专利名称：一种从蛇毒中纯化神经生长因子的方法
技术领域：
本发明涉及一种用疏水材料、离子交换材料和凝胶排组材料组合的三步法从蛇毒中纯化神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)的方法。
神经生长因子是目前唯一得到鉴定的能够促进神经细胞生长的生长因子，是交感神经元和某些感觉神经元的生长发育所必需的一种蛋白质。在临床上，神经生长因子主要疗效表现在以下几个方面(1)促进修复神经损伤。主要适用临床病症有神经炎、原发性癫痫、神经衰弱、血管神经性头痛、脑膜炎、脑外科手术后遗症、农药中毒性脑病后遗症、脑中风后遗症、神经性耳聋，小儿麻痹症、脑萎缩、肌肉硬索硬化症等疾病；(2)治疗和缓解Alzheimer型老年性痴呆症、老年性舞蹈症、帕金森氏综合症、格林巴利综合症等老年性退行性病症；(3)能有效地抑制某些肿瘤的有丝分裂，促使其向良性分化，如NGF对黑色素瘤，结肠癌等肿瘤有一定的疗效；(4)促进皮肤组织的愈合，特别是对长期性溃烂具有较好疗效；(5)促进胚胎早期发育和调节抗体免疫功能；(6)具有防止学习和记忆功能缺陷的功能。
目前，尽管在文献上有许多从蛇毒中提取NGF的层析方法报导，如文献1[Siigur，G.，etal.，Comp.Biochem.Physiol.，BComp.Biochem，1987，87B(2)，329-34]应用单克隆抗体免疫亲合层析法纯化了10种不同种类蛇毒中的NGF；文献2[Kilmon，J.，Am.Biotechnol.Lab.，1992，110(11)，18-20]报道了一种由硅胶和聚氨丙烯构成的、能够用不同离子交换和亲合配体活化的、称作Acti-Disk Cartridge的微孔纤维床来纯化蛇毒中NGF的方法；文献3[Stoeckel，K.，et al.，J.Neurochem，1976，26(6)1207-11]报道了一种将2.5S NGF通过CNBr连接到Sepharose 4B上，利用亲合层析方法从羊血清中提取NGF抗体的方法；文献4[Khamidor，D.K.，Khim.Prir.Soedim，1985，(4)546-51]和文献5[Siigur，J.，et al.，Comp.Biochem.Physiol.，Bcomp.Biochem.，1986，83B(3)，621-5]分别报导了用凝胶排组+离子交换+等电聚焦/层析聚焦的方法从蛇毒中提取NGF的方法；文献6[Koyama，J.，et al.，Biophys.Acta，1992，1160(3)287-92]采用了凝胶过凝+离子交换+亲合层析(Blue-Sepharose CL-6B)的方法从蝰蛇(Vipera russelli resselli)中提取了NGF；而最近，文献7[Kostiza，T.，et al.，Toxico，1995，33(10)，1249-61]报导了用弱阳离子交换+反相液相层析的方法从中华眼镜蛇蛇毒中提取NGF的方法，等等。但是，从分离介质的化学稳定性和商品可获得性，以便及从纯化工艺的可靠性和稳定性方面考虑，真正具有实际用途的从蛇毒中提取NGF的方法则是比较经典的、且目前在文献上大量使用的凝胶过滤+离子交换+凝胶过滤模式[文献8Hogue-Angeleui，R.A.，et al.，Biochemistry，15(1976)，26；文献9刘一平等，中华生化药物杂志，199415(1)]。但这种方法存在以下两个致命弱点(1)在第一步的凝胶排阻过程中一般都需要100多个小时，不但操作时间太长，而且蛋白与介质的长时间接触，使得所需的目标蛋白的活性有可能降低。(2)在第一步采用凝胶排组方法，由于凝胶介质吸附容量较小，使得样品处理量很小，因此，只能用于实验室少量样品的制备，很难放大到中试和规模生产上。
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提出一种用疏水材料、离子交换材料和凝胶排组材料组合的三步法从蛇毒中纯化神经生长因子的方法，所用时间为传统方法的1/10，且几乎可线性地从实验室放大到中试规模直至规模生产化。
图1是实现本发明所需的装置。
如图1所示，该装置包括两个并联的输液泵1，输液泵1的出口和混合器2的一端相连通，混合器的另一端与层析柱3相连通，层析柱3后配置一台紫外检测仪4和一台记录仪5。实际操作时，两个输液泵1用于将两种溶液泵入层析柱3，混合器2用于将两种溶液混合均匀，层析柱3用于目标蛋白和其它蛋白的分离，紫外检测仪4和记录仪5用于已分离样品的检测和记录。
1、疏水材料、洗脱溶液和洗脱方式的选择由于NGF具有较强的疏水性，因此所选择的疏水介质既要有一定的疏水性，但又不能太强，以致NGF不能洗脱下来，如正乙基、聚醚键型、正丁基或苯基介质均可作为选择之一。所选洗脱液既要使样品中的NGF能完全溶解，又不因沉淀而破坏NGF的活性，如pH在6.0-9.0的缓冲溶液(如20-50mmol/L的含Na+、K+、Mg++、Ca++、NH4+、H2PO4-、HPO42-和SO42-离子的盐溶液)。所选的洗脱方式以减低盐浓度的方式进行为宜。
2、离子交换材料、洗脱溶液和洗脱方式的选择由于NGF的等电点在7.0附近，因此所选择的离子交换介质既可以按阳离子交换的形式进行，也可以按阴离子交换的形式进行。如苯甲基、磺酸基、磷酸基和二乙酸二乙胺基、季胺基均可作为选择之一。所选洗脱液既要使样品中的NGF能完全溶解，又不因沉淀而破坏NGF的活性，如pH在5.0-7.0和7.0-9.0的缓冲溶液(如20-50mmol/L的含Na+、K+、Mg++、Ca++、H2PO4-、HPO42-和Cl-离子的盐溶液)。所选的洗脱方式以增加盐浓度的方式进行为宜。
3、凝胶排组材料、洗脱溶液和洗脱方式的选择由于NGF的分子量在30,000左右，因此所选择的凝胶排组介质的线性范围应在此范围内，且具有良好的非特异性吸附性能。如琼脂糖、葡聚糖或硅胶材料均可作为选择之一。所选洗脱液既要使样品中的NGF能完全溶解，又不因沉淀而破坏NGF的活性，如pH在5.0-9.0的缓冲溶液(如20-50mmol/L的含Na+、K+、Mg++、Ca++、H2PO4-、HPO42-和Cl-离子的盐溶液)。所选的洗脱方式以等度方式进行为宜。
操作实例取30.0克粗粉状蛇毒，溶于120ml 10mM的含Na+、K+、Mg++、Ca++、H2PO4-和HPO42-离子的pH＝7.0的缓冲液中，在4,000rpm离心30分钟，取上清按下列顺序纯化。
(1)、疏水层析层析柱2.6×50cm填料一种含正丁基的疏水材料，265ml胶平衡液A20mM PBS+1.5M(NH)2SO4，pH＝7.0洗脱液B20mM PBS，pH＝7.0梯度洗脱液B从0～100％，线性梯度流速290cm/h(25ml/min)操作先以平衡液A平衡层析柱30min，再将用样品上柱，用平衡液A冲洗20min后，开始100min梯度，再以洗脱液B维持20min，最后以平衡液A平衡层析柱以备下次再用。收集含NGF活性的峰约为180ml。
(2)、离子交换层析层析柱2.6×5.0cm填料一种含羧甲基的离子交换材料，265ml平衡液C20mM NaAc-HAc，pH＝5.0洗脱液D20mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH＝5.0梯度洗脱液D从0-100％，线性方式。
流速290cm/h(26ml/min)操作层析柱先以平衡液C平衡30min，再将上一步收集并经脱盐柱脱盐的样品上样(已转化成NaAc-HAc溶液)，以平衡液C冲液20min，100min梯度后，继续维持洗脱液D20min，再以30min平衡液C平衡层析柱。收集含NGF的活性峰约290ml。
(3)、凝胶排组层析层析柱2.6×125cm填料一种琼脂糖凝胶材料，660ml洗脱液50mM PBS，pH＝7.0流速124cm/h(11ml/min)操作离子交换层析后的样品分成三份，每次上样约100ml。收集样品约200ml用上述工艺从粗蛇毒中提取NGF，其纯化结果总结在表1中。
表1 纯化结果总结样品量(g)回收率123平均 分步回收率 总回收率粗毒30.0 30.0 30.0 30.0100％ 100％疏水材料1.52 1.38 1.42 1.444.8％ 4.80％离子交换0.42 0.32 0.34 0.3625.0％ 1.20％凝胶材料0.130 0.120 0.128 0.126 35.0％ 0.42％各步测定活性和比活结果见表2。
表2各步测定活性和比活结果产率 所得量 总活性 比活(mg) (mg/ml) (B.U.) (B.U./mg)粗毒 30,000 3.501.98×1076.60×102疏水材料 1,4200.453.69×1062.60×103离子交换3400.084.76×1061.40×104凝胶材料1280.012.94×1072.30×10权利要求
一种从蛇毒中纯化神经生长因子的方法，其特征在于，取一定量的粗粉蛇毒，溶于PH＝7.0的缓冲液中，离心后取上清依次进行疏水层析，离子交换层析和凝胶排组层析，疏水层析所选择的疏水介质为正乙基、聚醚键型、正丁基或苯基，所选择的洗脱液为PH在6.0-9.0的缓冲溶液，所选择的洗脱方式为减低盐浓度的方式，离子交换层析所选择的离子交换介质为苯甲基、磺酸基、磷酸基和二乙酸二乙胺基或季胺基，所选洗脱液为pH在5.0-7.0和7.0-9.0的缓冲溶液，所选的洗脱方式以增加盐浓度的方式，凝胶排组层析所选择的凝胶排组介质为琼脂糖、葡聚糖或硅胶材料，所选洗脱液为pH在5.0-9.0的缓冲溶液，所选的洗脱方式为等度方式。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的疏水层析洗脱液为20-50mmol/L的含Na+、K+、Mg++、Ca++、NH4+、H2PO4-、HPO42-和SO42-离子的盐溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的离子交换洗脱液为20-50mmol/L的含Na+、K+、Mg++、Ca++、H2PO4-、HPO42-和Cl-离子的盐溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的离子交换洗脱液为20-50mmol/L的含Na+、K+、Mg++、Ca++、H2PO4-、HPO42-和Cl-离子的盐溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，取30.0克粗粉状蛇毒，溶于120ml 10mM的含Na+、K+、Mg++、Ca++、H2PO4-和HPO42-离子的pH＝7.0的缓冲液中，在4,000rpm离心30分钟，取上清按下列顺序纯化(1)疏水层析先以平衡液A平衡层析柱30min，再将用样品上柱，用平衡液A冲洗20min后，开始100min梯度，再以洗脱液B维持20min，最后以平衡液A平衡层析柱以备下次再用。收集含NGF活性的峰约为180ml；其中层析柱2.6×50cm、填料为一种含正丁基的疏水材料，265ml胶、平衡液A为20mM PBS+1.5M(NH)2SO4，pH＝7.0、洗脱液B为20mM PBS，pH＝7.0、梯度洗脱液B从0～100％，线性梯度、流速290cm/h；(2)离子交换层析层析柱先以平衡液C平衡30min，再将上一步收集并经脱盐柱脱盐的样品上样，以平衡液C冲液20min，100min梯度后，继续维持洗脱液D 20min，再以30min平衡液C平衡层析柱，其中层析柱2.6×5.0cm、填料一种含羧甲基的离子交换材料，265ml胶、平衡液C20mM NaAc-HAc，pH＝5.0、洗脱液D20mM NaAc-HAc+1M NaCl，pH＝5.0、梯度洗脱液D从0-100％，线性方式、流速290cm/h(26ml/min)；(3)凝胶排组层析离子交换层析后的样品分成三份，每次上样约100ml，其中层析柱2.6×125cm、填料琼脂糖凝胶材料，660ml、洗脱液50mMPBS，pH＝7.0、流速124cm/h(11ml/min)。
全文摘要
本发明涉及一种用疏水材料、离子交换材料和凝胶排组材料组合的三步法从蛇毒中纯化神经生长因子的新方法,可以使所得的神经生长因子纯度在97%以上,最低比活为5ul/ml,所用时间为传统方法的1/10,且所得神经生长因子的活性比传统方法高一倍。本方法几乎可线性从实验室放大到中试规模直至规模生产。
文档编号C07K1/14GK1255503SQ99115898
公开日2000年6月7日 申请日期1999年11月9日 优先权日1999年11月9日
发明者边六交, 祁淼 申请人:边六交, 祁淼