸取代相组合，所述氨基酸取代选自天然氨基酸Gln54被Arg，Lys，或Asn的任何一种取代；天然氨基酸Asp145被Val，Leu，Ile或Ala的任何一种取代；天然氨基酸Ile201被Ser或Thr的任何一种取代；天然氨基酸Ser205被Asn，Gln，His，Lys或Arg的任何一种取代；天然氨基酸Ile245被Ser，Thr，Ala，Val，Leu，Asn，Gln，Lys，Arg或His的任何一种取代；天然氨基酸Ala248被Asn，Gln，Lys，Arg，His，Ser或Thr的任何一种取代；天然氨基酸Gly251被Thr，Asn，Ser，Gln，His，Lys，Arg，Val，Ile，Leu，Met，Phe，Ala或正亮氨酸的任何一种取代；天然氨基酸Cys288被Ser，Thr，Ala，Val，Leu或Ile的任何一种取代；更优选时，所述酶是下列胰腺人CPB突变体的任何一种胰腺人CPB中天然氨基酸Asp253被Arg或Lys的任何一种取代和天然氨基酸Gly251被Thr，Asn，Ser，Gln，Lys或Val的任何一种取代，非强制性地与任何一种或多种氨基酸取代相组合，所述氨基酸取代选自天然氨基酸Gln54被Arg取代；天然氨基酸Asp145被Ala取天然氨基酸Ile201被Ser取代；天然氨基酸Ser205被Asn取代；天然氨基酸Ile245被Ser，Ala或His的任何一种取代；天然氨基酸Ala248被His，Ser或Asn的任何一种取代；和天然氨基酸Cys288被Ser或Ala的任何一种取代；更优选时，所述酶是下列胰腺人CPB突变体的任何一种胰腺人CPB的天然氨基酸Asp253被Arg或Lys的任何一种和天然氨基酸Gly251被Thr，Asn或Ser的任何一种取代，非强制性地与任何一种或多种的氨基酸取代相组合，所述氨基酸取代选自天然氨基酸Gln54被Arg取代；天然氨基酸Asp145被Ala取代；天然氨基酸Ile201被Ser取代；天然氨基酸Ser205被Asn取代；天然氨基酸Ile245被Ala取代；天然氨基酸Ala248被Ser或Asn的任何一种取代；和天然氨基酸Cys288被Ser取代；特别是，所述酶是下列胰腺人CPB突变体的任何一种D253K；D253R；[G251N，D253K]；[G251T，D253K]；[G251S，D253K]；[G251T，D253R]；[A248S，G251T，D253K]；[A248N，G251N，D253K]；[A248S，G251N，D253K]或[S205N，G251N，D253K]。
按照本发明的另一方面，其中提供设计用于一个宿主的一套匹配的双组分系统，其中所述组分包括(i)第一组分是能与肿瘤相关抗原结合的导向部分，该导向部分连接到能将药物前体转变成抗肿瘤药物的CPB酶上，和；
(ii)第二组分是药物前体，它在所述酶的影响下可转变成抗肿瘤药物。其中所述酶是CPB酶的一种突变型式；第一组分在宿主中基本上是非免疫原的并且；药物前体在宿主中不被天然非突变的宿主酶明显可转变成抗肿瘤药物。
术语“药物前体在宿主中不可被天然非突变的宿主酶明显可转变成抗肿瘤药物”意指所述药物前体在给宿主施用时不产生不适当的非导向毒性问题。
术语“基本上非免疫原的”意指可将第一组分(结合物)施用于宿主一次以上而不引起明显的宿主免疫反应例如像在人体中使用连接细菌酶的小鼠抗体所见到的。
所述突变酶优选基于与期望使用该系统的宿主相同物种的酶，但突变酶可以基于来自不同物种的宿主酶，只要酶的结构在物种间是足够保守的以至不产生不适当的免疫原性问题。
所述导向部分优选是抗体，特别是抗体片段例如F(ab′)2。结合物合成所用的酶的连接键可通过已知方法实现如使用异双功能试剂作为交联剂或通过基因融合或任何其他适当方法。抗体可来自同宿主(例如在小鼠中使用小鼠抗体)或该抗体可经处理以至其在所选择的宿主中(例如在人体中使用嵌合的，CDR移植的或修饰的小鼠抗体)不被明显的识别为外来物。第一组分优选是如上述定义的结合物。
在猴和病人的临床前研究中均已显示将啮齿类抗体可变功能区移植到人抗体恒定功能区(嵌合抗体)或将啮齿类抗体的抗原结合环(CDRs)组建到人抗体中(CDR移植)会大大降低啮齿类抗体的免疫原性。甚至CDR移植抗体将来自啮齿类抗体的大量(＞50％)氨基酸序列结合到人框架中。尽管如此，已报道在猴和人中免疫原性大大降低。这提供出证据，即改变宿主酶的催化部位的十分有限数目的氨基酸有可能导致具有最小免疫原性的酶并且肯定其免疫原性比非宿主酶要低。读者从下列参考中得到指导A.Mountain and J.R.Adair，生物技术与遗传工程综述，10，1-142，1992；G.Winter and W.J.Harris，药理学动向，14，139-143，1993；I.I.Singer et al.，J.Immunol，150，2844-57，1993；J.Hakimi et al.，免疫学杂志，147，11352-59，1991和；J.D.Isacs et al.，柳叶刀，340，748-752，1992。恒定区功能区可以是例如人IgA，IgE，IgG或IgM功能区。人IgG2和3(特别是IgG2)是优选的，但也可使用IgG1和4同种型。人抗体本身还可被用在诸如在工程化的小鼠中所产生的抗体以生产人抗体。(Fishwald等in NatureBiotechnology(1996)，14，845-851)。
与天然宿主酶比较，就底物识别而言，宿主酶被突变以使酶与药物前体之间的相互作用形式发生改变。
酶突变最好是在其活性部位的极性改变以至其转变具有互补极性的药物前体；非突变宿主酶不明显转变该药物前体。优选天然宿主酶通过电子配对相互作用识别其天然底物并且这种相互作用在突变酶和互补药物前体设计中被逆转。在本说明书中术语“活性部位”包括涉及底物识别和/或催化功能性的任何方面的氨基酸残基。
点突变涉及如下方面天然氨基酸(用一个字母命名)，位置，新氨基酸。例如“D253K”意指在成熟活性HCPB的253位天冬氨酸(D)已经变成赖氨酸(K)。在一个酶中多突变将以方括号之间用逗点隔开的单个突变显示。
在本说明书中，术语CPB包括下面内容i)带有或没有标记物(例如c-myc)的酶的成熟、原或前原形式；ii)与在关键底物结合部位187-206和238-268之间的成熟活性胰HCPB有基本序列同一性(优选至少有60％同一性，更优选有至少80％同一性并特别优选有90％同一性)、C末端有赖氨酸或精氨酸、具有肽底物专一性的任何羧肽酶；优选人胰和血浆CPB酶(优选本文公开的胰腺酶)；除非另有指出或本文内容中自明的。
自然发生的CPBs等位基因突变体也在考虑之中。
一等位基因突变体是可在一个或多个位置具有替换，缺失或添加的可选择的一种序列形式，这种形式基本上不改变该CPB的功能。
为确定羧肽酶和成熟活性胰腺HCPB之间在其关键底物结合部位的同一性程度，按照下列方法给所述序列校准。当序列号39的109到415氨基酸残基被重新编号为1到37并且用LASERGENE系统的手册(1994年第二版，DNASTAR Inc.出版，1228 South Park Street，Madison，Wisconsin 53715，USA)，MACINTOCH用户指导LASERGENE生物计算机软件中描述的以PAM250残基加权Clustal法校准时，将关键锌结合残基(在H66，E69和H194)，关键末端-羧基底物结合残基(在R124，N141，R142，和Y246)以及催化残基做了必要校准。关键底物识别残基被认为是D253，具有位于核心β片层(包括残基187到206)和活性部位表面环和螺旋(残基238到268)之间的底物识别口袋。残基263-268(在238-268序列内)是β链，虽然它们都是核心β片层的部分。
本发明的突变体CPBs是具有本发明所要求的理想性质的任何上述CPBs的突变体。优选下列胰腺HCPB的突变体D253K，D253R和；特别优选[G251N，D253R]；在其他CPBs中的相应突变也在考虑之内。关键突变位置在下表中给出。
改变HCPB特异性的突变
注1.上述位置的优选突变组合总是在253位有改变。更优选突变组合在253和251位均有改变。253位的改变，与251位非强制性组合被认为是HCPB专一性改变的关键突变。
2.特别优选的组合是[G251N，D253K]和[G251T，D253K]。另一特别优选的组合是[G215S，D253K]。
本发明的突变体CPB还可包含其他“保守性”突变(插入，替换和/或缺失)，它们不明显改变所述关键突变的性质。为本文之目的，一种保守性氨基酸替换是自然发生的可能性高于随机发生的可能性十倍的替换(如Dayhoff等，Atlas of Protein Sequence and Structure，1971，第95-96页和图9-10中描述的计算方法所定义的)并在下表中给出。
保守替换原例举替换 优选替换Ala(A)val；leu；ile valArg(R)lys；gln；asn lysAsn(N)gln；his；lys；arg glnAsp(D)glugluCys(C)serserGln(Q)asnasnGlu(E)aspaspGly(G)proproHis(H)asn；gln；lys；arg argIle(I)leu；val；met；ala；phe； leunorleucineLeu(L)norleucine；ile；val； ilemet；ala；pheLys(K)arg；gln；asn argMet(M)leu；phe；ile leuPhe(F)leu；val；ile；ala leuPro(P)glyglySer(S)thrthrThr(T)serserTrp(W)tyrtyrTyr(Y)trp；phe；thr；ser pheVal(V)ile；leu；met；phe； leuala；norleucineCPBs参考包括如下内容Folk JE in The Enzymes Vol III，Academic Press(1971)，pg 57；Coll Met al(1991)EMBO Journal 10，1-9；Eaton DL et al(1991)生物化学杂志266，21833-21838；Yamamoto Ketal(1992)生物化学杂志267，1575-1581；美国专利5364934(Genentech)和；国际专利申请WO.95/14096(Eli Lilly)。
按照本发明的另一方面，其中提供一个系统作为在上文定义用于控制宿主中肿瘤细胞生长的方法，其中该方法包括给所述宿主施用有效量的第一组分，容许第一组分从全身循环基本清除，并施用有效量的第二组分。这些组分优选经静脉施用。
按照本发明的另一方面，其中提供一种处理宿主中肿瘤细胞生长的方法，其中该方法包括给所述宿主施用有效量的第一组分，容许第一组分从全身循环基本清除，并施用有效量的第二组分，其中这些组分形成本文定义的双组分系统。这些组分优选经静脉施用。
按照本发明的另一方面，其中提供一种包含在上文定义的向肿瘤区域集中的有效剂量的第一组分药用组合物和药用可接受载体或稀释剂。该组合物优选适合于静脉给药。第一组分优选作为干燥固体供应，在使用前用适当的稀释剂稀释。
按照本发明的另一方面，其中提供一种包含在上文定义的有效抗肿瘤剂量的第二组分的药用组合物和药用可接受载体或稀释剂。该组合物优选适合于静脉给药。第二组分优选作为干燥固体供应，在使用前用适当的稀释剂稀释。
含pCG330(也称为pICI1698)的E.coli MSD 1646按照布达佩斯条约于1994年11月23日储存于23St Machar Drive，Aberdeen，Scottland，United Kingdom AB2 1RY的国立工业与海洋微生物保藏有限公司；保藏号是NCIMB 40694。NCIMB 40694是本发明的另一方面内容。
抗体A5B7作为杂交瘤储存参考93071411按照布达佩斯条约与1993年7月14日储存在ECACC，应用微生物与研究PHLS中心，Porton Down，Salisbury，Wiltshire SP40JG，UK。优选人源化抗体A5B7的F(ab′)2的形式。
抗体806.077作为杂交瘤储存参考93071411按照布达佩斯条约于1996年2月29日储存在ECACC，应用微生物与研究PHLS中心，Porton Down，Salisbury，Wiltshire SP40JG，UK。抗体806.077是A5B7的另一种抗-CEA抗体，它适用于本发明。
按照本发明的另一方面，其中提供一种制作第一组分(结合物)的方法，如此处所述通过连接能与肿瘤相关抗原结合的导向部分和；一种能转变药物前体成为抗肿瘤药物的酶，其中该酶是宿主CPB酶的一种突变形式。连接可通过化学或分子生物学技术实现。
按照本发明的另一方面，其中提供本发明的第一组分。
按照本发明的另一方面，其中提供能编码本发明的第一组分(结合物)的多核苷酸序列。
按照本发明的另一方面，其中提供包含能编码本发明第一组分的多核苷酸序列的载体。
按照本发明的另一方面，其中提供包含能编码本发明第一组分的多核苷酸序列或载体的细胞。
按照本发明的另一方面，其中提供一种具有本发明所期望的特性的突变体CPB酶。
按照本发明的另一方面，其中提供一种能编码本发明的突变体CPB酶的多核苷酸序列。本发明进一步涉及若至少有70％序列间同一性时，与编码突变体CPBs多核苷酸序列相杂交的多核苷酸序列。本发明特别涉及在严谨条件下与上文描述的多核苷酸序列相杂交的多核苷酸序列。此处所用，术语“严谨条件”意指杂交仅当有至少95％并优选有至少97％序列间同一性时发生。
按照本发明的另一方面，其中提供一种含有能编码本发明的突变体CPB酶的多核苷酸序列的载体。该多核苷酸序列可被包含在各种表达载体的任何一种载体中，特别是表达多肽的载体或质粒。这类载体包括染色体，非染色体和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒；从质粒和噬菌体DNA，病毒DNA如痘苗，腺病毒，禽痘病毒和假狂犬病毒(pseudorabies)组合得到的载体。然而可使用任何其他质粒或载体只要它们在所述宿主中是可复制的和可存活的。通过各种方法可将适当的DNA序列插入到所述载体中。
一般说，用本行业所知方法将所述DNA序列插入到适当的限制性内切酶位点。这类方法和其他方法被认为是在熟悉本行业的人员的知识范围内。所述表达载体的DNA序列可操作地连接到适当的表达控制序列(启动子)以指导mRNA合成。作为这类启动子的代表性实例，可被提到的有LTR或SV40启动子，E.coli的lac或trp，噬菌体λ的P.sub.L启动子，和其他已知在原核或真核生物细胞或病毒中控制基因表达的启动子。所述表达载体还包含一个翻译起始用的核糖体结合位点和一个转录终止子。所述载体还可包括扩增表达所用的适当序列。此外，该表达载体优选含有提供表达特征的基因以筛选被转化的宿主细胞如用于真核生物细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性或如在E.coli.中的四环素或青霉素抗性。可将含上文所述的适当的DNA序列的载体以及适当的启动子或控制序列用于转化适当的宿主以使该宿主表达蛋白质。作为适当的宿主的代表性实例，可被提到的有细菌细胞，如E.coli.，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇和Sf9；动物细胞如NSO，CHO，COS或Bowes黑素瘤；植物细胞等。相信对宿主细胞的筛选是在熟悉本文教义的行业的人员的知识范围之内。更具体说，本发明还包括含一个或多个如上文广泛描述的重组构建体。该构建体包含一个载体如质粒或病毒载体，本发明的序列以顺向或逆向插入其中。在本实施方案的优选内容中，所述构建体进一步包括调节序列，例如包括一个可操作相连到该序列的启动子。
大量的适当载体和启动子为本行业专业人员所知，而且可购买到。下列载体作为实例提供。细菌pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pbs，pD10，phagescript，psiX174，pbluescript SK，pbsks，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核生物的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而可以使用任何其他质粒或载体只要它们在宿主中是可复制的和可存活的。可从任何需要的基因中使用带有可选择标记的CAT(氯霉素转移酶)载体或其他载体筛选启动子区。两个适当的载体是PKK232-8和PMC7。列举指定的细菌启动子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，P.sub.R，P.sub.L和trp。真核生物启动子包括CMV立即早期，HSV胸苷激酶，早和晚期SV40，来自逆转录病毒的LTRs，和小鼠金属硫蛋白-I。适当载体和启动子的筛选完全在本行业常用技术水平之内。
在进一步的实施方案中，本发明涉及含上述构建体的宿主细胞。该宿主细胞可以是高等真核生物细胞，如哺乳动物细胞，或低等真核生物细胞，如酵母细胞，或该宿主细胞可以是原核生物细胞，如细菌细胞。将构建体导入宿主细胞可由例如磷酸钙转染，DEAE-Dextran介导的转染，脂转染(阳离子脂质介导的多核苷酸传递)[Felgner等，in MethodsA Companion to Methods in Enzymology(1993)5，67-75]或电穿孔法(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods inMolecularBiology，(1986))来实现。专业读者将能选择用于给定宿主的大多数适合的方法。在宿主细胞中的构建体可以常规方式用于产生由重组序列编码的基因产物。或者，通过常规肽合成仪可合成本发明的多肽。在适当的启动子控制下可在哺乳动物细胞，酵母，细菌，或其他细胞中表达成熟蛋白质。还可用无细胞翻译系统用从本发明的DNA构建体得到的RNAs产生这类蛋白质。Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，描述了用于原核和真核宿主的适当的克隆和表达载体，其中的公开部分在此引用作为参考。
通过将增强子插入到载体中增加了由高等真核生物进行的编码本发明多核苷酸的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常在10到300bp，它作用于启动子，增加其转录。实例包括在复制起始bp100到270的晚期位点的SV40增强子，巨细胞病毒早期增强子，在复制起点晚侧(late side)的多瘤增强子和腺病毒增强子。一般说，重组表达载体将包括复制起点和容许宿主细胞转化的可选择性标记例如E.coli.的青霉素抗性基因和酿酒酵母TRP1基因，和从指导下游结构序列转录的高表达基因得到的启动子。这些启动子可从编码糖酵解酶如3磷酸甘油酸激酶(PGK)，α因子，酸性磷酸酶，或热休克蛋白的启动子以及其他启动子中得到。异源结构序列被装配在带有转录起始和转录终止序列并优选带有能将转录出的蛋白直接分泌到壁膜间隙或细胞外培养基的前导序列的适当相位中。非强制性地该异源序列可编码包括赋予所期望的特征(例如稳定或简化纯化所表达的重组产物)的N端识别肽的融合蛋白。通过将编码所期望的蛋白质的DNA结构序列与适当的转录起始和终止信号一起插入到带有功能启动子的可操作阅读相位中构建细菌使用的有用表达载体。该载体将包含一个或多个表型可选标记和一个复制起点以保证载体的维持并若需要的话提供在宿主内的扩增。适当的转化用原核宿主包括E.coli.，枯草杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，和在假单胞菌属，链霉菌属和葡萄球菌属范围内的不同的种，虽然从选择上也可用其他原核宿主。作为一种代表而非限制性实例，供细菌所用的有用表达载体可包含从市场购买的质粒得到的可选择标记和细菌复制起点，所述质粒包含众所周知的克隆载体pBR322(ATCC37017)，pAT153和pBluescript的遗传元件。例如这类市售载体包括pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。这些pBR322“骨架”部分与适当的启动子和所要表达的结构序列相结合。在对适当的宿主菌株进行转化并宿主菌株生长到适当的细胞密度之后，用适当方法(例如温度漂移或化学诱导)诱导所选择的启动子并追加培养细胞一段时间。
一般通过离心收集细胞，用物理或化学方法破细胞并保存得到的粗提取物用于进一步纯化。用任何常规方法包括冻融循环法，超声法，机械破碎，或用细胞裂解试剂可破碎用于表达蛋白质的微生物细胞，这类方法是熟悉本行业的人员所熟知的。也可用各种哺乳动物细胞培养系统表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的实例包括猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系，由Gluzman，Cell，23175(1981)描述，和能表达可相容载体的其他细胞系，例如NSO，C127，3T3，CHO，Hela和BHK细胞系。哺乳动物表达载体将包含一个复制起点，一个适当的启动子和增强子，并且还包含任何必要的核糖体结合位点，多腺苷化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5’侧翼非转录序列。从SV40剪接得到的DNA序列和多腺苷化位点可被用于提供需要的非转录遗传元件。通过包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水相互作用层析，亲和层析，羟基磷灰石层析和外源凝集素层析方法从重组细胞培养物回收和纯化表达产物。在纯化时优选呈现低钙离子浓度(大约0.15-5mM)。(Price etal.，J.Biol.Chem.，244917(1969)。当必要时可在完成所述成熟蛋白的构像时使用蛋白质重折叠步骤。最后，终纯化步骤可使用高效液相层析(HPLC)。本发明多肽可以是天然的纯化产物，或化学合成方法的产物，或通过重组技术从原核或真核宿主(例如，通过培养中的细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞)产生。根据在重组生产方法中使用的宿主的不同，可用哺乳动物或其他真核生物的碳水化合物使本发明的多肽糖基化或非糖基化。本发明的多肽还可包括起始甲硫氨酸残基。
还可考虑其他表达系统例如转基因非人哺乳动物，其中目的基因优选从载体中剪切而来并优选与指导在动物乳汁中表达蛋白质的乳房启动子(mammary promoter)相结合，被导入哺乳动物受精卵的前核(通常用微注射进入前核中的两个核(通常为雄核)中之一)然后移植给代孕母亲。由代孕母亲生产的一定比例的动物将携带并表达已经整合到染色体中的所述导入基因。由常规育种通常将整合基因传递给后代由此使无性种(stock)迅速扩大。最好简单的从雌性转基因动物乳汁中收获目的蛋白质。指引读者参阅下列出版物Simons et al.(1988)，Bio/Technology 6179-183；Wright et al.(1991)Bio/Technology9830-834；US4,873,191 and；US5,322,775。在Hogan et al，“小鼠胚胎操作；实验室指南”Cold Spring Harbor Laboratory 1986中描述了有关小鼠胚胎的操作。
还考虑了转基因植物例如下列出版物中所描述的Swain W.F.(1991)TKBTECH 9107-109；Ma J.K.C.et al.(1994)Eur.J.Immunology24；131-138；Hiatt A.et al(1992)FEBS Letters 30771-75；Hein M.B.etal Molecular Biology 15281-194。
若需要的话，用标准方法如下面简要概括的和如在“基因导向；实践方法”，IRL Press 1993中描述的方法可使宿主基因失活或被修饰。目标基因或其部分优选被克隆到一个载体中，用选择标记(如Neo)插入该基因以破坏其功能。将所述载体线性化并转化(通常用电穿孔)进入胚胎干(ES)细胞(例如从小鼠129/01a得到的)此后同源重组事件在一定比例的该干细胞中发生。扩张含该基因破损的干细胞并将其注入到胚泡中(例如来自C57BL/6J小鼠)并将其植入代孕母亲以发育。可用外被颜色标记鉴别嵌合后代。通过与携带遗传标记的小鼠交配繁育嵌合体以确定ES细胞对精细胞系的贡献，所述遗传标记使ES细胞来源的配子和宿主胚泡来源的配子相互区分开。半数ES细胞来源的配子将携带有该基因修饰。筛选后代例如通过Southen印记以检定携带基因破损的后代(约为亲代的50％)。这些选出的后代将是杂合子并且因此可与另一杂合子育种随后选出纯合后代(约为亲代的25％)。带有基因剔除的转基因动物可与通过已知方法如微注射DNA进入前核，原生质球融合(Jakobovits et al.(1993)Nature 362255-258)或对ES细胞的脂质介导的转染(Lam等(1993)Nature Genetics 5 22-29)产生的转基因动物杂交以产生带有内源基因剔除和外源基因置换的转基因动物。
含目标基因破损的ES细胞可通过用含有特异性改变的目标基因序列(该基因序列最好被克隆到载体中并在转化前被线性化)转化得到进一步修饰。继同源重组之后，将被改变的基因导入基因组。随后将这些胚胎干细胞用于创建如上所述的转基因物。
术语“宿主细胞”包括适于表达技术的原核生物细胞或真核生物细胞例如细菌，酵母，植物细胞和非人哺乳动物受精卵，卵母细胞，胚泡，胚胎干细胞和其他适合转基因技术的细胞。若上下文容许的话，术语“宿主细胞”还包括从转化的非人哺乳动物受精卵，卵母细胞，胚泡，胚胎干细胞，植物细胞和任何用于转基因技术的其他适当细胞发育而来的转基因植物或非人哺乳动物。
按照本发明的另一方面，其中提供包含一种载体或一种能编码本发明的突变体CPB酶的多核苷酸序列的细胞。按照本发明的另一方面，其中提供编码在SEQ ID NO39从位置109起所定义的成熟人胰羧肽酶B的核苷酸序列或在位置243有编码半胱氨酸残基的其突变体的核苷酸序列。在其他发表的人胰羧肽酶中没有看到在克隆序列中有243位半胱氨酸残基，正如Yamamoto等，在the Journal of BiologicalChemistry，v 267，2575-2581，1992中强调的，在此当与其他哺乳动物胰羧肽酶B氨基酸序列校准时其第233号位之后的序列中显示有一个缺口(见参考实例6中的讨论)。核苷酸优选为被分离的形式，就是说至少从任何天然发生的形式中经部分纯化。该突变体最好是适合本发明的突变体CPB酶。
按照本发明的另一方面，其中提供一种制作人胰羧肽酶B或在243位有一个编码半胱氨酸残基突变体的方法包括在宿主细胞中，编码SEQ ID NO39从109位起所定义的成熟人胰羧肽酶B核苷酸序列的表达或在其243位编码有半胱氨酸残基的突变体的表达。
按照本发明的另一方面，其中提供式1的药物前体，其中
W表示直接键或CH2R1和R2分别代表Cl，Br，I或-OSO2MeR3和R4分别代表H，C1-3烷基，C1-3烷氧基，F或Cl，C1-4烷基或R5和R6分别代表H，C1-4烷基或R3和R6一起代表-CH＝CH-CH＝CH-形成非强制性含有选自O，N和S的1-3杂原子的双环体系。
X选自-CHR7CHR8-此处R7和R8选自H和C1-4烷基，假如至少在R7或R8是H时非强制性被苯基取代；-NHCHR9-其中R9选自H；普通氨基酸侧链包括例如Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的侧链；(CH2)nCONHR10其中n＝1-3并且R10选自C1-6烷基，环戊基，环己基和苯基并且此处所列每个R10非强制性地被卤素，C1-4烷基或C1-4烷氧基取代；-NH-N(R12)-其中R12选自H和C1-4烷基；Y代表NH或OZ选自-(CH2)n-CO2H(n＝1-4)-CH2OCH2CO2H-(CH2)n四唑5-基(n＝1-4)-(CH2)nCONHSO2R11(n＝1-4)其中R11选自C1-4烷基-(CH2)nSO2NH2(n＝1-4)及其盐。
按照本发明的另一方面，其中提供下述化合物或其药用盐的任何一种a)N-(4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-3-甲基-苯氧基}-苯甲酰基)-L-丙氨酸；b)N-[N-(4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-3-甲基-苯氧基}-苯甲酰基)-L-丙氨酸]-L-谷氨酸；c)N-(4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-苯氧基}-苯甲酰基)-L-丙氨酸；d)N-[N-(4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-苯氧基}-苯甲酰基)-L-丙氨酸]-L-谷氨酸。
化合物b)和d)是本发明优选药物前体的第二种成分。化合物a)和c)是相应的药物。
按照本发明的另一方面，其中提供用做药物的式1化合物或上述药物前体b)或d)或其药用盐。
按照本发明的另一方面，其中提供用作治疗癌症的药物制剂(与本发明第一组分结合)的式1化合物或上述药物前体b)或d)或其药用盐。
在本说明书中总称术语“烷基”包括直链和支链烷基。然而鉴于个别烷基如“丙基”是专门仅用于直链形式而鉴于个别支链烷基如“异丙基”是专门仅用于支链形式。类似的习惯应用于其他总称术语。
不言而喻，由于一个或多个不对称碳原子，在式1化合物的范围内可存在光学活性或外消旋的形式，本发明在其定义中包括任何具有成为本发明突变体CPBs之底物的性质的光学活性或外消旋的形式。然而在式1化合物中，在碳原子有基团Y，Z和COOH附着时，假如存在相应的游离氨基酸碳原子，在相应游离氨基酸中就优选具有L构型。
通过本行业熟知的有机化学标准技术例如非强制性地通过从光学活性初始物质合成或通过拆开外消旋形式可进行光学活性形式的合成。类似的，与突变CPBs相对的底物性质可用标准实验室技术评价。
式1的碱性化合物的适当的药用盐是例如一种与如有机酸或无机酸的酸加成盐，例如盐酸，氢溴酸，硫酸，磷酸，三氟乙酸，柠檬酸或苹果酸。分子式1的酸性化合物的适当的药用盐是碱金属盐例如钠或钾盐，碱土金属盐例如钙或镁盐，铵盐或含有提供生理可接受性阳离子的有机碱的盐，例如含有甲胺，二甲胺，三甲胺，哌啶，吗啉或三-(2-羟乙基)胺。
本发明化合物可被用于组合物如片剂、胶囊或酏剂供口服，栓剂供经肠给药，无菌溶液或悬液供胃肠外或肌内给药等。可按治疗需要以提供最佳药效的剂量给病人施用本发明化合物。虽然所述剂量依据疾病的性质和严重情况，病人体重，当时病人所循的具体饮食，同时所用的药物，以及其他熟悉本行业的人员所知的因素在各病人之间将各不相同，剂量范围将一般是每病人每天约1到1000毫克，该剂量可以单副或多副施用。优选时，所述剂量将是每病人每天约2.5到250毫克；更优选时，是每病人每天约2.5到75毫克。
自然的，这些剂量范围可按需要以单位基础做调整以使可分成每日剂量和(如上述)剂量将依疾病的性质和严重性，病人体重，具体的饮食和其他因素有所不同。
一般说，可配制这些组合物成药物组合物并讨论如下。
将1到100毫克的式1化合物或其生理可接受的盐的化合物或混合物与生理可接受的载色剂，载体，赋形剂，黏合剂，防腐剂，稳定剂食用香料等复合成被接受的药物治疗所需要的单位剂量形式。这些组合物或制剂中活性成分的量是达到所述范围的适当剂量。
可被结合到片剂，胶囊等中的配料说明如下黏合剂如树胶，黄蓍胶，阿拉伯树胶，玉米淀粉或明胶；赋形剂如玉米淀粉，预凝胶化淀粉，藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖，乳糖或糖精；食用香料如薄荷，冬青油或樱桃油。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的物质外它可含有液体载体如脂油。各种其他物质可考虑作为包被或剂量单位物理形式的额外修饰。例如，片剂可被包以紫胶片，糖或两种都有。糖浆或酏剂可含有活性化合物，蔗糖作为甜味剂，羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯作为防腐剂，染料和食用香料如樱桃或柑橘香料。
可根据常规药物实践通过将活性成分溶解于或悬于媒介物中如注射用水，天然形成的植物油如芝麻油，花生油，豆油，棉子油等或合成脂类媒介物如甲基油酸盐等配制注射用无菌组合物。可根据需要加入缓冲液，防腐剂，抗氧化剂等。
通过制备结构相关化合物的任何已知可用程序均可制备式1化合物或其药用盐。提供这类方法作为本发明的一个进一步的特点并通过下列代表性实例给予解释，除非另有指出，在所述实例中可变基团具有上文定义的任何意义。在下述具体化合物合成被扩延之处，将意识到一般方法可被用于包括讨论中述及的具体结构的所有化合物。
1.具有W＝直接键的化合物可按图9的概括制备此类化合物。这些药物前体被突变体CPB裂解释放出中间体，后者进一步分解释放出相应的酚芥子(phenolmustard)(典型IC50＝1.5微摩尔)。
步骤a-d使用的适当试剂包括(a)DCCI，HOBT或水溶性碳化二亚胺(EDCI)或异丁基氯甲酸酯/三乙胺；(b)TFA(若P1＝叔-丁基，P2是苄基)或H2，Pd/C(若P1是苄基并且P2＝叔-丁基)；(c)EDCI，DMAP，DHCl3，(d)H2/Pd/C若P2＝苄基或TFA若和-丁基被用于保护作用。
图9中化合物2i)当Y＝NH2和P2是保护基如苄基时，并当Z是例如-(CH2)n-CO2H(n＝1-4)时，则当n＝1，使用二苄基L-天冬氨酸；当n＝2使用L-谷氨酸二苄酯和；当n＝3，使用L-2-氨基己二酸二苄酯。
ii)当Z是-(CH2)n-四唑就n＝2来说，使用

图10描述的反应序列以从甲酯产生需要的二苄基保护的中间物。步骤a-e中适当的试剂包括(a)Cs2CO3，PhCH2Br，DMF；(b)10％Pd/C，H2，BOC-O-BOC；(c)NaOH，MeOH，H2O(d)Cs2CO3，PhCH2Br，DMF；分离的异构体；(e)HCl，乙醚，CH2Cl2iii)当Z是-(CH2)nCONHSO2R11就例如n＝2并R11＝Me来说，从N-BOC-α-苄基谷氨酸制备被保护的中间产物如图11所示。
步骤a-b中适当的试剂包括(a)MeSO2NH2，DCCI，DMAP；(b)HCl，EtOAc.iv) 当Z＝-(CH2)nSO2NH2就例如n＝2来说，则使用L-2-氨基-4-氨磺酰丁酸-苄酯，它由L-2-氨基-4-氨磺酰丁酸(Aldrich ChemicalCompany)产生。v) 通过已建立起来的途径或通过例如使用如L-苹果酸代替相应的L-谷氨酸产生其中Y是OH的化合物。
图9中的化合物3i)当X＝-CH2CH2-时，通过用如图9中的化合物2所描述的化合物与琥珀酐反应可制备中间物以产生其中P1＝H的半琥珀酸酯。另一种选择是用半琥珀酸酯与上述中间产物偶联以代替琥珀酸酐。
ii)当X＝-NHCH(R9)-时，用CPB裂解药物前体以产生具有直接细胞毒性的分子式5化合物。例如当R9＝(CH2)2CONH-nC4H9和R1＝R2＝Cl，R3＝R4＝R5＝R6＝H，对LoVo细胞的细胞毒性是约IC50＝20微摩尔。
为制备X＝NHCH(R9)的化合物，使用如图12描述的常规肽偶联法。然后用酸(例如HCl/乙醚)处理中间产物以形成游离胺。按图13的描述进行对酚芥子的偶联。适合步骤a的试剂包括1.对硝基苯基氯甲酸酯，三乙胺，氯仿2.三乙胺，CH2Cl2或；1.COCl2/喹啉，CH2Cl22.三乙胺，CH2Cl2其中W＝CH2和X＝-NH-NH(R12)-的化合物此类化合物按图14的说明合成。适合步骤a-b的试剂包括(a)BOC-N(R12)-NH2，EDAC，CH2Cl2；TFA，HCl/ETOAC(b)1.吡啶，CH2Cl22.三乙胺，CH2Cl2然后通过标准方法使得到的产物脱保护。
当需要式1化合物的药用盐时，例如可通过所述化合物与适当的酸或碱用常规方法反应而得之。当需要式1化合物的非强制性的一种活性形式时，可通过用非强制性的活性初始物质执行前述方法之一，或通过用常规方法拆开所述化合物的一种外消旋形式而得之。
本发明突变体CPBs的进一步应用包括下列内容。
i)羧肽酶可用于从蛋白质中顺序除去碳末端的氨基酸并继对释放的氨基酸残基分析之后可将羧肽酶用于确定蛋白质C末端的氨基酸顺序(R.P.Ambler，inMethods in Enzymology，1967，vol.X1，436-445，Academic Press)。使用对C末端天冬氨酸和谷氨酸残基具有专一性的突变体羧肽酶使得容许使用这些酶来扩展由羧肽酶消化而进行的C末端分析的界限和使该分析容易进行。
ii)在免疫检定中可用突变体酶作为酶标记。通过任何适当技术例如HPLC可检测从底物(药物前体)转变的产物。在D.M.Kemeny，Pergamon Press 1991的ELISA实用指导中描述了用酶做标记的免疫检定技术。
现在将通过本发明的下列非限定性实例(以Reference Examples为参考)描述本发明(i)通过在真空中的旋转蒸发器进行蒸发并由过滤除去残留固体后进行work up步骤。
(ii)室温下，即在18-25℃和惰性气体如氩气氛下操作；(iii)在从E.Merck，Darmstadt，Germany获得的Merck Kieselgel硅胶(Art。9385)或Merck Lichroprep RP-18(Art.9303)反相硅胶上进行柱层析(用闪烁法)和中压液相层析；(iv)产量仅作说明用，不必获得最大产率；(v)式1的终产物有满意的微量分析并且通过核磁共振(NMR)和质谱分析确定了它们的结构；除非另有说明，用分子式1的终产物的CDCl3溶液来确定NMR谱数据，以δ标度测量化学闪烁值；使用下面缩写s，单重；d，双重；t，三重；m，多重；(vi)中间物一般没有被充分特性化并且通过薄层层析，红外(IR)或NMR分析检定纯度；(vii)熔点是未修正的并且用Mettler SP62自动熔点测定器或油浴器确定之；在经常规有机溶剂如乙醇，甲醇，丙酮，乙醚或己烷，单独或在混合物中结晶之后确定分子式1终产物的熔点并；(viii)全部温度为℃。
对图的概述给出如下。
图1说明胰HCPB克隆化图2说明胰HCPB测序。
图3说明载体pICI1266。
图4说明pICI1266表达载体基因克隆。
图5说明药物前体以及相应药物的细胞毒性。
图6列出生长培养基成分。
图7-14说明化学合成方法。
图15显示实施例21药物前体单独以及实施例22相应药物单独在LoVo肿瘤细胞中的细胞毒性。
图16显示实施例21的药物前体在突变酶，D253 HCPB存在时在LoVo细胞中的细胞毒性。数字标记的行代表如下内容1＝空白(无细胞)；2-4＝实施例22的药物分别在50，100&200微摩尔；5-8＝实施例21的药物前体分别在1.47，2.4，5.9&11.75微克/毫升D253K HCPB存在时；9＝500微摩尔实施例21的药物前体；和10＝对照(只有细胞)。每个数字标记的行含有2条块(带有标出错误的边际)其中每个条块代表来自一个平板上的6个孔的数据。
图17说明一种化学合成。
参考实施例1马尿酰-L-谷氨酸的合成(见图8)在一个大气压的氢中搅拌THF中的马尿酸-L-谷氨酸二苄酯(化合物3)(2.06g，4.2×10-3摩尔)和30％Pd/Carbon(50％湿)(0.77g)1.5小时。通过硅藻土(CeliteTM)过滤该混合物并使滤物蒸发至干燥。用二乙酯研制得到需要的如白色结晶固体1.02g终产物(78％)。熔点169-171℃.20D＝-2.5NMR DMSO d6 12.3，2H(宽)；8.7，1H(t)；8.2，1H(t)；7.9，2H(m)；7.5，3H(m)；4.3，1H(m)；3.9，2H(m)；2.3，2H(t)；1.9，2H(m)按下面制备初始物质化合物3。将1-羟基苯并三唑(0.73g，5.5×10-3摩尔)，三乙胺(1.4ml，9.7×10-3摩尔)和1-(3-二甲基-氨丙基)-3-乙基碳化二亚胺，HCl盐(1.05g，5，5×10-3摩尔)加入到马尿酸(0.90g，5×10-3摩尔)和L-谷氨酸二苄酯(2.50g，5×10-3摩尔)的DMF(35ml)溶液中。室温下搅拌该化合物过夜，将其倒入水(400毫升)中并用乙酸抽提两次(100毫升)。用饱和碳酸氢钠，水，2N HCl和水洗结合的抽提物。用硫酸镁干燥有机相并挥发得到所需要的如黄色油状初始物2.06g(84％)。
NMR DMSO d6 8.7，1H(t)；8.4，1H(d)；7.9，2H(m)；7.5，3H(m)；7.35，10H(m)；5.15，2H(s)；5.05，2H(s)；4.4，1H(m)；3.9，2H(t)；2.0，4H(m)。
参考实施例2马尿酰-L-天冬氨酸的合成在一个大气压氢中搅拌在THF中的马尿酰-L-二苄酯(1.28g，2.7×10-3摩尔)和30％Pd/Carbon(50％湿)(0.51g)3小时。通过CeliteTM过滤该混合物并蒸发滤物至干燥。用二乙酯研制得非白色结晶固体0.62g(78％)。熔点200-202℃.200D＝+7.9。
NMR DMSO d6 12.5，2H(宽)；8.7，1H(t)；8.2，1H(d)；7.7，2H(m)；7.5，3H(m)；4.6，1H(m)；3.9，2H(d)；2.7，2H(m)如下合成初始物质。将1-羟基苯并三唑(0.73g，5.5×10-3摩尔)，三乙胺(1.4ml，9.7×10-3摩尔)和1-(3-二甲基-氨丙基)-3-乙基碳化二亚胺，HCl盐(1.05g，5，5×10-3摩尔)加入到马尿酸(0.90g，5×10-3摩尔)和L-谷氨酸二苄酯(2.31g，5×10-3摩尔)的DMF(35ml)溶液中。室温下搅拌该化合物4小时然后将其倒入水(450毫升)中并用乙酸抽提两次(100毫升)。用饱和碳酸氢钠，水，2NHCl和水洗结合的抽提物。在硫酸镁上干燥有机相并挥发至干燥得到所需要的如黄色油状初始物1.90g(80％)。NMR DMSO d6 8.7，1H(t)；8.45，1H(d)；7.9，2H(m)；7.5，3H(m)；7.3，10H(m)；5.15，2H(s)；5.05，2H(s)；4.8，1H(m)；3.9，2H(m)；2.9，2H(m)参考实施例3重组HCPB对Hipp-Arg的酶活性通过分光光度计检定如参考实施例12描述所产生的纯化人CPB之转变马尿酸-L-精氨酸(Hipp-Arg；Sigma)成为马尿酸的能力。
通过用一定浓度范围(0.75-0.125mM)的Hipp-Arg和1微克/毫升浓度的CPB酶检测Hipp-Arg向254nM马尿酸转变的初始速率来确定天然HCPB的Km和kcat。在37℃，0.25mMTris HCl pH7.5的缓冲液中用1厘米通道长度比色杯以1.0ml总体积用Perkin Elmer Lambda 2分光光度计进行检测。用ENZFITTER软件程序(Biosoft，Perkin Elmer)计算Km和Vmax值。通过反应混合物中的该酶浓度除以Vmax计算出Kcat。
人CPB对Hipp-Arg的结果是Km＝0.18mMKcat＝65s-1该结果证明重组子HCPB具有酶活性并能断裂Hipp-Arg中的酰氨键释放出马尿酸。
参考实施例4精氨酸芥子药物前体的合成(见图7)(2S)，2-(3-{4-[双-(2-氯乙基]-氨基)-苯氧羰基}-丙酰-氨基)-5-胍基-戊酸(化合物5c，图7)(2S)，2-(3-{4-[双-(2-氯乙基]-氨基)-苯氧羰基}-丙酰-氨基)-5-(2-硝基)-胍基-戊酸苄酯(化合物4c，图7)(275毫克；0.44mmol)在含10％Pd/C(200毫克)的乙酸/MeOH(1/1∶V/V)(8毫升)中的溶液在Paar仪中以80psi被氢化6小时。过滤后，蒸发有机相。得到的油用CH2Cl2/二乙醚重结晶以得到所期望的如白色固体(180毫克)，的化合物5c，产率84％。
1HNMR(CD3OD)1.55-1.7(m，3H)；1.8-1.9(m，1H)；2.6-2.7(m，2H)；2.75-2.85(m，1H)；2.9-2.95(m，1H)3.1-3.2(m，2H)3.6-3.7(m，4H)；3.7-3.8(m，4H)4.3(dd，1H)；6.75(dd，2H)；6.95(dd，2H)。
MS(ESI)512-514(MNa)+分析(C20H29N5O4Cl21.5H2O)计算值.C47.91H6.43N13.97实测值C47.7H6.21N14.26制备初始化合物4c如下。向(2S)，2-氨基-5-(2-硝基)-胍基-戊酸苄酯(化合物2c)(654毫克；1mmol)的CHCl3(10ml)溶液中加入二氢呋喃2，5二酮(化合物1)(120毫克；2毫摩尔)随后滴加三乙胺(202毫克；2毫摩尔)。室温下搅拌2小时蒸发溶剂并将粗残留物溶于水。pH用2N HCl调到2.5。用乙酸提取水层。用盐水洗有机层，干燥(硫酸镁)并蒸发以得到(2S)，2-(3-羰基-戊氨基)-5-(2-硝基)胍基戊酸苄酯(化合物3c)。用二乙酯研制得到的固体物并滤出280毫克(68％)。
1HNMR(CD3OD)1.52-1.68(m，2H)；1.7-1.8(m，1H)；1.85-1.95(m，1H)；2.45-2.7(m，4H)；3.15-3.3(m，2H)；4.5(m，1H)；5.15(dd，2H)；7.25-7.4(m，5H)MS(ESI)432[MNa]+向化合物3c(204毫克；0.5毫摩尔)的CHCl3(5毫升)悬液加入4-[双(2-氯乙基)氨基]-酚(化合物6)(135毫克；0.5毫摩尔)，EDCI(19毫克；0.5毫摩尔)随后加入DMAP(18毫克；0.75毫摩尔)。室温下搅拌6小时，使溶剂蒸发。残留物被乙酸和水分开用2N HCl将水相酸化至pH＝3。用乙酸提取后，用盐水洗有机层，干燥(硫酸镁)并蒸发。用CH2Cl2/MeOH(95/5∶V/V)作为洗脱剂通过闪烁层析纯化以得到所期望的如白色泡沫的初始物质(281毫克)产率90％。4c1HNMR(CD3OD)1.55-1.7(m，2H)；1.7-1.8(m，1H)；1.85-1.95(m，1H)；2.55-2.75(m，2H)；2.8-2.9(m，2H)；3.15-3.25(m，2H)3.6-3.7(m，4H)；3.7-3.8(m，4H)4.5(dd，1H)；5.15(dd，2H)；6.7(d，2H)；6.95(d，2H)；7.32(m，5H)MS(ESI)647-649(MNa)+参考实施例5琥珀酸-单-{4-[N，N-双(2-氯乙基)氨基]-苄基}酯(此处亦称为“中间产物”)在搅拌下向琥珀酐(225毫克，2.25毫摩尔)的CHCl3(10毫升)的悬液中加入4-[N，N-双(2-氯乙基)-氨基]酚(化合物6，图7；203毫克，0.75毫摩尔)随后加入三乙胺(75毫克，0.75毫摩尔)。搅拌混合物过夜并使溶剂挥发。溶解粗残留物在醋酸/Et2O/水中并在搅拌下调pH到3。用水，盐水洗有机层，干燥(硫酸镁)，并蒸发。从Et2O/己烷使得到的油结晶并滤出白色固体并在真空中干燥以得到期望的终产物(210毫克；产率83％)。熔点98-100℃。MS(ESI)356-358[MNa]+1HNMR(CDCI3)2.8(dd，2H)；2.9(dd，2H)；3.65(dd，4H)3.75(dd，4H)；6.65(d，2H)；7.0(d，2H)；分析(C14H17Cl2O4N0.2H2O)计算值％C49.78H5.19N4.15实测值％C49.9H5.3N4.2参考实施例6人胰羧肽酶B(HCPB)的克隆标准的分子生物学技术，如限制性酶解，连接，激酶反应，去磷酸化，多聚酶链反应(PCR)，细菌转化，凝胶电泳，缓冲液配制和DNA扩增、纯化和分离，是按照Maniatis等，(1989)MolecularCloning，A Lanoratory Manual；Second editionCold Spring HarnorLaboratory，Cold Spring Harbor，New York描述的方法或具体产品的制造商推荐方法进行的。在大多数情况中，酶购自New England Biolabs，但可以使用其他提供者和相应的方法。按照Applied Biosystems Inc.提供的说明书，在Applied Biosystems 380A DNA合成仪中从5’二对甲氧三苯甲基碱基保护的核苷-2-氰乙基-N，N’二异丙基氨基磷酸制备寡核苷酸序列并将被保护的核苷酸连接到0.2微摩尔级的受控制的珠孔玻璃支持物上。
用PCR技术从克隆在λgt10载体(Clontech，人胰5’STRETCHcDNA，HL 1163a)中的人胰cDNA库得到人胰羧肽酶B的编码序列，并将其克隆到pBluescript II KS+(Stratagene)质粒载体中。
一般的，一份cDNA库(5微升滴度＞108pfu/ml)与100pMols两种寡聚合苷酸引物，BPT1和BPB1(SEQ ID NO28和SEQ IDNO29)，终浓度为200微摩尔的dNTP，Taq聚合酶反应缓冲液，和2.5单位的Taq聚合酶混合，终体积为100微升。在加入到Taq酶前将混合物加热94℃10分钟，PCR温浴在94℃15分钟，50℃2分钟，和72℃2分钟进行30循环，随后在反应结束时一次温浴72℃9.9分钟。
设计两个寡核苷酸引物以使PCR从基因的5’从前序列的起点与原序列的起点之间的BPT1(SEQ ID NO28)延伸并从基因的3’端从BPB1(SEQ ID NO29)反向延伸，如图1所示。还设计BPT1和BPB1以将单限制性位点，SacI和XhoI分别引入PCR产物。
通过琼脂糖凝胶电泳分析了一份PCR产物的正确大小的DNA(约1250碱基对)并发现其主要含有一条该正确大小的带。用Centricon100微浓缩柱(Amicon)纯化了来自所述反应混合物的其余产物并使其与多余试剂分开，随后用乙醇/醋酸钠沉淀，离心，真空干燥分离DNA并重悬浮于水中。用酶SacI和XhoI消化分离的DNA，用切下和玻璃乳法(Geneclean，Stratec Sdientific，或其他类似产品)从凝胶电泳纯化并分离正确大小的带(约1250碱基对)。
用SacI酶限制性酶解pBbluescript II KS+双链DNA(Stratagene)用牛肠碱性磷酸酶使产物去磷酸化以除去5’磷酸基团并减少再连接和转化后的载体本底。用玻璃乳法从酶反应污染物中纯化DNA产物，然后用XhoI酶限制性酶解。通过用切下和玻璃乳法(Geneclean，Stratec Sdientific，或其他类似产品)从凝胶电泳纯化并分离正确大小的DNA(约2850碱基对)。
用凝胶电泳与已知标准比较核对每份限制酶解的DNA和纯化的DNA样品以备纯化和浓缩估计之用。根据这些估计值用摩尔分子比约为1载体比2.5插入片段(1pBluescript II KS+比2.5HCPB PCR产物)，并终DNA浓度约2.5ng/微升，在T4DNA连接酶，1mMATP和酶缓冲液存在时准备连接混合物以将HCPB基因克隆到载体中。
连接反应之后，该DNA混合物被用于转化E.coli菌株DH5α(Gibco-BRL，最高效率感受态细胞)。整份细胞铺在含100微克/毫升青霉素的L-琼脂营养培养基上以筛选质粒载体，并在37℃培养过夜。通过杂交方法鉴定含有目的物插入的质粒克隆。
挑出大约200个菌落一式两份地平板接种于无菌硝基纤维素滤膜(Schlercher and Schull)，在含有作为选择质粒载体的100微克/毫升青霉素的L-琼脂营养培养基的平板上预湿，并在37℃培养过夜。一复制平板存于4℃，作为这些菌落的活细胞源，另一份所述平板做变性处理并将DNA从各个菌落固定到硝基纤维素上。将所述硝基纤维素滤器从琼脂平板除去并接着放在Whatman滤纸上吸印1.10％SDS持续2分钟2.0.5M NaOH，1.5M NaCl持续7分钟3.0.5M NaOH，1.5M NaCl持续4分钟4.0.5M NaOH，1.5M NaCl持续2分钟5.0.5M Tris pH7.4，1.5M NaCl持续2分钟6.2×SSC(标准柠檬酸盐水)持续2分钟然后将该滤器放在Whatman滤纸上在10×SSC中吸印并通过紫外处理(Spectrolinker XL-1500 UV交联器)将变性DNA交联到硝基纤维素上。然后使滤器在室温下干燥，然后在6×SSC中60℃下轻微摇动1小时进行预杂交(例如用Techne HB-1D杂交仪)。预杂交封闭在滤器上的非特异性DNA结合部位。
为确定哪些克隆含有目的DNA插入，用从所述胰cDNA库(见上)的HCPB PCR产物制备的放射性标记32P-DNA探针与交联到硝基纤维素滤器上的DNA杂交。在总体积50微升中(Pharmacia T7Quickprime试剂盒)用T7DNA聚合酶将50ng DNA标记上50微居里的32P-dCTP(～3000居里/毫摩尔)，使反应在37℃进行15分钟。然后将标记的探针加热到95℃持续2分钟，使双链DNA变性，立刻在60℃加入到10毫升6×SSC。用此溶液替换滤器上的预杂交液。在轻轻摇动中60℃下持续温浴约3小时。此后，杂交液排除水分并用2×SSC在60℃下洗滤器两次，每次15分钟。然后轻轻将滤器吸干，用胶膜(cling film)覆盖(SaranTMwrap或类似物)，X射线胶片(例如KodakXomatARSTM)室温暴光过夜。该胶片显影后，将那些在X射线胶片上有最强暴光(最暗的斑点)的菌落鉴定为含目的插入片段的菌落。在此系列实验中约50％的菌落产生阳性杂交。从中选出12菌落用于进一步筛选。从复本滤器中挑出这些菌落，划线并保持在含100微克/毫升青霉素的L琼脂营养培养基上，并在含100微克/毫升青霉素的L-肉汤营养培养基中生长。
通过PCR用引物BPT1和BPB1(SEQ ID NO28和SEQ IDNO29)核对挑选出的隔离群的正确大小的插入，并用内部引物BPT2(SEQ ID NO30)和BPB1进行引发合成(引发)。设计BPT2是为在位于成熟基因起点前的原序列的末端引发和引入XbaI限制性位点。
为进行PCR，挑出被选分离的筛选菌落并分散到200微升蒸馏水中并在一个封闭的Ependorph管中100℃加热10分钟。然后在微离心机中离心该悬液10分钟以团集细胞碎片，并将1微升上清液用做PCR筛选中的DNA模板。一般说，1微升上清液与20pMols的两种寡核苷酸引物，BPT1和BPB1，终浓度为200微摩尔的dNTPs，Taq聚合酶反应缓冲液，和0.5单位的Taq聚合酶混合在20微升终体积中。使用25个循环的90℃持续1.5分钟，50℃持续2分钟，72℃持续2分钟进行PCR温浴，继之以反应终止时的一次72℃持续9.9分钟。
通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的正确大小(从引物BPT1到BPB1大约1250碱基对，和从BPT2到BPB1大约900碱基对，见图1)的DNA。12个菌落中的十个给出正确大小的PCR DNA产物。然后取该10个菌落克隆的6个用于质粒DNA制备(用Qiagen Maxi试剂盒，从100毫升的在有100微克/毫升青霉素的L-肉汤中的37℃过夜培养物)。然后用USB Sequenase DNA测序试剂盒(其中参入细菌噬菌体T7 DNA聚合酶)对这些质粒DNA制品进行含盖PCR产物插入片段区域测序。用8个即被称为676，336，337，679，677，1280，1279和1281(SEQ ID NO30到37)的分开的寡核苷酸引物对每个克隆测序。在图2描绘出在HCBP序列中的测序引物的定位，引物336，1279，676，1280，677和1281是‘向前’，而337和679‘向后’。
发现在该6个克隆中的5个在并包括SacI和XhoI限制性位点之间具有1263个相同的碱基对序列(SEQ ID NO38)，并将此序列用于进一步的实验中。在SEQ ID NO39中显示该DNA序列翻译成相应的多肽序列。该成熟蛋白序列的起始是氨基酸残基109。14号氨基酸残基标志推定的原酶序列的起始。仅有部分该酶分泌前导序列(前序列存在于克隆的PCR产生的DNA中。所述多肽序列显示在361位的一个天冬氨酸残基，这在当该全序列与其他哺乳动物羧肽酶A和B校准时表现出B型专一性(见由Catasus L等Biochem J.，287，299-303，1992给出并讨论的255号氨基酸)。然而，在其他发表的人胰羧肽酶B序列中没有观察到所述序列克隆中的243位半胱氨酸残基如由Yamamoto等在the Journal of Biological Chemistry，V 267，2575-2581，1992中强调的，在与其他哺乳动物胰羧肽酶B氨基酸序列与之校准时在其244号位置之后的序列中出现一个缺口。图2还显示了天冬氨酸残基在酶识别位置的大致部位，以及成熟酶的135位的半胱氨酸残基(在SEQ ID NO39的243位)。
这些克隆之一于1994年11月23日储存在国立工业与海洋细菌保藏有限公司(23St.Machar Drive，Aberdeen AB2 1RY，Scotland)并有标示为NCIMB 40694。从该克隆得到的质粒称为pICI1698。
参考实施例7从E.coli表达成熟的HCPB-(His)6-c-Myc为达到从E.coli表达成熟的HCPB，将来自pICI1698的成熟基因转移到一个质粒载体中，后者使蛋白质产物受控制的分泌到细菌的周质中。此分泌型载体称为pICI266，它在适合于受控制表达的细菌宿主MSD522中，于1993年10月11日将其储存在国立工业与海洋细菌保藏有限公司(Aberdeen AB2 1RY，Scotland)并有标示NCIMB40589。在图3中表示pICI266的质粒图谱。该质粒有四环素抗性和诱导基因(TetA和TetR)，一个AraB操纵子和启动子序列以供基因表达，和一个AraC基因以供表达控制。启动子序列后接PelB翻译前导序列，后者引导接在其后的多肽进入周质中。基因克隆的位点有一些单一的限制性位点并且后接噬菌体T4转录终止序列。在图4中描绘了该区域中的DNA序列和供基因克隆的特点。
为将成熟HCPB序列克隆到pICI266中决定通过PCR产生HCPBDNA，并在该成熟基因的起始处的密码子利用上做些改变。而且，为有助于检测和纯化该表达构建体，向该酶中加入了称之为(His)6-c-myc的C末端肽标记。该标记包括6个组氨酸，三肽接头(EPE)和一个来自c-myc的肽序列(EQKLISEEDL)，后者被抗体9E10所识别(如Evan等Mol.Cell Biol，v5，129-136，1985所发表的并可从Cambridge Research Biochemicals和其他抗体供应商买到)通过加入一个天冬氨酸完成C末端。6个组氨酸残基应使被表达的蛋白质能在金属螯合物柱上纯化(例如来自Qiagen的Ni-NTAAgrose)。此外，使用PCR引物在该基因5’(FspI)和3’(EcoRI)引入独有的限制性位点以便利向该表达载体引入PCR产物。在SEQ IDNOs40和41中显示两个称为FSPTS1和6HIS9E10R1BS1的引物序列。
为生成一个用于克隆到pICI266中的被修饰的基因，在终体积为100微升其中存在约5ng pICI1698DNA，终浓度为200微摩尔的dNTPs，Taq聚合酶反应缓冲液，和2.5单位Taq聚合酶时，使用100pMols的引物FSPTS1和6HIS9E10R1BS1B组建PCRs。在加入Taq酶前将该混合物在94℃加热10分钟，使用30个循环的94℃持续1.5分钟，50℃持续2分钟，和72℃持续2分钟进行PCR温浴，随后在反应终止时72℃一次温浴9.9分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分析一份PCR产物的正确大小的DNA(约1000碱基对)并发现其主要含有该正确大小的带。用Centricon100微浓缩柱(Amicon)纯化反应混合物的其余产物并与多余试剂分开。，随后通过乙醇/醋酸钠沉淀，离心，真空干燥分离DNA并重悬浮于蒸馏水中。用酶FspI和EcoRI限制性酶解被分离的DNA，并用切除和玻璃乳(Geneclean，Stratec Scientific，或其他类似产品)从琼脂糖凝胶电泳纯化和分离该正确大小(约1000碱基对)的带。
用标准DNA技术(Qiagen质粒试剂盒或类似物)制备的pICI266双链DNA被KpnI酶解，要非常小心以保证完全酶解。然后通过65℃加热10分钟使酶失活，然后在冰上冷却。如供应商(New EnglandBiolabs)所推荐的，在dNTPs存在时，再用T4DNA聚合酶消化KpnI生成的3’突出并在16℃温浴15分钟。通过在70℃加热15分钟使酶失活来终止反应。用玻璃乳从酶反应污染物中纯化DNA产物，一份产物经核对用于琼脂糖凝胶电泳产率分析，而其余产物用EcoRI做限制性酶解。再次注意保证完全限制性酶解。通过琼脂糖凝胶电泳用切除和玻璃乳(Geneclean，Stratec Scientific，或其他类似产品)纯化和分离正确大小(约5600碱基对)的DNA。
用琼脂糖凝胶电泳的方法与已知标准比较核对每份经限制性酶解和纯化的DNA样品以用于纯度和浓度估计。根据这些估计值用摩尔分子比约为1载体比2.5插入片段(1pICI266比2.5HCPB PCR产物)，并终DNA浓度约2.5ng/微升，在T4DNA连接酶，1mMATP和酶缓冲液存在下，用适合平末端DNA的连接条件(FspI加入到T4 DNA聚合酶处理过的KpnI中)准备连接混合物以将HCPB基因克隆到载体中。
连接反应之后，该DNA混合物被用于转化E.coli菌株DH5α(Gibco-BRL，最高效率感受态细胞)。整份细胞铺在含10微克/毫升四环素的L-琼脂营养培养基上以筛选质粒载体，并在37℃培养过夜。通过杂交方法鉴定含有目的物插入的质粒克隆。
挑出大约350个克隆平铺于双重无菌硝基纤维素滤器(Schlercherand Schull)，在含有作为选择质粒载体的10微克/毫升四环素的L-琼脂营养培养基的平板上预湿，并在37℃培养过夜。一复制平板存于4℃，作为这些菌落的活细胞源，另一份所述平板做变性处理并将DNA从各个菌落固定到硝基纤维素上。将所述硝基纤维素滤器从琼脂平板除去并接着放在Whatman滤纸上吸印1.10％SDS持续2分钟2.0.5M NaOH，1.5M NaCl持续7分钟3.0.5M NaOH，1.5M NaCl持续4分钟4.0.5M NaOH，1.5M NaCl持续2分钟
5.0.5M Tris pH7.4，1.5M NaCl持续2分钟6.2×SSC(标准柠檬酸盐水)持续2分钟。
然后将该滤器放在Whatman滤纸上在10×SSC中吸印并通过紫外处理(Spectrolinker XL-1500 UV交联器)将变性DNA交联到硝基纤维素上。然后使滤器在室温下干燥，然后在6×SSC中60℃下轻微摇动1小时进行预杂交(例如用Techne HB-1D杂交仪)。预杂交封闭在滤器上的非特异性DNA结合部位。
为确定哪些菌落含有目的DNA插入，用从所述胰cDNA库(见上)的HCPB PCR产物制备的放射性标记32P-DNA探针与交联到硝基纤维素滤膜上的DNA杂交。在50微升总体积中(Pharmacia T7Quickprime试剂盒)用T7DNA聚合酶将50ng DNA标记上50微居里的32p-dCTP(～3000居里/毫摩尔)，使反应在37℃进行15分钟。然后将标记的探针加热到95℃持续2分钟，使双链DNA变性，立刻在60℃加入到10毫升6×SSC。用此溶液替换滤器上的预杂交液。在轻轻摇动中60℃下持续温浴约3小时。此后，杂交液排除水分并用2×SSC在60℃下洗滤器两次，每次15分钟。然后轻轻将滤器吸干，用胶膜(cling film)覆盖(SaranTMwrap或类似物)，X射线胶片(例如KodakXomatARSTM)暴光室温过夜。该胶片显影后，将那些在X射线胶片上有最强暴光(最暗的斑点)的菌落鉴定为含目的插入片段的菌落。在此系列实验中约50％的菌落产生阳性杂交。从中选出12菌落用于进一步筛选。从复本滤膜中挑出这些菌落，划线并保持在含10微克/毫升四环素的L琼脂营养培养基上，并在含10微克/毫升四环素的L-肉汤营养培养基中生长。
通过PCR用引物FSPTS1和6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO40和SEQ ID NO41)核对挑选出的分离物的正确大小的插入，以及用内部引物BPB2(SEQ ID NO33)和FSPT1进行的引发合成。设计BPB2是为在位于成熟基因内引发合成和产生一个约430碱基对的片段。
为进行PCR，挑出被选分离的筛选菌落并散布到200微升蒸馏水中并在一个封闭的管中100℃加热10分钟。然后在微离心机中离心该悬液10分钟以团集细胞碎片，并将1微升上清液用做PCR筛选中的DNA模板。一般说，1微升上清液与20pMols的两种寡核苷酸引物，FSPT1和6HIS9E10RIBS1，或FSPT1和BPB2，终浓度为200微摩尔的dNTPs，Taq聚合酶反应缓冲液，和0.5单位的Taq聚合酶混合在20微升终体积中。使用25个循环的90℃持续1.5分钟，50℃持续2分钟，72℃持续2分钟进行PCR温浴，继之以反应终止时一次72℃持续9.9分钟。
通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的正确大小(从引物FSPTS1到6HIS9E10R1BS1大约1000碱基对，和从引物FSPTS1到BPB2大约430碱基对，见图1)的DNA。全部12个菌落给出正确大小的PCR DNA产物。然后取该10个菌落克隆的6个用于质粒DNA制备(用QiagenMaxi试剂盒，从100毫升的在有10微克/毫升四环素的L-肉汤中的37℃过夜培养物)。然后用USB Sequenase DNA测序试剂盒(其中参入细菌噬菌体T7 DNA聚合酶)对这些质粒DNA制品进行含盖PCR产物插入片段区域测序。或使用自动DNA测序服务器(使用ABI测序仪)。使用数个分开的寡核苷酸引物对这些克隆测序。将其中三个称为1540，1590和1731的引物用于核对表达载体与插入基因(SEQ IDNOs42，43和44)之间的克隆连接，以及从插入基因的起点和终点取得序列资料。用其他引物，包括称为679，677，1802，和1280(SEQ ID NOs33，34，45和35)确定插入基因序列的其余部分。这个含有修饰的成熟HCPB基因的质粒被称为pICI1712。确认的显示从PeIB序起点到(His)6-c-myc标记终点的氨基酸翻译的克隆基因序列被显示为SEQ ID NO46它具有PeIB的第一个密码子中从1开始编号的DNA和在成熟HCPB中从1开始编号的肽。
为获得修饰的HCPB的受控制的表达，将pICI1712质粒DNA转化进入氯化钙转化感受态E.coli表达菌株。在这些菌株中包括了用阿拉伯糖(Ara)作为主要碳源时不能生长的菌株，和阿拉伯糖操纵子染色体缺失的菌株。优选菌株被称为MSD213(Casadaban等，Journalof Molecular Biology，138，179-208，1980的菌株MC1000)，并具有不完全基因型，F-AraΔ(Ara-Leu)ΔLacX74 Gal GalK StrR。另一优选菌株被称为MSD525(菌株MC1061)并具有基因型，AraD139Δ(Ara Leu)7697ΔLac74GalU HsdR RpsL。类似基因型的E.coli菌株适合于在质粒pICI266中从Arab启动子的基因的受控制表达，这个菌株可从E.coli Genetic Stock Centre，Department of Biology，YaleYniversity，CT，USA获得。对转化的筛选是在含10微克/毫升四环素的L琼脂营养培养基上37℃过夜。从转化平板中挑出单个菌落，通过划线和保持在含10微克/毫升四环素的L琼脂营养培养基，并在含10微克/毫升的L肉汤培养基中生长而被纯化。
以相同的方式处理全部pICI1712被转化的菌株以检测克隆的HCPB基因的表达。
1.用单菌落接种到含10微克/毫升四环素10毫升L肉汤营养培养基的25毫升Universal容器中，并在37℃振摇培养过夜。
2.取0.75毫升(1％v/v)的该过夜培养物接种到经在250毫升锥型烧瓶中预热到37℃的含10微克/毫升四环素的75毫升L肉汤培养基中。接种瓶继续在37℃振摇在540nm光吸收监测生长。要求在该培养物的指数生长期诱导克隆的蛋白质表达，而这个时期在540nmO.D.为0.4和0.6之间，并且一般取接种后90到150分钟之间。
3.在细胞已达到需要的光密度时通过将烧瓶置于室温30分钟使培养物冷却。然后加入阿拉伯糖到终浓度为1％(w/v)，继续在30℃振摇培养物4到6小时。
4.培养后进行最终光密度测定，离心收集细胞。用最终O.D.测定值计算蛋白质丙烯酰胺凝胶(Laemmli)缓冲液上样体积，该缓冲液用于重悬浮所述细胞沉淀。O.D.小于1时，每0.1O.D.单位用10微升，而O.D.大于1时，每0.1O.D.单位用15微升体积。Laemmli上样缓冲液包含0.125M Tris-HCl pH6.8，含2％SDS，2％β-巯基乙醇，10％甘油和0.1％溴酚兰。
5.重悬浮后，通过100℃加热10分钟使样品变性，然后离心以将粘性细胞碎片从上清液中分开。一般将表达样品(通常20微升上清液)上样到17％的SDS丙烯酰胺凝胶用于电泳分离蛋白质。通常准备一式两份凝胶以便一份可做总蛋白质染色(用Coomassie或类似染料和标准条件)，而另一份可被处理以使用Western分析时指示具体产物。
为Western分析，使用半干电泳印记器将凝胶电泳中的蛋白质转移到尼龙膜(Problot，AppliedBiosystems样品用)。在操作前和操作期间注意保证使膜维持潮湿。在蛋白质从胶中移出后，用5％低脂奶粉(Marvel或类似产品)的磷酸缓冲盐水(PBS)溶液室温轻微搅拌5小时阻断进一步结合。然后将该膜在含0.05％吐温20的PBS中室温下轻微搅拌洗三次，每次5分钟。然后将洗过的膜与初级抗体(单克隆9E10小鼠抗c-myc肽(见上))以适当的稀释度(一般，腹水是1比10,000或杂交瘤是1比40)在含0.05％吐温20和0.5％1低脂奶粉中一起温浴，室温轻微搅拌过夜。然后在室温在含0.05％吐温20的PBS中轻微搅拌洗3次，每次5分钟。然后将洗过的膜与第二抗体，即辣根过氧化物酶标记的抗-小鼠IgG(一般从山羊生成，如来自Sigma的A4416)一起以适当的稀释度(一般1比10,000)在含0.05％吐温20和0.5％低脂奶粉中的PBS中室温下轻微搅拌3次，每次至少10分钟。然后将该膜用Amersham ECL Western检测试剂盒法处理，并在第一次用Amersham Hyperfilm ECL暴光30分钟，随后暴光适当时间以得到清楚的表达蛋白带的图像。可使用其他类似敏感性的膜上有过氧化物酶标记蛋白质的检测方法。
在pICI266(pICI1712)中克隆的标记的HCPB的良好表达通过Coomassie染色凝胶得到证明，该凝胶在与载体(pICI266)单独克隆相比时在35,000道尔顿处显示一条额外的强蛋白质带和一条用c-myc肽标记的Western分析检测得到的有强信号的同样大小的带。
参考实施例8来自E.coli的成熟HCPB的表达在E.coli中克隆和表达成熟HCPB的方法与参考实施例7中描述的方法非常类似。还用pICI266作为克隆载体，但在此实施例中用于成熟HCPB基因的PCR的起始物质是质粒pICI1712，标记的基因在该表达载体中。在PCR反应中(代替引物FSPTS1和6HIS9E10R1BS1)使用了两个称为2264和2265的寡核苷酸(SEQ ID NOs48和49)，使用与参考实施例7类似的条件，但用pICI1712 DNA代替pICI1698。首先，设计2264寡核苷酸上链在pICI1712上作引物并包括在PeIB前导序列中的NcoI限制酶位点并延续到插入的成熟HCPB基因起点(包含在SEQ ID NO46中的36到66DNA碱基对)。其次，设计2265寡核苷酸下链引物从成熟HCPB基因的末端开始，位于(His)6-c-myc标记序列起点之前(与包含在SEQ ID NO46中的965到987DNA碱基对互补)，并在其后含有一个EcoRI(GAATTC)限制酶位点的基因末尾引入翻译终止密码(与TAATAA互补)以及充填碱基。在PCR中该寡核苷酸引物返回所述基因以分离成熟基因序列。
通过琼脂糖凝胶电泳对一份PCR产物分析正确大小的DNA(约970碱基对)并发现主要含有一个正确大小的带。以参考实施例7的一种类似的方式从所述反应混合物纯化其余的产物。用NcoI和EcoRI限制性酶解所分离到的DNA，并以参考实施例7的一种类似的方式纯化一条正确大小的带(约940碱基对)。
用NcoI和EcoRI酶限制性酶解以类似于参考实施例7的方式制备的pICI266双链DNA，要十分仔细以保证完全酶解。以参考实施例7的一种类似的方式纯化正确大小的DNA(约5600碱基对)。
用凝胶电泳的与已知标准比较核对经限制酶解和纯化的每份的纯度和浓度。根据这些估计准备连接混合物以用参考实施例7的一种类似的方式将HCPB基因克隆到pICI266载体中。
继连接反应之后，以参考实施例7的一种类似的方式将该DNA混合物用于转化E.coli菌株DH5α，挑出菌落并通过杂交检测。
然后取6个克隆用于质粒制备，然后以参考实施例7的一种类似的方式对其做覆盖PCR产物区测序。所述克隆用6个分开的被称为1504，1802，679，1280，677和1731(SEQ ID NOs42，45，33，35，34和44)寡核苷酸引物测序。根据测序结果，选出一个含具有所要求的成熟HCPB基因序列的质粒的克隆，并称其为pICI1736。
该克隆基因的确认序列，显示出氨基酸翻译，从PelB序列的起点到EcoRI限制性位点，PeIB的第一个起始密码子中的1开始DNA编号，从成熟HCPB中的1开始肽编号，该序列表示为SEQ ID NO 50。
为得到成熟HCPB的受控制表达，以参考实施例7的类似方式转化pICI1736质粒DNA进入氯化钙转化感受态E.coli表达菌株。以参考实施例7的一种类似的方式处理全部pICI1736被转化菌株以检测克隆的HCPB基因的表达。然而，在这种情况下，不能将对c-myc肽标记的9E10单克隆抗体特异性用于Western分析，由于成熟HCPB没有C末端标记。因此，初级抗体是在兔体内产生的抗牛羧肽酶A(来自Biogenesis)，它先前已显示出与纯化的人胰羧肽酶B有交叉反应。第二抗体是用辣根过氧化物酶标记的抗兔AgG抗体并从山羊产生(Sigma A9169或类似产品)。
通过Coomassie染色凝胶与载体(pICI266)单独克隆相比时显示一条约34,000道尔顿的额外蛋白质带从而在E.coli菌株MSD213和MSD252中证明了克隆在pICI266(pICI1736)中的成熟HCPB的表达。使用抗牛羧肽酶A通过Western分析得到一个同样大小的带的信号。
参考实施例9从COS细胞表达成熟HCPB通过PCR从pICI1698(参考实施例1)生成编码前HCPB的基因。用模板pICI1698(10微克)和在含10毫摩尔Tris-HCl(pH8.3)的缓冲液(100微升)中的寡核苷酸SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2(每个为100pMols)，50毫摩尔KCL，1.5mM MgCl2，dATP，dCTP，dGTP，dTTP各0.125mM和2.5单位的Taq DNA聚合酶(Amplitaq，Perkin-Elmer Cetus)组建PCR。反应物用矿物油覆盖(100微升)并在94℃温浴1分钟，53℃温浴1分钟和72℃温浴2.5分钟共25个循环，再加上72℃温浴10分钟。通过1％琼脂糖(I型琼脂糖，SigmaA-6013)凝胶电泳继之以从胶中切下带，分离985bp的PCR产物并通过使用Geneclean(Geneclean II试剂盒，Stratech Scientific Ltd.或Bio101 Inc.)分离该DNA片段。Geneclean试剂盒含有1)6M碘化钠2)用于进行氯化钠/乙醇/水洗涤的氯化钠，Tris和EDTA浓缩液；3)一个含有1.25ml特殊设计的在水中的二氧化硅基质悬液Glassmilk(TM)-1.5ml瓶。
这是一个基于Vogelstein and Gillespie发表在Proceedings of theNational Academy of Sciences USA(1979)Vol 76，p615的DNA纯化技术。另一选择是可使用“Molecular Cloning-一实验室指南”SecondEdition，Sambrook，Fritsch and Maniatis(Cold Spring HarborLaboratory，1989)描述的任何方法。简单说，Geneclean方法如下。向1体积的凝胶切片加入3体积的该试剂盒的碘化钠溶液。通过在55℃加热该混合物使其熔化后加入Glassmilk(5-10微升)，混匀并在所处环境温度中放置10分钟。离心沉下玻璃乳并用该试剂盒的NEWWASH(500微升)洗3次。从Glassmilk除去洗涤缓冲液使其在空气中干燥。通过将干燥的Glassmilk温浴在55℃的水中5-10分钟洗脱DNA。通过离心回收含洗脱DNA的水上清液。可重复洗脱步骤并汇集上清液。
用EcoRI和HindIII在100微升含100毫摩尔Tris-HCI(pH7.5)，10毫摩尔的氯化酶，50毫摩尔NaCI，0.025％triton X-100，和25单位的HindIII和EcoRI(New England Biolabs)中37℃下消化前HCPB基因1小时。通过琼脂糖凝胶电泳和如上描述GeneClean纯化被消化的片段以便接起片段和克隆到pBluescript(Stratagene Cloning Systems)中。
用EcoRI和HindIII(每种25单位)在如上述的100微升反应液中消化pBluescript KS+DNA(5微克)到完全。加入小牛肠碱性磷酸酶(1微升；New England Biolabs，10单位/微升)到被消化的质粒中以除去磷酸基并在37℃再温浴30分钟。通过在70℃温浴10分钟破坏磷酸酶活性。如上述从琼脂糖凝胶纯化EcoRI-HindIII切割的质粒。在20微升的含30毫摩尔Tris-HcI(pH7.8)，10毫摩尔MgCI2，10毫摩尔DTT，1毫摩尔ATP，50微克/毫升BSA和400单位T4 DNA连接酶(New England Biolabs，Inc)的溶液中用上述切割的质粒DNA在25℃持续4小时与EcoRI-HindIII消化的前HCPB基因(50ng)连接。使用随细胞提供的说明书用1微升的一份反应物转化20微升感受态E.coliDH5α细胞(最大效率DH5α感受态细胞，Life TechnologiesLtd)。将被转化的细胞平铺在加入100微克/毫升青霉素的L-琼脂上。通过PCR鉴定可能的前HCPB克隆。如上述对每个克隆进行PCR以制备前HCPB基因，不同的是在进行25个循环的PCR前将所述带有细胞的混合物在94℃温浴5分钟并用寡核苷酸SEQ ID NOs3和4代替寡核苷酸SEQ ID NOs1和2。通过1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR样品(10微升)。通过1.2kbPCR产物的出现鉴定含前HCPB基因的克隆。产生1.2kb的克隆被用于大规模质粒DNA制备并通过DNA序列分析确定插入的序列。在pBluescript中含有前HCPB基因的质粒被命名为pMF15。
为生成能在真核生物细胞中表达HCPB的载体，使用GS-System(TM)系统(Celltech Biologics)(WO 87/04462，WO 89/01036，WO 86/05807和WO 89/10404)。该方法需要克隆前HCPB基因到载体pEE12中HindIII-EcoRI区域[该载体类似于Bebbington等描述的pSV2.GS(1992)Bio/Technology 10，169-175，具有原先存在于pSV.GS中的许多限制性位点，通过定点诱变以提供多接头区中的单独位点]。为构建表达载体，用EcoRI和HindIII如上述消化质粒pEE12和pMF15。从1％琼脂糖凝胶中分离来自每个消化物的适当载体(来自pEE12)和插入片段(来自pMF15)并连接起来和用于转化感受态DH5α细胞。将被转化的细胞平铺到加入青霉素(100微克/毫升)的L琼脂上。如上述用在CMV启动子内(SEQ ID NO 5)和在所述HCPB基因中(SEQ ID NO 6)作引物的寡核苷酸通过PCR筛选菌落。产生1.365kbPCR产物的克隆被用于大规模质粒DNA制备并通过DNA序列分析确定插入的序列。在pEE12中含有前HCPB序列的质粒被命名为pMF48。
第二个真核生物表达质粒，pEE12含有前原HCPB的前原序列，是如上述制备的。在初始PCR中使用寡核苷酸SEQ ID NOs 7和8以分离用于来自pMF18(在参考实施例11中描述的)的前原序列。在此情况下，用热起始方法通过首先在无TaqDNA聚合酶时95℃温浴5分钟进行PCR。然后加入Taq DNA聚合酶(2.5单位)并如上述继续PCR完成25个循环。将360bp片段克隆到pBluescript以得到pMF66并随后克隆到pEE12(通过PCR用SEQ ID NOS7和8筛选)以得到pMF67。
为在真核细胞中表达，将含能表达前HCPB基因和前原序列的载体转染进入COS-7细胞。COS细胞是非洲绿猴肾细胞系，CV-1，它被起点-感染性SV40病毒转化，并已经广泛被用于短期瞬时表达各种蛋白质，因为它们能复制含SV40复制起点的环状质粒到十分高的拷贝数。有两种广泛通用的COS细胞克隆，COS-1和COS-7。Bebbington在MethodsA companion to Meithods in Enzymology(1992)2，p141中描述了转染COS细胞的基本方法。为表达HCPB，通过一种称为脂感染-阳离子脂质介导的多核苷酸传递的方法[Felgner等inMethodsA Companion to Methods in Enzymologyz(1993)5，67-75]在含有热失活胎牛血清(FCS)的2毫升Dulbecco′s Modified Eagle′sMedium(DMEM)中用质粒载体pMF48和pMF67(每种4微克)转染在6孔培养板中的COS-7细胞(2×105)。该细胞在37℃二氧化碳培养箱中培养20小时。在无血清培养基中的质粒DNA混合物(200微升；OPTI-MEM Reduced Serum Medium；GibcoBRL Cat.No.31985)与LIPOFECTIN试剂轻轻混合(12微升；GibcoBRLCat.No.18292-011)并在环境温度中培养15分钟。用无血清培养基(2毫升；OPTI-MEM)洗细胞。加入无血清培养基(600微升；OPTI-MEM)到DNA/LIPOFECTIN并将该混合物覆盖在37℃培养的细胞上在二氧化碳培养箱中培养6小时。含培养基的DNA被含10％FCS的正常DMEM取代并该细胞如前培养72小时。如参考实施例3所述分析细胞上清液(250微升)中HCPB对Hipp-Arg(5小时检定)的活性。用LIPOFECTIN处理过但无DNA的COS细胞上清液水解1.2％的底物，而经表达前HCPB质粒与前原序列混合物转染的COS细胞上清液水解61％的Hipp-Arg底物。仅用前HCPB质粒转染的COS细胞水解Hipp-Arg的水平相当于仅用LIPOFECTIN试剂处理COS细胞所观察到的水平。
LIPOFECTIN试剂是1∶1(w/w)阳离子脂质N-[1-(2，3-dioleyloxy)丙基]-n，n，n-三甲基氯化铵(DOTMA)和dioleoyl磷脂酰乙醇胺(DOPE)在膜过滤水中的脂质体制剂。它自动与DNA结合形成脂质DNA复合物见Felgner等in Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84，7431。
参考实施例10从E.coli表达原HCPB在E.coli中克隆和表达原HCPB的方法十分类似于参考实施例7中描述的方法。仍使用pICI266作为克隆载体，并且圆HCPB基因的PCR所用起始物质是质粒pICI1698(如参考实施例6中所描述的)。在该PCR反应中使用了两个被称为2310和2265的寡核苷酸(代替引物ESPTS1和6HIS9E10R1BS1)，使用与参考实施例7类似的条件。
首先，设计2310寡核苷酸上链，在pICI1698上作引物并在从PeIB前导序列(包括在SEQ ID NO46中的DNA碱基对51到66)到插入的原HCPB基因起点(包含在SEQ ID NO38中的40到57 DNA碱基对)之间加入NcoI限制酶位点。其次，设计2265寡核苷酸下链，从成熟HCPB基因的末端开始作引物，位于(His)6-c-myc标记序列起点之前(与包含在SEQ ID NO46中的965到987 DNA碱基对互补)，并在其后含有一个EcoRI(GAATTC)限制酶位点的基因末尾引入翻译终止密码(与TAATAA互补)以及充填碱基。在PCR中该寡核苷酸向后引物延伸进入所述基因以分离该原基因序列。
通过琼脂糖凝胶电泳对一份PCR产物分析正确大小的DNA(约1240碱基对)并发现主要含有一个正确大小的带。以参考实施例7的一种类似的方式从所述反应混合物纯化其余的产物。用NcoI和EcoRI限制性酶解所分离到的DNA，并以参考实施例7的一种类似的方式纯化一条正确大小的带(约1210碱基对)。
用NcoI和EcoRI酶限制性酶解以类似于参考实施例7制备的pICI266双链DNA，要十分仔细以保证完全酶解。以参考实施例7的一种类似的方式纯化正确大小的DNA(约5600碱基对)。
用凝胶电泳与已知标准比较核对经限制酶解和纯化的每份的纯度和浓度。根据这些估计准备连接混合物以用参考实施例7的一种类似的方式将原HCPB基因克隆到pICI266载体中。
继连接反应之后，以参考实施例7的一种类似的方式将该DNA混合物用于转化E.coli菌株DH5α，挑出菌落并通过杂交检测之。
以参考实施例7类似的方法通过PCR使用引物2310和2265，(SEQ ID NOs52和49)核对四个阳性杂交分离物之正确大小的插入，和以一对内部引物1279(SEQ ID NO36)和679(SEQ ID NO33)进行的引发。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的正确大小的DNA(从引物2310到2265约1200碱基对，而从引物1279到679约580碱基对)。全部克隆均得到正确大小的PCR DNA产物。
然后取全部4个克隆用于质粒制备，然后以参考实施例7的一种类似的方式对其做覆盖PCR产物区测序。所述克隆用6个分开的被称为1504，1802，679，1281，1590和1592(SEQ ID NOs42，45，33，37，53和54)寡核苷酸引物测序。根据测序结果，选出一个含具有所要求的原HCPB基因序列的质粒的克隆，并称其为pICI1738。
SEQ ID NO55显示在pICI1738中，显示出氨基酸翻译的该克隆原基因的确认序列，从PelB序列的起点到EcoRI限制性位点，它具有的DNA编号从PeIB的第一个起始密码子中的1开始，而肽的编号从成熟HCPB中的1开始。
为得到原HCPB的受控制表达，以参考实施例7的类似方式转化pICI1738质粒DNA进入氯化钙转化感受态E.coli表达菌株。以参考实施例7的一种类似的方式处理全部pICI1738被转化的表达菌株以检测克隆的HCPB基因的表达。然而，在这种情况下，不能将对c-myc肽标记特异的9E10单克隆抗体用于Western分析，由于原HCPB没有C末端标记。因此，初级抗体是在兔体内产生的抗牛羧肽酶A(来自Biogenesis)，它先前已显示出与纯化的人胰羧肽酶B有交叉反应。第二抗体是用辣根过氧化物酶标记的抗兔AgG抗体并从山羊产生(Sigma A0545或类似产品)。
通过Coomassie染色凝胶与载体(pICI266)单独克隆相比时显示一条约40,000道尔顿的额外蛋白质带，以及产生标记的HCPB(参考实施例7)，从E.coli菌株证明了克隆在pICI266(pICI1738)中的原HCPB的表达。使用抗牛羧肽酶A一条同样大小的带通过Western分析检测给出一个信号。
参考实施例11从COS细胞表达原HCPB使用如模板pICI1689和寡核苷酸SEQ ID NOS 1和7通过如参考实施例9中描述PCR制备前原HCPB以得到1270bpPCR产物。用EcoRI和HindIII消化该基因并将其初步克隆到pBluescript KS+(以产生pKF18)然后克隆到如参考实施例9中描述的DH5α中的pEE12中(以产生pMF49)。通过使用如参考实施例9描述的LIPOFECTIN试剂将pMF49转染进入COS-7细胞，并检测上清液对Hipp-Arg(5h检定)的HCPB活性，如参考实施例3描述的，随后用在50毫摩尔Tris-HCI(pH7.6)中的胰蛋白酶(700微克/毫升)，150毫摩尔NaCI在4℃持续1小时。在这种条件下，达到Hipp-Arg底物的完全水解，而来自单独用LIPOFECTIN试剂处理(无质粒DNA)的COS细胞的上清液当用胰蛋白酶活化时水解30％的Hipp-Arg底物。
参考实施例12天然HCPB的纯化通过两种途径已确定一个系统用于天然的和不同突变酶的初步纯化。
首先描述优选途径。从-70℃的储存物中取含重组酶的重组E.coli细胞团并融化。测量细胞团的克重并加入等于初始称重细胞团体积的缓冲液A(200毫摩尔Tris(羟甲基)氨基甲烷盐酸(TRIS-HCI)，20％蔗糖，pH8.0)。将细胞悬液在室温温浴20分钟并偶尔轻微搅拌混合然后加入等体积蒸馏水并充分混合。在室温下温浴细胞20分钟并偶尔轻微搅拌。所得粗等渗破碎物通过98000xg在4℃下离心90分钟得到澄清，随后轻轻倒出在沉积不溶碎片上的上清液。加入脱氧核糖核酸酶1到该上清液中使终浓度为0.1毫克/毫升。在室温温浴该混合物，并连续震动，直到降低粘性到足以使其上载于羧肽酶抑制剂活化的Sepharose亲和层析柱上，该柱按照来自Pharmacia的CNBr活化的Sepharose 4B所带的说明书和来自马铃薯块茎(c-0279，Sigma)羧肽酶抑制剂的说明书来制备。将该上清液调到pH8.0并上载到所述亲和层析柱上，该柱用10毫摩尔的TRIS-HCI，500毫摩尔氯化钠，pH8.0预平衡。洗载有上清液的柱直到流过的吸光率返回到结合物被洗脱缓冲液(100毫摩尔碳酸钠，500毫摩尔氯化钠，pH11.4)从柱上洗脱之前的基线。洗脱组分在-20℃冷冻同时使用抗c-myc标记抗体(9E10)，继之用受4氯萘酚和过氧化氢作用可产生颜色反应的抗小鼠辣根过氧化物酶结合物(a-9044，Sigma)通过Western印记分析确定含重组羧肽酶的洗脱组分。
汇集含有重组羧肽酶B的组分，使其浓缩并在急冻前调pH到pH7.5并在-20℃储存。进一步纯化汇集的样品，用已知方法如离子交换和如需要的话，进行凝胶渗透层析。
第二个途径涉及E.coli细胞的全部溶解，这与如优选途径所使用的周质休克相反。
取含重组酶的重组E.coli细胞团并使之悬浮于溶胞缓冲液中(50毫摩尔TRIS-HCI，15％蔗糖，pH8.0)。加溶菌酶到1毫克/毫升浓度并在同时加十二烷基磺酸锂(LDS)(每25毫升悬浮液中加80微升25％的溶液)冰浴该悬浮液30分钟并偶尔震动，然后加脱氧核糖核酸酶1到1毫克/毫升浓度并再次冰浴30分钟同时偶尔震动。然后将悬浮液分成200毫升体积并超声以完全破细胞间隔30秒一次共10次。将超声过的悬液在98,000xg在4℃离心90分钟，然后轻轻倒出在沉淀的不溶性碎片上的上清液。调上清液到pH8.0并上载到亲和层析柱上，该柱用10毫摩尔TRIS-HCI，500毫摩尔氯化钠，pH8.0预平衡。上载上清液后，洗柱直至流过的吸光率返回到结合物被洗脱缓冲液(100毫摩尔碳酸钠，500毫摩尔氯化钠，pH11.4)从柱上洗脱前的基线.。洗脱组分在-20℃冷冻同时使用抗c-myc标记抗体(9E10)，继之用受4氯萘酚和过氧化氢作用可产生颜色反应的抗小鼠辣根过氧化物酶结合物(a-9044，Sigma)通过Western印记分析确定含重组羧肽酶的洗脱组分。汇集含有重组羧肽酶B的组分，使其浓缩并在急冻前调pH到pH 7.5并在-20℃储存。进一步纯化汇集的样品，用已知方法如离子交换和如需要的话，进行凝胶渗透层析。
通过SDS-PAGE和Coomassie染色硝基纤维素印记分析了来自两个途径汇集物的样品，而Coomassie染色硝基纤维素印记提供了重组羧肽酶B的正确分子量的染色带。使用Edman降解技术通过自动蛋白质/肽测序仪测序这些带而对纯化的重组羧肽酶B给出了明确的匹配。
参考实施例13从COS细胞表达鼠A5B7F(ab’)2-HCPB融合蛋白能与肿瘤相关抗原相结合的特殊抗体是小鼠单克隆抗体A5B7。抗体A5B7结合到人癌胚抗原上(CEA)并特别适合于导向结肠直肠癌。A5B7购自DAKO Ltd.，16 Manor Courtyard，Hughenden Aveneu，High Wycombe，Bucks HP13 5RE，England，United Kindom。通过常规方法从完整IgG抗体可制备抗体片段例如Mariani，M.等(1991)Molecular Immunology 28，69-77描述的F(ab’)2片段。一般说，抗体(或抗体片段)-酶结合物应至少是二价的，就是说能结合到至少2个肿瘤相关抗原(它们可能相同或不同)。通过已知方法例如通过“CDB移植”如在EP239400中所公开的或通过移植完全的可变区到人恒定区如US4816567公开的。人源化的抗体可用于减小抗体(或抗体片段)的免疫原性。抗体A5B7的人源化变体已在PCT WO92/01059中被公开。
将产生单克隆抗体A5B7的杂交瘤储存在the European Collectionof Animal Cell Cultures，Division of Biolodics，PHLS Centre for AppliedMicrobiology and Research，Porton Down，Salisbury，Wiltshire SP4 OIG，United Kingdom.储存的日期是1993年7月14日和保藏号是No.93071411。使用本行业已知标准技术如Fenge C.Fraune E&Schuegerl K在“从培养中的动物细胞生产生物制品”(Spier RE，Griffiths JR&Meignier B，eds)Butterworth-Herinemann，1991，262-263中和AndersonBL&Gruenberg ML在“单克隆抗体的市场化生产”(Seaber S，ed)，Marcel Dekker，1987，175-195中所提供的资料可从储存的杂交瘤获得抗体A4B7。这类细胞要求可通过有限稀释不时的再克隆以维持抗体生产的良好水平。
本实施例描述通过PCR从A5B7杂交瘤制备cDNA，分离专一性Fd和轻链片段，这些片段的完整DNA序列的确定，随后制备Fd-HCPB融合蛋白基因和能在真核生物细胞中产生轻链及Fd-HCPB融合蛋白共表达载体，通过用来自HCPB的前原序列共转染从COS细胞表达该F(ab’)2-HCPB。
a)从杂交瘤细胞制备mRNA从真核生物细胞分离多聚A+mRNA有几种方法(Sambrook J.，Fritsch E.F.，Mainatis T.，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Second Edition，1989，Chapter 8 p3hereinafter参照Maniatis)。Pharmacia以试剂盒形式提供了一个此类方法，并且该方法基于相对少数的细胞溶解(107或更少)随后将polyA+mRNA结合到寡dT柱上。通过用低浓度盐洗去不需要的细胞成分随后在升高的温度下在高盐溶液中洗脱mRNA。
使用Quickprep mRNA试剂盒(Pharmacia Biotechnology Ltd.)从107A5B7杂交瘤制备mRNA。通过在Unikon 930分光光度计(Kontron Instruments)中从300-320nm扫描一个样品并使用在260nm的40微克/毫升的消光系数估计mRNA的浓度。将此mRNA以2.5微克一份沉淀储存在乙醇沉淀中。
b)cDNA合成用于cDNA合成的方法基于Gubler和Hofman的方法它依靠从引物mRNA逆转录，随后用RNA酶H处理以提供由聚合酶I引发和合成第二条链。在Maniatis(第8章)中综述了其他cDNA合成的方法。
在含2.5单位胎盘RNA酶抑制剂(Life Technologyies Inc.)补充以无RNA酶水的10微升溶液中与5微克mRNA样品通过在70℃温浴随后在冰上冷却用寡dT(12-18体混合物，Pharmacial BiotechnologyLtd.，0.5微克)为引物。然后通过加入4微升5xH-RT缓冲液(250毫摩尔Tris，pH8.3，200mM KCI，30mM氯化镁和0.5mg/mlBSA)，2微升的0.1MDTT(二硫苏糖醇)，1微升dNTP混合物(20毫摩尔的dATP，dCTP，dGTP和dTTP)，4微升Superscript逆转录酶(LifeTechnologies Ltd.)并在42℃1小时进行第一条cDNA链合成。对第二条链反应，加入1.5微升(如上述)dNTP混合物，92.5微升无RNA酶水，30微升5x反应缓冲液(125毫摩尔Tris，pH7.5，500mM KCI，25mM MgCI2，50mM(NH4)2SO4和0.5毫克/毫升β-NAD)，1微升T4DNA连接酶(10单位，Life Technologies Ltd.)，4微升DNA聚合酶I(40单位Life Technologies Ltd.)和1微升RNA酶H(2.7单位，LifeTechnologies Ltd.)并在16℃进一步温浴2小时。为保证制备平末端cDNA，在加入2微升T4 DNA聚合酶(10单位，Life TechnologiesLtd.)后进行最终在16℃温浴5分钟。然后通过在70℃温浴10分钟终止酶反应。
c)通过PCR分离抗体基因片段用cDNA作模板进行A5B7Fd和L链片段的分离。该Fd片段被终止在紧接铰链序列之后(c末端的苏氨酸)下文称其为蛋白酶解型Fd。
来自第一条链cDNA反应或完成第二条链反应的物质适合作为模板。该物质可从完成的反应物不经稀释使用或在双蒸水中稀释使用(稀释直至1％)。将寡核苷酸(SEQ ID号13-19)用于生成Fd和L链片段。对每个抗体片段，5’区寡核苷酸(Fd片段的SEQ ID 13和L链的SEQ ID 14)编码了一个限制酶位点(Fd的HindIII和L链的EcoRI)一个共有Kozak序列(GCCGCCACC)以使翻译起始和天然鼠信号序列的部分增加到最大。蛋白酶解型Fd片段的3’区寡核苷酸(SEQ ID 15与编码突变的抗体铰链区的3’端互补以引入紧接该铰链区之后的串列翻译终止密码子(TAG和TAA)并在该序列以外含有一个EcoRI限制酶位点。由一个寡核苷酸(SEQ ID 16)确定的L链3’区与编码区的末端互补，引入了另一个翻译终止密码子(TAA)和一个EcoRI限制位点。每个片段(该Fd的SEQ IDS 17和18和L链的SEQ IDS 19和65)的其他成对的部分重叠和互补寡核苷酸序列被用于将沉默突变引入每个DNA链导致从该Fd片段的CH1和L链的VL除去一个BamHI而不改变所编码的氨基酸序列。与适当的突变寡核苷酸一起使用每个5’和3’寡核苷酸以产生每个抗体链的2突变片段。在纯化后将着这两个片段以等比例混合并用做使用该相关的5’和3’区寡核苷酸进行第二轮PCR反应。这些反应的产物是全长Fd和L链片段而没有中间的BamHI位点。
一般说，加入5微升cDNA到100微升反应物含10毫摩尔Tris-HCI，pH8.3，50毫摩尔KCI，0.1％明胶，1.5毫摩尔MgCI2，1.25毫摩尔各dATP，dCTP，dGTP和dTTP，1微摩尔各适当的寡核苷酸对和2.5单位的TaqDNA聚合酶(Amplitaq，Perkin-ElmerCetus)。每个反应物被100微升矿物油覆盖并在94℃温浴1.5分钟，50或55℃温浴1.0分钟和72℃温浴2.0分钟共25个循环外加72℃10分钟。还组建了无DNA对照反应物。
通过每份5微升样品在0.8％琼脂糖(Sigma Chemical Company Ltd.)凝胶电泳随后在1微克/毫升溴化乙锭(BDH Laboratory Supplies)溶液中染色并在紫外透射灯上观察DNA分析PCR反应物。在有A5B7cDNA的全部PCR反应物中可见到适当大小的带表明Fd片段和L链的扩增。在对照反应物中没有DNA带表明所用试剂中不含污染的DNA。
通过使用Centriton 100过滤浓缩剂(Amicon Ltd.)纯化每个PCR产物。加入每个反应物到浓缩剂中并通过加入双蒸水使体积增加到2毫升。然后将其在500xg(Sorval RT6000B台面型离心机用H1000B转子)离心5分钟并弃去＂流出物＂(“flow-through＂)。再次稀释存留物到2毫升并再次离心。此过程重复3次。这种方法导致从所扩增的DNA除去多余的寡核苷酸和缓冲液成分。然后将这些纯化的DNA直接用于随后的PCR反应。将适当对的片段按等比例混合并将每份与期望的5’和3’寡核苷酸一起用于第二轮PCR。
d)将PCR产生的片段克隆到pBluescript第二轮PCR反应的产物显示了分别与全长Fd和L链一致的约775bp和730bp的带。使用如上述的Centricon100微浓缩剂还纯化了这些产物。然后将每个DNA产物在含50微升3摩尔醋酸钠，蒸馏水到500微升和1毫升的无水乙醇的溶液中沉淀。将溶液冰浴10至少10分钟然后11,600xg离心10分钟(MSE Microcentaur)。弃去上清液，用进一步离心5分钟的方法在1毫升70％乙醇中(v/v在蒸馏水中)洗沉降物。弃去上清液在真空中使DNA沉降物干燥。重新悬浮该DNA沉降物在蒸馏水中。然后用EcoRI和HindIII在含有20毫摩尔的Tris-醋酸盐，pH7.9，10毫摩尔醋酸镁，50毫摩尔醋酸钾，1毫摩尔二巯基苏糖醇(DTT)，和25单位各HindIII和EcoRI(PromegaCorporation)的200微升反应物中酶解Fd PCR产物。用EcoRI在30微升含90毫摩尔Tris-HCI，pH7.5，10毫摩尔氯化镁，50毫摩尔氯化钠和10单位EcoRI反应物中酶解L链产物。将酶解物在37℃温浴1小时。
然后通过在0.75％SeaPlaque GTG琼脂糖凝胶(FMC BioProductsLtd)电泳，随后从凝胶切下适当大小的带纯化被酶解的片段。通过在65℃温浴2分钟重新将凝胶切片溶解，用蒸馏水稀释到终体积为450微升并加入50微升的3摩尔醋酸钠。用等体积的液化苯酚抽提该溶液，用Tris缓冲液pH 7.6(Fisons Scientific Equipment)平衡，11,600xg离心2分钟(MSE MicroCentaur)以分离水相和酚相。得到的水相再用酚∶氯仿混合物(50∶50v/v)抽提并再用氯仿然后用乙醇沉淀如上描述。将每份纯化的沉降物再悬浮于10微升蒸馏水中并通过在0.8％琼脂糖凝胶电泳观察1微升样品以估计质量和浓度。
在Fd和L链cDNA的初始克隆中使用pBluescript(StratageneCloning Systems)。这种噬菌体质粒嵌合体载体具有唯一的EcoRI和HindIII克隆位点，青霉素基因，和CoIEI和fI复制起始以分离双链或单链DNA。用30单位的EcoRI(Promega Corporation)在100微升含90毫摩尔Tris-HCI，pH7.5，10毫摩尔氯化镁，50毫摩尔氯化钠的反应物中或用EcoRI和HindIII在100微升含20毫摩尔Tris-醋酸盐，pH7.9，10毫摩尔醋酸镁，50毫摩尔醋酸钾，1毫摩尔二巯基苏糖醇(DTT)，和25单位各EcoRI和HindIII(Promega Corporation)在37℃1小时酶解5微克的pBluescript KS-DNA至完全。加入2微升小牛-肠碱性磷酸酶(2单位，Bohringer Mannheim)到该EcoRI酶解的质粒中以除去5’磷酸基并继续在37℃又温浴30分钟。通过在70℃温浴又10分钟破坏磷酸酶活性。如上述将EcoRI和HindIII切割的质粒从SeaPlaque GTG琼脂糖凝胶纯化。
用50ng的EcoRI-HindII或EcoRI/CIP在10微升的含30毫摩尔Tris-HCI，pH7.8，10毫摩尔氯化镁，10毫摩尔DTT，1毫摩尔ATP和1.5单位T4 DNA连接酶(Promega Corporation)的溶液中分别处理pBluescript，在16℃进行2.5小时。连接25-50ng所述酶解的Fd或L链PCR产物。使用随细胞携带的方法，用每份1微升的反应物转化20微升感受态E.coli DH5α细胞(Life Technologies Ltd.)。将被转化的细胞平铺在加入100微克/毫升青霉素，1毫摩尔IPTG和0.2％X-gal的L-琼脂上并在37℃培养过夜。根据在上述培养基上产生白色菌落与含亲代质粒的细胞产生的兰色相比较选出含克隆插入的克隆。
e)cDNA克隆的DNA序列分析从琼脂平板挑出由颜色筛选鉴别的可能Fd和L链cDNA克隆并用于大规模质粒DNA制备。用每个克隆接种到200毫升加入100微克/毫升青霉素的L肉汤的500毫升锥形烧瓶中。将该培养物在37℃震摇培养过夜。生长后，通过在Sorvall RC5C离心机和GS3转子在4℃5000xg离心10分钟团集每个培养瓶的细胞。将团集的每个培养瓶的细胞重新悬浮于20毫升TE缓冲液并在SorvallRC5C离心机和SS-34转子在oak-ridge管中在4℃2000xg再次离心10分钟。将每个洗过的细胞团集物再悬浮于3毫升冰冷却的25％蔗糖，50毫摩尔Tris，pH8.0，并放在冰上。加入新鲜的溶菌酶溶液(10mg/ml，1.0ml)，通过旋转该管混合内容物并在冰上放置5分钟。加入乙二胺四乙酸钠(EDTA)溶液(1.0毫升0.5毫摩尔浓度，pH8.5)，轻轻混合内容物。最终加入5.0毫升冰冻的TritonX溶液(0.1％TritonX-100，62.5毫摩尔EDTA，50毫摩尔Tris，pH8.0)轻轻混合内容物并继续冰浴10分钟。然后通过在Sorvall RC5C离心机和GS-34转子在4℃39,000xg离心30分钟团集细胞碎片。加入含质粒DNA的上清液到16克氯化色(BoehringerMannheim)和150微升溴化乙锭溶液(10毫克/毫升)中并通过加入TE缓冲液将体积增加到18.5毫升。该溶液被转移到卷帽聚丙烯离心管(Sorvall Instruments).封闭该离心管并在Sorvall TV865B(钛，垂直的)转子和OTD65B离心机在18℃180,000xg离心16小时。
离心后，可见到在形成的CsCI/EtBR密度梯度中DNA为一条明显的橙色带。使用皮下注射器刺破离心管壁从该梯度中移出质粒DNA。用TE缓冲液将取自梯度的样品稀释3-4倍并通过加入等体积的异丙基酒精沉淀DNA并冰浴10分钟。通过在Sorvall RC5C离心机和SS-33转子中在4℃离心17,000xg团集沉淀的DNA并弃去上清液。用70％(v/v)乙醇洗得到的团集物并再次离心5分钟。然后在真空中干燥团集物，重新悬浮在1.8毫升的TE缓冲液和200微升3摩尔醋酸钠溶液中并用等体积酚抽提，用17,000xg离心2分钟以分相。水相用等体积的氯仿再次抽提随后通过加入等体积-20℃乙醇并冰浴10分钟沉淀DNA。如上述团集纯化的DNA，用5毫升70％乙醇洗并使团集物真空干燥。再悬浮干燥的团集物于500微升双蒸水中并通过使用50微克/毫升/OD260的消光系数在紫外分光光度计中扫描从300到220nm的稀释样品估计DNA浓度。许多专门试剂盒例如Qiagen((Hybaid Ltd)，也可用于质粒DNA纯化。
然后用纯化的质粒DNA进行DNA测序。通过Sanger(Proc.Nat.Acad.Sci.USA 74，1977，p5463)的双脱氧链终止法使用适当的试剂盒如由United States Biochemical Company提供的Sequenase试剂盒并按照所提供的方案可将双链DNA用于序列分析。
将每份(2-4微克)Fd和L链cDNA克隆质粒DNA用于DNA序列分析。首先通过用0.2摩尔NaOH，0.2摩尔EDTA在终体积100微升室温下温浴10分钟使每份DNA变性。然后通过加入10微升3摩尔醋酸钠(pH5.0)和275微升乙醇和冰浴10分钟沉淀变性的DNA。如上述DNA的方法回收沉淀的DNA。然后通过与0.5p摩尔的适当引物在10微升含10％二甲亚砜(DMSO)的Sequenase反应缓冲液(40毫摩尔Tris，pH7.5，25毫摩尔氯化镁，50毫摩尔氯化钠)中在65℃下2分钟继之以逐渐冷却到30℃使变性DNA行引物粘合。然后按照所提供的方案加入10％DMSO到标记和终止混合物中将这些有引物粘合的模板用于测序反应。
在6％聚丙烯酰胺8摩尔尿素变性凝胶(Sanger和Coulson，1978，FEBS lett.87，p107)上高清晰度电泳后通过放射自显影分析测序反应物。
下面给出所克隆的cDNAs的完整的Fd和L链序列(SEQ ID NO20蛋白酶解型Fd链和SEQ ID NO 22 L链)。含蛋白酶解型Fd的质粒被称为pAF1和L链pAF3。还确定了在每个片段中由于除去了BamHI位点而存在沉默突变。所述DNA序列表明当与公开的恒定区DNA序列资料(in Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Bilofsky，H.，Reid-Milner，M.，Perry，H.，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest，FourthEdition，Public Health Service N.I.H.Washington DC)比较时，该抗体是IgGlk同种型。
f)Fd-HCPB融合DNA序列的制备通过PCR将一个编码Fd序列的C-末端区的基因，从SEQ ID NO 20(位置497)的NcoI位点加入到HCPB序列。在此过程中引入8个氨基酸的接头序列(VPEVSSVF；SEQ ID NO 67)的DNA。如参考实施例9用寡核苷酸SEQ ID NOS9和10进行质粒pAF1的PCR以产生一个338bp的产物。类似的，用寡核苷酸SEQ ID NOS 11和1进行pICI1698的PCR以产生一个998bp的产物。通过琼脂糖凝胶电泳和如参考实施例9中描述的Geneclean分离两个产物并(每个0.2ng在50微升总体积中)用于具有10个94℃1分钟，63℃4分钟继之以94℃2分钟的循环的第二次热起始PCR。加入侧翼寡核苷酸(SEQ IDNOS 9和1；每个100pM)到50微升的具有Amplitaq(2.5单位)缓冲液中。加热到90℃3分钟后，让混合物进入25个94℃1.5分钟，55℃2分钟和72℃2分钟继之以72℃10分钟的循环中。产物是一条1336bp的带，如前分离，然后用EcoRI和HindIII切下并克隆到DH5α中的pBluescipt中(通过PCR用寡核苷酸SEQ ID NOS 3和4筛选克隆)以得到pMF35。为取得完整Fd-HCPB融合蛋白序列，用NcoI和EcoRI在含50毫摩尔醋酸钾，20毫摩尔Tris-醋酸盐(pH7.9)，10毫摩尔氯化镁，1毫摩尔DTT，EcoRI(40单位)和NcoI(20单位)缓冲液(100微升)中切割质粒pAF1和pAF35(每种10微克)。如参考实施例9中的描述从pAF1分离载体片段(3.4kb)并用小牛肠碱性磷酸酶处理并连接到从pMF35纯化的1.2kb片段。将得到的载体克隆在DH5α(通过PCR用寡核苷酸SEQ ID NOS 3和4筛选1,922bp的插入)并命名为pMF39。来自pMF39的EcoRI-HindIII片段被克隆到DH5α中的pEE6[它是pEE6.hCMV的一个衍生物-Stephens和Cockett(1989)Nucleic Acids Research 17，7110-其中hCMV启动子的上游HindIII位点已被转变成一个BglII位点](通过PCR用寡核苷酸SEQID NOS 5和6筛选约2,200bp的插入)以产生pMF43。
质粒pAF3(上述的e)和pEE12[该载体类似于在Bebbington等(1992)Bio/Technology 10，169-175中描述的pSV2.GS，原在pVS2.GS中具有的许多限制位点通过定点突变被除去以提供多接头区的独有位点]。然后从SeaplaqueGTG琼脂糖分离来自每个酶解物的载体和插入片段并亦如先前所述连接起来用于转化感受态DH5α细胞。将转化细胞平铺于加入100微克/毫升青霉素的L琼脂上。通过PCR方法从转化物中筛选菌落。将菌落转移到200微升蒸馏水中并通过涡流混合。然后将悬浮的细胞加热到100℃持续1分钟并在用上清液进行PCR反应前11，600xg离心2分钟。在每个PCR反应中，在CMV启动子内的寡核苷酸(SEQ ID 5)和与轻链的3’端互补的寡核苷酸(SEQ ID 16)一起用做适当的寡核苷酸。唯一带有插入在CMV启动子下游表达起点的抗体片段基因的克隆将产生约2.0kb的特异性PCR产物。得到的质粒被命名为pAF6。为构建共表达载体，用BglII(20单位)和SalI(40单位)在含10毫摩尔Tris-醋酸盐(pH7.9)，150毫摩尔氯化钠，10毫摩尔氯化镁，1毫摩尔DTT和BSA(100微克/毫升)的缓冲液(100微升)中切割pMF43(10微克)并通过琼脂糖凝胶电泳分离4348bp片段和如前述用Geneclean纯化。类似的，用BamHI(40单位)和SalI(40单位)切pAF6并分离7.8kb的载体片段和连接到来自pMF43的BglII-SalI片段并克隆到DH5α中。用两套寡核苷酸(SEQ ID NOS 14和12，以及SEQ ID NOS 13和16)通过PCR筛选菌落，给出360bp和1.3kb的克隆分别通过DNA测序而被表征。具有正确序列的克隆被命名为pMF53-在DH5α中的轻链/Fd-HCPB共表达载体。
g)在COS细胞中A5B7F(ab′)2-HCPB表达用pMF53代替pMF48重复参考实施例9的用编码前原序列的质粒共转染COS-7细胞。如在参考实施例3和9中的描述检测COS细胞上清液的HCPB活性。用LIPOFECTIN试剂处理过，但无质粒DNA的COS细胞上清液水解1.2％的底物，而用表达轻链/Fd-HCPB和前原序列的质粒混合物转染的COS细胞水解34％的Hipp-Arg底物。仅用pMF53质粒转染的COS细胞以用LIPOFECTIN试剂单独处理的COS细胞所见的水平水解Hipp-Arg。通过Western分析，约80kDa和160kDa的带是可见的，分别相应于Fab′-HCPB和F(ab′)2-(HCPB)2。在一个CEA ELISA检定中(见下面i和j)按照j给出的方案用细胞上清液(见上)检测结合CEA物质的存在。
h)Western印记分析如下描述进行Wester印记分析在有或无还原剂时，用等体积的样品缓冲液(62.5毫摩尔Tris，pH6.8，1％SDS，10％蔗糖和0.05％溴酚蓝)与每份(20微升)每上清液样品混合。在65℃温浴样品10分钟然后按照制造商的指导在MultiphorII仪中在8-18％丙烯酰胺梯度胶上电泳(Pharmacia BiotechnologyProducts的Excel凝胶系统)。电泳后，用Novablot仪(LKB ProdukterAB)按照制造商提供的方案将分开的蛋白质转移到Hybond C-Super膜(Amersham International)。印记后，将膜风干。
通过使用抗-鼠F(ab′)2抗体-过氧化物酶结合物(ICN Biomedicals，产品号67-430-1)检测抗体片段的存在。用ECL检测系统(Amersham International)按照所提供的方案观察鼠A5B7抗体片段的存在。
i)ELISA分析适合ELISA检定的标准方法在Burdon，R.H.和van Kippenberg，P.H.编辑的“生物化学和分子生物学中的实验室技术”第15卷“酶免疫检定的实践与理论”，Tijssen，P.，1985，Elsebier Science Publishers B.V.中提供。资料的另一来源是“抗体-一实验室指南”Harlow，E.和Lane，D.P.1988，Cold Spring Harbor Laboratory出版。
j)抗-CEA ELISA1.准备包被缓冲液(1袋碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液-Sigma C-304-在100毫升双蒸水中)。
2.加5微升CEA原液(1毫克/毫升，Dako)到10毫升的包被缓冲液供96孔板所需。
3.加100微升稀释的CEA到Nunc＂maxisorp＂微量滴定板的每个孔中-50ng/孔/100微升。
4.在4℃温浴过夜(或室温2小时)。
5.每次用磷酸盐缓冲盐水+0.01％叠氮钠(PBSA)+0.05％Tween20洗板4次5分钟。
6.用含0.05％Tween20的1％BSA(Sigma A-7888)的PBSA以每孔200微升封闭平板。室温温浴2小时。
7.用含0.05％Tween 20的PBSA洗板4次，每次5分钟。
8.上载样品(培养物上清液)和适当的标准(双倍稀释的蛋白酶解型A5B7F(ab′)2)。稀释生长培养基(或PBS)中的样品。包括PBSA+1％BSA和稀释液做空白对照。
9.在环境温度中温浴3小时。
10.用PBSA+0.5％Tween20洗板6次每次5分钟。
11.准备第二抗体溶液(抗-小鼠IgG F(ab′)2，来自山羊，过氧化物酶结合的-ICN67-430-1-20微升在40毫升PBSA+1％BSA+0.5％Tween20中)并每孔加100微升。
12.室温温浴1小时。
13.用PBSA+0.5％Tween20洗板6次每次5分钟。
14.通过溶解1袋磷酸盐-柠檬酸盐过硼酸盐缓冲液(Sigma P-4922)在100毫升双蒸馏水中。加30毫克邻-苯二胺二盐酸化物(OPD，Sigma P-8287)。每孔加150微升。
15.在黑暗中室温温浴15分钟。
16.通过每孔加入2摩尔的硫酸50微升终止反应。
17.在平板阅读器中读490nm OD。
实施例1从E.coli克隆和表达D253K HCPB-(His)6-c-Myc在E.coli中克隆和表达D253K-HCPB的方法十分类似于参考实施例7中描述的方法。再次使用pICI266作为克隆在体，并且原HCPB基因的PCR起始物质是质粒pICI1698(如在参考实施例6中所描述的)。然而，在此情况下，在该基因的PCR扩增期间使用定点诱变使成熟基因的253位氨基酸的密码子从天冬氨酸改变为赖氨酸(GAC到AAA)，即D253的变化。以类似于参考实施例7中所描述的方式准备两个PCR混合物。在第一个反应物中引物是FSPTS1(SEQ ID NO40)和1398(SEQ ID NO57)。在第二个反应物中引物是6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO41)和1397(SEQ ID NO58)在两个反应物中起始的DNA均是pICI1698。引物1398和1397(SEQID NO57和58)被设计成在253位氨基酸密码子附近退火，在该DNA序列中引入GAC到AAA的变化，并在两个PCR产物的末端产生互补序列。另外两个引物，FSPTS1和6HIS9E10R1BS1(SEQ IDNOs40和41)是参考实施例7中所描述的。分析这两个PCR反应物每份的正确大小的DNA(约750和250碱基对)并通过琼脂糖凝胶电泳估计浓度，并发现含有该正确大小的主要的带。然后在终体积为80微升的最终浓度到200微摩尔的dNTPs，Taq聚合酶反应缓冲液，2单位Taq聚合酶的存在下使用大约4ng的头两个PCR产物的每个组建另一PCR。在加入Taq酶前在94℃加热混合物10分钟，用10个循环的94℃持续1分钟和63℃持续4分钟进行PCR温浴。在完成这些循环时通过加入120p摩尔的每个末端引物，FSPTS1和6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NOs40和41)，另加dNTP(约外加100微摩尔)，Taq聚合酶反应缓冲液，和4单位Taq聚合酶组成120微升的反应混合物。在加入Taq酶前将混合物在94℃加热10分钟，并用30个94℃持续1.5分钟，50℃持续2分钟，和72℃持续2分钟的循环，继之以在反应结束时的一次72℃温浴9.9分钟，进行PCR温浴。
通过琼脂糖凝胶电泳分析一份该PCR产物的正确大小的DNA(约1000碱基对)并发现主要含一条正确大小的带。以参考实施例7的一种类似的方式纯化来自该混合物的其余产物。用酶Fsp1和EcoRI限制性酶解所分离的DNA，并以参考实施例7的一种类似方式纯化正确大小的带(约1000碱基对)。
用KpnI酶限制性酶解以参考实施例7的一种类似方式制备的pICI266双链DNA，并用T4DNA聚合酶处理平末端，十分小心以保证酶解完全。然后用限制性酶EcoRI消化纯化的DNA。以参考实施例7的一种类似方式纯化正确大小的DNA(约5600碱基对)。
用琼脂糖凝胶电泳与已知标准比较核对每份限制性酶解的并纯化的DNA样品的纯度和浓度估计值。从这些估计物准备连接混合物以便以参考实施例7的一种类似方式克隆HCPB基因到pICI266载体中。在连接反应后，以参考实施例7的一种类似方式用该DNA混合物转化E.coli菌株DH5α，挑出菌落并通过杂交检测。
使用引物FSP1TS1和6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NOs40和41)通过PCR对6个阳性杂交分离物核对其正确大小的插入，并以一对内部引物FSPTS1(SEQ ID NO40)和679(SEQ ID NO33)以参考实施例7的一种类似方式进行引发，通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的正确大小的DNA(从引物FSPTS1到6HIS9E10R1BS1约1000碱基对，而从引物FSPT1到679约430碱基对)。全部克隆均给出正确大小的PCR DNA产物。
然后取其中6个克隆用于质粒DNA制备，然后以参考实施例7的一种类似的方式对其做覆盖PCR产物区测序。所述克隆用8个分开的被称为1281，677，1504，679，1802，1590，1280和1731(SEQID NOs37，34，42，33，45，43，35和44)寡核苷酸引物测序。根据测序结果，选出一个含具有所要求的原HCPB基因序列的质粒的克隆，并称其为pICI1713。
在pICI1713中克隆的D253K-HCPB基因的确认序列的显示出氨基酸翻译的部分，是从PelB序列的起点到EcoRI限制性位点，显示为SEQID NO59，它具有的DNA编号从PeIB的第一个起始密码子中的1开始，而肽的编号从成熟HCPB的1开始。
为得到D253K-HCPB的受控制表达，以参考实施例7的类似方式转化pICI1713质粒DNA进入氯化钙转化感受态E.coli表达菌株。以参考实施例7的一种类似的方式处理全部pICI1713被转化的表达菌株以检测克隆的D253K-HCPB基因的表达。在这种情况下，以参考实施例7的一种类似的方式将对c-myc肽标记特异的9E10单克隆抗体用于Western分析，由于D253K-HCPB有C末端(His)6-c-myc标记。
通过Coomassie染色胶与载体(pICI266)单独克隆，以及产生标记的HCPB克隆(参考实施例7)相比时显示一条约35,000道尔顿的强蛋白质带，从E.coli菌株证明了克隆在pICI266(pICI1713)中标记的D253K-HCPB的表达。通过Western分析检测c-myc标记，一个同样大小的带给出一强信号。
实施例2从E.coli克隆和表达D253R HCPB-(His)6-c-mycD253R-HCPB在E.coli中的克隆和表达方法十分类似于参考实施例8中所描述的方法。再次使用pICI266作为克隆载体，并且用于原HCPB基因的PCR的初始物质是质粒pICI1712(如在参考实施例7中描述的)。然而，在此情况下，在该基因的PCR扩增时使用定点诱变以将成熟基因的253位氨基酸的密码子从天冬氨酸改变为精氨酸(GAC到CGC)，即D253的变化。以类似于参考实施例7中所描述的方式准备两个PCR混合物。在第一个反应物中引物是2264(SEQ ID NO48)和2058(SEQ ID NO61)。在第二个反应物中引物是6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO41)和2054(SEQ ID NO62)。在两个反应物中起始的DNA均是pICI1712。
引物2058和2054(SEQ ID NOs61和62)被设计成在253位氨基酸密码子附近退火，在该DNA序列中引入GAC到CGC的变化，并在两个PCR产物的末端产生互补序列。另外两个引物，2264和6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NOs48和41)是参考实施例7和8中所描述的。分析这两个PCR反应物每份的正确大小的DNA(约750和250碱基对)并通过琼脂糖凝胶电泳估计浓度，并发现主要含有该正确大小的带。然后在终体积为80微升的最终浓度到200微摩尔的dNTPs，Taq聚合酶反应缓冲液，2单位Taq聚合酶的存在下使用大约4ng的头两个PCR产物的每个组建另一PCR。在加入Taq酶前在94℃加热混合物10分钟，并用10个循环的94℃持续1分钟和63℃持续4分钟进行PCR温浴。在完成这些循环时通过加入120p摩尔的每个末端引物，2264和6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NOs48和41)，另加dNTPs(约外加100微摩尔)，Taq聚合酶反应缓冲液，和4单位Taq聚合酶组成反应混合物补足到120微升。在加入Taq酶前将混合物在94℃加热10分钟，并用30个94℃持续1.5分钟，50℃持续2分钟，和72℃持续2分钟的循环，继之以在反应结束时的一次72℃温浴9.9分钟，进行PCR温浴。
通过琼脂糖凝胶电泳分析一份该PCR产物的正确大小的DNA(约1000碱基对)并发现主要含一条正确大小的带。以参考实施例7的一种类似的方式纯化来自该混合物的其余产物。用酶Nco1和EcoRI限制性酶解所分离的DNA，并以参考实施例7的一种类似方式纯化一条正确大小的带(约1000碱基对)。
用NcoI和EcoRI酶限制性酶解以参考实施例7的一种类似方式制备的pICI266双链DNA，十分小心以保证酶解完全。以参考实施例7的一种类似方式纯化正确大小的DNA(约5600碱基对)。
用琼脂糖凝胶电泳与已知标准比较核对每份限制性酶解的并纯化的DNA样品的纯度和浓度估计值。从这些估计物准备连接混合物以便以参考实施例7的一种类似方式克隆HCPB基因到pICI266载体中。
在连接反应后，以参考实施例7的一种类似方式用该DNA混合物转化E.coli菌株DH5α，挑出菌落并通过杂交检测。
然后取其中3个克隆用于质粒DNA制备，然后以参考实施例7的一种类似的方式对其做覆盖PCR产物区测序。所述克隆用9个分开的被称为1281，677，1504，679，1802，1590，1280，1731和1592(SEQ ID NOs37，34，42，33，45，43，35，44和54)寡核苷酸引物测序。根据测序结果，选出一个含具有所要求的D253R-HCPB基因序列的质粒的克隆，并称其为pICI1746。
在pICI1746中克隆的D253R-HCPB基因的确认序列的显示出氨基酸翻译的部分，是从PelB序列的起点到EcoRI限制性位点，显示为SEQID NO63，它具有的DNA编号从PeIB的第一个起始密码子中的1开始，而肽的编号从成熟HCPB中的1开始。
为得到D253R-HCPB的受控制表达，以参考实施例7的类似方式转化pICI1746质粒DNA进入氯化钙转化感受态E.coli表达菌株。以参考实施例7的一种类似的方式处理全部pICI1746被转化的表达菌株以检测克隆的D253K-HCPB基因的表达。在这种情况下，以参考实施例7的一种类似的方式将对c-myc肽标记特异的9E10单克隆抗体用于Western分析，因为D253R-HCPB有C末端(His)6-c-myc标记。
通过Coomassie染色胶与载体(pICI266)单独克隆，以及产生标记的HCPB克隆(参考实施例7)相比时显示一条约35,000道尔顿的强蛋白质带，从E.coli菌株证明了克隆在pICI266(pICI1746)中的标记D253R-HCPB的表达。通过Western分析检测c-myc标记，一个同样大小的带给出一强信号。
使用在实施例3中给出的类似方法达到纯化。
实施例3从E.coli纯化突变型D253K HCPB-(His)6-c-Myc蛋白质首先描述在一细胞团中的羧肽酶B类似物D253K的20升发酵过程。用质粒pZen1713(pICI1713；见上实施例1)转化E.coli K12菌株MSD1924并且将得到的菌株MSD2230(MSD1924 pZen1713)保存在-80℃甘油冷冻混合液中。
将MSD2230划线在含L四环素(10微克/毫升)的琼脂平板上以便在37℃过夜生长后分离单菌落。从该L四环素(10微克/毫升)琼脂表面移取6个单菌落MSD2230将其重新悬浮在10毫升L四环素(10微克/毫升)肉汤中并将100微升该培养物立即接种到各含75毫升的L四环素(10微克/毫升)的6份250毫升Erlenmeyer烧瓶的每一个中。37℃在往复震荡器(300rpm)上生长15-16小时后，汇合烧瓶的内容物并用于接种一个含图6描绘的15升生长培养基的发酵罐中(U30D瓶，B.Braun，Melsungen，Germany)。
发酵在温度37℃和pH6.7下进行并且通过设定加入6摩尔的氢氧化钠或2摩尔的硫酸自动控制pH6.7。设定的溶解氧张力(dOT)是气体饱和度的50％并且它由该发酵罐的自动调节器维持搅拌器速率在200和1000rpm之间。通过一个Tylan物流控制器保持每分钟流向发酵罐的空气在20升，它相当于每分钟1.3个瓶体积。
接种后4.5小时，将酵母提取物溶液(225克/升)以速率190-210毫升/小时填入发酵罐共计28.5小时。从酵母提取物填入后1.5小时起，设定的发酵温度被降低到25℃。在达到这一温度时，约一小时后，一次注入50％阿拉伯糖使终浓度在发酵罐瓶的0.5％来诱导羧肽酶类似物D253K的表达。接种后1-2小时，以45-55毫升/小时的速率向发酵罐填入甘油(714克/升)和硫酸铵(143克/升)的混合物直至收获。在这些条件下继续发酵直到发酵罐接种后大约75小时当通过将发酵罐的内容物转移分装到1升离心瓶中而收获培养物时。通过在SorvallRC-3B离心机中离心(7,000xg，4℃，30分钟)使用过的培养基与细菌细胞分开。一般这个过程产生最终干重为大约20克/升。
如下纯化所述细胞团。从-70℃的储存物中取含重组酶D253KHCPB的重组E.coli细胞团并融化。测量细胞团的重量并发现是309克。加入缓冲液A[200毫摩尔Tris(羟甲基)氨基甲烷盐酸(TRIS-HCI)，20％蔗糖，pH8.0]使重悬浮液体积为320毫升。将细胞悬液温浴在室温20分钟并偶尔轻微搅拌混合然后，在室温加入等体积蒸馏水并充分混合。再在室温下温浴细胞20分钟并偶尔轻微搅拌混合。
所得粗等渗破碎物通过98000xg在4℃下离心90分钟得到澄清，随后轻轻倒出在沉积不溶碎片上的上清液得到的澄清液体积为240毫升。在蒸馏水(5毫升)中溶解脱氧核糖核酸酶1(24毫克)并加入到所述上清液中。在室温温浴该混合物，并连续震动30分钟，直到降低上清液粘性到足以使其上载于羧肽酶抑制剂活化的Sepharose亲和层析柱上，该柱按照来自Pharmacia的CNBr活化的Sepharose 4B所带的说明书和来自马铃薯块茎(c-0279，Sigma)羧肽酶抑制剂的说明书来制备。将该上清液用10毫摩尔TRIS-HCI，500毫摩尔氯化钠，pH8.0(缓冲液B)1∶1稀释，调到pH8.0并以0.5毫升/分钟上载到羧肽酶B亲和层析柱上过夜。该柱在4℃用缓冲液B预平衡。上载该上清液后，洗所述柱直到流过的吸光率返回到结合物在4℃被洗脱缓冲液(100毫摩尔碳酸钠，500毫摩尔氯化钠，pH11.4)从柱上洗脱之前的基线，收集1毫升组分。在取出待确定含重组羧肽酶的组分后，该洗脱组分在-20℃冷冻。通过Western印记分析，使用抗c-myc标记抗体(9E10)，继之用受4-氯萘酚和过氧化氢作用可产生颜色反应的抗小鼠辣根过氧化物酶结合物(a-9044，Sigma)确定含重组羧肽酶的洗脱组分。组分11到14被确定为含重组羧肽酶B。汇集这些组分，并在急冻前调pH到pH 7.5和用Millipore Centifuge Ultrafree-20(截取10,000分子量)浓缩并在-20℃储存。此处详尽的纯化提供了体积0.95毫升中纯度为80％的4.7毫克D253K突变型羧肽酶。
实施例4天冬氨酸酚芥子药物前体(5a化合物，图7)的合成(2S)，2-(3-(4[双-(2-氯乙基)-氨基)-苯氧羰基]-丙酰-氨基)琥珀酸使用类似于参考实施例4中给出的方法。
(2S)，2-(3-{4[双-(2-氯乙基)-氨基)-苯氧羰基]-丙酰-氨基)琥珀酸二苄酯(4a)在80psi下被氢化2小时以给出需要的终产物5a(产率86％)。
5a1HNMR(CD3OD)2.65-2.75(t，2H)；2.8-2.9(m，4H)；3.7-3.75(m，4H)；3.8-3.85(m，4H)4.75(dd，1H)；6.7-6.8(m，2H)；7.0-7.1(m，2H)。
MS(ESI)471-473(MNa)+Anal(C18H22N2O7CI21.4H2O)计算值.％C45.56H5.27N5.90实测值 ％C45.79H5.60N5.91制备起始物质化合物4a如下。
在用二乙醚/己烷重结晶后(产率80％)使(2S)，2氨基-琥珀酸二苄酯(化合物2a)反应产生(2S)，2-(3-羧基丙酰氨基)-琥珀酸二苄酯(化合物3a)。
3a1HNMR(CDCI3)2.42-2.6(m，2H)；2.6-2.75(m，2H)；2.85(dd，2H)；3.1(dd，1H)；4.9(dd，1H)5.05(dd，2H)；5.15(s，2H)；6.7(d，1H)；7.25-7.5(m，10H)。
MS(ESI)436[MNa]+Anal(C22H23NO7O.4H2O)计算值.％C62.82H5.70N3.33实测值 ％C63.2H5.75N2.9使3a反应生成需要的起始物质4a(产率78％)(室温维持搅拌3小时并通过闪烁层析用二乙醚/己烷(70/30 V/V作为洗脱剂)达到纯化。
4a1HNMR(CDCI3)2.55-2.65(m，2H)；2.8-2.9(m，2H)；2.9(dd，1H)；3.1(dd，1H)；3.6(dd，4H)；3.7(dd，4H)；4.9(dd，1H)5.05(dd，2H)；5.15(s，2H)；6.58(d，1H)；6.65(d，2H)；6.95(d，2H)；7.25-7.4(m，10H)。
MS(ESI)651-653(MNa)+实施例5谷氨酸酚芥子药物前体(5b；图7)的合成(2S)，2-(3-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基)-苯氧羰基]-丙酰-氨基)戊二酸在参考实施例4给出类似的方法在60psi下氢化(2S)，2-(3-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基)-苯氧羰基]-丙酰-氨基)戊二酸二苄酯(4b)3小时以产生需要的终产物5b(产率93％)。
5b1HNMR(CD3OD)1.9-2.0(m，1H)；2.1-2.2(m，1H)；2.35-2.45(m，2H)；2.55-2.7(m，2H)；2.8-2.9(m，2H)；3.65-3.7(m，4H)；3.72-3.8(m，4H)4.45-4.5(m，1H)；6.75(d，2H)；6.95(d，2H)。
MS(ESI)485-487(MNa)+制备起始物质化合物4b如下。
在用二乙醚/己烷重结晶后(产率80％)使(2S)，2氨基-戊二酸二苄酯(2b)反应产生(2S)，2-(3-羧基丙酰氨基)-戊二酸二苄酯(3b)(产率定量的)3b1HNMR(CDCI3)2.0-2.1(m，1H)；2.2-2.3(m，1H)；2.3-2.5(m，4H)；2.6-2.7(m，2H)；4.65(dd，1H)；5.05(s，2H)；5.15(s，2H)；6.5(d，1H)；7.3-7.4(m，10H)。
MS(ESI)450[MNa]+
使3b反应生成需要的起始物质4b(产率82％)4b1HNMR(CDCI3)1.95-2.05(m，1H)；2.2-2.3(m，2H)；2.3-2.5(m，2H)；2.6(dt，2H)；2.8-3.0(m，2H)；3.6(dd，4H)；3.7(dd，4H)；4.7(dd，1H)5.1(s，2H)；5.2(s，2H)；6.3(d，1H)；6.6(d，2H)；6.95(d，2H)；7.3-7.4(m，10H)。
MS(ESI)665-667(MNa)+实施例6检定突变型人CPB和天然人CPB对Hipp-Asp和Hipp-Glu药物前体类似物的活性。
用HPLC为基础的检定方法检定纯化的突变型人CPB(D253K和D253R；实施例1-3)和如参考实施例12中所描述生产的天然人CPB的转变马尿酰L天冬氨酸(Hipp-Asp-参考实施例2)，马尿酰L-谷氨酸(Hipp-Glu-参考实施例1)或马尿酰-L-精氨酸(Sigma ChemicalCompany-目录号H6625)成为马尿酸。
反应混合物(250微升)在0.025摩尔Tris-HCL，pH7.5中含4微克人CPB(天然或突变型)和0.5毫摩尔Hipp-Asp或Hipp-Glu。在37℃温浴样品5小时。通过加入250微升的80％甲醇，20％蒸馏水，0.2％三氟醋酸终止反应并通过HPLC定量产生的马尿酸。
用Hewlett Packard 1090 Series 11(有二极管布阵)HPLC系统进行HPLC分析。注射样品(50微升)到Hichrom Hi-RPB柱上(25厘米)并用40％甲醇，60％蒸馏水，0.1％三氟醋酸的流动相以1毫升/分钟的流动速率分离。用已知量的马尿酸(Sigma-H6375)生成校准曲线来确定产物(马尿酸)的量。结果在表1中显示并以用4微克酶在37℃5小时内底物到产物的转换百分数表示。
表1.通过突变型和天然人CPB转变Hipp-Arg和Hipp-GluHipp-Asp Hipp-Glu Hipp-Arg(向马尿酸转变百分数)天然CPB 00100D253K突变型CPB 78 91 ＜2D253R突变型CPB 72 52 3
该数据表明在人CPB中在253位引入赖氨酸或精氨酸残基代替天然酶中的天冬氨酸残基改变了酶的底物专一性以致于该酶能够转变Hipp-Asp或Hipp-Glu。相反，天然酶不能转变这两个化合物的任何一种成为马尿酸但却能转变Hipp-Arg成为马尿酸。用D253K突变体和Hipp-Glu底物观察到最佳活性。
实施例7用Hipp-Asp和Hipp-Glu确定HCPB突变型的Km和kcat对Hipp-Asp(参考实施例2)和/或Hipp-Glu(参考实施例1)分别在实施例3，参考实施例12，实施例27和实施例28检定了纯化的D253K HCPB，[Q54R，D145A，D253K]HCPB，[G251N，D253K]HCPB和[G251T，D253K]HCPB以确定这些底物的Km和kcat。在0.025M Tris-HCL缓冲液pH7.5条件下分别在0.25-8.0mM和0.25-5.0mM范围内稀释Hipp-Glu和Hipp-Asp。其中用1摩尔NaOH调整必要的底物样品到pH7.5。
加入D253K HCPB(微克/毫升用于Hipp-Asp和0.5微克/毫升用于Hipp-Glu)，[Q54R，D145A，D253K]HCPB(1.5微克/毫升用于Hipp-Glu)，[G251N，D253K]HCPB(0.14微克/毫升用于Hipp-Glu)和(G251T，D253K]HCPB(0.02微克/毫升用于Hipp-Glu)到这些底物中(500微升反应体积)以起始反应。37℃温浴样品5小时。通过加入含0.2％TFA的500微升甲醇/蒸馏水(80/20)终止反应。通过在实施例6中所描述的HCPB确定产生的马尿酸的量。
用ENZFITTER软件程序(Biosoft，Perkin Elmer)计算Km和Vmax值。用反应混合物中的酶浓度除Vmax(用HCPB分子量34KDa)计算Kcat。结果被显示在表2a和2b。
表2aD253K突变型HCPB对Hipp-Asp和Hipp-Glu的Km和kcat数据Km(mM) kcat(s-1) kcat/Km(mM-1s-1)Hipp-Asp2.70.26 0.1Hipp-Glu5.33.80.7
表2bHCPB突变型对Hipp-Glu的Km和kcat数据突变体Km(mM) kcat(s-1) kcat/Km(mM-1s-1)[Q54R，D145A，D253K] 10.6 15 1.4[G251N，D253K] 2.324 10[G251T，D253K] 1.175 68该数据证实在人CPB中253位天冬氨酸被赖氨酸残基取代导致一种有合理的酶动力学的能转变HippAsp和Hipp-Glu成为马尿酸的酶。D253K HCPB对Hipp-Glu与对Hipp-Asp底物相比kcat/Km要大7倍。引入额外的突变增加了D253K HCPB对Hipp-Glu的活性高达100倍。
实施例8对谷氨酸药物前体的突变型HCPB和天然HCPB的活性的检定。
检定纯化的D253K HCPB和天然人CPB(如分别在实施例3和参考实施例12中所描述产生的)从谷氨酸药物前体酶促切下谷氨酸的能力(例如实施例5)。切割释放出一个中间产物(参考实施例5)，其自身无酶降解而释放出活性酚芥末药物。用HPLC为基础的检定方法检测了谷氨酸药物前体向中间产物的转变。
药物前体在0.25-5.0mM范围内在0.025摩尔Tris-HCL缓冲液(pH7.5)中被稀释。其中用1摩尔氢氧化钠调必要的药物前体样品到pH7.5。D253K突变型HCPB或天然HCPB均以终浓度为0.25毫克/毫升被加入到这些底物中(250微升预温暖到37℃2分钟)以起始该反应。样品在37℃温浴4分钟。通过加入250微升98.8％MeCN，0.2％TFA并将样品放在冰上终止反应。然后通过HPLC定量所产生的中间产物浓度。
HPLC分离按实施例6中描述的进行，不同的是用含0.1％TFA的MeCN/蒸馏水(55/45 V/V)的移动相以达到药物前体(保留时间4.9分钟)和中间产物(保留时间8.4分钟)的分离。用已知量的中间产物生成校准曲线，由此定量所产生的中间产物的量。
用在双份样品中天然和突变型(D253K)HCPB以5.0毫摩尔和0.25毫摩尔的药物前体形成的中间产物的量在表3给出。
表3通过天然和突变型(D253K)HCPB转变药物前体成中间产物。药物前体浓度 中间产物浓度(毫摩尔)(mM) 天然HCPB 突变型HCPB5.00,0 0.023，0.0220.25 0,0 0.005，0.005用在实施例7中描述的ENZFITTER软件程序从一定范围的底物浓度(0.25-5.0mM)产生的中间产物的量计算突变型人的酶(D253K)和药物前体的Km，Vmax和kcat值。D253K突变型HCPB的结果是Km＝1.25mMVmax＝1.17×10-4mMsec-1Kcat＝0.016sec-1该数据显示在人CPB中引入253位赖氨酸残基代替天然酶中出现的天冬氨酸残基改变了该酶的底物专一性以至它能转变谷氨酸药物前体成为其自身崩解的中间产物。相反，天然酶不能转变药物前体成为其中间产物。由于该药物前体相对非细胞毒性的(实施例9)并且该中间产物是非酶促降解以释放出杀肿瘤细胞的游离酚芥末药物(实施例9)，这些结果证明CPB的活性部位残基的突变可产生一种能转变相对非细胞毒性药物前体成为能杀肿瘤细胞的潜在细胞毒性药物的突变型人酶。
实施例9在LoVo人结肠直肠肿瘤细胞中的谷氨酸药物前体和酚芥子药物的细胞毒性。
通过下面方法已证明谷氨酸药物前体(实施例5)和相应的酚芥子药物(图7，化合物6)对肿瘤细胞的差别细胞毒性。
在96孔(2,500细胞/孔)微量滴定板中用终浓度范围在5×10-4到5×10-8摩尔的药物前体或药物在37℃培养LoVo结肠直肠肿瘤细胞1小时。然后洗细胞并进一步在37℃培养3天。在洗去死亡细胞后加入TCA并通过加入SRB染料如P.Skehan等J.Natl.Cancer Inst.82，1107(1990)所描述的评估细胞的蛋白质粘合到该板的量。通过抑制细胞生长达50％所需要的浓度(IC50)评估该化合物的效价。
在用酚芥子药物处理LoVo细胞时观察到大约1微摩尔的IC50。相反，谷氨酸药物前体的细胞毒性要小的多，具有大约50微摩尔的IC50(图5)。因此，突变型CPB谷氨酸药物前体对肿瘤细胞的细胞毒性比酚芥子药物低50倍。
若加入如实施例3中的描述所生产的突变型HCPB(D253K)100微克到含谷氨酸药物前体的检定孔中可见到其细胞毒性比得上活性药物的细胞毒性由此证明通过突变型酶转变药物前体以释放出更有效力的药物。加入100微克的天然人CPB到每个孔中并不明显增强谷氨酸药物前体的细胞毒性。这些研究证明了突变型人CPB酶(D253K)选择性转变相对无活性药物前体成有效力的能杀肿瘤细胞的细胞毒性药物的潜力。
实施例10人源化A5B7 F(ab′)2-D253K HCPB融合蛋白的制备重复参考实施例13中描述的方法但用A5B7的人源化序列代替鼠A5B7轻链和Fd序列，并用D253K序列代替HCPB序列。在参考实施例13f)中描述的8氨基酸接头序列被相应的人的序列，APPVAGPS(SEQ ID NO66)取代。通过用如参考实施例13中描述的HCPB前原序列共转染从COS细胞表达融合蛋白。通过基本上如参考实施例13中的描述瞬时导入质粒载体(每种750微克)到COS-7(11)细胞中而进行融合蛋白的大规模表达。通过使含融合蛋白的上清液流过固定化蛋白A并用高pH缓冲液洗脱结合的融合蛋白或通过使含融合蛋白的上清液流过固定化的羧肽酶抑制剂，遵循重组羧肽酶的纯化的途径，以及用如实施例3中所使用的高pH洗脱纯化所述蛋白质。这两个途径均可涉及通过单独凝胶扩散层析，离子交换层析，疏水作用层析或它们的结合使用进一步纯化融合蛋白。
重复参考实施例13中描述的方法但Fd和轻链，如SEQ ID NOS 20和22的鼠序列分别被在SEQ ID NOs24和26中显示的人源化序列所取代。在参考实施例13中的HCPB序列被D253K序列[在参考实施例1，但无(His)6-c-Myc标记]取代。用pICI1713(在实施例1中描述的)取代在参考实施例13中的PCR模板。
用各种方法包括由Edwards(1987)Am.Biotech.Lab.5，38-44，Jayaraman等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88，4084-4088，Foguetand Lubbert(1992)Biotechniques 13，674-675和Pierce(1994)Biotechniques 16，708描述的方法制备在SEQ ID NOs 24和26中显示的人源化序列。
实施例11震摇烧瓶发酵以制备D253K HCPB用质粒pICI1713(见实施例1)转化E.coli菌株MSD213并在-80℃作为甘油储存物储存得到的菌株MSD213pZen1713。将一份MSD213pZen1713在L四环素的琼脂平板上划线以在37℃生长过夜后分离出单菌落。移取单菌落MSD213pZen1713并接种到含75毫升的L四环素肉汤的250毫升Erlenmeyer烧瓶中。在37℃在往复震摇器上生长16小时后用该烧瓶的内容物接种到含600毫升的L四环素肉汤的OD550＝0.1的9个2升Erlenmeyer烧瓶中的每个中。然后在往复震摇器上在20℃培养该烧瓶直到通过测量该培养物的光密度所估计的生长达到OD550＝0.5。在此点，通过加入阿拉伯糖到培养物中使终浓度为0.01％w/v而诱导异源蛋白质生产并如上述在20℃继续培养42小时。
通过在Sorvall RC-3B离心机离心(7000xg，4℃，30分钟)使用过的培养基与细菌细胞分开并将该细胞团储存在-70℃。
实施例12从E.coli克隆和表达[G251N，D253R]HCPB-(His)6-c-Myc在E.coli中克隆和表达[G251N，D253R]HCPB的方法十分类似于参考实施例8中所描述的方法。如在实施例2中描述的制备[G251N，D253R]HCPB基因但用于PCR定点突变的起始物质是质粒pICI1764(在实施例2中描述)中的D253R HCPB而不是pICI1712。然而，在此情况下在该基因的PCR扩增期间使用定点突变以改变成熟基因中251位氨基酸密码子从甘氨酸变为天冬酰胺(GGC到AAC)，即G251N的变化。
以在参考实施例7和8中描述的一种类似方式准备两个PCR混合物。在第一个反应物中引物是2264(SEQ ID NO48)和1038(SEQID NO68，代替SEQ ID NO61)。在第二个反应物中，引物是6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO41)和1043(SEQ ID NO69，代替SEQ ID NO62)。在两个反应物中起始DNA均是pICI1764。
引物1038和1043(SEQ ID NOs68和69)被设计在密码子251氨基酸附近退火，在DNA序列中引入GGC到AAC的改变，并产生在所述两个PCR产物末端的互补序列。
克隆在pMC12.5.4中的克隆的[G251N，D253R]HCPB基因确定序列，显示从PelB序列的起点到EcoRI限制性位点的氨基酸翻译，它类似于SEQ ID NO63，该序列具有DNA编号从PelB的第一个密码子中的1开始，以及肽编号从成熟HCPB中的1开始，而不同的是251氨基酸被改变成天冬酰胺(Asn)和相关的密码子改变为AAC。
为获得[G251N，D253R]HCPB的受控制表达，以参考实施例7的一种类似方式将pMC12.5.4质粒DNA转化进入转化感受态E.coli表达菌株MSD213。以参考实施例7的一种类似方式处理pMC12.5.4转化的表达菌株以检测克隆的[G251N，D253R]HCPB基因的表达。在此情况下在Western分析中以参考实施例7的一种类似方式使用对C-myc肽标记专一的9E10单克隆抗体，因为[G251N，D253R]HCPB具有C末端(His)6-c-myc标记。
当与单独克隆载体(pICI266)，以及与产生标记HCPB克隆(参考实施例7)比较时通过Coomassie染色凝胶显示在大约35,000Daltons处一条强蛋白质带来从E.coli证明在pICI266(pMC12.5.4)中克隆标记的[G251N，D253R]HCPB的表达。通过c-myc标记的Western分析，一条同样大小的带给出一强信号。
实施例13从E.coli克隆和表达[G251N，D253K]HCPB-(His)6-c-Myc在E.coli中克隆和表达[G251N，D253K]HCPB的方法十分类似于参考实施例8中所描述的方法。如在实施例2中描述的制备[G251N，D253K]HCPB基因但用于PCR定点突变的起始物质是质粒pICI1713(在实施例1中描述)中的D253KHCPB基因而不是pICI1712。然而，在此情况下在该基因的PCR扩增期间使用定点突变以改变成熟基因中251位氨基酸密码子从甘氨酸变为天冬酰胺(GGC到AAC)，即G251N的变化。以在参考实施例7和8中描述的一种类似方式准备两个PCR1混合物。在第一个反应物中引物是2264(SEQ ID NO48)和2261(SEQ ID NO70，代替SEQ ID NO61)。在第二个反应物中，引物是6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO41)和2260(SEQ ID NO71，代替SEQ ID NO62)。在两个反应物中起始DNA均是pICI1713。引物2261和2260(SEQ ID NOs70和71)被设计在密码子251氨基酸附近退火，在DNA序列中引入GGC到AAC的改变，并产生在所述两个PCR产物末端的互补序列。
克隆在pMC43.1中的克隆的[G251N，D253K]HCPB基因确定序列，显示从PelB序列的起点到EcoRI限制性位点的氨基酸翻译，它类似于SEQ ID NO59所显示的序列，该序列具有DNA编号从PelB的第一个密码子中的1开始，以及肽编号从成熟HCPB中的1开始，而不同的是251氨基酸被改变成天冬酰胺(Asn)和相关的密码子改变为AAC。
为获得[G251N，D253K]HCPB的受控制表达，以参考实施例7的一种类似方式将pMC43.1质粒DNA转化进入转化感受态E.coli表达菌株MSD213。以参考实施例7的一种类似方式处理pMC43.1转化的表达菌株以检测克隆的[G251N，D253K]HCPB基因的表达。在此情况下在Western分析中以参考实施例7的一种类似方式使用对C-myc肽标记专一的9E10单克隆抗体，因为[G251N，D253R]HCPB具有C末端(His)6-c-myc标记。
当与单独克隆载体(pICI266)，以及与产生标记HCPB克隆(参考实施例7)比较时通过Coomassie染色凝胶显示在大约35,000Daltons处一条强蛋白质带来从E.coli证明在pICI266(pMC43.1)中克隆标记的[G251N，D253K]HCPB的表达。通过c-myc标记的Western分析，一条同样大小的带给出一强信号。
实施例14从E.coli克隆和表达[G251T，D253K]HCPB-(His)6-c-Myc在E.coli中克隆和表达[G251T，D253K]HCPB的方法十分类似于参考实施例8中所描述的方法。如在实施例2中描述的制备[G251T，D253K]HCPB基因但用于PCR定点突变的起始物质是质粒pICI1713(在实施例1中描述)中的D253RHCPB基因而不是pICI1712。然而，在此情况下在该基因的PCR扩增期间使用定点突变以改变成熟基因中251位氨基酸密码子从甘氨酸变为苏氨酸(GGC到ACT)，即G251T的变化。以在参考实施例7和8中描述的一种类似方式准备两个PCR混合物。在第一个反应物中引物是2264(SEQ ID NO48)和1038(SEQ ID NO68，代替SEQ ID NO61)。在第二个反应物中，引物是6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO41)和2659(SEQ ID NO72，代替SEQ ID NO62)。在两个反应物中起始DNA均是pICI1713。引物1038和2659(SEQ ID NOs68和72)被设计在密码子251氨基酸附近退火，在DNA序列中引入GGC到ACT的改变，并产生在所述两个PCR产物末端的互补序列。
克隆在pMC46.4.1中的克隆的[G251T，D253K]HCPB基因确定序列，显示从PelB序列的起点到EcoRI限制性位点的氨基酸翻译，它类似于SEQ ID NO59，该序列具有DNA编号从PelB的第一个密码子中的1开始，以及肽编号从成熟HCPB中的1开始，而不同的是251氨基酸被改变成苏氨酸(Thr)和相关的密码子改变为ACT。
为获得[G251T，D253K]HCPB的受控制表达，以参考实施例7的一种类似方式将pMC46.4.1质粒DNA转化进入转化感受态E.coli表达菌株MSD213。以参考实施例7的一种类似方式处理pMC46.4.1转化的表达菌株以检测克隆的[G251T，D253K]HCPB基因的表达。在此情况下在Western分析中以参考实施例7的一种类似方式使用对C-myc肽标记专一的9E10单克隆抗体，因为[G251T，D253K]HCPB具有C末端(His)6-c-myc标记。
当与单独克隆载体(pICI266)，以及与产生标记HCPB克隆(参考实施例7)比较时通过Coomassie染色凝胶显示在大约35,000Daltons处一条强蛋白质带来从E.coli证明在pICI266(pMC46.4.11)中克隆标记的[G251T，D253K]HCPB的表达。通过c-myc标记的Western分析，一条同样大小的带给出一强信号。
实施例15从E.Goli克隆和表达[G251N，D253K，T266G]HCPB-(His)6-c-Myc在E.coli中克隆和表达[G251N，D253K，T266G]HCPB的方法十分类似于参考实施例8中所描述的方法。如在实施例2中描述的制备[G251N，D253K，T266G]HCPB基因但用于PCR定点突变的起始物质是质粒pMC43.1(在实施例13中描述)中的[D251N，D253K]HCPB基因而不是pICI1712。然而，在此情况下在该基因的PCR扩增期间使用定点突变以改变成熟基因中266位氨基酸密码子从苏氨酸变为甘氨酸(ACC到GCC)，即T266G的变化。以在参考实施例7和8中描述的一种类似方式准备两个PCR混合物。在第一个反应物中引物是2264(SEQ ID NO48)和1045(SEQ ID NO73，代替SEQ ID NO61)。在第二个反应物中，引物是6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO42)和55(SEQ ID NO74，代替SEQ ID NO62)。在两个反应物中起始DNA均是pMC43.1。
PCR，克隆，表达和检定的方法与实施例14中方法相同。根据测序结果选择含具有需要的[G251N，D253K，T266G]HCPB基因序列的质粒的克隆并称其为pMC47.1。
实施例16用E.coli表达具有肽标记的其他突变型HCPBs以在参考实施例7和8，以及实施例12，13，14和15中描述的类似方式已经组建了许多其他突变型HCPBs。在每一情况下通过类似于上面描述的实施例的方法建立寡核苷酸以便在基因序列中引入专一性改变。在某些情况下基于对突变的基因的完整测序检定了其他突变，并且在PCR反应期间可能会引入这些突变。已检定了具有对底物类似物有酶活性的突变体(见下面实施例18)，并且它们的示例在下面表4中给出。酶活性显示出类似于通过等渗破细胞释放周质蛋白质片段而从E.coliMSD213中的pICI1713(D253K HCPB)或pICI1746(D253R HCPB)所发现的酶活性。随后将这类物质归为周质破细胞物或破细胞物并通过下面方法制备。
1.用单菌落接种含10微克/毫升四环素和终浓度为0.01％(w/v)的75毫升L肉汤营养培养基。20℃震摇(250rpm)培养约60小时。
2.然后通过在4℃离心收集细胞。
3.重新悬浮细胞团于在200毫摩尔Tris-HCI pH7.5中含1毫摩尔EDTA的300微升20％蔗糖中，并在室温温浴15分钟。
4.通过加入450微升的蒸馏水生成周质破细胞物，并在室温下进一步温浴15分钟。
5.通过离心除去多余细胞物，并在制备后立即检定上清液的酶活性并在检定前保持在4℃。
表4在粗提E.coli周质破细胞物中与D253K HCPB或D253R HCPB相关的活性突变Hipp-GluHipp-AspHipp-Arg[Q54R，D145A，D253K] a a[I245S，D253K] a a[I245A，D253K] a a[I245H，D253K] a NAD[A248H，D253K] a NADC288S cC288A d[G251K，D253R] a NAD[I201S，D253K] NADb[G251Q，D253K] a NAD[G251S，D253K] e a[G251V，D253K] a NAD[A248N，G251S，D253K] a a[A248S，G251S，D253K] a NAD[I201T，D253R] b ba＝相当于D253K HCPB的活性b＝相当于D253R HCPB的活性c＝成熟HCPB活性的75％(在参考实施例7和8中描述的)d＝成熟HCPB活性的25％(在参考实施例7和8中描述的)e＝＞10倍的D253K HCPB活性NAD＝无被检测的活性实施例17检定对Hipp-Glu，Hipp-Asp和Hipp-Arg药物前体类似物的一定范围的人CPB突变体的活性。
本实施例建立在实施例6中描述的突变体范围之上。
用以HPLC为基础的类似于实施例6中描述的分析法检定纯化的人CPB突变体(在实施例3，12，13，16，28，30，31，32和33中描述的D253K；[G251K，D253R]；[G251N，D253R]；[I201S，D253K]；[G251N，D253K]；[Q54R，D145A，D253K]；[G251T，D253K]；[G251S，D253K]；[A248N，G251N，D253K]；[A248S，G251N，D253K]和[S205N，G251N，D253K])的转变马尿酰-L-谷氨酸(Hipp-Glu-参考实施例1)、马尿酰-L-天冬氨酸(Hipp-Asp-参考实施例2)和马尿酰-L-精氨酸(.Sigma Chemical Company-目录号H6625)成为马尿酸的能力。
反应混合物(500微升)含突变型人CPB(0.01-12.5微克，取决于突变型)和0.5毫摩尔Hipp-Glu或Hipp-Asp或Hipp-Arg在0.025摩尔Tris-HCIL中，pH7.5。在37℃温浴样品30分钟。通过加入500微升40％甲醇，60％蒸馏水，0.2％三氟醋酸终止反应，并通过如在实施例6中描述的HPLC但使用20％甲醇，80％50毫摩尔磷酸盐缓冲液，pH6.5对生成的马尿酸的量进行定量。在230nm检测马尿酸。结果在表5中显示并以在37℃下30分钟内将底物转变成产物的百分数表示。
表5通过HCPB突变体转变Hipp-Glu，Hipp-Asp或Hipp-Arg。
底物突变体 浓度 Hipp-GluHipp-AspHipp-Arg(μg/ml) (转变百分数)D253K 25 79 22 02.5 14.6 2.9 0[G251K，D253R] 25 5.5 0.2 02.5 3.2 0.2 0[G251N，D253R] 25 57 9.4 02.5 8.8 1.4 0[I201S，D253K] 25 27.8 33.1 02.5 4.6 5.8 0[G251N，D253K] 25 100 8.3 1.82.5 62.4 1.9 0.4
底物突变体浓度 Hipp-GluHipp-Asp Hipp-Arg微克/毫升(转变百分数)[G251R，D145A，D253K] 25 90 30 02.5 26 5.2 0[G251T，D253K] 25 100 14 5.20.02 8.2 0 0[G251S，D253K} 25 100 2.8 0.80.25 14.5 0 0[A248N，G251N，D253K] 25 100 2.5 1.40.25 25.3 0.6 0[A248S，G251N，D253K] 25 86 1.3 00.5 10.7 0 0[S205N，G251N，D253K] 25 85 0.480.20.5 7.9 0 0该数据证明全部11个突变体具有转变Hipp-Glu和Hipp-Asp底物的能力，并显示出最小的或无能力转变Hipp-Arg(天然人.CPB的底物，实施例6)。在此分析中最好的突变体是Hipp-Glu的[G251T，D253K]和Hipp-Asp的[I201S，D253K]。
实施例18[G251T，D253K]HCPB和HCPB突变体的活性的检定用实施例17中描述的检定条件但用50微升未经稀释或10倍稀释或100倍稀释的[G251T，D253K]HCPB粗提E.coli周质破细胞物(破细胞物)样品代替纯化的酶。在37℃温浴样品30分钟。作为比较以类似的实验法检定D253K HCPB并含125微升未经稀释的D253K破细胞物样品。对其他HCPB突变体，反应体积是250微升并含125微升未经稀释的破细胞物或50倍稀释的破细胞物。如实施例16中的描述准备破细胞物样品。通过如实施例17中描述的HPLC定量检测在24小时内产生的马尿酸的量，并且其结果显示在表6中并被表示为在37℃24小时内底物转变成产物的百分数。
表6通过[G251T，D253K]HCPB和其他HCPB突变体转变Hipp-Glu，Hipp-Asp和Hipp-Arg突变体 在反应混合物中 底物破细胞物浓度 Hipp-GluHipp-Asp Hipp-Arg(％) (转变％)[D253K] 507.4 2.00[G251T，D253K] 10100 2.60.81 93 0 0.10.1 60 - -[G251N，D253K，T266G] 500.95 3.4-[G251S，D253K] 5093.8 1.6-1 5- -[A248N，G251T，D253K] 5095 1 -1 53.5 - -[A248S，G251T，D253K] 5091.3 0.5-1 20 - -[G251T，D253R] 5065.4 14.6 -[A248N，G251N，D253K] 5063.9 0 -[A248S，G251N，D253K] 5046.1 1 -[S205N，G251N，D253K] 5014.1 0 -该数据证明突变体[G251T，D253K]在转化Hipp-Glu成马尿酸时活性至少比D253K高50倍。[G251T，D253K]突变体对Hipp-Glu比对Hipp-Arg(天然CPB的底物，实施例6)的活性高900倍以上。
实施例19在LoVo肿瘤细胞中实施例21的药物前体和实施例22的相应药物的细胞毒性在LoVo人结肠直肠肿瘤细胞中实施例21的药物前体和实施例22的药物的不同细胞毒性如实施例9中所描述的得到证明。
用所述药物前体处理的LoVo肿瘤细胞具有905微摩尔的IC50，而用所述药物处理的该细胞具有84微摩尔的IC50(来自3个分开的研究的数据)。在图15中显示一项代表性研究。因此该所述药物前体对LoVo结肠直肠肿瘤细胞的细胞毒性比所述药物要少10倍还多从而证明其在与本文描述的HCPB突变体一起使用的有用性。
当将如实施例3中描述产生的D253K HCPB突变体加入到含LoVo肿瘤细胞的检定孔中，会看到实施例21的药物前体促进杀细胞。加入2.4和11.75微克/毫升之间的D253K HCPB到所述药物前体(500微摩尔)导致与用200微摩尔的实施例22的活性药物(图16)所见到的相匹配的毒性。这些研究进一步证明人CPB的突变型酶选择性转变相对无细胞毒性的药物前体成为能杀肿瘤细胞的强细胞毒性药物的潜力。
实施例20通过D253K HCPB和其他HCPB突变体转变实施例4的药物前体纯化的D253KHCPB(实施例3)转变实施例24的药物前体成实施例25的药物的能力被证明如下。
在37℃温浴含D253K HCPB(7.5微克)，0.5毫摩尔药物前体在0.0025摩尔Tris-HCI缓冲液中，pH7.5的反应混合物5分钟。通过加入MeCN(500微升)加0.2％三氟醋酸终止该反应。然后通过HPLC定量检测所产生的药物的量。
如实施例6中描述的进行HPLC分离不同的是用70％MeCN，30％蒸馏水和0.1％三氟醋酸的流动相以达到分离药物前体(保留时间3.8分钟)和药物(保留时间4.9分钟)并在260nm检测所述化合物。从用已知量的药物生成的校准曲线定量所产生的药物的量。
在该实验中，在37℃和5分钟内D253K HCPB(15微克/毫升)导致70.4％药物前体水解成药物(反应终止时的药物浓度是0.352毫摩尔)。
在表7显示通过其他HCPB突变体用同样的实验条件药物前体向药物的转变。在该反应混合物中[Q54R，D145A，D253K]HCPB和[G251T，D253K]HCPB突变体的量减少到0.75微克。
表7通过HCPB突变体转变实施例24的药物前体突变体浓度药物前体水解(μg/ml)(％)D253K 15 70.4D253R 15 18.3[G251K，D253R] 15 16.2[G251N，D253R] 15 66.7[I201S，D253K] 15 72.6[G251N，D253K] 15 75.9[Q54R，D145A，D253K] 1.5 26.0[G251T，D253K] 1.5 36.0该数据证明HCPB突变体可转变药物前体成药物从而提供所见的对模型底物Hipp-Glu和Hipp-Asp的活性可适用于芥末药物前体的进一步证据。
实施例21N-[N-(4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-3-甲基-苯氧基}苯甲酰基)-L-丙氨酸]-L-谷氨酸(见图17的反应图解)向在乙酸中(5毫升)的N-[N-(4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-3-甲基-苯氧基}苯甲酰基)-L-丙氨酸]-L-谷氨酸二苄酯(化合物8；130毫克)加入30％Pd/C(50％湿；25毫克)。在一个氢气压下搅拌该混合物1小时。经CELITE(硅藻土)过滤除去催化剂并将过滤物蒸发至干以产生油状标题化合物(化合物11)，88克(88％产率)。
NMR DMSOd67.9-6.6(m，7H)；4.85(m，1H)；4.6(m，1H)；3.4(m，8H)；2.25(s，2H)；2.4-1.9(m，4H)；1.45(d，3H)；MS ESI，566[M-H]-如下制备起始物质化合物8。
溶解4-羟基苯甲酸(13.8克，0.1摩尔)于甲醇中并向该溶液加入甲氧化钠(10.8克，0.2摩尔)。然后使该溶液蒸发至干燥。向所得到的固体物加入DMF(500毫升)随后加入4-氟-2-甲基-1-硝基苯(购自Aldrich在5氟-2-硝基-甲苯下)(10.2毫升0.1摩尔)。在125℃加热该混合物2小时，冷却并倒入3升水中，用2摩尔HCI酸化其至pH2并用醋酸抽提2次。用水洗合并的有机层，干燥并蒸发至干。用乙醚研制得到的固体物以产生6.1克如一种白色固体物，4-(3-甲基-4硝基-苯氧基)-苯甲酸(化合物1)(22％产率；熔点＝187-190℃)。
在5℃向异丁烯(34克)的二氯甲烷(100毫升)溶液加入化合物1(5克)，随后加入浓硫酸(0.5毫升)。在环境温度下搅拌该混合物2天并将其倒入饱和碳酸氢钠溶液(200毫升)。用二氯甲烷抽提水层并使合并的有机抽提物干燥并蒸发至产生油状物。用5％在己烷中的醋酸对该油进行层析以产生4-(3-甲基-4硝基-苯氧基)苯甲酸叔丁酯(化合物2)，2.5克(42％产率；熔点＝81-83℃)。
向化合物2(2.15克/毫升5毫摩尔)的醋酸溶液(35毫升)加入30％Pd/C(50％湿)(400毫克)。在一个氢气压下搅拌该混合物2小时。通过CELITE过滤混合物并蒸发过滤物以产生4-(4-氨基-3-甲基-苯氧基)-苯甲酸叔丁酯(化合物3)如一种固体(1.9克，99％产率)。熔点，84-86℃。
使化合物3(2克)的1∶1醋酸/水(30毫升)溶液通过乙烯氧化物(5克)。在环境温度下放置2天后，将该混合物倒入饱和的碳酸氢钠溶液中(200毫升)并用醋酸抽提2次。用水洗合并的有机提取物干燥并蒸发以产生一种油状物(2.5克，99％产率)4-{4-[双-(2-羟乙基)-氨基]-3-甲基-苯氧基) 苯甲酸叔丁酯(化合物4)。
NMR CDCl38.0(d，2H)；7.3-6.9(m，7H)；3.6(t，4H)；3.2(t，4H)；2.3(s，3H)；1.5(s，9H)。
向化合物4(2.5克)的1∶1乙腈/四氯化碳溶液(90毫升)中加入咪唑(1.7克)和三苯磷杂环戊二烯(6.6克)。在室温下搅拌该混合物3小时并蒸发至干燥。残留物被分隔在1摩尔的柠檬酸溶液和醋酸之间。用水洗有机层，干燥并蒸发至干。用己烷/醋酸(9∶1)对残留物进行层析以产生如一种油状物的(1.2克，44％产率)4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-3-甲基-苯氧基) 苯甲酸叔丁酯(化合物5)。
NMR CDCl37.95(d，2H)；7.2-6.9(m，7H)；3.4(m，8H)；2.3(s，3H)；1.6(s，9H)。
使化合物5的二氯甲烷溶液(5毫升)和三氟醋酸(10毫升)在环境温度下摇动2小时。蒸发该混合物至干，与醋酸一起共沸两次以产生如一种三氟醋酸盐固体物(1.0克，73％产率)的4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-3-甲基-苯氧基)苯甲酸(化合物6)。熔点，91-3℃。
向N-Boc-L-丙氨酸-L-谷氨酸二苄酯(Beilharz等，1983，36，751-8(化合物7，250毫克，0.5毫摩尔)的二氯甲烷溶液(2毫升)加入三氟醋酸(4毫升)。使该溶液在环境温度中放置1小时然后蒸发至干。再次溶解残留物于醋酸中，用饱和碳酸氢钠溶液洗，干燥并蒸发以产生一种油(化合物7其BOC基团被除去)。加入在DMF(2毫升)中的此油到DMF(3毫升)中的化合物6(255毫克)，随后加入羟基苯并三唑(70毫克)，1-(3-二甲氨丙基)-3-乙基碳二胺盐酸化物(DECI；115毫克)和三乙胺(0.18毫升)。在环境温度下搅拌该混合物1小时，倒入饱和的碳酸氢钠溶液(100毫升)和醋酸(100毫升)。分开有机层，用水并随后用0.5摩尔柠檬酸洗，干燥并蒸发至干。用醋酸/己烷(1∶1)对残留物层析以产生需要的油状的起始化合物(150毫克，40％产率)。
NMR CDCl37.8(d，2H)；7.4-6.7(m，7H)；5.2(s，2H)；5.0(s，2H)；4.7(m，2H)；3.4(m，8H)；2.3(m，3H)；2.45-2.0(s，4H)；1.4(s，3H)。
实施例22制备N-(4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-3-甲基-苯氧基}苯甲酰基)-L-丙氨酸(反应图解见图17)将N-(4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-3-甲基-苯氧基}苯甲酰基)-L-丙氨酸叔丁酯(400毫克；化合物9)溶解于二氯甲烷(4毫升)中并加入三氟醋酸(8毫升)。在环境温度下放置化合物1小时，蒸发至干并与醋酸共沸两次以产生油状(0.43克，52％产率)的标题化合物(化合物10；与实施例21的药物前体对应的药物。
NMR DMSOd68.5(d，1H)；7.8-6.5(m，7H)；4.4(m，1H)；3.55(t，4H)；3.35(t，4H)；2.3(s，3H)；1.4(d，3H)；MS[M+H]+，439如下制备起始化合物9。
向在二甲基甲酰胺(2毫升)中的4-{4-[双(2-氯乙基)-氨基]-3-甲基-苯氧基)苯甲酸(实施例21中的化合物6)(586毫克，1毫摩尔)加入羟苯三唑(135克)，1-(30二甲氨丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸化物(230毫克)，然后加入L-丙氨酸-叔丁酯盐酸化物(181毫克)和三乙胺(0.54毫升)。在环境温度下搅拌该混合物2小时，倒入饱和碳酸氢钠溶液(60毫升)，用醋酸抽提两次并用水洗合并的抽提物，用1摩尔柠檬酸溶液洗，干燥并蒸发至干。用己烷/醋酸(4∶1)对残留物层析以产生需要的油状起始物质(0.4克，81％产率)。
NMR CDCl37.8(d，2H)；7.3-6.7(m，7H)；4.6(m，1H)；3.4(t，8H)；2.3(s，3H)；1.5(s，3H)；1.5(s，9H)。
实施例23在异种移植小鼠中药物前体和人源化抗体突变型HCPB融合蛋白的抗肿瘤作用。
在下列模式中可证明适合于药物前体和人源化的抗体突变型HCPB融合蛋白(实施例10)的抗肿瘤作用。
皮下注射LoVo结肠直肠肿瘤细胞(ECAC号87060101)(1×107)进入无胸腺裸鼠。当肿瘤直径在4至5毫米时，以10至100毫克/公斤之间的剂量静脉注射施用该结合物。在所述融合蛋白集中到肿瘤局部并经适当的时间间隔以使残留结合物从血流和正常组织中清除后，在剂量范围为10-1000毫克/公斤以单剂量或复剂量通过静脉注射或腹膜下注射方法施用所述药物前体。结合抗体-酶融合蛋白和药物前体使肿瘤生长明显低于未处理的对照肿瘤或只单独经同等剂量的结合物或药物前体处理的肿瘤。这些研究证明人源化的抗体突变型CPB融合蛋白和所述突变型药物前体导致明显的抗肿瘤活性。
实施例24N[N-(4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-苯氧基}苯甲酰基)-L-丙氨酸1-L-谷氨酸的制备以一种类似于实施例21中给出的方式但用4-(4-硝基苯氧基)苯甲酸(Ravick等(1993)，JACS，55，1289-1290)代替4-(3-甲基-4硝基苯氧基)苯甲酸(实施例21中的化合物1)制备出标题化合物。
NMR DMSOd68.4(d，1H)；8.3(d，1H)；7.8(d，1H)；7.05-6.75(m，6H)；4.5(m，1H)；4.25(m，1H)；3.7(s，8H)；2.4-1.6(m.4H)；1.4(d.3H)MS ESP，551[M-H]-实施例25N-(4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-苯氧基}苯甲酰基)-L-丙氨酸的制备以一种类似于实施例22中给出的方式但用4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-苯氧基}苯甲酸(该化合物在实施例24中制备作为中间产物)代替4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-3-甲基-苯氧基}苯甲酸。
NMR CDCl37.75(d，2H)；7.0-6.4(m，6H)；4.6(m，1H)；3.6-3.4(m，8H)；1.6(d，2H)。
MS ESP，423[M-H]-实施例26纯化来自E.coli的D253R HCPB-His6-cMyc用质粒pICI1746(在实施例2中描述)代替质粒pICI1713重复实施例11中描述的方法。发酵时使用12只2升含600毫升L四环素的Erlenmeyer烧瓶代替实施例11中使用的9只烧瓶。
从-70℃保存中取出重组E.coli细胞并使之融化。称细胞团重量并知是82.4克。加入缓冲液A(200毫摩尔Tris-HCI(pH8.0)，20％蔗糖)使该细胞团重悬浮以产生130毫升的重悬浮体积。在室温温浴该细胞悬液20分钟并偶尔轻微搅拌，然后在室温加入等体积的蒸馏水并混合均匀。再在室温温浴该细胞悬液20分钟并偶尔轻微搅拌。通过4℃98000xg离心90分钟使得到的等渗破细胞物澄清，然后缓慢倒出团集的不溶性碎片之上的上清液。用10毫摩尔Tris-HCI，500毫摩尔氯化钠，pH8.0(缓冲液B)，1∶1稀释该上清液，调pH到8.0，总体积到500毫升并上载(过夜，0.5毫升/分钟速率)到羧肽酶抑制剂亲和层析柱。按照随CNBr活化的Sepharose 4B(一种用于固定化含初级胺配基的预活化的4％凝胶；Pharmacia目录号17-0430-01)和马铃薯块茎羧肽酶抑制剂(c-0279，Sigma)所带的说明书制备该层析柱。此大小的羧肽酶纯化所用的基质的量是15毫升装载于一个Pharmacia XK 16柱。为生成15毫升的基质的量，使用5克干基质和80毫克羧肽酶抑制剂。制备该亲和层析柱的方法如下。
悬浮冷冻干燥的基质5克于1毫摩尔HCI中。分数份加入1毫摩尔HCI在多孔玻璃滤器上洗膨胀的胶。溶解羧肽酶抑制剂(80毫克)于含0.5摩尔的氯化钠(交联缓冲液；25毫升)的0.1摩尔的碳酸氢钠(pH8.3)中，然后在一个塞住的管中与所述凝胶混合。掉头旋转该混合物在室温下1小时或在4℃18小时然后用至少5凝胶体积的交联缓冲液洗去多余的配基。转移该凝胶到0.1毫摩尔的Tris-HCI(pH8.0)并在室温放置2小时，然后用至少5凝胶体积的含0.5摩尔NaCI的0.1摩尔醋酸盐缓冲液(pH4.0)洗并随后用至少5凝胶体积的含0.5摩尔NaCI的0.1摩尔Tris-HCI(pH8.0)洗。
用缓冲液B在4℃对该柱预平衡。上载上清液后，洗该柱直至流经的吸光率返回到基线然后通过洗脱缓冲液(100毫摩尔碳酸钠，500毫摩尔氯化钠，pH11.4)在4℃洗脱，1毫升分组收集。在取样测定含重组羧肽酶B各组分后将洗脱的组分在-20℃冷冻。这通过Western印记分析用抗-c-myc标记抗体(9E10)继之用当与4氯萘酚和过氧化氢相遇时可产生颜色反应的抗小鼠辣根过氧化物酶结合物(a-9044，Sigma)完成，或通过银染的聚丙烯酰胺凝胶电泳完成。测定组分20到66的含重组羧肽酶B。从该柱收集的开始上载的那部分洗脱上清液在该柱重新平衡后再次过柱。该收集组分的洗脱条件和分析均等同于它们的第一次洗脱。测定25到60组分的含重组羧肽酶B。与得自第一次过程的组分合并，调pH到pH7.5并用Millipore CentrifugalUltrafree-20℃离心(一种截取10,000分子量的过滤装置)随后急冻并储存于-80℃。此处详述的纯化方法提供3.5毫克/毫升的D253R突变型HCPB，纯度87％在550微升体积中。
实施例27
纯化来自E.coli的[G251N，D253K]HCPB-His6-cMyc用pMC43.1(实施例13中描述)代替质粒pMC1746重复实施例26中描述的方法。细胞团的重量是94克，将其重悬浮于110毫升的缓冲液A中。用缓冲液B稀释后上载到马铃薯抑制剂柱的等渗破细胞物体积是500毫升。在第一次洗脱中收集10到27组分。在第二轮中收集10到39洗脱组分。本纯化提供900微升纯度为95％的1.24毫克/毫升的[G253N，D253K]HCPB。
实施例28纯化来自E.coli的[G251T，D253K]HCPB-His6-cMyc用pMC46.4.1(实施例14中描述)代替质粒pMC1746重复实施例26中描述的方法。细胞团的重量是46克，将其重悬浮于65毫升的缓冲液A中。用缓冲液B稀释后上载到potator抑制剂柱的等渗破细胞物体积是260毫升。在第一次洗脱中收集8到28组分。在第二轮中收集41到79洗脱组分。本纯化提供500微升纯度为95％的0.67毫克/毫升的[G253T，D253K]HCPB。
实施例29药用组合物下面解释可用于人类治疗目的的本发明的代表性药用剂量形式。
可注射的溶液i)无菌水溶液，注射用，每毫升溶液含实施例10的抗体酶 1.0毫克醋酸钠三水合物6.8毫克氯化钠7.2毫克吐温200.05毫克结合物的典型剂量是30毫克，3天后继之以药物前体。
ii)用于终药物前体剂量形式制剂的配置如下玻瓶(3×20毫升)，每个含600毫克实施例21的药物前体；3个安瓶含11毫升2.15％(w/v)碳酸氢钠；针头(3x18G)；疏水滤器用于给瓶开口；和3x一次性无菌0.22水溶液用微米滤器。全部物品必须在2-8℃储存。
所述操作最好在无菌条件下仔细进行。在用药前1小时内，用针头和疏水滤器给一只药物前体小瓶开口。然后通过塞子在针管中推进和针头直接加入无菌的2.15％w/v碳酸氢钠(10毫升)。让开口适当静止轻轻旋动小瓶以得到清澈的溶液(作为游离碱该溶液将是50毫克/毫升)。通过无菌滤器所需剂量的体积被抽进无菌注射器中。然后用一套着的无菌针头替换该滤器并在给药前保持注射单元冷却。每个其余的小瓶在一个小时间隔内以同样方式准备以使例如三个分开的剂量在每隔1小时给药。
实施例30从E.coli克隆，表达和纯化[G251S，D253K]HCPB-(His)6-c-Myc在E.coli中克隆和表达[G251S，D253K]HCPB的方法十分类似于参考实施例8中所描述的方法。如在实施例2中描述的制备[G251S，D253K]HCPB基因但用于PCR定点突变的起始物质是质粒pICI1713(在实施例1中描述)中的[D253K]HCPB基因而不是pICI1712。然而，在此情况下在该基因的PCR扩增期间使用定点突变以改变成熟基因中251位氨基酸密码子从甘氨酸变为丝氨酸(GGC到TCT)，即G251S的变化。以在参考实施例7和8中描述的一种类似方式准备两个PCR混合物。在第一个反应物中引物是2264(SEQ ID NO48)和1038(SEQ ID NO68，代替SEQ ID NO61)。在第二个反应物中，引物是6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO42)和54(SEQ ID NO75，代替SEQ ID NO62)。在两个反应物中起始DNA均是pICI1713。
PCR，克隆，表达和鉴定的方法与实施例14相同。根据测序结果，选择出一个含有所需要的[G251S，D253K]HCPB基因序列克隆，并命名为pMC49.2。
为纯化[G251S，D253K]HCPB，用质粒pMC49.2代替质粒pICI1746重复实施例26中描述的方法。细胞团的重量是77克，将其悬浮于100毫升的缓冲液A中。用羧肽酶B稀释后，上载到马铃薯抑制剂柱上的等渗破细胞物的体积是395毫升。在第一次洗脱，收集11到40组分。在第二轮，收集12到33洗脱组分。本纯化提供500微升体积中纯度为86％的1.7毫克/毫升[G251S，D253K]HCPB。
实施例31从E.coli克隆，表达和纯化[A248N，G25 1N，D253K]HCPB-(His)6-c-Myc在E.coli中克隆和表达[A248N，G251N，D253K]HCPB的方法十分类似于参考实施例8中所描述的方法。如在实施例2中描述的制备[A248N，G251N，D253K]HCPB基因但用于PCR定点突变的起始物质是质粒pMC43.1(在实施例13中描述)中的[G251N，D253K]HCPB基因而不是pICI1712。然而，在此情况下在该基因的PCR扩增期间使用定点突变以改变成熟基因中248位氨基酸密码子从丙氨酸变为天冬酰胺(GCT到AAC)，即G248N的变化。以在参考实施例7和8中描述的一种类似方式准备两个PCR混合物。在第一个反应物中引物是2264(SEQ ID NO48)和1024(SEQ ID NO76，代替SEQ ID NO61)。在第二个反应物中，引物是6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO42)和1028(SEQ ID NO77，代替SEQ ID NO62)。在两个反应物中起始DNA均是pMC43.1。
PCR，克隆，表达和鉴定的方法与实施例14相同。根据测序结果，选择出一个含有所需要的[A248N，G251N，D253K]HCPB基因序列克隆，并命名为pMC50.2。
为纯化[A248N，G251N，D253K]，用质粒pMC50.2代替质粒pICI1746重复实施例26中描述的方法。细胞团的重量是83克，将其悬浮于100毫升的缓冲液A中。用羧肽酶B稀释后，上载到马铃薯抑制剂柱上的等渗破细胞物的体积是560毫升。在第一次洗脱，收集23到40组分。在第二轮，收集18到40洗脱组分。本纯化提供1000微升体积中纯度为90％的1.0毫克/毫升[A248N，G251N，D253K]HCPB。
实施例32从E.coli克隆，表达和纯化[A248S，G251N，D253K]HCPB-(His)6-c-Myc在E.coli中克隆和表达[A248S，G251N，D253K]HCPB的方法十分类似于参考实施例8中所描述的方法。如在实施例2中描述的制备[A248S，G251N，D253K]HCPB基因但用于PCR定点突变的起始物质是质粒pMC43.1(在实施例13中描述)中的[G251N，D253K]HCPB基因而不是pICI1712。然而，在此情况下在该基因的PCR扩增期间使用定点突变以改变成熟基因中248位氨基酸密码子从丙氨酸变为丝氨酸(GCT到TTC)，即G248S的变化。以在参考实施例7和8中描述的一种类似方式准备两个PCR混合物。在第一个反应物中引物是2264(SEQ ID NO48)和1024(SEQ ID NO76，代替SEQ ID NO61)。在第二个反应物中，引物是6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO42)和1030(SEQ ID NO78，代替SEQ ID NO62)。在两个反应物中起始DNA均是pMC43.1。
PCR，克隆，表达和鉴定的方法与实施例14相同。根据测序结果，选择出一个含有所需要的[A248S，G251N，D253K]HCPB基因序列克隆，并命名为pMC51.2。
为纯化[A248S，G251N，D253K]，用质粒pMC51.2代替质粒pICI1746重复实施例26中描述的方法。细胞团的重量是71.5克，将其悬浮于100毫升的缓冲液A中。用羧肽酶B稀释后，上载到马铃薯抑制剂柱上的等渗破细胞物的体积是520毫升。在第一次洗脱，收集10到40组分。在第二轮，收集10到32洗脱组分。在第三轮，收集15到40洗脱组分。本纯化提供1500微升体积中纯度为80.5％的0.8毫克/毫升[A248S，G251N，D253K]HCPB。
实施例33从E.coli克隆，表达和纯化[S205N，G251N，D253K]HCPB-(His)6-c-Myc在E.coli中克隆和表达[S205N，G251N，D253K]HCPB的方法十分类似于参考实施例8中所描述的方法。如在实施例2中描述的制备[S205N，G251N，D253K]HCPB基因但用于PCR定点突变的起始物质是质粒pMC43.1(在实施例13中描述)中的[G251N，D253K]HCPB基因而不是pICI1712。然而，在此情况下在该基因的PCR扩增期间使用定点突变以改变成熟基因中205位氨基酸密码子从丝氨酸变为天冬酰胺(TCA到AAC)，即S205N的变化。以在参考实施例7和8中描述的一种类似方式准备两个PCR混合物。在第一个反应物中引物是2264(SEQ ID NO48)和1010(SEQ ID NO79，代替SEQ ID NO61)。在第二个反应物中，引物是6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO42)和1016(SEQ ID NO80，代替SEQ ID NO62)。在两个反应物中起始DNA均是pMC43.1。
PCR，克隆，表达和鉴定的方法与实施例14相同。根据测序结果，选择出一个含有所需要的[S205N，G251N，D253K]HCPB基因序列克隆，并命名为pMC52.1。
为纯化[S205N，G251N，D253K]，用质粒pMC51.2代替质粒pICI1746重复实施例26中描述的方法。细胞团的重量是77克，将其悬浮于100毫升的缓冲液A中。用羧肽酶B稀释后，上载到马铃薯抑制剂柱上的等渗破细胞物的体积是420毫升。在第一次洗脱，收集10到40组分。在第二轮，收集12到29洗脱组分。本纯化提供650微升体积中纯度为85％的0.8毫克/毫升[S205N，G251N，D253K]HCPB。
实施例34从E.coli克隆和表达[G251T，D253R]HCPB-(His)6-c-Myc在E.coli中克隆和表达[G251T，D253R]HCPB的方法十分类似于参考实施例8中所描述的方法。如在实施例2中描述的制备[G251T，D253R]HCPB基因但用于PCR定点突变的起始物质是质粒pICI1746(在实施例2中描述)中的[D253R]HCPB基因而不是pICI1712。然而，在此情况下在该基因的PCR扩增期间使用定点突变以改变成熟基因中251位氨基酸密码子从甘氨酸变为苏氨酸(GGC到ACT)，即G251T的变化。以在参考实施例7和8中描述的一种类似方式准备两个PCR混合物。在第一个反应物中引物是2264(SEQ ID NO48)和1038(SEQ ID NO68，代替SEQ ID NO61)。在第二个反应物中，引物是6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO42)和794(SEQ ID NO81，代替SEQ ID NO62)。在两个反应物中起始DNA均是pICI1746。
PCR，克隆，表达和鉴定的方法与实施例14相同。根据测序结果，选择出一个含有所需要的[G251T，D253R]HCPB基因序列克隆，并命名为pMC55.2。
实施例35从E.coli克隆和表达[I201T，D253R]HCPB-(His)6-c-Myc在E.coli中克隆和表达[I201T，D253R]HCPB的方法十分类似于参考实施例8中所描述的方法。如在实施例2中描述的制备[I201T，D253R]HCPB基因但用于PCR定点突变的起始物质是质粒pICI1746(在实施例2中描述)中的[D253R]HCPB基因而不是pICI1712。然而，在此情况下在该基因的PCR扩增期间使用定点突变以改变成熟基因中201位氨基酸密码子从异亮氨酸变为苏氨酸(ATC到ACT)，即I201T的变化。以在参考实施例7和8中描述的一种类似方式准备两个PCR混合物。在第一个反应物中引物是2264(SEQ ID NO48)和1003(SEQ ID NO82，代替SEQ ID NO61)。在第二个反应物中，引物是6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO42)和795(SEQ ID NO83，代替SEQ ID NO62)。在两个反应物中起始DNA均是pICI1746。
PCR，克隆，表达和鉴定的方法与实施例14相同。根据测序结果，选择出一个含有所需要的[I201T，D253R]HCPB基因序列克隆，并命名为pMC57.2。
实施例36从E.coli克隆，表达和纯化[A248N，G251T，D253K]HCPB-(His)6-c-Myc在E.coli中克隆和表达[A248N，G251T，D253K]HCPB的方法十分类似于参考实施例8中所描述的方法。如在实施例2中描述的制备[A248N，G251T，D253K]HCPB基因但用于PCR定点突变的起始物质是质粒pMC46.4(在实施例14中描述)中的[G251T，D253K]HCPB基因而不是pICI1712。然而，在此情况下在该基因的PCR扩增期间使用定点突变以改变成熟基因中248位氨基酸密码子从丙氨酸变为天冬酰胺(GCT到AAC)，即G248N的变化。以在参考实施例7和8中描述的一种类似方式准备两个PCR混合物。在第一个反应物中引物是2264(SEQ ID NO48)和1024(SEQ ID NO76，代替SEQ ID NO61)。在第二个反应物中，引物是6HIS9E10R1BS1(SEQ ID NO42)和1028(SEQ ID NO77，代替SEQ ID NO62)。在两个反应物中起始DNA均是pMC46.4。
PCR，克隆，表达和鉴定的方法与实施例14相同。根据测序结果，选择出一个含有所需要的[A248N，G251T，D253K]HCPB基因序列克隆，并命名为pMC59.3。
实施例37从E.coli克隆，表达和纯化[A248S，G251T，D253K]HCPB-(His)6-c-Myc在E.coli中克隆和表达[A248S，G251T，D253K]HCPB的方法十分类似于参考实施例8中所描述的方法。如在实施例2中描述的制备[A248S，G251T，D253K]HCPB基因但用于PCR定点突变的起始物质是质粒pMC46.4(在实施例14中描述)中的[G251T，D253K]HCPB基因而不是pICI1712。然而，在此情况下在该基因的PCR扩增期间使用定点突变以改变成熟基因中248位氨基酸密码子从丙氨酸变为丝氨酸(GCT到TTC)，即G248S的变化。以在参考实施例7和8中描述的一种类似方式准备两个PCR混合物。在第一个反应物中引物是2264(SEQ ID NO48)和1024(SEQ ID NO76，代替SEQ IDNO61)。在第二个反应物中，引物是6HIS9E10R1BS1(SEQ IDNO42)和1030(SEQ ID NO78，代替SEQ ID NO62)。在两个反应物中起始DNA均是pMC46.4。
PCR，克隆，表达和鉴定的方法与实施例14相同。根据测序结果，选择出一个含有所需要的[A248S，G251T，D253K]HCPB基因序列克隆，并命名为pMC60.3。
实施例38人源化A5B7 F(ab′)2-[G251T，D253K]HCPB融合蛋白的制备重复实施例10中描述的方法但用[G251T，D253K]HCPB序列代替D253K HCPB序列。在实施例14中描述了[G251T，D253K]HCPB序列。
实施例39[A248S，G251T，D253K]HCPB-(His)6-c-Myc的纯化与酶活性用MSD 2812(MSD 1924 pZEN1921)代替MSD2230重复实施例3中描述的方法。质粒pZEN1921也被称做pMC60.3。在实施例37中描述了质粒pMC60.3的制备。分别处理细胞团的两个样品。从储存中取出的细胞团的重量在第一个样品中是593克，而在第二个样品中是558克。将它们悬浮在缓冲液A中(分别是750毫升和710毫升)以制备等渗破细胞物。用缓冲液稀释后顺序上载到两个马铃薯抑制剂柱的等渗破细胞物的体积是每样品3升。在第一次纯化中，从两个柱收集的组分是18到80(柱1)和30到63(柱2)。在第二次纯化中，从两个柱收集的组分是21到73(柱1)和23到68(柱2)。合并纯化组分提供了在4.4毫升体积中纯度是83％的2.6毫克/毫升的[A248S，G251T，D253K]HCPB。
如在实施例17中的描述测定了对Hipp-Glu，Hipp-Asp和Hipp-Arg底物的酶活性。
浓度 Hipp-Glu Hipp-Asp Hipp-Arg(μg/ml) (转变％)25 935.5 00.2514.5 00如实施例7中的描述确定对Hipp-Glu的Km和kcat。
Km(mM)1.1kcat(s-1)19kcat/Km(mM-1s-1)17.3实施例40[G251T，D253R]HCPB-(His)6-c-Myc的纯化与酶活性用MSD 2803(MSD 1924 pZEN1907)代替MSD2230重复实施例3中描述的方法。质粒pZEN1907也被称做pMC55.2。在实施例34中描述了质粒pMC55.2的制备。分别处理细胞团的两个样品。从储存中取出的细胞团的重量在第一个样品中是660克，而在第二个样品中是484克。将它们悬浮在缓冲液A中(分别是800毫升和700毫升)以制备等渗破细胞物。用缓冲液稀释后顺序上载到两个马铃薯抑制剂柱的等渗破细胞物的体积分别是1.6升和1.4升。在第一次纯化中，从两个柱收集的组分是20到70(柱1)和20到65(柱2)。在第二次纯化中，从两柱收集对应于图表记录器上所绘制的洗脱峰值的单一组分。合并的纯化组分提供了在1.4毫升体积中纯度是50％的3.6毫克/毫升的[G251T，D253R]HCPB。
如在实施例17中的描述测定了对Hipp-Glu，Hipp-Asp和Hipp-Arg底物的酶活性。
浓度Hipp-Glu Hipp-Asp Hipp-Arg(μg/ml) (转变％)25 96 29 01 16.2 1.2 0如实施例7中的描述确定对Hipp-Glu和Hipp-Asp的Km和kcat。
Hipp-Glu Hipp-AspKm(mM) 1.61.7kcat(s-1) 7.80.7kcat/Km(mM-1s-1) 4.90.4ES70099AFG/MB30JUL96
式1
式2
式3
式4
式5
序列列表(1)一般资料(i)申请人(A)名称ZENECA LIMITED(B)街15 STANHOPE GATE(C)城市LONDON(E)国家联合王国(F)邮编(ZIP)W1Y 7LN(G)电话0171 304 5000(H)电话传真0171 304 5151(I)电报0171 834 2042(ii)发明题目化合物(iii)序列号74(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机可兼容IBM PC(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件 PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1资料(i)序列特性(A)长度41碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO1CTCTAGGAAT TCTTATTAGT ACAGGTGTTC CAGGACGTAG C 41(2)SEQ ID NO2资料(i)序列特性(A)长度108碱基对(B)类型核酸
(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO2CCCAAGCTTG CCGCCACCAT GTTGGCAGTC TTGGTTCTGG TGACTGTGGC CCTGGCATCT60GCTGCAACAG GACACAGTTA TGAGAAGTAC AACAAGTGGG AAACGATA108(2)SEQ ID NO3资料(i)序列特性(A)长度16碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO3AACAGCTATG ACCATG 16(2)SEQ ID NO4资料(i)序列特性(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO4GTAAAACGAC GGCCAGT17(2)SEQ ID NO5资料(i)序列特性(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链单链
(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO5TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC 30(2)SEQ ID NO6资料(i)序列特性(A)长度23碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO 6CAGACTCTGC AGCAGGTCCA CAG 23(2)SEQ ID NO7资料(i)序列特性(A)长度54碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO7CCCAAGCTTG CCGCCACCAT GTTGGCACTC TTGGTTCTGG TGACTGTGGC CCTG 54(2)SEQ ID NO8资料(i)序列特性(A)长度39碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO8CTCATAACTG AATTCTTATT AACGAACCCG GCTATCAAA 39(2)SEQ ID NO9资料(i)序列特性(A)长度34碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO9GGATCTGCTG CCCAAGCTTA CTCCATGGTG ACCC34(2)SEQ ID NO10资料(i)序列特性(A)长度80碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO10CTTCTCATAA CTGTGTCCTG TTGCGAACAC GCTGCTCACC TCGGGCACTG TACATATGCA60AGGCTTACAA CCACAATCCC80(2)SEQ ID NO11资料(i)序列特性(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO11GGTTGTAAGC CTTGCATATG TACAGTGCCC GAGGTGAGCA GCGTGTTCGC AACAGGACAC60AGTTATGAGA AGTACAAC 78(2)SEQ ID NO12资料(i)序列特性(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO12CCGTTTGATC TCGAGCTTGG TGCCTCC27(2)SEQ ID NO13资料(i)序列特性(A)长度50碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO13ATATAAAGCT TGCCGCCACC ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT 50(2)SEQ ID NO14资料(i)序列特性(A)长度48碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO14ATCGAATTCG CCGCCACCAT GGATTTTCAA GTGCAGATTT TCAGCTTC 48(2)SEQ ID NO15资料(i)序列特性(A)长度45碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO15TGAGAATTCT TACTATGTAC ATATGCAAGG CTTACAACCA CAATC45(2)SEQ ID NO16资料(i)序列特性(A)长度35碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO16GCGCCGAATT CTTATTAACA CTCATTCCTG TTGAA 35(2)SEQ ID NO17资料(i)序列特性(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO17GACCTGGAAC TCTGGATCTC TGTCCAGCGG 30(2)SEQ ID NO18资料(i)序列特性
(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO18AGGTGTGCAC ACCGCTGGAC AGAGATCCAG 30(2)SEQ ID NO19资料(i)序列特征(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO19TGGTACCAGC AGAAGCCAGG TTCCTCCCCC 30(2)SEQ ID NO20资料(i)序列特性(A)长度777碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(ix)特征(A)名称/关键字CDS(B)位置16..765(xi)序列描述SEQ ID NO20AAGCTTGCCG CCACC ATG AAG TTG TGG CTG AAC TGG ATT TTC CTT GTA ACA 51Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr1 5 10CTT TTA AAT GGT ATC CAG TGT GAG GTG AAG CTG GTG GAG TCT GGA GGA 99Leu Leu Asn Gly Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly15 20 25GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCC TGT GCA ACT TCT 147Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser30 35 40GGG TTC ACC TTC ACT GAT TAC TAC ATG AAC TGG GTC CGC CAG CCT CCA 195Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro45 50 55 60GGA AAG GCA CTT GAG TGG TTG GGT TTT ATT GGA AAC AAA GCT AAT GGT 243Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn 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(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(ix)特征(A)名称/关键字CDS(B)位置1..1047(ix)特征(A)名称/关键字mat-肽(B)位置67..1047(xi)序列描述SEQ ID NO46ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT 48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala-22 -20 -15 -10GCC CAA CCA GCC ATG GCG GCA ACT GGT CAC TCT TAC GAG AAG TAC AAC 96Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Thr Gly His Ser Tyr Glu Lys Tyr Asn-51 5 10AAG TGG GAA ACG ATA GAG GCT TGG ACT CAA CAA GTC GCC ACT GAG AAT 144Lys Trp Glu Thr Ile Glu Ala Trp Thr Gln Gln Val Ala Thr Glu Asn15 20 25CCA GCC CTC ATC TCT CGC AGT GTT ATC GGA ACC ACA TTT GAG GGA CGC 192Pro Ala Leu Ile Ser Arg Ser Val Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg30 35 40GCT ATT TAC CTC CTG AAG GTT GGC AAA GCT GGA CAA AAT AAG CCT GCC 240Ala Ile Tyr Leu Leu Lys Val Gly Lys Ala Gly Gln Asn Lys Pro Ala45 50 55ATT TTC ATG GAC TGT GGT TTC CAT GCC AGA GAG TGG ATT TCT CCT GCA 288Ile Phe Met Asp Cys Gly Phe His Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala60 65 70TTC TGC CAG TGG TTT GTA AGA GAG GCT GTT CGT ACC TAT GGA CGT GAG 336Phe Cys Gln Trp Phe Val Arg Glu Ala Val Arg Thr Tyr Gly Arg Glu75 80 85 90ATC CAA GTG ACA GAG CTT CTC GAC AAG TTA GAC TTT TAT GTC CTG CCT 384Ile Gln Val Thr Glu Leu Leu Asp Lys Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro95 100 105GTG CTC AAT ATT GAT GGC TAC ATC TAC ACC TGG ACC AAG AGC CGA TTT 432Val Leu Asn Ile Asp Gly Tyr Ile Tyr Thr Trp Thr Lys Ser Arg Phe110 115 120TGG AGA AAG ACT CGC TCC ACC CAT ACT GGA TCT AGC TGC ATT GGC ACA 480Trp Arg Lys Thr Arg Ser Thr His Thr Gly Ser Ser Cys Ile Gly Thr125 130 135GAC CCC AAC AGA AAT TTT GAT GCT GGT TGG TGT GAA ATT GGA GCC TCT 528Asp Pro Asn Arg Asn Phe Asp Ala Gly Trp Cys Glu Ile Gly Ala Ser140 145 150CGA AAC CCC TGT GAT GAA ACT TAC TGT GGA CCT GCC GCA GAG TCT GAA 576Arg Asn Pro Cys Asp Glu Thr Tyr Cys Gly Pro Ala Ala Glu Ser Glu155 160 165 170AAG GAG ACC AAG GCC CTG GCT GAT TTC ATC CGC AAC AAA CTC TCT TCC 624Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala Asp Phe Ile Arg Asn Lys Leu Ser Ser175 180 185ATC AAG GCA TAT CTG ACA ATC CAC TCG TAC TCC CAA ATG ATG ATC TAC 672Ile Lys Ala Tyr Leu Thr Ile His Ser Tyr Ser Gln Met Met Ile Tyr190 195 200CCT TAC TCA TAT GCT TAC AAA CTC GGT GAG AAC AAT GCT GAG TTG AAT 720Pro Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys Leu Gly Glu Asn Asn Ala Glu Leu Asn205 210 215GCC CTG GCT AAA GCT ACT GTG AAA GAA CTT GCC TCA CTG CAC GGC ACC 768Ala Leu Ala Lys Ala Thr Val Lys Glu Leu Ala Ser Leu His Gly Thr220 225 230AAG TAC ACA TAT GGC CCG GGA GCT ACA ACA ATC TAT CCT GCT GCT GGG 816Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly Ala Thr Thr Ile Tyr Pro Ala Ala Gly235 240 245 250GGC TCT GAC GAC TGG GCT TAT GAC CAA GGA ATC AGA TAT TCC TTC ACC 864Gly Ser Asp Asp Trp Ala Tyr Asp Gln Gly Ile Arg Tyr Ser Phe Thr255 260 265TTT GAA CTT CGA GAT ACA GGC AGA TAT GGC TTT CTC CTT CCA GAA TCC 912Phe Glu Leu Arg Asp Thr Gly Arg Tyr Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser270 275 280CAG ATC CGG GCT ACC TGC GAG GAG ACC TTC CTG GCA ATC AAG TAT GTT 960Gln Ile Arg Ala Thr Cys Glu Glu Thr Phe Leu Ala Ile Lys Tyr Val285 290 295GCC AGC TAC GTC CTG GAA CAC CTG TAC CAC CAC CAT CAC CAC CAT GAG1008Ala Ser Tyr Val Leu Glu His Leu Tyr His His His His His His Glu300 305 310TTC GAG GAG CAG AAG CTG ATC TCT GAG GAG GAC CTG AAC TAATAA 1053Phe Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn315 320 325(2)SEQ ID NO47资料(i)序列特性(A)长度349氨基酸(B)类型氨基酸
(D)拓扑结构线型(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO47Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala-22 -20 -15 -10Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Thr Gly His Ser Tyr Glu Lys Tyr Asn-5 1 5 10Lys Trp Glu Thr Ile Glu Ala Trp Thr Gln Gln Val Ala Thr Glu Asn15 20 25Pro Ala Leu Ile Ser Arg Ser Val Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Ar930 35 40Ala Ile Tyr Leu Leu Lys Val Gly Lys Ala Gly Gln Asn Lys Pro Ala45 50 55Ile Phe Met Asp Cys Gly Phe His Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala60 65 70Phe Cys Gln Trp Phe Val Arg Glu Ala Val Arg Thr Tyr Gly Arg Glu75 80 85 90Ile Gln Val Thr Glu Leu Leu Asp Lys Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro95 100 105Val Leu Asn Ile Asp Gly Tyr Ile Tyr Thr Trp Thr Lys Ser Arg Phe110 115 120Trp Arg Lys Thr Arg Ser Thr His Thr Gly Ser Ser Cys Ile Gly Thr125 130 135Asp Pro Asn Arg Asn Phe Asp Ala Gly Trp Cys Glu Ile Gly Ala Ser140 145 150Arg Asn Pro Cys Asp Glu Thr Tyr Cys Gly Pro Ala Ala Glu Ser Glu155 160 165 170Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala Asp Phe Ile Arg Asn Lys Leu Ser Ser175 180 185Ile 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(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO52CCAACCAGCC ATGGCGCATC ATGGTGGTGA GCAC 34(2)SEQ ID NO53资料(i)序列特性(A)长度23碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO53GGCTGGATTC TCAGTGGCGA CTT 23(2)SEQ ID NO54资料(i)序列特性(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO54GGAGAAAGCC ATATCTGCCT G 21(2)SEQ ID NO55资料(i)序列特性(A)长度1284碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(ix)特征(A)名称/关键字CDS(B)位置1..1272(ix)特征(A)名称/关键字mat-肽(B)位置352..1272(xi)序列描述SEQ ID NO 55ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT 48Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala-117-115-110-105GCC CAA CCA GCC ATG GCG CAT CAT GGT GGT GAG CAC TTT GAA GGC GAG 96Ala Gln Pro Ala Met Ala His His Gly Gly Glu His Phe Glu Gly Glu-100-95 -90AAG GTG TTC CGT GTT AAC GTT GAA GAT GAA AAT CAC ATT AAC ATA ATC 144Lys Val Phe Arg Val Asn Val Glu Asp Glu Asn His Ile Asn Ile Ile-85 -80 -75 -70CGC GAG TTG GCC AGC ACG ACC CAG ATT GAC TTC TGG AAG CCA GAT TCT 192Arg Glu Leu Ala Ser Thr Thr Gln Ile 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AGC CGA TTT432Val Leu Asn Ile Asp Gly Tyr Ile Tyr Thr Trp Thr Lys Ser Arg Phe110 115 120TGG AGA AAG ACT CGC TCC ACC CAT ACT GGA TCT AGC TGC ATT GGC ACA480Trp Arg Lys Thr Arg Ser Thr His Thr Gly Ser Ser Cys Ile Gly Thr125 130 135GAC CCC AAC AGA AAT TTT GAT GCT GGT TGG TGT GAA ATT GGA GCC TCT528Asp Pro Asn Arg Asn Phe Asp Ala Gly Trp Cys Glu Ile Gly Ala Ser140 145 150CGA AAC CCC TGT GAT GAA ACT TAC TGT GGA CCT GCC GCA GAG TCT GAA576Arg Asn Pro Cys Asp Glu Thr Tyr Cys Gly Pro Ala Ala Glu Ser Glu155 160 165 170AAG GAG ACC AAG GCC CTG GCT GAT TTC ATC CGC AAC AAA CTC TCT TCC624Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala Asp Phe Ile Arg Asn Lys Leu Ser Ser175 180 185ATC AAG GCA TAT CTG ACA ATC CAC TCG TAC TCC CAA ATG ATG ATC TAC672Ile Lys Ala Tyr Leu Thr Ile His Ser Tyr Ser Gln Met Met Ile Tyr190 195 200CCT TAC TCA TAT GCT TAC AAA CTC GGT GAG AAC AAT GCT GAG TTG AAT720Pro Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys Leu Gly Glu Asn Asn Ala Glu Leu Asn205 210 215GCC CTG GCT AAA GCT ACT GTG AAA GAA CTT GCC TCA CTG CAC GGC 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NO64Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala-22 -20 -15 -10Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Thr Gly His Ser Tyr Glu Lys Tyr Asn-5 1 5 10Lys Trp Glu Thr Ile Glu Ala Trp Thr Gln Gln Val Ala Thr Glu Asn15 20 25Pro Ala Leu Ile Ser Arg Ser Val Ile Gly Thr Thr Phe Glu Gly Arg30 35 40Ala Ile Tyr Leu Leu Lys Val Gly Lys Ala Gly Gln Asn Lys Pro Ala45 50 55Ile Phe Met Asp Cys Gly Phe His Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala60 65 70Phe Cys Gln Trp Phe Val Arg Glu Ala Val Arg Thr Tyr Gly Arg Glu75 80 85 90Ile Gln Val Thr Glu Leu Leu Asp Lys Leu Asp Phe Tyr Val Leu Pro95 100 105Val Leu Asn Ile Asp Gly Tyr Ile Tyr Thr Trp Thr Lys Ser Arg Phe110 115 120Trp Arg Lys Thr Arg Ser Thr His Thr Gly Ser Ser Cys Ile Gly Thr125 130 135Asp Pro Asn Arg Asn Phe Asp Ala Gly Trp Cys Glu Ile Gly Ala Ser140 145 150Arg Asn Pro Cys Asp Glu Thr Tyr Cys Gly Pro Ala Ala Glu Ser Glu155 160 165 170Lys Glu Thr Lys Ala Leu Ala Asp Phe Ile Arg Asn Lys Leu Ser Ser175 180 185Ile Lys Ala Tyr Leu Thr Ile His Ser Tyr Ser Gln Met Met Ile Tyr190 195 200Pro Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys Leu Gly Glu Asn Asn Ala Glu Leu Asn205 210 215Ala Leu Ala Lys Ala Thr Val Lys Glu Leu Ala Ser Leu His Gly Thr220 225 230Lys Tyr Thr Tyr Gly Pro Gly Ala Thr Thr Ile Tyr Pro Ala Ala Gly235 240 245 250Gly Ser Arg Asp Trp Ala Tyr Asp Gln Gly Ile Arg Tyr Ser Phe Thr255 260 265Phe Glu Leu Arg Asp Thr Gly Arg Tyr Gly Phe Leu Leu Pro Glu Ser270 275 280Gln Ile Arg Ala Thr Cys Glu Glu Thr Phe Leu Ala Ile Lys Tyr Val285 290 295Ala Ser Tyr Val Leu Glu His Leu Tyr His His His His His His Glu300 305 310Phe Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn315 320 325(2)SEQ ID NO65资料(i)序列特性(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO65GGATTTGGGG GAGGAACCTG GCTTCTGCTG 30(2)SEQ ID NO66资料(i)序列特性(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO66Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser1 5(2)SEQ ID NO67资料(i)序列特性(A)长度8氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO67Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe1 5(2)SEQ ID NO68资料(i)序列特性(A)长度23碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO68GCAGCAGGAT AGATTGTTGT AGC 23(2)SEQ ID NO69资料(i)序列特性(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO69CAATCTATCC TGCTGCTGGG AACTCTCGCG 30(2)SEQ ID NO70资料(i)序列特性(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO70GGTCATAAGC CCAGTCTTTA GAGTTCCCAG 30(2)SEQ ID NO71资料(i)序列特性(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO71CTATCCTGCT GCTGGGAACT CTAAAGACTG 30(2)SEQ ID NO72资料(i)序列特性(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO72CAATCTATCC TGCTGCTGGG ACTTCTAAAG 30(2)SEQ ID NO73资料(i)序列特性
(A)长度28碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO73GGAATCAGAT ATTCCTTCGG CTTTGAAC28(2)SEQ ID NO74资料(i)序列特性(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO74GGAATATCTG ATTCCTTGGT C 21(2)SEQ ID NO75资料(i)序列特性(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO75CAATCTATCC TGCTGCTGGG TCTTCTAAAG 30(2)SEQ ID NO76资料(i)序列特性(A)长度20碱基对(B)类型核酸
(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO76GATTGTTGTA GCTCCCGGGC 20(2)SEQ ID NO77资料(i)序列特性(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO77GGAGCTACAA CAATCTATCC TAACGCTGGG 30(2)SEQ ID NO78资料(i)序列特性(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO78GGAGCTACAA CAATCTATCC TTTCGCTGGG 30(2)SEQ ID NO79资料(i)序列特性(A)长度25碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO79GGGTAGATCA TCATTTGGGA GTACG 25(2)SEQ ID NO80资料(i)序列特性(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO80CCAAATGATG ATCTACCCTT ACAACTATGC 30(2)SEQ ID NO81资料(i)序列特性(A)长度30碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO81CAATCTATCC TGCTGCTGGG ACTTCTCGCG 30(2)SEQ ID NO82资料(i)序列特性(A)长度23碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO82CATTTGGGAG TACGAGTGGA TTG 23(2)SEQ ID NO83资料(i)序列特性(A)长度25碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线型(ii)分子类型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO83CGTACTCCCA AATGATGACT TACCC 2权利要求
1.在人体中基本上是非免疫原性的一种结合物，包括能与肿瘤相关抗原结合的导向部分，该导向部分被连接到能将药物前体转变成抗肿瘤药物的突变型羧肽酶B(CPB)，其中所述药物前体在人体中不被天然非突变酶明显转变成抗肿瘤药物。
2.权利要求1的一种结合物，其中所述导向部分是一种抗体。
3.权利要求2的一种结合物，其中所述抗体是F(ab′)2抗体片段。
4.权利要求1-3的任何之一的一种结合物，其中所述酶被突变成在其活性部位中包含一种极性改变以使其能转变具有一种互补的极性药物前体。
5.权利要求4的一种结合物，其中所述酶是任何一种下述胰腺人CPB突变体具有氨基酸253天冬氨酸被精氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺或赖氨酸之任何一种所替换的胰腺人CPB，并非强制性地与一种或多种氨基酸替换相组合，所述替换选自天然氨基酸谷氨酰胺54被精氨酸，赖氨酸或天冬酰胺的任何一种替换；天然氨基酸天冬氨酸145被缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸或丙氨酸之任何一种替换；天然氨基酸异亮氨酸201被丝氨酸或苏氨酸之任何一种替换；天然氨基酸丝氨酸205被天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸赖氨酸或精氨酸之任何一种替换；天然氨基酸异亮氨酸245被丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，赖氨酸，精氨酸或组氨酸之任何一种替换；天然氨基酸丙氨酸248被天冬酰胺，谷氨酰胺，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，丝氨酸或苏氨酸之任何一种替换；天然氨基酸甘氨酸251被苏氨酸，天冬酰胺，丝氨酸，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸或正亮氨酸或之任何一种替换；和天然氨基酸半胱氨酸288被丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸或异亮氨酸之任何一种替换。
6.权利要求4的一种结合物，其中所述酶是下面胰腺人CPB突变体的任何一种具有天然氨基酸天冬氨酸253被精氨酸或赖氨酸之任何一种所替换和天然氨基酸甘氨酸251被苏氨酸，天冬酰胺，丝氨酸，谷氨酰胺，赖氨酸或缬氨酸之任何一种所替换的胰腺人CPB，非强制性地与一种或多种氨基酸替换相组合，所述替换选自天然氨基酸谷氨酰胺54被精氨酸替换；天然氨基酸天冬氨酸145被丙氨酸替换；天然氨基酸异亮氨酸201被丝氨酸替换；天然氨基酸丝氨酸205被天冬酰胺替换；天然氨基酸异亮氨酸245被丝氨酸，丙氨酸或组氨酸之任何一种替换；天然氨基酸丙氨酸248被组氨酸，丝氨酸或天冬酰胺之任何一种替换；和天然氨基酸半胱氨酸288被丝氨酸或丙氨酸之任何一种替换。
7.权利要求4的一种结合物，其中所述酶是下面胰腺人CPB突变体的任何一种具有天然氨基酸天冬氨酸253被精氨酸或赖氨酸之任何一种所替换和天然氨基酸甘氨酸251被苏氨酸，天冬酰胺或丝氨酸之任何一种所替换的胰腺人CPB非强制性地与一种或多种氨基酸替换相组合，所述替换选自天然氨基酸谷氨酰胺54被精氨酸替换；天然氨基酸天冬氨酸145被丙氨酸替换；天然氨基酸异亮氨酸201被丝氨酸替换；天然氨基酸丝氨酸205被天冬酰胺替换；天然氨基酸异亮氨酸245被丙氨酸替换；天然氨基酸丙氨酸248被丝氨酸或天冬酰胺之任何一种替换；和天然氨基酸半胱氨酸288被丝氨酸替换。
8.权利要求4的一种结合物，其中所述酶是下面胰腺人CPB突变体的任何一种D253K；D253R；[G251N，D253K]；[G251T，D253K]；[D253S，D253K]；[G251T，D253R]；[A248S，G251T，D253K]；[A248N，G251N，D253K]；[A248S，G251N，D253K]；或[S205N，G251N，D253K]。
9.设计用于一个宿主的一种匹配的双组分系统，其中所述组分包括(i)第一组分是能与肿瘤相关抗原结合的导向部分，该导向部分被连接到能将药物前体转变成抗肿瘤药物的CPB酶和；(ii)第二组分是在所述酶作用下可转变成抗肿瘤药物的药物前体；其中所述酶是CPB酶的一种突变型。第一组分在所述宿主内是基本非免疫原性和；所述药物前体在所述宿主内不被天然非突变宿主酶明显转变成抗肿瘤药物。
10.权利要求9的一种双组分系统，其中第一组分是在权利要求1-8的任何之一中定义的结合物并且该系统被设计用于人类宿主。
11.一种符合权利要求9或10中任何之一的双组分系统，其中第二组分包括在权利要求12b)或12d)中定义的药物前体之任何一种。
12.下述化合物或其药用盐之任何一种a)N-(4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-3-甲基-苯氧基}-苯甲酰基)-L-丙氨酸；b)N-[N-(4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-3-甲基-苯氧基}-苯甲酰基)-L-丙氨酸]-L-谷氨酸；c)N-(4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-苯氧基}-苯甲酰基)-L-丙氨酸；或d)N-[N-(4-{4-[双-(2-氯乙基)-氨基]-苯氧基}-苯甲酰基)-L-丙氨酸]-L-谷氨酸。
13.在权利要求1或4-8的任何之一中定义的突变型CPB酶。
14.能编码权利要求13中定义的突变型CPB酶的多核苷酸序列。
15.包含权利要求14中定义的多核苷酸序列的载体。
16.包含权利要求14中定义的多核苷酸序列的宿主细胞。
17.制备权利要求13中定义的突变型CPB酶的一种方法，它包括从权利要求16中定义的宿主细胞表达所述酶并至少非强制性部分纯化该酶。
18.包含权利要求9-10的任何中定义的第一组分和药物可接受载体或稀释剂的药物组合物。
19.包含权利要求9或11的任何中定义的第二组分和药物可接受载体或稀释剂的药物组合物。
20.一种制备结合物的方法，包含连接如权利要求1-3的任何之一中定义的能与肿瘤相关抗原结合的导向部分和能将药物前体转变成抗肿瘤药物的酶，其中所述酶是如权利要求1或4-8的任何之一中定义的宿主CPB酶的一种突变型。
21.如保存在国立工业与海洋微生物保藏中心(NCIMB)保藏号为NCIMB40694的质粒pCG330。
22.编码SEQ ID NO39中从109位起所定义的成熟人胰腺羧肽酶B或其在243位编码有半胱氨酸的突变体的核苷酸序列。
23.制备人胰腺羧肽酶B或其在243位编码有半胱氨酸残基的突变体的方法，其中该方法包括在在宿主细胞中表达编码SEQ ID NO39中从109位起所定义的成熟人胰腺羧肽酶B或其在243位编码有半胱氨酸残基的突变体的核苷酸序列。
24.一种处理宿主中的肿瘤细胞的方法，其中该方法包括给所述宿主以有效剂量的第一组分，使该第一组分基本在全身循环清除，并给予有效量的第二组分，其中该组分形成如权利要求9-11的任何之一中所定义的系统。
全文摘要
适合在癌症中使用的抗体引指导的酶药物前体治疗(ADEPT)系统,其以突变的羧肽酶B(CPB)酶为基础。适合于ADEPT的酶结合物在人体中基本上是非免疫原性的包括能与肿瘤相关抗原结合的导向部分(例如抗体),该导向部分与突变型CPB酶相连,后者能将药物前体转变成抗肿瘤药物,其中所述药物前体在人体中不被天然的非突变酶有效转变成抗肿瘤药物。一种优选的酶突变体是在其253位包含一个赖氨酸和一个精氨酸残基的人胰CPB。适合的芥子药物前体在本说明书中公开。
文档编号C07K19/00GK1193278SQ96196288
公开日1998年9月16日 申请日期1996年8月13日 优先权日1995年8月16日
发明者D·C·布拉克, D·H·达维斯, R·I·多维尔, J·F·亨纳, P·R·马沙姆, A·M·斯拉特尔, L·F·A·亨内奎 申请人:曾尼卡有限公司