特定的二核苷酸和它们作为粘膜纤毛清除和纤毛颤动频率调节剂的应用的制作方法

专利名称：特定的二核苷酸和它们作为粘膜纤毛清除和纤毛颤动频率调节剂的应用的制作方法
该申请是1997年2月10日提交的美国专利申请08／798，508的部分续展申请。
前言技术背景本发明涉及增加残留的粘液分泌物水化、刺激粘蛋白的产生和增加纤毛颤动频率以促进对剩余分泌物的清除的特定的二核苷酸。
背景技术：
慢性阻塞性肺病(COPD)在美国有一千五百万病人，是死亡的第六大原因。其特征在于粘液分泌物在肺部的残留。许多被诊断患有COPD的病人也有称为慢性支气管炎(CB)的疾病，每年600，000病人由于慢性支气管炎的急性发作而住院。囊性纤维变性和原发性纤毛运动障碍(PCD)是临床特点类似于COPD的肺病的例子。纤毛运动障碍不论是原发的或继发的，都会导致只能通过咳嗽清除的分泌物残留。
另一类特征在于残留粘液分泌物积聚的疾病是窦炎，它是一种典型地与上呼吸道感染有关的鼻旁窦炎症。窦炎是美国最常见的影响着估计为3千1百万人的保健方面的疾病。(A．Moss和V．Parsons，National Center for Health Statistics，198666-7．DHHS Publication No．(PHS)86-1588(1985))。
中耳炎(OM)主要是3岁以下的孩子中耳的病毒或细菌感染，上呼吸道感染常促使其发生，通过鼻咽和咽鼓管扩散到中耳。每年约有25，000，000-50，000，000次就诊来诊断和治疗中耳炎。到三岁时，约75％孩子至少发过一次急性中耳炎(J．Klein，Clin Infect Dis 19，823-33(1994))。用抗生素治疗后，中耳里积聚的液体还在，导致听力障碍并会延误潜在的语言和认知的发育。增加中耳分泌物的清除能力会降低或减少中耳炎的明显后遗症。
另外由残留分泌物导致的疾病是肺炎。由于各种原因而卧床的病人形成肺炎的危险性很大。尽管对其高度警戒并进行大量的介入治疗，每年仍有400，000以上的病人发生肺炎，具有明显的发病率和死亡率。
也有因治疗上的需要而增加泪腺系统排泪的情况。当泪腺排泪系统不能正常运行时，结果是过量流泪(泪溢)、脓性粘液排出和复发性泪囊炎。目前对鼻泪管阻塞的治疗最广泛的是进行侵入性的手术，研究者业已在找寻非侵入性的药物治疗方法。
通过类似于水化气道上皮机制的P2Y2和／或P2Y4嘌呤受体调节机制，可经泪腺附属组织来刺激泪液分泌。干眼病是由于角膜前泪膜异常产生的指症，其特征在于产生的泪液减少或泪膜蒸发增加，并有其导致的眼表面疾病。目前，干眼病的药物治疗主要局限于给予人工泪液(生理盐水)以使眼睛暂时再水化。但是，减轻是暂时的，需要经常给药。
通常情况下，粘液分泌物通过粘膜纤毛清除(MCC)系统除去。MCC依赖于三个步骤的整体行动1)杯状细胞和粘膜下层腺体的粘液分泌；2)上皮细胞上纤毛的运动，它驱使粘液穿过管腔表面；和3)离子经管腔上皮细胞输入和输出，它们共同控制水流入粘液。
现已知诸如尿苷5’-三磷酸盐(UTP)的核苷酸磷酸盐调节MCC系统的所有步骤。首先，UTP已显示能增加体外的杯状细胞分泌粘蛋白的速率和总量(M．Lethem等，Am J Respir Cell Mol Biol 9，315-22(1993))。第二，UTP已显示能在体外增加人气道上皮细胞纤毛颤动频率(D．Drutz等，Drug Dev．Res．37(3)，185(1996))。第三，UTP已显示在体外能增加Cl-的分泌，因此增加了来自气道上皮细胞的水分泌(S．Mason等，Br．J．Pharmacol．103，1649-56(1991))。另外，II型肺泡细胞能对UTP反应而释放表面活性剂(Gobran，Am．J．Physiol．267，L625-L633(1994))使肺部功能保持最佳，并有助于MCC最大化(M．Knowles等，N．Engl．J．Med．325，533-38(1991))。由于通过P2Y2受体对磷脂酶C的刺激，UTP已显示能增加细胞内的Ca++(H．Brown等，Mol．Pharmocol．40，648-55(1991))。
UTP对粘膜纤毛提升系统的所有步骤的调节导致正常志愿者的肺部粘膜纤毛清除率增加2．5倍，同时没有任何明显的副作用(K．Olivier等，Am J．Respir．Crit．Care Med．154，217-23(1996))。此外，UTP能明显增强PCD患者的咳嗽清除(经咳嗽清除残留的分泌物)(P．Noone等，Am．J．Respir．Crit．Care Med．153，A530(1996))。
由于UTP能增加剩余粘液分泌物清除能力，申请人研究是否其它核苷磷酸盐能有相同的治疗作用(若不是更高的话)。本发明基于该研究基础。
前述的二核苷酸及其相应的参考文献列于表Ⅰ。
表Ⅰ文献里的二核苷酸(括号里的数字相应于下面的参考文献)
A=腺嘌呤核苷eA=亚乙烯基腺嘌呤核苷U=尿嘌呤核苷m7G=7-甲基鸟嘌呤核苷G=鸟嘌呤核苷m2，7G=2，7-二甲基鸟嘌呤核苷T=胸腺嘧啶脱氧核苷 m2，2，7G=2，2，7-三甲基鸟嘌呤核苷X=黄嘌呤核苷NAD=烟酰胺核苷TAD=Tiazofurin C-NAD=C-烟酰胺核苷BAD=苯甲酰胺核苷C-PAD=C-吡啶酰胺核苷D=2，6-二氨基嘌呤 N=核苷(1)M．A．G．Sillero等，Eur．J．Biochem_76，331(1977)(2)C．G．Vallejo等，Biochim．Biophys．Acta，483，304(1976)(3)H．Coste等，J．Biol．Chem_262，12096(1987)(4)K．E．Ng等，Nucleic Acid Res_15，3573(1987)(5)J．Stepinski等，Nucleosides & Nucleotides，14，717(1995)(6)A．Zatorski等，J．Med．Chem_39，2422(1996)(7)P．Rotilan等，FEBS，280，371(1991)(8)P．C．Zamecnik等，Proc．Natl．Acad．Sci_89，2370(1992)(9)J．Walker等，Biochemistry，32，14009(1993)(10)R．H．Hiderman等，J．Biol．Chem_266，6915(1991)(11)J．Luthje等，Eur．J．Biochem_173，241(1988)(12)R．H．Silverman等，Microbiological Rev_43，27(1979)(13)C．D．Lobaton等，Eur．J．Biochem_50，495(1975)(14)G．Lowe等，Nucleosides & Nucleotides，10，181(1991)(15)G．M．Blackburn等，Nucleosides & Nucleotides，10，549(1991)(16)J．C．Baker等，Mutation Res_208，87(1988)(17)G．Klein等，Biochemistry，27，1897(1988)(18)E．Castro等，Br．J．Pharmacol_100，360(1990)(19)D．R．Elmaleh等，Proc．Natl．Acad．Sci_81，918(1894)(20)R．Bone等，J．Biol．Chem_261，16410(1986)(21)Fed．Amer．Soc．Exper．Bio_Abstr．第I部分，1878号(1991)(22)M．T．Miras-Portugal等，Ann．NY Acad Sci_603，523(1990)(23)A．Guranowski等，Biochemistry，27，2959(1988)(24)F．Grummt等，Plant Mol．Bio_2，41(1983)(25)A．G．McLennan等，Nucleic Acid Res_12，1609(1984)(26)P．Zamecnik等，Analytical Biochem_134，1(1983)(27)E．Rapaport等，Proc．Natl．Acad．Sci_78，838(1981)(28)T．Kimura等，Biol．Pharm．Bull_18，1556(1995)(29)E．Schulze-Lohoff等，Hypertension，26，899(1995)(30)B．K．Kim等，Proc．Natl．Acad．Sci_89，11056(1992)(31)P．C．Zamecnik等，Proc．Natl．Acad．Sci_89，2370(1992)(32)H．Morii等，Eur．J．Biochem_205，979(1992)(33)E．Castro等，Pflugers Arch_426，524(1994)(34)H．Schluter等，Nature，367，186(1994)(35)E．Castro等，Br．J．Pharmacol_206，833(1992)(36)T．Casillas等，Biochemistry，32，14203(1993)(37)J．Pintor等，J．Neurochem_64，670(1995)(38)E．Castro等，J．Biol．Chem_270，5098(1995)(39)V．A．Panchenko等，Neuroscience，70，353(1996)(40)E．Castro等，Br．J．Pharmacol_100，360(1990)(41)J．Pintor等，Gen．Pharmac_26，229(1995)(42)J．Pintor等，Br．J．Phamacol_115，895(1995)(43)A．Kanavarioti等，Tett．Lett_32，6065(1991)发明综述本发明提供了新颖的式I化合物及其药物组合物。本发明也提供了在清除剩余粘膜分泌物和增加纤毛颤动频率方面有用的化合物。因此，本发明的较宽的技术方案涉及通式I化合物或其药学上可接受的醇或盐式Ⅰ 其中X是氧、亚甲基、二氟亚甲基、酰亚氨基；n=0，1或2；m=0，1或2；n+m=0，1，2，3或4；和B和B’各自独立地代表各自通过9-或1-位连接的嘌呤残基或嘧啶残基；Z=OH或N3；Z’=OH或N3；Y=H或OH；Y’=H或OH；条件是当Z是N3时，Y是H，或当Z’是N3时，Y’是H；进一步的条件是表Ⅰ化合物排除在外。
本发明的化合物是对P2Y2和／或P2Y4嘌呤受体选择性很高的激动剂，这样，它们可用来治疗慢性阻塞性肺病，如慢性支气管炎，PCD和囊性纤维变性，也可用于治疗具有患肺炎危险的卧床病人。此外，由于本发明的化合物能清除剩余粘膜分泌物并刺激纤毛颤动频率，所以它们也可用于治疗窦炎、中耳炎和鼻泪管阻塞。它们也可用来治疗干眼病、视网膜脱落和伤口愈合。另外，由于这些化合物的药理作用，它们被用于引痰过程。另外，人们推定，本发明化合物通过增加来自肺粘膜的分泌物的清除能增加运动员的成绩。
发明详述本发明提供了新颖的式Ⅰ化合物及其药物组合物。本发明也提供了用于清除剩余粘膜分泌物并增加纤毛颤动频率的化合物。因此，本发明较宽的技术方案涉及通式Ⅰ的新颖化合物，及其药学上可接受的酯或盐式Ⅰ 其中X是氧、亚甲基、二氟亚甲基、酰亚氨基；n=0，1或2；m=0，1或2；n+m=0，1，2，3或4；和B和B’各自独立地代表各自通过9-或1-位连接的嘌呤残基或嘧啶残基；Z=OH或N3；Z’=OH或N3；Y=H或OH；Y’=H或OH；条件是当Z是N3时，Y是H，或当Z’是N3时，Y’是H；进一步的条件是表Ⅰ化合物排除在外。
呋喃糖优选地为β-构型。
呋喃糖最好为β-D-构型。
式Ⅰ优选的化合物是式IA化合物或药学上可接受的盐式IA 其中X=O；n+m=1或2；Z，Z′，Y和Y′=OH；B和B’是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤或如式Ⅱ和式Ⅲ中所定义的那样；X=O；n+m=3或4；Z、Z’、Y和Y’=OH；B=尿嘧啶；B’是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤或如式Ⅱ和式Ⅲ中所定义的那样；或X=O；n+m=1或2；Z、Y和Y’=OH；Z′=H；B=尿嘧啶；B’是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤或如式Ⅱ和式Ⅲ中所定义的那样；或
X=O；n+m=0，1或2；Z和Y=OH；Z’=N3；Y’=H；B=尿嘧啶；B’=胸腺嘧啶；或X=O；n+m=0，1或2；Z和Z’=N3；Y和Y’=H；B和B’是胸腺嘧啶；或X=CH2、CF2或NH；n和m=1；Z、Z’、Y和Y’=OH；B和B’是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤或如式Ⅱ和式Ⅲ中所示的那样；条件是表Ⅰ化合物排除在外。
另一组优选的式Ⅰ化合物是式IB化合物或其药学上可接受的盐式IB 其中X是氧、亚甲基、二氟亚甲基或酰亚氨基；n=0或1；
m=0或1；n+m=0，1或2；和B和B’各自独立地是如式Ⅱ所示的嘌呤残基，或如式Ⅲ所示的嘧啶残基，各自通过9-或1-位连接。当B和B’是尿嘧啶，在N-1位连接到核糖基部分时，则m+n可等于3或4，此时X为氧(参见实施例5)。核糖基部分如图所示为D-构型，但也可为L-，或D-和L-。D-构型是优选的。
式Ⅱ 其中R1是如下所定义的烷基或芳基部分，或是ω-A(C1-6烷基)CONH(C1-6烷基)-，其中A是氨基、巯基、羟基或羧基；R2是O(腺嘌呤1-氧化物衍生物)，或没有(腺嘌呤衍生物)；或R1和R2连接在一起形成5-元稠合的咪唑环(1，N6-亚乙烯基腺嘌呤衍生物)，任选地在亚乙烯基部分的4-或5-位被如下定义的烷基、芳基或芳烷基部分所取代；R3是如下所定义的烷基、芳基或芳烷基、烷氨基、芳氨基或芳烷基氨基(NHR’)；烷氧基、芳氧基或芳烷基氧基(OR’)；烷硫基、芳硫基或芳烷硫基(SR’)；或ω-A(C1-6烷基)CONH(C1-6烷基)B-，其中A和B独立地是氨基、巯基、羟基或羧基；或它们的药学上可接受的酯、酰胺或盐。
这样，取代的腺嘌呤衍生物包括腺嘌呤1-氧化物；1，N6-(4-或5-取代的亚乙烯基)腺嘌呤；6-取代的腺嘌呤；或8-取代的氨基腺嘌呤，其中6-或8-HNR’基团里的R’选自芳烷基(C1-6)，芳基部分如下所述被任意地官能化；烷基；和带有下列官能团的烷基，如([6-氨基己基]氨甲酰基甲基)-，和ω-酰基化的氨基(羟基、硫羟基和羧基)烷基(C2-10)和它们的ω-酰基化的氨基(羟基、硫羟基和羧基)，衍生物，其中酰基选自，但不限于，乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基、取代的-苯甲酰基等，或羧酸部分以其酯或酰胺衍生物形式存在，如乙基酯或甲基酯或其甲基、乙基或苯甲酰胺基衍生物。ω-氨基(羟基，硫羟基)部分可用C1-4烷基烷基化。
同样，B或B’，或两者可为通式Ⅲ的嘧啶，它们通过1-位连接，或其药学上可接受的酯、酰胺或盐式Ⅲ 其中R4是氢、羟基、巯基、氨基、氰基、芳烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基或二烷基氨基，烷基可任意地连接以形成杂环；R5是氢、酰基(如乙酰基或苯甲酰基)、C1-6烷基、芳酰基、随意地如下官能团化、C1-5链烷酰基、苯甲酰基或磺酸酯；R6是羟基、巯基、烷氧基、芳烷氧基、C1-6烷硫基、氨基、C1-5二取代氨基、三唑基、烷氨基或二烷氨基，其中烷基可任意地连接以形成杂环，或连接到N3上以形成随意取代的环；或R5和R6连接在一起，在亚乙烯基部分的4-位或5-位上任意被如下定义的烷基、芳基或芳烷基部分所取代的嘧啶环(3，N4-亚乙烯基胞嘧啶衍生物)的位置3和4位之间形成5-元稠合咪唑环。
R7是氢，羟基，氰基，硝基，烯基(其烯基部分任意与氧连接以形成环，所述的环在与氧相邻的碳上被烷基或芳基任意取代)取代炔基，卤素，烷基，取代烷基，全卤代甲基(如，CF3)，C2-6烷基，C2-3链烯基或取代乙烯基(如，烯丙基氨基、溴乙烯基和丙烯酸乙酯或丙烯酸)，C2-3炔基或取代炔基；或R6-R7通过在R6处的N或O一起形成5或6-元饱和或不饱和环，这类环可含本身含有官能团的取代基；条件是当R8是氨基或取代氨基时，R7是氢；和R8是氢，氨基或取代氨基，烷氧基，芳基烷氧基，烷硫基，芳基烷硫基，甲酰氨基甲基，羧甲基，甲氧基，甲硫基，苯氧基或苯硫基。
在上述Ⅱ和Ⅲ的通式里，酰基有利地包括链烷酰基或芳酰基。可为直链或支链的烷基有利地含有1-8个碳原子，特别是1-4个碳原子，它们可任意地被一个或多个合适的下述取代基所取代。芳基包括诸如芳氧基的芳基部分，优选的是被一个或多个如下所述的合适取代基所任意取代的苯基。上述链烯基和炔基有利地含2-8个碳原子，特别是2-6个碳原子，如乙烯基或乙炔基，它们可任意地被下述的一个或多个适当取代基所取代。
上述烷基、链烯基、炔基和芳基的合适取代基选自卤素、羟基、C1-4烷氧基、C1-4烷基、C6-10芳基、C7-12芳烷基、C7-12芳基烷氧基、羧基、氰基、硝基、磺酰氨基、磺酸酯、磷酸酯、磺酸、氨基和取代氨基，其中氨基被C1-4烷基单或双取代，当双取代时，烷基被随意地连接以形成杂环。
本发明化合物包括它们的药学上可接受的酯，如，但不限于乙酰基和苯甲酰基酯。可这样制备酯类使所需的羟基化合物与合适的酸反应，用羰基二咪唑、二环己基碳化二亚胺或其它合适的缩合剂活化，或与酸酐或酰氯在有或没有碱性催化剂，如叔胺、季铵盐或无机碱时进行反应。
本发明化合物也包括它们非毒性药学上可接受的盐，如，但不限于碱金属盐，如钠或钾盐；碱土金属盐，如锰、镁或钙盐；或铵盐或四烷基铵盐，即NX4+(其中X是C1-4)。药学上可接受的盐是保留了母体化合物所需的生物活性并没有不良毒性作用的盐。本发明也包括本文揭示化合物的酰化的前体药物(如酯类)。本技术领域人员会了解用来制备式I、IA和IB包含的化合物的非毒性的药学上可接受的盐和其酰化前体药物的各种合成方法。
本发明化合物是高选择性的P2Y2和／或P2Y4嘌呤受体的激动剂；这样它们可用来治疗哺乳动物，包括人体的慢性阻塞性肺病，如慢性支气管炎，PCD，囊性纤维变性以及预防由于卧床而发生的肺炎。此外，由于它们能清除剩余的粘膜分泌物并刺激纤毛颤动频率，本发明化合物也可用于治疗哺乳动物，包括人体的窦炎、中耳炎和鼻泪管阻塞。另外本发明化合物治疗哺乳动物，包括人体的干眼病和视网膜脱落也是有用的。
虽然本发明化合物主要涉及治疗人体对象，但它们也可用于治疗兽医的其它哺乳动物对象，如狗和猫。
P2Y2和其它P2Y受体活性的肌醇磷酸盐试验显示了本发明化合物在药物上的用途。该广泛应用的试验如E．Lazarowski等在Brit．J．Pharm．116，1619-27(1995)所述，依赖于测量肌醇磷酸盐的形成作为化合物活化通过G-蛋白与磷脂酶C连接的受体的活性的量度。
通式I、IA或IB化合物可口服，局部外用给药，非胃肠道给药，通过吸入或喷雾给药，手术时给药，直肠给药或阴道给药，可使用含常规非毒性的药学上可接受的载体、辅剂和赋形剂的剂型。本文使用的术语局部外用剂型包括膏药剂、凝胶剂、霜剂、软膏剂或滴鼻剂、滴耳剂或滴眼剂。本文术语非胃肠道给药包括皮下注射、静脉注射、肌内注射、胸骨内注射或输液技术。另外，本文也提供了包括通式I、IA或IB的化合物和药学上可接受载体的药剂。通式I、IA或IB的一种或多种化合物可与一种或多种非毒性的药学上可接受的载体或稀释剂或辅剂，和必需的其它活性组分共同存在。一种载体为糖类，其中化合物可通过玻璃化密切地掺入基质，或只是简单地与载体(如，乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇)或其它肺部或气道给药可接受的赋形剂混合。
通式I、IA或IB的一个或多个化合物可分开给药，或一起给药，或与诸如DNAse或乙酰半胱氨酸的粘液溶解药分开或一起给药。
含通式I、IA或IB化合物的药物组合物可为适合口服使用的剂型，如片剂、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散粉末或颗粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊、或糖浆剂或酏剂。根据制备药物组合物的技术领域的任何公知方法来制备口服组合物，这类组合物可含有一种或多种选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的物质，以得到优质可口的药剂。片剂含有活性组分及与之混合的非毒性的、药学上可接受的、适合用于制备片剂的赋形剂。这些赋形剂可为，如，惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，如，玉米淀粉或藻酸；粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可不包衣，或用已知技术进行包衣以延缓其在胃肠道里的崩解和吸收，从而在较长的时间里提供缓释作用。例如，可使用诸如诸如甘油基单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯的时间延缓材料。
口服制剂也可为硬明胶胶囊，其中活性组分与惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或可为软明胶胶囊，其中活性组分与水或油介质，如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
水性悬浮液含有活性材料和与之混合的适合制备水性悬浮液的赋形剂。这类赋形剂是悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素和藻酸钠。分散剂或湿润剂可为天然磷脂或丙炔化氧与脂肪酸的缩合产物，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯的缩合产物，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的缩合产物。本技术领域人员知道许多特定的本说明书提及的赋形剂和湿润剂。水性悬浮液也可含有一种或多种防腐剂，如对-羟基苯甲酸乙酯或正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。
适合通过加入水制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒剂包括活性组分和与之混合的分散剂或湿润剂，悬浮剂和一种或多种防腐剂。合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂已在上面进行了例举。也可存在另外的赋形剂，如，甜味剂、调味剂和着色剂。
通式I、IA或IB可用无菌介质经非胃肠道给药。根据所用的赋形剂和浓度，药物可悬浮于或溶于赋形剂。有利的是，诸如局部麻醉药、防腐剂和缓冲剂的辅剂可溶于赋形剂。无菌可注射的制剂可以是在非毒性非胃肠道可接受的稀释剂或溶剂里的无菌可注射的溶液或悬浮液。在这些可接受的赋形剂和溶剂中可被使用的是灭菌水、盐水溶液或Ringer溶液。
通式I、IA或IB化合物也可以栓剂形式对耳、直肠或阴道给药。可通过使药物与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述的赋形剂在常温下是固体，但在体温下是液体，并因此熔融而释放药物。这类材料是可可脂和聚乙二醇。
通式I、IA或IB化合物溶液可通过手术时置入进行给药。
约10-7M到约10-1M，优选的是10-5到10-1M级别的剂量水平用来治疗上述疾病。可与载体材料混合得到单位制剂的活性组分用量根据治疗对象和特定的给药方式而定。但是，应当明白，针对特定病人的特定剂量水平应当根据各种因素，包括使用的特定化合物的活性，年龄，体重，一般健康状况，性别，饮食、给药时间，给药途径和分泌速率，合并给药情况和进行治疗的特定疾病的严重程度而定。
可这样制备本发明包含的化合物用缩合剂，如，但不限于，羰基二咪唑或二环己基碳化二亚胺使核苷单-、双-或三磷酸盐活化，并与第二分子的相同或不同的单-、双-或三磷酸盐反应以形成所需的二核苷酸多磷酸盐；或如上活化的核苷磷酸盐接着与非-核苷单-、双-或多磷酸盐部分，如，但不限于单磷酸盐或焦磷酸盐阴离子进行缩合反应，得到所需的二核苷酸多磷酸盐，该情况下的未分离的中间体为单核苷酸多磷酸盐；或如上所活化的单-、双-或多磷酸盐部分，或为酰卤或有亲核取代反应性的其它衍生物的形式，可接着与核苷磷酸盐或多磷酸盐进行缩合，得到所需的二核苷酸多磷酸盐；或者可通过在嘌呤、嘧啶或糖环上的一个部分或多个部分进行取代或衍生化来修饰预先形成的二核苷酸多磷酸盐形成所需的二核苷酸多磷酸盐。用作起始材料的核苷磷酸盐可是市售的，或可通过本技术领域公知的方法从相应的核苷制得。同样，若核苷购买不到，它们可通过对其它易得的核苷进行修饰来制备，或通过本技术领域周知的方法从杂环和糖前体合成得到。
本技术领域人员可以知道，如下列实施例所示，可以改变起始物质并使用另外的步骤以产生本发明化合物。在一些情况下可能必须保护特定的反应性官能团以达到上述转变。总之，对这类保护基团的需要及连接和除去这类基团的条件对有机合成技术领域人员是显而易见的。
本发明通过下列实施例作进一步阐述，下列实施例并非用来限定本发明的范围或精神。
实施例1制备P1，P4-二(尿苷5’-)P2，P3-亚甲基四磷酸盐加入三丁胺(24微升，0．1毫摩尔)使亚甲基二膦酸(Aldrich，0．0088克，0．05毫摩尔)溶于无水DMF(0．5ml)。用无水DMF(2×1毫升)蒸发溶液至干两次，干燥的残留物溶于无水DMF(0．5毫升)，加入类似干燥的尿苷5’-单磷酰吗啉(monophosphomorpholidate)4-吗啉-N，N’-二环己基甲脒盐(Sigma，0．137克，0．2毫摩尔)在无水DMF(0．5毫升)中的溶液。使反应混合物在80-90℃下加热7小时；然后通过减压蒸发除去溶剂。残留物溶于水(2毫升)，加于碳酸氢盐形式的DEAE纤维素柱(2．5×50cm床体积)上。柱用水洗脱，然后用碳酸氢铵(0-0．33M，900毫升)梯度洗脱。然后监测洗脱进程，测定洗脱液在254纳米处的吸收；收集0．23和0．26M之间的洗脱组分，蒸发至于，通过用去离子水重复蒸发来脱盐。每50微升一份的残留物溶于水(300微升)并通过半制备HPLC纯化(Alltech PEI 5μ，10×250mm，梯度0-0．66M碳酸氢铵，5．0ml／分钟，20分钟)；每次洗脱在8．7-9．0分钟内的流出峰合并后，冻干得到标题化合物(0．007毫摩尔，14％得率，通过将其在λ最大263处的吸收度与尿苷单磷酸盐的标准溶液比较进行定量)。在AlltechPEI柱上的色谱纯度为96．5％，梯度为0-0．66M的碳酸氢铵，1．0ml／分钟，20分钟保留时间13．03分钟。1H NMR在D2O中(δppm，内标为四甲基甲硅烷)2．39(t，J=21．5Hz，2H)；4．12(m，6H)；4．243(m，4H)；5．841(d，J=7．9Hz，2H)；5．847(d，J=4．5Hz，2H)；7．77(d，J=8．1Hz，2H)。31P NMR在D2O中(δppm，内标H3PO4)-10．2到-10．7(复杂的m，2P)；7．8到8．4(复杂的m，2P)。
实施例2P1，P4-二(尿苷-5’-P2，P3-二氟亚甲基四磷酸盐)使二氟亚甲基二磷酸的三丁基铵盐(如C．McKenna等，J．Org．Chem．46，4574-76(1981)和D．Burton等，J．Fluorine Chem．15，263-66(1980所述)(0．014克，0．025毫摩尔)。如亚甲基磷酸所述转化生成，溶于尿苷5’-单磷酰吗啉4-吗啉-N，N’-二环己基甲脒盐(Sigma，0．034克，0．05毫摩尔)在无水二甲亚砜(0．7毫升)里的溶液，并在50℃下加热9天。冷却的反应混合物用水稀释并加于碳酸氢盐形式的DEAE纤维素柱(2．5×50cm床体积)上。柱用水洗脱，然后用碳酸氢铵(0-0．33M，总体积900毫升)梯度洗脱。然后监测流出进程，测定洗脱液在254纳米处的吸收；收集0．29和0．30M之间的洗脱组分，蒸发至干，通过用去离子水重复蒸发来脱盐，以得到标题化合物(0．0011毫摩尔，4．4％得率，通过将其在λ最大263处的吸收度与尿苷单磷酸盐的标准溶液比较进行定量)。在Alltech PEI柱上的色谱纯度为88．5％(梯度为0-0．66M碳酸氢铵，1．0ml／分钟，20分钟)，保留时间12．03分钟。1H NMR在D2O中(δppm，内标四甲基甲硅烷)4．05-4．085(m，6H)；4．18-4．20(m，4H)；5．80(d，J=8．0Hz，2H)；5．81(d，J=4．5Hz，2H)；7．77(d，J=7．9Hz，2H)。31P NMR在D2O中(δppm 内标 H3PO4)-10．63(dd，J=18．3，11．3Hz，2P)；-5．83(tdd，J=75，18．3，11．3Hz，2P)。19F NMR 在D2O中73．406(t，J=75．5Hz)。
实施例3制备P1，P4-二(尿苷5’-P2，P3-酰亚氨基四磷酸盐)将酰亚氨基二磷酸四钠(Sigma，0．05毫摩尔)溶于水(0．5ml)并加于三丁胺形式的Biorad AG-MP50强阳离子交换树脂(2毫升床体积，3meq)柱上。柱用水(～10毫升)洗脱，洗脱液通过与无水DMF蒸发冻干。在室温下用酰亚氨ad fg磷酸四丁基qpv(0．05毫摩尔)在无水DMF(1．0毫升)中的溶液处理尿苷5’-单磷酰吗啉4-吗啉-N，N’-二环己基甲脒盐(Sigma，0．068克，0．1毫摩尔)达20天，进行基本如上所述的分离得到标题化合物的铵盐(1．6％)。1H NMR在D2O中(δppm，内标四甲基甲硅烷)4．07-4．09(m，6H)；4．17-4．22(m，4H)；5．79(d，J=8．1Hz，2H)；5．80(d，J=4．8Hz，2H)；7．78(d，J=8．2Hz，2H)。31P NMR在D2O中(δppm，内标H3PO4)-10．82(m，4p)；类似于在相同的条件下得到的P1，P4-二(腺苷5’-四磷酸盐)(Sigma)的P-P偶合类型。
实施例4制备P1，P4-二(4-硫代尿苷5’-四磷酸盐)将4-硫代尿苷单磷酸钠(Sigma，25毫克，0．057毫摩尔)溶于水(0．5毫升)，加到三丁胺形式的Biorad AG-MP50强阳离子交换树脂柱上(2毫升床体积，3meq)，柱用水洗脱(～10毫升)，冻干洗脱液。将三丁铵盐溶于无水DMF(0．5毫升)，加入羰基二咪唑(4．86毫克，0．03毫摩尔)。在氮气下于室温使反应混合物放置12天。在真空、室温下使反应混合物蒸发至干，残留物溶于水(2毫升)，加于碳酸氢盐形式的DEAE纤维素柱(2．5×50cm床体积)上。柱用水(～250毫升)洗脱，然后用碳酸氢铵(0-0．33M，总体积900毫升)梯度洗脱，然后用400毫升以上的0．33到0．5M碳酸氢铵梯度洗脱。跟踪流出进程，可监测洗脱液在280纳米处的吸收；收集0．336和0．339M之间的洗脱组分，蒸发至干，通过用去离子水重复蒸发来脱盐得到标题化合物(0．0045毫摩尔，18％得率，通过将其在λ最大332nm处的吸收与4-硫代尿苷二磷酸盐的标准溶液比较进行定量)。1H NMR在D2O中(δppm，内标四甲基甲硅烷)4．09-4．11(m，6H)；4．18-4．24(m，4H)；5．76(d，J=4．5Hz，2H)；6．47(d，J=7．7Hz，2H)；7．67(d，J=8．2Hz，2H)。31P NMR在D2O中(δppm，内标H3PO4)-22．57到-22．73(m，2p)；-10．76到-10．91(m，2P)；类似于在相同的条件下得到的P1，P4-二(腺苷5’-四磷酸盐)(Sigma)的P-P偶合类型。
实施例5制备P1，P5-二(尿苷5’-五磷酸盐)向100毫升圆底烧瓶中加入尿苷5’-二磷酸三丁基铵盐(1．81毫摩尔，10毫升)和羰基二咪唑(469毫克，2．90毫摩尔)的DMF溶液，使溶液在N2下搅拌2小时。向内加入尿苷5’-三磷酸三丁基铵盐(1．81毫摩尔，10毫升)的DMF溶液，让溶液在60℃下搅拌24小时。真空蒸发溶液，通过柱色谱纯化两次(DEAE Sephadex；H2O＞0．5M NH4HCO3梯度洗脱)。在35℃下真空浓缩纯净流，加入H2O，再蒸发共0次得到白色固体(200毫克)。1H NMR在D2O中(δppm，内标四甲基硅烷)4．0(m，br，6H)，4．1(m，4H)，5．7(m，4H)，7．7(d，J=8．1Hz，2H)；31P NMR在D2O中(δppm，内标H3PO4)-22．3(m，3P)，-10．6(d，J=42．9Hz，2P)。
实施例6制备P1，P4-二(3，N4-亚乙烯基胞苷5’-)四磷酸盐向P1，P4-二(胞苷5’-)四磷酸盐(参照物3，表Ⅰ；铵盐，6微摩尔，在0．66毫升水中)加入碳酸氢钠(0．005克，60微摩尔)，冻干溶液以除去氨。残留物溶于水(0．2毫升)和氯乙醛溶液(50％在水中，0．30毫升)的混合物，使反应混合物在室温下放置6天。冻干反应混合物，胶状残留物在氧化氘(0．7毫升)和二氯甲烷(1．5毫升)之间分配。水溶液的1H NMR谱表明乙烯基化进行了约50％，而31P谱表明四磷酸盐链是完整的。将另外的氯乙醛溶液(0．25ml)加到NMR溶液里，让混合物再放置10天。冻干溶液，再用氧化氘冻干残留物以除去可交换的质子。如前所述，残留物在氧化氘和二氯甲烷之间分配，由NMR谱证明已完全转化为乙烯基衍生物。将氧化氘溶液加到碳酸氢盐形式的DEAE纤维素柱(2．5×50cm床体积)上。柱用水(～250毫升)洗脱，然后用1000毫升以上的0到0．5M的碳酸氢铵梯度洗脱。跟踪流出进程，监测洗脱液在280纳米处的吸收；收集0．29和0．32M之间的洗脱流分，蒸发至干，通过用去离子水重复蒸发来脱盐得到标题化合物(1．584微摩尔，26．4％得率，通过将其在λ最大273处的吸收度与3，N4-亚乙烯基胞苷5’-单磷酸盐的标准溶液比较进行定量)。1H NMR在D2O中(δppm，内标四甲基甲硅烷)4．123(m，6H)；4．258(m，4H)；5．986(s，2H)；6．92(d，J=8．1Hz，2H)；7．461(s，2H)；7．772(s，2H)；8．00(d，J=7．6Hz，2H)。31P NMR在D2O中(δppm，内标H3PO4)-22．474(m，2P)；-10．650(m，2P)；极为类似于在相同的条件下得到的P1，P4-二(腺苷5’-四磷酸盐)(Sigma)的P-P偶合类型。
实施例6(a)P1，P4-二(咪唑并[1，2-c]嘧啶-5(6H)-酮-2-(3-硝基)-苯基-6-β-D-核呋喃糖核苷5’-)四磷酸盐，四铵盐将P1，P4-二(胞苷5’-)四磷酸四铵盐(100毫克，0．117毫摩尔)(参照物3，表I)溶于水(10毫升)，经Dowex 50H+树脂柱(3克，用甲醇和水预洗)冲洗，并用50毫升水洗涤。加入三丁胺(1毫升)和二甲基甲酰胺(DMF)(5毫升)，蒸发溶液得到油。将油溶于无水DMF(10毫升)，蒸发周期重复两次。最终的油溶于无水DMF(10毫升)和三丁胺(1．5毫升)中，再加入α-溴-3’-硝基-乙酰苯(86毫克，0．351毫摩尔)。在氮气下使反应混合物在70℃下加热20小时，此时再加入α-溴-3’-硝基-乙酰苯(50毫克，0．205毫摩尔)。再加热18小时后，真空蒸去溶剂，残留物经快速色谱纯化(DEAE Sephadex，0＞1．0M NH4HCO3)得到黄色固体(13．5mg)1HNMR(D2O，TMS)δ4．0-4．2(m，br，10H)，6．0(d，J=5．7Hz，2H)，6．4(d，J=8．1Hz，2H)，7．35(t，J=7．8Hz，2H)，7．5(d，J=8．1Hz，2H)，7．80(m，3H)，8．03(s，2H)；31P NMR(D2O，H3PO4std)δ-10．67(m，2P)，-22．26(m，2P)。
实施例7P1-(胸苷-5’-)P4-(尿苷-5’-)四磷酸盐(UP4T)使尿苷5’-三磷酸(UTP)三钠盐(PtoBioSint，5．86克，0．01摩尔)在水(5毫升)里的溶液经过三丁胺形式的BioRad AG-MP 50强阳离子交换树脂柱(50毫升床体积)，用蒸馏水(约300毫升)洗脱。向该溶液中加入三丁胺(5毫升)，振摇悬浮液，直至水溶部分的pH升到8。分离各层，将水性溶液蒸发到较少的体积，然后冻干过夜。将残留物溶于无水二甲基甲酰胺(DMF，20毫升)，在0．1mmHg下蒸发溶剂。用无水丙酮溶解干燥的三丁胺盐，使成100毫升，得到储备溶液(0．1MUTP)。将二环己基碳化二亚胺(DCC)(Baker，0．1克，0．5毫摩尔)加到前述的UTP溶液的一份中(1．0ml，0．1毫摩尔)，使溶液在室温下搅拌30分钟。通过过滤除去沉淀下来的二环己基脲，用醚(10毫升)萃取反应混合物，将残留物溶于无水氘化的二甲亚砜(DMSO-d6，0．3毫升)。将这一尿苷5’-环偏磷酸盐(UcTP)溶液加到胸苷5’-单磷酸盐(TMP，0．064克，0．2毫摩尔)和三丁胺(0．2ml)在DMSO-d6(0．3毫升)中的溶液，在50℃下放置24小时。高真空下使反应混合物蒸发过夜，残留物溶于水(1．0毫升)，过滤以除去残留的二环己基脲，通过半制备性离子交换色谱分离(Hamilton PRP X-100柱，用等浓度的1．0M碳酸氢铵洗脱，5毫升／分钟，30分钟，多次注射100微升)。二核苷四磷酸盐在21到23分钟之间洗脱出来；通过将其在λ最大263nm处的紫外吸收与UMP和TMP标准品比较对产物定量(11．1％得率，以UTP为基)。1H NMR(D2O，内标四甲基甲硅烷，δppm)1．78(s，3H)；2．19-2．22(m，2H)；4．04-4．13(m，6H)，4．22-4．27(m，2H)；4．52(m，被D2O部分掩盖)；4．74(m，被D2O部分掩盖)；5．83(d，J=8．1Hz，1H)；5．84(d，J=5．0Hz，1H)；6．195(t，J=6．9Hz，1H)；7．61(s，1H)；7．82(d，J=8．1Hz，1H)。31P NMR(D2O，内标H3PO4δ5ppm)-22．71(m，2P)；-10．97(m，2P)。
实施例8P1-(肌苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4I)除了在蒸去溶剂前将反应混合物在25℃下放置5周外，其它基本按照如上所述尿苷5’-环三偏磷酸盐(UcTP)和肌苷5’-单磷酸盐的缩合。将残留物溶于水(1．0毫升)，过滤，通过在Hamilton PRP X-100柱的离子交换色谱，用等浓度的1．0M碳酸氢铵洗脱，5毫升／分钟，持续30分钟，以每分150微升的一系列等分进样。蒸发6-9分钟之间洗脱的流分，冻干过夜以除去缓冲剂。通过将其在260nm处的紫外吸收与UMP和TMP品比较对二核苷四磷酸盐定量(8％得率，HPLC(AUC)测得96％纯度)。1H NMR(D2O，内标四甲基甲硅烷，δppm)4．13(m，6H)；4．24-4．27(m，2H)；4．47(m，被D2O部分掩盖)；5．78(d，J=7．9Hz，1H)；5．83(d，J=4．7Hz，1H)；6．003(d，J=5．7Hz，1H)；7．79(d，J=7．9Hz，1H)；8．10(s，1H)；8．37(s，1H)。31P NMR(D2O，内标H3PO4，δppm)-22．43(m，2P)；-10．72(m，2P)。
实施例9P1-(4-硫代尿苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4(4-SH-U))将4-硫代尿苷单磷酸钠(25毫克，0．057毫摩尔)溶于水(0．5毫升)，加在三丁胺形式的BioradAG-MP50强阳离子交换树脂(2毫升床体积，3毫当量)柱上，用水(～10毫升)洗脱柱，冻于洗脱液。将所得的4-硫代-UMP的三丁胺盐与尿苷5’-环三偏磷酸盐(0．1毫摩尔)缩合，基本上如实施例7所述，用二环己基碳化二亚胺(206毫克)活化UTP来制备所述的尿苷5’-环三偏磷酸盐(72小时反应时间)。从反应混合物蒸去DMSO后，将残留物溶于水(～1毫升)，在Hamilton PRP X-100柱上通过离子交换色谱，用等浓度的1．0M碳酸氢铵洗脱，5毫升／分钟，每份分离200μl。在328纳米处监测。冻干在15-25分钟流出的流分，得到标题化合物(9．7％得率，HPLC(AUC)测得为99．7％纯度)，通过将其在332nm处的紫外吸收与4-硫代-UMP在相同波长下的吸收比较对其定量。1H NMR(D2O，内标四甲基甲硅烷，δppm)4．04(m，被HOD部分掩盖重叠)；4．14(m，被HOD部分重叠)；5．72(m，3H)；6．42(d，J=7．4Hz)；7．55(d，J=7．6Hz)；7．70(d，J=8．1Hz)。31P NMR(D2O，内标H3PO4，δppm)-20．88(m，2P)；-9．27(m，2P)。
除了用己烷代替醚从反应混合物里萃取过量DCC外，实施例10-12基本按照实施例7所述从尿苷5’-环三偏磷酸盐(0．1毫摩尔)和相关的核苷5’-单磷酸盐(0．2毫摩尔)制备。
实施例10P1-(胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐，(UP4araC)(20毫克)；1H NMR(D2O)，δ4．30-3．95(m，10H)，5．99(d，J=6．7Hz，1H)，6．08(d，J=5．2Hz，1H)，7．82-7．77(m，2H)；31P NMR(D2O)δ-10．79(m，2P)，-22．52(m，2P)。
实施例11P1-(尿苷5’-)-P4-(黄苷5’-)四磷酸盐(UP4X)(27．7毫克)；1H NMR(D2O)，δ4．50-4．40(m，10H)，5．80-5．70(m，3H)，7．70(d，J=8．0Hz，1H)，7．88(s，1H)；31PNMR(D2O)δ-10．73(m，2P)，-22．41(m，2P)。
实施例12P1-(2’-脱氧尿苷5’-)-P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4dU)(40．6毫克)；1H NMR(D2O)，δ2．20-2．15(m，2H)，4．45-3．95(m，9H)，5．80-5．74(m，3H)，6．12(t，J=6．7Hz，1H)，7．80-7．74(m，2H)；31P NMR(D2O)δ2．9(m，2P)，-8．9(m，2P)。
实施例13P1-(3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷5’-)-P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4(AZT))和实施例14，P1，P4-二(3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷5’-)四磷酸盐，(AZT)2P4将3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷5’-单磷酸(AZTMP)钠盐(50毫克，0．135毫摩尔)溶于水(1毫升)，加在三丁胺形式的Biorad AG-MP50强阳离子交换树脂柱上。柱用水(～10毫升)洗脱，冻干洗脱液。所得的三丁胺盐与尿苷5’-环三偏磷酸盐(0．1毫摩尔)缩合，基本如实施例7所述通过用二环己基碳化二亚胺(206毫克)活化UTP可制备所述的尿苷5’-环三偏磷酸盐。蒸发反应混合物后的残留物溶于水(1．0毫升)，通过0．45μ的注射过滤器以除去少量固体，滤液经Hamilton PRP X-100柱的制备性HPLC，用1．0M碳酸氢铵(75％)和甲醇(25％)(4毫升／分钟)的等浓度混合液洗脱。冻干在5-8分钟之间洗脱的流分以得到UP4(AZT)(7．9％)，通过将其在264纳米处的紫外吸收与UMP和TMP在相同波长处的吸收比较进行定量。1H NMR(D2O，内标四甲基甲硅烷，δppm)1．78(s，3H)；2．30-2．34(m，2H)；4．07-4．14(m，6H)；4．22-4．29(m，2H)；4．52(m，1H)；5．82(d，J=4．4Hz，1H)；5．84(d，J=8．1Hz，1H)；6．12(t，J=7Hz，1H)；7．62(s，1H)；7．81(d，J=8．1Hz，1H)。31P NMR(D2O，δppm，内标H3PO4)-22．51(m，2P)，-11．06(m，1P)；-10．81(m，1P)。
收集和冻干同一反应混合物在25-40分钟之间洗脱出的流组分，得到P1，P4-二(3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷5’-)四磷酸盐(3％)，通过将其在266纳米处的紫外吸收与TMP在相同波长处的吸收比较进行定量。1H NMR(D2O，内标四甲基甲硅烷，δppm)1．80(s，6H)；2．31-2．35(m，4H)；4．09-4．11(m，6H)；4．46-4．47(m，2H)；6．12(t，J=7Hz，2H)；7．63(s，2H)。31P NMR(D2O，δppm，内标H3PO4)-22．47(m，2P)，-11．35(m，2P)。
实施例14P1，P6-二(尿苷-5’-)六磷酸盐(U2P6)在相似的条件下使尿苷环三偏磷酸盐与尿苷5’-三磷酸盐反应形成二核苷六磷酸盐(6．97％)。1H NMR(D2O，内标四甲基甲硅烷，δppm)4．06-4．19(m，6H)；4．21-4．26(m，4H)；5．78(d，J=8．2Hz，2H)；5．81(d，J=5．4Hz，2H)；7．78(d，J=8．1Hz，1H)。31PNMR(D2O，δppm，内标H3PO4)-22．41(m，4P)；-10．89(m，2P)。
实施例15和162’(3’)-苯甲酰基-P1，P4-二(尿苷5’-)四磷酸盐(实施例15)和P1，P4-二(2’(3’)-苯甲酰基尿苷5’-)四磷酸盐(实施例16)在无水DMF(1毫升)里合并苯甲酸(61．7毫克，0．505毫摩尔)和1，1-羰基二咪唑(81．8毫克，0．505毫摩尔)，在室温下搅拌1小时。加入在无水DMF(2毫升)里的P1，P4-二(尿苷5’-)四磷酸盐(97毫克，0．102毫摩尔)，使混合物在室温下搅拌4小时。将温度升高到35℃，继续搅拌6天。将反应混合物蒸发至干，溶于水，加到Sephadex DEAE A25柱(2．5×20厘米)，用碳酸氢铵(0-0．3M，400毫升总体积)梯度洗脱，然后用等浓度的碳酸氢铵(0．5M，500毫升)洗脱。收集两个流分，蒸发至干，然后重复用水共同蒸发以除去铵盐。较早洗脱出的物质被鉴定为单苯甲酰基酯1H NMR(D2O)δ4．0-4．23(m，9H)，5．35-5．45(m，1H)，5．65-5．85(m，3H)，5．98-6．02(m，1H)，7．32-7．95(m，7H)；31P NMR(D2O)δ-10．70(m，2P)，-22．28(m，2P)较晚洗脱的物质被鉴定为二苯甲酰基酯1H NMR(D2O)δ4．05-4．40(m，8H)，5．30-6．05(m，6H)，7．2-7．95(m，12H)；31P NMR(D2O)δ-10．70(m，2P)，-22．45(m，2P)。
实施例17，18，19和20P1-(2’-脱氧鸟苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4dG)(实施例17)P1-(2’-脱氧腺苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4dA)(实施例18)P1-(2’-脱氧肌苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4dI)(实施例19)P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4dC)(实施例20)使在水(18毫升)中的尿苷5’-三磷酸盐(5．0克)通过Dowex 50H+柱，将三丁胺(3．0g)加到洗脱液里。浓缩混合物得到油，加无水DMF蒸发干燥，再溶于无水DMF(18毫升)。加入二环己基碳化二亚胺(DCC，3．5克)，使溶液在室温下搅拌30分钟，通过过滤除去沉淀。滤液中加入己烷(70毫升)，分离下层，再用己烷(70毫升)洗涤以彻底除去DCC。该尿苷5’-环偏亚磷酸盐(UcTP)溶液用于下列实验实施例17P1-(2’-脱氧鸟苷5’-)-P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4dG)
将2’-脱氧鸟苷5’-单磷酸盐(d-GMP，Sigma，500毫克)溶于DMF(4．5ml)，加入三丁胺(1．0ml)，真空浓缩溶液至油状。加入尿苷5’-环偏磷酸盐(UcTP，如上述)溶液的三分之一，使溶液在40℃下加热24小时。溶液蒸发到油状，溶于水(10毫升)，加到以0．25M碳酸氢铵预平衡的碳酸氢盐形式的Sephadex DEAE(350ml，4．5×22cm)柱上。柱依次用0．25，0．30，0．35，0．40和0．50M碳酸铵盐洗脱。洗脱液用HPLC监测(SynchroPak AX-300，75％0．5MKH2PO4，25％MeCN1．0ml／分钟，UV254nm)，浓缩含UP4dG的流分得固体，然后与水共蒸发6-7次，得到二核苷酸铵盐的橙黄色固体(140毫克，用HPLC(AUC)估计纯度为94％)。
实施例18P1-(2’-脱氧腺苷5’-P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4dA)基本如上所述，使2’-脱氧腺苷5’-单磷酸盐(d-AMP，Sigma，500mg)与尿苷5’-环偏磷酸盐反应，得到UP4dA的白色固体铵盐(140毫克，如上的HPLC纯度，99％)。
实施例19P1-(2’-脱氧肌苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4dI)如以上对UTP所述用Dowex 50(H+)树脂将2′-脱氧肌苷5′-单磷酸盐(d-IMP，Sigma，钠盐1．0克)转化为其游离酸形式。用三丁胺(2．0m．)将洗脱液中和，将混合物真空浓缩到油状。所得的三丁胺盐通过与MF蒸发进行干燥，将残留物溶于DMF(4．5ml)，基本所述，用尿苷5’-环三偏酸盐处理得到P1-(2’-脱氧肌苷’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐。
实施例20P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4dC)基本处理2’-脱氧胞苷5’-单磷酸盐(d-CMP，Sigma，500mg)得到P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐的白色固体(130毫克)，HPLC的估计纯度为82％。
实施例21通过肌醇磷酸盐试验药理活性用E．Lazarowski等，Brit．J．Pharm．116，1619-27(1995)所述的肌醇磷酸盐试验对实施例1-20化合物试验它们激活Y1、P2Y2、P2Y4和P2Y6受体活性的能力。结果如下表Ⅱ所示。
表Ⅱ二核苷酸性总结EC50(微摩尔)

IA 反应＜2-倍基础值弱 EC50＞100微摩尔(XX％) 同一研究中阳性对照的反应百分数nd 没有测定现已以完整、清楚和确切地使本技术领域的人员能实施的方式揭示本发明、其制备方法和使用方法。应当明白，前面描述了本发明优选的技术方案，其可修改而并不脱离所附的权利要求书所述的本发明的精神或范围，为了特别指出本发明的权利要求，以下列权利要求书来结束本说明书。
权利要求
1．一种下式Ⅰ化合物，或其药学上可接受的酯或盐式Ⅰ 其中X是氧、亚甲基、二氟亚甲基、酰亚氨基；n=0，1或2；m=0，1或2；n+m=0，1，2，3或4；和B和B’各自独立地代表各自通过9-或1-位连接的嘌呤残基或嘧啶残基；Z=OH或N3；Z’=OH或N3；Y=H或OH；Y’=H或OH；条件是当Z是N3时，Y是H，或当Z’是N3时，Y’是H；进一步的条件是表Ⅰ化合物排除在外表Ⅰ二核苷酸
A=腺嘌呤核苷 eA=亚乙烯基腺嘌呤核苷U=尿嘌呤核苷 m7G=7-甲基鸟嘌呤核苷G=鸟嘌呤核苷 m2，7G=2，7-二甲基鸟嘌呤核苷T=胸腺嘧啶脱氧核苷m2，2，7G=2，2，7-三甲基鸟嘌呤核苷X=黄嘌呤核苷 NAD=烟酰胺核苷TAD=TiazofurinC-NAD=C-烟酰胺核苷BAD=苯甲酰胺核苷 C-PAD=C-吡啶酰胺核苷D=2，6-二氨基嘌呤 N=核苷
2．根据权利要求1所述的化合物，它具有下式IA结构式IA 其中X=O；n+m=1或2；Z、Z’、Y和Y’=OH；B和B’是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤或如式Ⅱ和式Ⅲ中所定义的那样；X=O；n+m=3或4；Z、Z’、Y和Y’=OH；B=尿嘧啶；B’是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤或如式Ⅱ和式Ⅲ中所定义的那样；或X=O；n+m=1或2；Z、Y和Y’=OH；Z’=H；B=尿嘧啶；B’是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤或如式Ⅱ和式Ⅲ中所定义的那样；或X=O；n+m=0，1或2；Z和Y=OH；Z’=N3；Y’=H；B=尿嘧啶；B’是胸腺嘧啶；或X=O；n+m=0，1或2；Z和Z’=N3；Y和Y’=H；B和B’是胸腺嘧啶；或X=CH2、CF2或NH；n和m=1；Z、Z’、Y和Y’=OH；B和B’是尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤或如式Ⅱ和式Ⅲ中所示的那样；式Ⅱ 其中R1是C1-8烷基；苯基或苯氧基(可被卤素；羟基；C1-4烷氧基；C1-4烷基；C6-10芳基；羧基；氰基；硝基；磺酰氨基；磺酸酯基；磷酸酯基；磺酸；氨基或取代氨基所取代，其中氨基可被C1-4烷基单取代或双取代，双取代时，烷基可被连接形成杂环)；或是ω-A(C1-6烷基)CONH(C1-6烷基)-，其中A是氨基、巯基、羟基或羧基；R2是O，或没有；或R1和R2连接在一起形成5-元稠合的咪唑环(在亚乙烯基部分的4-或5-位可被C1-4烷基；苯基或苯氧基所取代；它们可被卤素；羟基；C1-4烷氧基；C1-4烷基；C6-10芳基；羧基；氰基；硝基；磺酰氨基；磺酸酯；或磷酸酯；磺酸；氨基或取代氨基(其中氨基可被C1-4烷基单取代或双取代，双取代时，烷基可连接形成杂环)或被C7-12芳基烷基取代)；R3是C1-8烷基；苯基或苯氧基(它们可被卤素；羟基；C1-4烷氧基；C1-4烷基；C6-10芳基；羧基；氰基；硝基；磺酰氨基；磺酸酯；磷酸酯；磺酸；氨基或取代氨基所取代，其中氨基可被C1-4烷基单取代或双取代，双取代时，烷基可连接形成杂环)；或C7-12芳烷基；C1-4烷氨基、苯基氨基或C7-12芳基烷基氨基、C1-4烷氧基或C7-12芳基烷氧基；C1-4烷硫基、苯硫基或C7-12芳基烷硫基；或ω-A(C1- 6烷基)CONH(C1-6烷基)B-，其中A和B独立地是氨基、巯基、羟基或羧基；式Ⅲ 其中R4是氢、羟基、巯基、氨基、氰基、C7-12芳基烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基或二C1-4烷基氨基，其中烷基可连接形成杂环；R5是氢、乙酰基或苯甲酰基、C1-6烷基、苯氧基、C1-5链烷酰基、苯甲酰基或磺酸酯；R6是羟基、巯基、C1-4烷氧基、C7-12芳基烷氧基、C1-6烷硫基、氨基、C1- 5二取代氨基、三唑基、C1-6烷氨基或二-C1-4烷氨基，其中烷基可连接形成杂环，或连接到N3上以形成取代的环；或R5和R6连接在一起，在嘧啶环的3和4位之间形成5-元稠合的咪唑环(3，N4-亚乙烯基胞嘧啶衍生物)，在亚乙烯基部分的4-位或5-位上被C1-4烷基；苯基或苯氧基所取代；它们可被卤素；羟基；C1-4烷氧基；C1-4烷基；C6-10芳基；羧基；氰基；硝基；磺酰氨基；磺酸酯；或磷酸酯；磺酸；氨基或取代氨基取代，其中氨基被C1-4烷基单取代或双取代，双取代时，烷基可连接形成杂环；或被C7-12芳基烷基取代；R7是氢，羟基，氰基，硝基，或C2-8烯基，其烯基部分通过与氧连接以形成环，所述的环在与氧相邻的碳上可被C1-4烷基、苯基取代，取代C2-8炔基，卤素，C1-4烷基，取代C1-4烷基，CF3，C2-6烷基，C2-3链烯基，烯丙基氨基、溴乙烯基，丙烯酸乙酯，丙烯酸，C2-3炔基、取代C2-3炔基；或R6-R7可通过在R6处的N或O一起形成5或6-元饱和或不饱和环，这类环可含本身有官能团的取代基；条件是当R8是氨基或取代氨基时，R7是氢；R8是氢，氨基或二-C1-4烷基氨基，C1-4烷氧基，C7-12芳基烷氧基，C1-4烷硫基，C7-12芳基烷硫基，甲酰氨基甲基，羧甲基，甲氧基，甲硫基，苯氧基或苯硫基。
3．根据权利要求1所述的化合物，它为式IB化合物式IB 其中X是氧、亚甲基、二氟亚甲基或酰亚氨基；n=0或1；m=0或1；n+m=0，1或2；B和B’各自代表如式Ⅱ所示的嘌呤残基，或如式Ⅲ所示的嘧啶残基，各自通过9-或1-位连接；式Ⅱ 其中R1是C1-8烷基；苯基或苯氧基(可被卤素；羟基；C1-4烷氧基；C1-4烷基；C6-10芳基；羧基；氰基；硝基；磺酰氨基；磺酸酯基；磷酸酯基；磺酸；氨基或取代氨基所取代，其中氨基可被C1-4烷基单取代或双取代，双取代时，烷基可被连接形成杂环)；或是ω-A(C1-6烷基)CONH(C1-6烷基)-，其中A是氨基、巯基、羟基或羧基；或R2是O，或没有；或R1和R2连接在一起形成5-元稠合的咪唑环(在亚乙烯基部分的4-或5-位可被C1-4烷基；苯基或苯氧基所取代；它们可被卤素；羟基；C1-4烷氧基；C1-4烷基；C6-10芳基；羧基；氰基；硝基；磺酰氨基；磺酸酯；或磷酸酯；磺酸；氨基或取代氨基(其中氨基被C1-4烷基单取代或双取代，双取代时，烷基可连接形成杂环)或被C7-12芳基烷基取代)；R3是C1-8烷基；苯基或苯氧基(它们可被卤素；羟基；C1-4烷氧基；C1-4烷基；C6-10芳基；羧基；氰基；硝基；磺酰氨基；磺酸酯；磷酸酯；磺酸；氨基或取代氨基所取代，其中氨基可被C1-4烷基单取代或双取代，双取代时，烷基可连接形成杂环)；或C7-12芳烷基；C1-4烷氨基、苯基氨基或C7-12芳基烷基氨基、C1-4烷氧基或C7-12芳基烷氧基；C1-4烷硫基、苯硫基或C7-12芳基烷硫基；或ω-A(C1-6烷基)CONH(C1-6烷基)B-，其中A和B独立地是氨基、巯基、羟基或羧基；式Ⅲ 其中R4是氢、羟基、巯基、氨基、氰基、C7-12芳基烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷氧基、C1-6烷基氨基或二C1-4烷基氨基，其中烷基可连接形成杂环；R5是氢、乙酰基或苯甲酰基、C1-6烷基、苯氧基、C1-5链烷酰基、苯甲酰基或磺酸酯；R6是羟基、巯基、C1-4烷氧基、C7-12芳基烷氧基、C1-6烷硫基、氨基、C1-5二取代氨基、三唑基、C1-6烷氨基或二C1-4烷氨基，其中烷基可连接形成杂环，或连接到N3上以形成取代的环；R5和R6连接在一起，在嘧啶环的3和4位之间形成5-元稠合的咪唑环(3，N4-亚乙烯基胞嘧啶衍生物)，在亚乙烯基部分的4-位或5-位上被C1-4烷基；苯基或苯氧基所取代；它们可被卤素；羟基；C1-4烷氧基；C1-4烷基；C6-10芳基；羧基；氰基；硝基；磺酰氨基；磺酸酯；或磷酸酯；磺酸；氨基或取代氨基取代，其中氨基被C1-4烷基单取代或双取代，双取代时，烷基可连接形成杂环；或被C7-12芳基烷基取代；R7是氢，羟基，氰基，硝基，或C2-8烯基，其烯基部分可通过与氧连接而形成环，所述的环在与氧相邻的碳上被C1-4烷基、苯基取代，取代C2-8炔基，卤素，C1-4烷基，取代C1-4烷基，CF3，C2-6烷基，C2-3链烯基，烯丙基氨基、溴乙烯基，丙烯酸乙酯，丙烯酸C2-3炔基、取代C2-3炔基；或R6-R7可通过在R6处的N或O一起形成5或6-元饱和或不饱和环，这类环可含本身有官能团的取代基；条件是当R8是氨基或取代氨基时，R7是氢；R8是氢，氨基或二C1-4烷基氨基，C1-4烷氧基，C7-12芳基烷氧基，C1-4烷硫基，C7-12芳基烷硫基，甲酰氨基甲基，羧甲基，甲氧基，甲硫基，苯氧基或苯硫基。
4．根据权利要求2或3所述的化合物，其中式Ⅱ和Ⅲ的酰基含有烷基或芳基，烷基具有1-4个碳原子，包括诸如芳基氧基的芳基基团是苯基，其中烷基和芳基被选自卤素、羟基、C1-4烷氧基、C1-4烷基、C7-12芳基、C7-12芳基烷氧基、羧基、氰基、硝基、磺酰氨基、磺酸酯、磷酸酯、磺酸、氨基和取代氨基的取代基所取代，其中氨基被C1-4烷基单或双取代，当双取代时，烷基可被连接形成杂环。
5．根据权利要求1-3任一所述的化合物，其中B和B’是在N-1位上连接到核糖基部分的尿嘧啶，当X是氧时，m+n等于3或4。
6．根据权利要求1-3任一所述的化合物，其中核糖基部分为D-构型。
7．根据权利要求1-3任一所述的化合物，其中核糖基部分为L-构型。
8．根据权利要求1-3任一所述的化合物，其中核糖基部分为D-和L-构型。
9．P1，P4-二(尿苷5’-)P2，P3-亚甲基四磷酸盐。
10．P1，P4-二(尿苷5’-)P2，P3-二氟亚甲基四磷酸盐。
11．P1，P4-二(尿苷5’-)P2，P3-酰亚氨基四磷酸盐。
12．P1，P4-二(4-硫代尿苷5’-)四磷酸盐。
13．P1，P5-二(尿苷5’-)五磷酸盐。
14．P1，P4-二(3，N4-亚乙烯基胞苷5’-)四磷酸盐。
15．一种药物组合物，包括如权利要求1-3任一所述的式I、IA或IB化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
16．一种治疗哺乳动物慢性阻塞性肺病的方法，包括给予治疗阻塞性肺病有效量的权利要求1-3任一所述的式I、IA或IB化合物。
17．一种治疗哺乳动物窦炎、中耳炎或鼻沮管阻塞的方法，包括给予能有效清除粘液分泌物的量的如权利要求1-3任一所述的式I、IA或IB化合物。
18．一种治疗哺乳动物干眼病的方法，包括给予治疗干眼病有效量的如权利要求1-3任一所述的式I、IA或IB化合物。
19．一种治疗哺乳动物视网膜脱落的方法，包括给予治疗视网膜脱落有效量的如权利要求1所述的式Ⅰ化合物。
20．一种哺乳动物引痰的方法，包括给予能有效引痰量的如权利要求1所述的式Ⅰ化合物。
21．一种使哺乳动物易于咳出痰的方法，包括给予能有效地帮助咳出痰的数量的如权利要求1所述的式Ⅰ化合物。
22．一种化合物，它选自P1-(胸苷5’-)P4-(尿苷-5’-)四磷酸盐(UP4T)，P1-(肌苷5’-)P4-(尿苷-5’-)四磷酸盐(UP4I)，P1-(4-硫代尿苷5’-)P4-(尿苷-5’-)四磷酸盐(UP4(4-SH-U))，P1-(胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4araC)，P1-(尿苷5’-)-P4-(黄苷5’-)四磷酸盐(UP4X)，P1-(2’-脱氧尿苷5’-)-P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4dU)，P1-(3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4(AZT))，P1，P4-二(3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷5’-)四磷酸盐((AZT)2P4)，P1，P6-二(尿苷5’-)六磷酸盐(U2P6)，2’(3’)-苯甲酰基-P1，P4-二(尿苷5’-)四磷酸盐，P1，P4-二(2’(3’)-苯甲酰基尿苷5’-)四磷酸盐，P1-(2’-脱氧鸟苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4dG)，P1-(2’-脱氧腺苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4dA)，P1-(2’-脱氧肌苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4dI)，和P1-(2’-脱氧胞苷5’-)P4-(尿苷5’-)四磷酸盐(UP4dC)。
全文摘要
本发明涉及特定新颖的二核苷酸及其制剂,它们是对P2Y
文档编号C07H21/00GK1292795SQ98803259
公开日2001年4月25日 申请日期1998年2月6日 优先权日1997年2月6日
发明者W·彭德格斯特, B·R·耶扎, J·L·赖德奥特, S·M·西迪基 申请人:印斯拜尔药品股份有限公司