聚羟基链烷酸酯和利用微生物制备它们的方法

专利名称：聚羟基链烷酸酯和利用微生物制备它们的方法
技术领域：
本发明涉及新的聚羟基链烷酸酯(PHA)，以及利用微生物制备这种新的PHA的方法。
由石油得来的合成聚合物早已用作塑料等等。最近，处理使用过的塑料已经成为一个严重的社会问题。这些合成的聚合物优点是难以分解，已经用于代替金属或玻璃原料。然而，在大量消耗和大量处理时，这些难以分解的特点使它们成本集中在废料处理的设备上，或当它们燃烧时，增加了二氧化碳的排放，和会产生有害物质例如二噁英和内分泌破坏物而引起环境污染。
另一方面，微生物制备的聚酯(以下简称“微生物的聚酯”)可以被生物降解并入自然界的再循环系统中。因此，与众多普通的合成聚合物化合物相反，它们不会残留在自然环境，不会引起污染。此外，因为生物降解性免除了焚化处理，从防止空气污染和全球变暖的立场来说，微生物的聚酯是有效的，并可用作如塑料保持环境。另外，已经研究了它们的潜在用途如作为医用的软材料(日本专利申请公开号5-159,6-169980、6-169988、6-225921等等)。
迄今为止，已经报道过不同的细菌以制备并积聚PHB或其它在细胞中的羟基链烷酸的共聚物(生物降解塑料手册，由生物降解塑料协会主编，N.T.S.出版，第178-197页(1995))。已知这样获得的微生物的PHA根据使用的微生物的种类、培养基组成、培养条件等等而具有不同的组成和结构，在制备的过程中，已经进行了许多与控制PHA组成和结构相关的研究以改良PHA性质。
例如，在培养期间真养产碱菌(Alcaligenes eutropus)H16 ATCC号17699和它的突变体通过在培养过程中改变碳源可以制备3-羟丁酸(3HB)和3-羟基戊酸(3HV)的不同组成比的共聚物(日语译本的PCT国际公开号6-15604、7-14352、8-19227等等)。
日本专利号2642937公开了当使用无环脂肪族烃作为碳源时，使用食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)ATCC29347制备单体单元为6到12个碳原子的3-羟基链烷酸酯的PHA。
日本专利申请公开号5-74492公开了一种方法，包括将羟甲基(无芽胞)杆菌属种(Methylobacterium sp.)、副球菌属种(Paracoccus sp.)、产碱杆菌属种(Alcaligenes sp.)或假单胞菌属种(Pseudomonas sp.)与3到7个碳原子的伯醇接触，因此可以制备3HB和3HV的共聚物。
日本专利申请公开号5-93049和7-265065公开了使用油酸和橄榄油作为碳源，豚鼠气单胞菌属(Aeroomonas caviae)可以制备3HB和3-羟己酸(3HHX)的二元共聚物。
日本专利申请公开号9-191893公开了使用葡糖酸和1,4-丁二醇作为碳源，食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)1F013852可以制备单体单元为3HB和4-羟丁酸的聚酯。
此外，据报道某些微生物能制备具有不同的取代基例如不饱和烃基、酯基、烯丙基氰基、硝基、卤代烃基和环氧基的PHA。于是，已经开始使用这种技术试图改善微生物的PHA的性质。在FEMS微生物学文集(128期(1995)第219-228页)详细地叙述了具有这种取代基的微生物的聚酯的例子。大分子化学(191期，1957-1965页，1990)，高分子(24期，5256-5260页，1991)，和Chirality(3期，492-494页，1991)报道了食油假单胞菌属制备包含单体单元为3-羟基-5-苯基戊酸(3HPV)的PHA，而且可能由于3HPV单体单元的存在而改变了聚合物性质。
如上所述，通过改变制备聚合物的微生物、培养基组成、培养条件等等可以获得不同的组成/结构的微生物的PHA。然而，它们的物理性能仍然不能满足塑料的需要。为了更进一步扩大应用范围，重要的是更广泛地研究改进性质，因此，必须研究和开发由结构不同的单体单元制成的PHA，制备它们的方法以及能够有效地制备想要的PHA的微生物。
另一方面，如上所述，通过根据需要的性能选择引入取代基等等方法，预计在侧链上引入取代基的那些PHA可以作为具有有效功能和性质的“功能聚合物”。研究和开发能满足功能和生物降解性两者要求的PHA、制备它们的方法以及能够有效地制备想要的PHA的微生物是同样重要的。
在侧链上引入取代基的这种PHA的一个例子是在侧链上有苯氧基的PHA。
例如，大分子化学物理(195期，1655-1672页(1994))报道了用食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)制备包含来自11-苯氧基十一酸的3-羟基-5-苯氧基戊酸和3-羟基-9-苯氧基壬酸单元的PHA。
高分子(29期，3432-3435页(1996))也报道了用食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)可用于制备包含来自6-苯氧基己酸的3-羟基-4-苯氧基丁酸和3-羟基-6-苯氧基己酸单元的PHA、包含来自8-苯氧基辛酸的3-羟基-6-苯氧基己酸和3-羟基-8-苯氧基辛酸单元的PHA、和包含来自11-苯氧基十一酸的3-羟基-5-苯氧基戊酸和3-羟基-7-苯氧基庚酸单元的PHA。聚合物产率如下。
此外，加拿大微生物学杂志(41期，32-43页(1995))报道了当使用辛酸和对氰基苯氧基己酸或对硝基苯氧基己酸作为底物时，食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)ATCC29347或腐臭假单胞菌(Pseudomonasputida)KT2442可以制备包含3-羟基-对氰基苯氧基己酸或3-羟基-对硝基苯氧基己酸单体单元的PHA。
日本专利号2989175描述了由3-羟基-5-(单氟基苯氧基)戊酸酯(3H5(MFP)P)单元或3-羟基-5-(二氟基苯氧基)戊酸酯(3H5(DFP)P)单元组成的均聚物，包含至少3H5(MFP)P单元和3H5(DFP)P单元之一的共聚物，可以制备这种聚合物的腐臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；和使用假单胞菌属种制备上述聚合物的方法。
按照如下所述的“2-步骤培养”进行这种制备。培养期步骤1-24小时；步骤2-96小时。在每个步骤中的底物和获得的聚合物如下。
(1)获得的聚合物3H5(MFP)P均聚物在步骤1中的底物柠檬酸、酵母提取物在步骤2中的底物单氟苯氧基十一酸(2)获得的聚合物3H5(DFP)P均聚物在步骤1中的底物柠檬酸、酵母提取物在步骤2中的底物二氟苯氧基十一酸(3)获得的聚合物3H5(MFP)P共聚物在步骤1中的底物辛酸或壬酸、酵母提取物在步骤2中的底物单氟苯氧基十一酸(4)获得的聚合物3H5(MFP)P均聚物在步骤1中的底物辛酸或壬酸、酵母提取物在步骤2中的底物二氟苯氧基十一酸它描述了微生物可以同化取代中链长度的脂肪酸以制备具有在侧链末端由1到2氟原子取代的苯氧基的聚合物，而且这种聚合物具有立构规整性和疏水性，同时保持高熔点和好的可加工性。
已经报道了在其单体单元中包含环己基的PHA可表现出与包含普通脂肪族羟基链烷酸作为单元的PHA不同的聚合物性质，以及用食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)制备的方法(高分子，30期，1611-1615页(1997))。
根据这个报告，在包含壬酸(以下简称NA)和4-环己基丁酸(以下简称CHBA)或5-环己基戊酸(以下简称CHVA)的培养基中培养食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)，获得由含环己基单元和来源于壬酸单元(各比例是未知的)制成的PHA。
在底物总浓度为20毫摩尔的条件下通过改变CHBA与NA的比例，获得表2所示的结果。在表2中，CDW细胞质量(干重)(mg/L)；PDW聚合物质量(干重)(mg/L)；和产率PDW/CDW(％)。
然而，在这种情况下，单位体积培养物的聚合物产率(w/v)是不够的，而且壬酸-衍生的脂肪族的羟基链烷酸单元存在于所得到的PHA中。
如上所述，为了使用上述食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)制备在侧链上具有不同的引入取代基的PHA，不仅利用具有引入取代基的链烷酸酯作为聚合物原料，而且作为生长的碳源。
不仅利用具有引入聚合物的取代基的链烷酸酯作为聚合物的原料，而且作为生长碳源的这种方法要求补给碳源和能源作为由链烷酸酯的β氧化形成的乙酰辅酶A。然而，在这种方法中，乙酰辅酶A不会由β氧化作用形成，除非底物有特定链长度，所以有一个严重的问题作为PHA底物的可利用的链烷酸酯是有限的。通常，β氧化作用产生一种新的底物，其中每次链长度减少两个亚甲基单元，而且它们作为PHA的单体单元引入，合成的PHA常常是由链长度相差两个亚甲基链的单体单元组成的共聚物。在上述报告中，生成的聚合物是由三个单体单元，即作为代谢副产品的来源于底物8-苯氧基辛酸的3-羟基-8-苯氧基辛酸、3-羟基-6-苯氧基己酸和3-羟基-4-苯氧基丁酸组成的共聚物。因此，使用这种方法难以获得由单一单体单元组成的PHA。此外，在取决于由β氧化作用形成的乙酰辅酶A作为碳源和能源的方法中，有这样的问题如微生物的缓慢的生长率、PHA的慢速合成和PHA的低产量。
因此，通常微生物在除具有引入取代基的链烷酸酯外还包含中等链长脂肪酸例如辛酸和壬酸等等作为生长碳源的培养基中生长，然后提取PHA。
然而，用上述方法制备的PHA包含具有引入取代基的单体单元和来源于生长碳源的单体单元(例如，3-羟基辛酸和3-羟基壬酸)。这种中链长度(mcl)单体单元的聚合物在室温下是胶粘的，而当与理想的PHA混合时，显著地降低了玻璃化转变点(Tg)。因此，为了获得在室温下是固态的聚合物，污染的中链长度单体单元是不合要求的。另外，由于侧链结构不均匀侧链的存在会妨碍分子内部或分子间相互作用，从而显著地影响结晶度和取向。为了改善聚合物性能和作用，这种中链长度单体单元的混合物是一个严重的问题。解决这一问题的一个方法是增加纯化步骤以分离和除去来源于生长碳源的中链长度单体单元的“不想要的”聚合物，并获得仅仅由具有特定取代基的单体单元组成的PHA。然而，此操作麻烦，而且必然大大减少产率。更严重的问题是如果有用的单体单元与无用的单体单元形成共聚物，那么很难只除去无用的单体单元。特别是，当PHA包含具有这种基团如来源于不饱和烃的基团、酯基、芳香基、氰基、硝基、来源于作为侧链结构的卤代烃和环氧化物的基团的单体单元时，中链长度单体单元常常与有用的单体单元形成共聚物，所以PHA合成之后很难除去中链长度单体单元。
本发明可以解决上述问题。本发明的目的是提供一种可用于装置材料、医用材料等等的PHA，其在侧链上包含具有取代基的不同结构的单体单元。本发明的另一个目的是提供一种利用微生物制备这种PHA的方法，尤其是制备具有完全不污染的单体单元和高产率的PHA的方法。本发明的另一个目的是提供没有无用的单体单元而仅仅由理想的单体单元组成的新PHA，以及利用微生物制备这种PHA的方法。
为了解决上述问题，尤其是为了开发用于装置材料、医用材料等等的在侧链上具有取代的或未被取代的苯氧基、苯基和环己基的PHA，本发明人已经广泛地探求在细胞中能够制备和积聚PHA的新的微生物，和利用新的微生物制备理想的PHA的方法。
此外，为了开发有效获得没有混合无用的单体单元的理想PHA的方法，本发明人进行了广泛地研究，并发现在除具有理想的原子团的烷羧酸酯之外补充有酵母提取物的培养基中培养微生物，可以有选择地制备唯一的理想PHA，其没有与无用的单体单元混合，或掺合少量的无用单体单元，这样完成了本发明。
因此，本发明新的PHA的制备方法其特征在于在包含烷羧酸酯和酵母提取物的培养基中培养微生物，该微生物能够利用培养基中的烷羧酸酯作为低廉的材料制备PHA。特别是，按照如下所述实施方案可以进行制备本发明PHA的方法。
根据本发明的一个方面，提供包含一个或多个由结构式(1)表示的单体单元的聚羟基链烷酸酯， 其中R为至少一种选自由结构式(2)、(3)和(4)任何一个表示的基团； 在结构式(2)中，R1是选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，q是1-8的整数；在结构式(3)中，R2是选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，r是1-8的整数；在结构式(4)中，R3是选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，s是1-8的整数；只要不选择下列的R当选择一种R在结构式(2)中R是R1=H和q=2,R是R1=H和q=3，在结构式(3)中R是R2=卤素和r=2，或R是R2=-CN和r=3，以及R是R2=-NO2和r=3；当选择两种R时
在结构式(2)中一种组合是R1=H，而q=3和5，在结构式(3)中一种组合是R为R2=H，而r=2和4，一种组合是R为R2=H和r=2和6，以及一种组合是R为R2=卤素和r=2和4；当选择三种R时在结构式(2)中一种组合是R为R1=H，而q=3、5和7，在结构式(3)中一种组合是R为R2=H和r=1、3和5，以及一种组合是R为R2=H和r=2、4和6。
根据本发明的另一方面，提供一种制备聚羟基链烷酸酯的方法，包括下列步骤在包含原料链烷酸酯和酵母抽提物的培养基中培养微生物，其中微生物利用链烷酸酯制备聚羟基链烷酸酯。
本发明提供一种制备聚羟基链烷酸酯的方法，使用链的端部由下列任何一种6-碳环原子团基团取代的ω-取代的-直链链烷酸作为原料取代的或未被取代的苯基，取代的或未被取代的苯氧基基团，和取代的或未被取代的环己基基团，而且包含相应的ω-取代的3-羟基-链烷酸作为单体单元，以及提供适合于选择制备在侧链的端部具有6-碳环原子团的聚羟基链烷酸酯的微生物。首先根据本发明在包含酵母提取物和ω-取代的-直链链烷酸作为原料的无机培养基中用微生物制备不同的聚羟基链烷酸酯是可能的，例如，培养属于假单胞菌属种的微生物对作为原料的ω-取代的-直链链烷酸作用可以有效制备不同的聚羟基链烷酸酯。因此，用具有生物降解性的聚羟基链烷酸酯作为功能聚合物可以应用于不同的领域例如医学处理的装置原料和原料。


图1是从实施例A-2中菌株P91的培养细胞中收集的PHA的1H-NMR光谱。
图2是实施例B-1中获得的5-苯氧基戊酸的核磁共振(NMR)光谱。
图3A是组成实施例B-2中获得的PHA的单体单元甲基酯化了的化合物的GC-MS测量的总离子色谱图(TIC)，而图3B是在TIC中主峰的质谱。
图4是实施例B-2中获得的PHA的核磁共振(NMR)光谱。
图5A是组成实施例B-3中获得的PHA的单体单元甲基酯化了的化合物的GC-MS测量的总离子色谱图(TIC)，而图5B是在TIC中主峰的质谱。
图6是实施例C-I获得的5-(4-氟苯氧基)戊酸的核磁共振(NMR)光谱。
图7A是组成实施例C-2中获得的PHA的单体单元甲基酯化了的化合物的GC-MS测量的总离子色谱图(TIC)，而图7B是在TIC中主峰的质谱。
图8是实施例C-2中获得的PHA的核磁共振(NMR)光谱。
图9A是组成实施例C-3获得的PHA的单体单元甲基酯化了的化合物的GC-MS测量的总离子色谱图(TIC)，而图9B是在TIC中主峰的质谱。
图10是实施例D-5中用菌株H45制备的聚3-羟基-5-苯基戊酸的1H-NMR光谱。
图11是实施例D-5中用菌株H45制备的聚3一羟基-5-苯基戊酸的13C-NMR光谱。
图12是jessenii假单胞菌P161的16s核蛋白体(rRNA)编码区的脱氧核糖核酸序列(DNA序列)；FERM BP-7376。
图13是实施例E-1中使用链烷酸酯作为原料生物合成的FPVA的NMR光谱。
图14是实施例E-5中使用FPVA作为原料按照本发明制备方法获得的PHA的1H-NMR光谱。
图15是实施例E-5中使用FPVA作为原料获得的PHA的碳-13核磁共振(13C-NMR)光谱。
图16是由实施例F-3中纯化的3-羟基-4-环己基丁酸单元组成的PHA的1H-NMR光谱。
图17是由实施例F-3中纯化的3-羟基-4-环己基丁酸单元组成的PHA的碳-13核磁共振(13C-NMR)光谱。
图18是实施例G-1中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯的质谱。
图19是实施例G-1中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯的质谱。
图20是实施例G-2中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯的质谱。
图21是实施例G-2中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯的质谱。
图22是实施例H-1中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)甲酯的质谱。
图23是实施例H-1中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)甲酯的质谱。
图24是实施例H-1中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)甲酯的质谱。
图25是实施例H-2中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)甲酯的质谱。
图26是实施例H-2中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)甲酯的质谱。
图27是实施例H-2中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)甲酯的质谱。
图28是实施例I-1中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯的质谱。
图29是实施例I-1中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯的质谱。
图30是实施例I-1中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)甲酯的质谱。
图31是实施例I-2中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯的质谱。
图32是实施例I-2中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯的质谱。
图33是实施例I-2中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)甲酯的质谱。
图34是实施例J-1中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-6-苯基己酸(3HPxHx)甲酯的质谱。
图35是实施例J-2中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-4-苯基丁酸(3HPxB)甲酯的质谱。
图36是实施例J-2中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-6-苯基己酸(3HPxHx)甲酯的质谱。
图37是实施例K-1中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-5-苯基戊酸(3HPV)甲酯的质谱。
图38是实施例K-1中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯的质谱。
图39是实施例K-2中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-5-苯基戊酸(3HPV)甲酯的质谱。
图40是实施例K-2中制备的聚合物的气相色谱-质谱联用法(GC-MS)获得的3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯的质谱。
最优方案的详细说明本发明涉及一种新的聚羟基链烷酸酯(PHA)和制备PHA的方法。
制备本发明PHA的方法中的第一个实施方案是以下列为特征的制备方法在包含酵母提取物和结构式(12)的链烷酸酯的培养基中培养微生物 其中R为至少一个或多个选自由下列结构式(2)、(3)或(4)任何一个表示的基团，从微生物的细胞中提取聚羟基链烷酸酯(PHA)，和获得具有结构式(13)的单体单元的PHA， 其中R’为至少一个或多个基团选自同结构式(12)中的R的基团；具有相应的R1的基团，其中q=q0-2、q=q0-4或q=q0-6，只要R所选的基团是结构式(2)，其中q=q0；具有相应的R2的基团，其中r=r0-3、r=r0-4或r=r0-6，只要R所选的基团是结构式(3)，其中r=r0；和具有相应的R3的基团，其中s=s0-2、s=s0-4或s=s0-6，只要R所选的该基团是结构式(4)，其中s=s0，条件是q0-2、r0-2或s0-2,q0-4、r0-4或s0-4,q0-6、r0-6或s0-6是一个或多个整数， 其中R1选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，q是选自1-8的整数；在结构式(3)中，R2选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，r是选自1-8的整数；在结构式(4)中，R3选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，S是选自1-8的整数。特别是，该制备方法的特征在于获得由上述通式(13)表示的单体单元组成的聚羟基链烷酸酯。
在此方法中，只使用结构式(12)的链烷酸酯作为原料可以制备包含相应的单体单元，有时和伴随具有较短碳链的二级单体单元的PHA。如上所述，多种结构式(12)的链烷酸酯还可以用作原料，那时，考虑到制备的聚合物需要的功能和性能，优选使用适当数量的链烷酸酯。通常，使用不超过约五种不同结构式(12)的链烷酸酯作为原料完全可以达到预期的上述目的。此外，为了精细地控制功能和性能，可以使用五种以上不同的原料。例如，可使用总数超过五种的不同原料，该原料由不超过约三种不同的链烷酸酯组成，每种选自由上述通式(2)、(3)和(4)表示的链烷酸酯基团。
在结构式(2)中苯环上的取代基R1和在结构式(3)中苯环上的取代基R2可以选自邻位(2-或6-位置)、间位(3-或5-位置)或对位(4-位置)的任何位置。所得到的聚羟基链烷酸酯包含具有相应的取代苯环的单体单元。根据预期功能和性能可合适地确定选择一种异构体作为原料。当上述功能和性能的不同不是关键的问题时，可以更有利地使用在苯环的对位(4-位置)上具有取代基的链烷酸酯，就产率和准备工作而言，其类似于掺入聚合物中的未被取代的链烷酸酯。同样地，在结构式(4)的环己基环上取代基R3的位置可以选自1-、2-(或6-)、3-(或5-)和4-位置的任何位置，而且可以选择顺式和反式两种构型。所得到的聚羟基链烷酸酯包含具有相应的取代环己基环的单体单元。根据预期功能和性能可合适地确定选择一种异构体作为原料。当上述功能和性能的不同不是关键的问题时，可以更有利地使用在环己基环的4-位置上具有取代基的链烷酸酯，就产率和准备工作而言，其类似于掺入聚合物中的未被取代的链烷酸酯。用微生物制备的聚羟基链烷酸酯，在单体单元的3-位置的碳原子上有手性中心，通常是仅仅由R-体组成的聚合物，即全同立构聚合物。因此，用本方法制备的PHA成为一种具有生物降解性的聚合物。
按照本发明的方法，用两步骤可以培养微生物，该步骤包括在包含结构式(12)的链烷酸酯和酵母提取物的介质中初始培养，和在包含链烷酸酯和有限氮源的介质中后续培养。还可以在包含结构式(12)和酵母提取物的培养基中一步培养微生物。此外，使用的微生物优选选自属于假单胞菌属种的微生物。可方便得到属于假单胞菌属种的菌株例子，如菊苣假单胞菌(Pseudomonascichorii)YN2(FERM BP-7375)、菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)H45(FERM BP-7374)、腐臭假单胞菌(Pseudomonas putida)P91(FERMBP-7373)和jessenii假单胞菌P161(FERM BP-7376)，且更优选选择上述四种菌株的任何一种。
下面将逐一地和更明确地描述在制备本发明聚羟基链烷酸酯的方法的第一个实施方案中的优选方式。
本发明人已经成功地获得了微生物，当其在包含酵母提取物和结构式(14)的4-苯氧基丁酸(PxBA)的培养基中培养时，能够制备由结构式(5)的3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)的单体单元组成的聚3-羟基-4-苯氧基丁酸(PHPxB)均聚物 因此，本发明制备聚羟基链烷酸酯的方法的上述第一个实施方案包括一种方式，其特征在于具有培养微生物的步骤，该微生物在包含结构式(14)的PxBA和酵母提取物的介质中能够利用PxBA制备由结构式(5)的3HPxB单体重复单元组成的PHPxB均聚物。
一直没有报道过使用PxBA作为底物用微生物制备包含3HPxB的单体单元的聚羟基链烷酸酯，以及用微生物制备聚羟基链烷酸酯的PHPxB均聚物。因此，用上述方法获得PHPxB是新的，且包括在本发明提供的新的聚羟基链烷酸酯中。
本发明人还成功地获得微生物，当其在包含酵母提取物和结构式(15)的5-苯氧基戊酸(PxVA)的培养基中培养时，能够制备由结构式(6)的3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)单体单元组成的均聚物 因此，包括在上述第一个实施方案中的另一个方式其特征在于具有培养微生物的步骤，该微生物在包含结构式(15)的PxVA和酵母提取物的培养基中能够利用PxBA制备由结构式(6)的3HPxV单体重复单元组成的聚3-羟基-5-苯氧基戊酸(PHPxV)均聚物。
一直没有报道过使用PxVA作为底物用微生物制备包含3HPxV的单体单元的聚羟基链烷酸酯，以及用微生物制备聚羟基链烷酸酯的PHPxV均聚物。因此，用上述方法获得PHPxV是新的，且包含本发明提供的新聚羟基链烷酸酯。
本发明人还成功地获得微生物，当其在包含酵母提取物和结构式(17)的5-(4-氟苯氧基)戊酸(FPXVA)的介质中培养时，能够制备由结构式(16)的3-羟基-5-氟苯氧基戊酸(3HFPxV)单体单元组成的均聚物 因此，包括在上述第一个实施方案中的另一个方式其特征在于具有培养微生物的步骤，该微生物在包含结构式(17)的FPxVA和酵母提取物的培养基中能够利用FPxVA制备由结构式(16)的3HFPxV单体重复单元组成的聚3-羟基-5-(氟苯氧基)戊酸(PHFPxV)均聚物。
本发明人还成功地获得微生物，当其在包含酵母提取物和结构式(23)的7-苯氧基庚酸(PXHpA)的培养基中培养时，能够制备分别由结构式(6)和(22)表示的3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)和3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)单体单元组成的共聚物 因此，包括在上述第一个实施方案中的另一个方式其特征在于具有培养微生物的步骤，该微生物在包含结构式(23)的PxHpA和酵母提取物的介质中能够利用PxHpA制备分别由结构式(6)和(22)表示的3HPxV和3HPxHp单体单元组成的聚羟基链烷酸酯共聚物。
本发明人还成功地获得一种微生物，当其在包含酵母提取物和结构式(26)的8-苯氧基辛酸(PxOA)的培养基中培养时，能够制备分别由结构式(5)、(24)和(25)表示的3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPXB)、3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羟基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)组成的共聚物 因此，包括在上述第一个实施方案中的另一个方式其特征在于具有培养一种微生物的步骤，该微生物在包含结构式(26)的PxOA和酵母提取物的介质中能够利用PxOA制备分别由结构式(5)、(24)和(25)表示的3HPxB、3HPxHx和3HPxO单体单元组成的聚羟基链烷酸酯共聚物。
成功地获得了一种微生物，其制备由结构式表示的3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)、3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羟基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)单元组成的共聚物。
包括在上述第一个实施方案中的再一个方式包括步骤使用微生物培养法在包含上述结构式(28)表示的PxUDA和酵母提取物的培养基中用PxUDA制备由上述结构式(6)、(22)、和(27)表示的3HPxV、3HPxHp和3HPxN单体单元组成的聚羟基链烷酸酯共聚物。
此外，除了上述方法之外，在上述详细的特定形式的系列中，使用其中的具有苯氧基的侧链被所需的基团取代的结构式(12)的链烷酸酯作为单体组分的原料，用微生物可以选择地制备具有不同的相应侧链的PHA。使用结构式(12)的链烷酸酯作为原料和具有结构式(13)表示的单体单元组成的聚羟基链烷酸酯的生产方法也包括在上述生产本发明聚羟基链烷酸酯方法的第一个实施方案中。 (R至少是选自结构式(3)表示的一种或多种基团)； (R’是在上述结构式(12)中选择的基团，与R一样)和对于由下列结构式(3)表示和是r=r0的基团的情况，选为R的基团具有相应的R2，且至少一个或多个基团选自r=r0-2、q=r0-4或r=r0-6的基团。r0-2、r0-4或r0-6可以是1或以上的整数值； (其中R2选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，r是选自1-8的整数；)多数情况下，当用包含结构式(12)表示的一种链烷酸酯作为原料和相应的单体单元制备PHA时，有时减少了伴随碳链的副产物单体单元。另一方面，如上所述，用结构式(12)表示的链烷酸酯作为原料时，可以使用多种链烷酸酯进行培养。考虑到制备的聚合物所需的功能和物理性能，优选使用适当的几种。通常，最多使用3种结构式(12)表示的链烷酸酯作为原料，预期可以充分地完成上述目的。另外，为了精确地控制功能和物理性能，可以使用三种以上的多种原料。
对于原料来说，在结构式(3)的苯环上R2的任何一个取代位置可以选自邻位(位置2或位置6)、间位(位置3或位置5)或对位(位置4)。生产出的聚羟基链烷酸酯是含有相应取代苯氧基的单体单元的聚羟基链烷酸酯。根据目标功能和物理性能适当地确定选为原料的异构体。在上述功能和物理性能的差异不是问题的情况下，考虑到产率或容易快速形成聚合物，与未取代的相比，通常可以更优选使用在苯环的对位(位置4)上有取代基的聚羟基链烷酸酯。在用这种微生物制备的聚羟基链烷酸酯中，单体单元位置3的碳原子具有中心的手性，且通常是仅由R体组成的聚合物，和全同立构聚合物。所以，用这种方法制备的PHA是具有生物降解性的聚合物。
另外，发明人成功地获得当微生物在含结构式(18)表示的5-苯基戊酸(PVA)和酵母提取物的培养基中培养时，能够制备由结构式(9)表示的3-羟基-5-苯基戊酸(3HPV)单体单元组成的均聚物。 换句话说，包括在上述第一个实施方案中的另一个方法，其特征在于具有以下步骤在含有结构式(18)的PVA和酵母提取物的培养基中培养微生物，该微生物使用PVA可以制备由上述结构式(9)表示的3HPV单体重复单元组成的聚3-羟基-5-苯基戊酸(PHPV)均聚物。
发明人也成功地获得当微生物在含结构式(19)的5-(4-氟苯基)戊酸(FPVA)和酵母提取物的培养基中培养时，能够制备由结构式(7)表示的3-羟基-5-(4-氟苯基)戊酸(3HFPV)单体单元组成的均聚物。 换句话说，包括在上述第一个实施方案中的另一个方法，其特征在于具有以下步骤在含有结构式(19)的FPVA和酵母提取物的培养基中培养微生物，使用FPVA可以制备由结构式(7)表示的3HFPV单体重复单元组成的聚3-羟基-(4-氟苯基)戊酸(PHFPV)均聚物。
迄今为止，没有报道过以3HFPV作为单体单元、FPVA作为底物用微生物生产聚羟基链烷酸酯。也没有报道过用微生物生产聚羟基链烷酸酯，该聚羟基链烷酸酯是PHFPV的均聚物。所以，用上述方法生产出的PHFPV是一种新产品，且包括在本发明提供的新聚羟基链烷酸酯中。
发明人也成功地获得当微生物在含结构式(21)表示的6-苯基己酸(PHxA)和酵母提取物的培养基中培养时，能够制备由结构式(10)和(11)表示的3-羟基-4-苯丁酸(3HPB)和3-羟基-6-苯基己酸(3HPHx)单体单元组成的共聚物。
换句话说，包括在上述第一个实施方案中的另一个方法，其特征在于具有以下步骤在含有上述结构式(21)的PHxA和酵母提取物的培养基中培养微生物，使用PHxA到制备由上述结构式(10)和(11)表示的3HPB和3HPHx单体单元组成的聚羟基链烷酸酯共聚物。
迄今为止，没有报道过以PHxA作为底物用微生物生产含有3HPB和3HPHx单体单元的聚羟基链烷酸酯。也没有报导过用微生物制备由3HPB和3HPHx单体单元组成的聚羟基链烷酸酯的方法。所以，用上述方法生产出的由3HPB和3HPHx单体单元组成的聚羟基链烷酸酯是一种新产品，且包括在本发明提供的新聚羟基链烷酸酯中。
此外，除了上述方法之外，在上述详细的特定形式的系列中，使用具有苯基的侧链被所需的基团取代的结构式(12)的链烷酸酯作为单体组分的材料，用微生物可以选择地制备具有不同的相应侧链的PHA。使用结构式(12)的链烷酸酯作为原料和具有结构式(13)表示的单体单元的聚羟基链烷酸酯生产方法也包括在上述生产本发明聚羟基链烷酸酯方法的第一个实施方案中。 (在结构式(12)中，R是选自下列结构式(2)表示的至少一个或多个基团)
(在结构式(13)中，R’是选择与上述结构式(12)中的相同的R基团)，和如果选为R的基团是用结构式(2)表示的，且是q=q0的基团，具有相应的R1，且至少一个或多个基团选自q=q0-2、q=q0-4或q=q0-6，那么q0-2、q0-4或q0-6可以是1以上的整数值。) (结构式(2)中，R1选自2原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的官能团，q是选自1-8的整数。)在多数情况下，当用包含结构式(12)表示的一种链烷酸酯作为原料和相应的单体单元制备PHA时，在有些情况下，减少了伴随碳链的副产物单体单元。另一方面，如上所述，用结构式(12)表示的链烷酸酯作为原料时，可以使用多种链烷酸酯作为培养物。考虑到制备的聚合物所需的功能和物理性能，优选使用适当的几种。通常，最多使用3种结构式(12)表示的链烷酸酯作为原料，预期可以充分地完成上述目的。另外，为了精确地控制功能和物理性能，可以使用三种以上的多种原料。
对于原料来说，在结构式(2)的苯环上任何一个取代位置的R1可以选自邻位(位置2或位置6)、间位(位置3或位置5)或对位(位置4)。生产出的聚羟基链烷酸酯是含有相应取代苯基的单体单元的聚羟基链烷酸酯。根据目标功能和物理性能适当地确定选为原料的异构体。在上述功能和物理性能的差异没有问题的情况下，考虑到产率或容易快速形成聚合物，与未取代的相比，通常可以更优选使用在苯环的对位(位置4)上有取代基的聚羟基链烷酸酯。在用这种微生物制备的聚羟基链烷酸酯中，单体单元位置3的碳原子具有中心的手性，且通常是仅由R体组成的聚合物，和全同立构聚合物。所以，用这种方法制备的PHA是具有生物降解性的聚合物。
另外，发明人发现当使用4-环己基-丁酸(CHBA)作为底物，在含有CHBA和酵母提取物的培养基中培养微生物来制备聚羟基链烷酸酯以存储在细胞中；聚羟基链烷酸酯的单体单元包含高比例的3-羟基-4-环己基丁酸(3HCHB)，并表现出足够高的产率，生产出的聚羟基链烷酸酯含有3HCHB，发现进行纯化处理可以分离由3HCHB单体重复单元组成的PHCHB均聚物。
换句话说，包括在上述第一个实施方案的另一个方式是制备由3HCHB单体单元组成的聚3-羟基-4-环己基丁酸(PHCHB)的方法，和 制备PHCHB均聚物的方法，该均聚物由结构式(8)表示的3HCHB单体单元组成的，且其特征在于所有以下步骤在含有结构式(20)表示的CHBA和酵母提取物的培养基中培养微生物。 迄今为止，没有报道过用微生物生产聚羟基链烷酸酯的方法，该聚羟基链烷酸酯是PHCHB的均聚物。所以，用上述方法生产出的PHCHB是一种新产品，且包括在本发明提供的新聚羟基链烷酸酯的发明中。
此外，除了上述方法之外，在上面详细描述的系列特定形式中，使用结构式(12)的链烷酸酯(其中具有环己基的侧链被所需的基团取代)作为单体组分的材料，用微生物可以选择地制备具有不同的相应侧链的PHA。使用结构式(12)的链烷酸酯作为材料且具有结构式(13)表示的单体单元的聚羟基链烷酸酯的生产方法也包括在上述使用本发明聚羟基链烷酸酯的制备方法的第一个实施方案中。 (在结构式(12)中，R是选自下列结构式(4)表示的至少一个或多个基团) (在结构式(13)中，R’是选择与上述结构式(12)中的相同的R基团)，和如果选为R的基团是用结构式(4)表示，且是s=s0的基团，那么它具有相应的R3，且至少一个或多个基团选自s=s0-2、s=s0-4或s=s0-6。s0-2、s0-4或s0-6可以是1或以上的整数值。) (在结构式(4)中，R3选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，S是选自1-8的整数。)在多数情况下，当用含有一种结构式(12)表示的链烷酸酯作为原料和相应的单体单元制备PHA时，在有些情况下，减少了伴随碳链的副产物单体单元。另一方面，如上所述，用结构式(12)表示的链烷酸酯作为原料时，可以使用多种链烷酸酯作为培养物。考虑到制备的聚合物所需的功能和物理性能，优选使用适当的几种。通常，最多使用3种结构式(12)表示的链烷酸酯作为原料，预期可以充分地完成上述目的。另外，为了精确地控制功能和物理性能，可以使用三种以上的多种原料。
对于原料来说，在结构式(4)的环己基环上R3的任何一个取代位置可以选自位置1、位置2(或位置6)、位置3(或位置5)，和位置4。另外，可以选择顺式构型或反式构型二者之一。生产出的聚羟基链烷酸酯是含有相应取代环己基环的单体单元的聚羟基链烷酸酯。根据目标功能和物理性能适当地确定选为原料的异构体。在上述功能和物理性能的差异没有问题的情况下，考虑到产率或容易快速形成聚合物，与未取代的相比，通常可以更优选使用在环己基环的位置4上有取代基的聚羟基链烷酸酯。在用这种微生物制备的聚羟基链烷酸酯中，单体单元位置3的碳原子具有中心的手性，且通常是仅由R体组成的聚合物，和全同立构聚合物。所以，用这种方法制备的PHA是具有生物降解性的聚合物。
另外，发明人成功地获得一种微生物当其在含有酵母提取物和结构式(15)表示的5-苯氧基戊酸(PxVA)以及结构式(18)表示的5-苯基戊酸(PVA)的培养基中培养时，能够制备由结构式(6)表示3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)单体单元和结构式(9)表示的3-羟基-5-苯基戊酸(HPV)单体单元组成的共聚物。
换句话说，包括在上述第一个实施方案中的另一个方式是使用PxVA和PVA制备聚(3-羟基-5-苯氧基戊酸/3-羟基-5-苯基戊酸)共聚物的方法，其中该共聚物由上述结构式(6)和(9)表示的3HPxV单体单元和3HPV单体单元的重复单元组成，该方法其特征在于具有以下步骤在含有上述结构式(15)、(18)表示的PxVA和PVA，以及酵母提取物的培养基中培养微生物。
迄今为止，没有报道过以PHxA作为底物用微生物生产含有3HPxV和3HPV单体单元的聚羟基链烷酸酯的方法。也没有报导过用微生物制备由3HPxV和3HPV单体单元组成的聚羟基链烷酸酯的方法。所以，用上述方法生产出的且由3HPxV和3HPV单体单元组成的聚羟基链烷酸酯是一种新产品，并包括在本发明提供的新聚羟基链烷酸酯的发明中。
此外，除了上述方法之外，在上面详细描述的系列特定形式中，使用选自结构式(12)的链烷酸酯的多种链烷酸酯作为原料，用微生物可以选择地制备含有多种具有不同的相应侧链的单体单元的PHA。换句话说，本发明聚羟基链烷酸酯的制备方法的第一个实施方案包括使用多种链烷酸酯作为原料，以特殊形式制备聚羟基链烷酸酯的方法，该聚羟基链烷酸酯含有多种具有不同相应侧链的单体单元。
换句话说，该制备方法其特征在于在含有酵母提取物和结构式(12)表示的链烷酸酯的培养基中培养微生物
(在结构式(12)中，R是选自下列结构式(2)、(3)或(4)表示的至少一个或多个基团)，而且提取微生物获得结构式(13)表示的聚羟基链烷酸酯，该聚羟基链烷酸酯具有结构式(13)表示的至少一种单体单元 (在结构式(13)中，R’是选择与上述结构式(12)中的相同的R基团)，且至少一个或多个基团选自下列基团具有相应的R1，且为q=q0-2、q=q0-4或q=q0-6，条件是选为R的基团由结构式(2)表示，且是q=q0的基团，具有相应的R2，且r=r0-2、r=r0-4或r=r0-6，条件是选为R的基团由结构式(3)表示，且是r=r0的基团，和具有相应的R3，且s=s0-2、s=s0-4或s=s0-6，条件是选为R的基团由结构式(4)表示的，且是s=s0的基团。
q0-2、r0-2或s0-2，或q0-4、r0-4或s0-4，或q0-6、r0-6或s0-6可以是1或以上的整数值。) (在结构式(2)中，R1选自原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，q是选自1-8的整数；在结构式(3)中，R2选自选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，r选自1-8的整数；在结构式(4)中，R3选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，S是选自1-8的g整数。)特别是，该制备方法其特征在于获得由单体单元组成的聚羟基链烷酸酯，该单体单元具有与至少一种作为原料的链烷酸酯相应的侧链。换句话说，特征在于至少一个或多个侧链结构的单体单元的聚羟基链烷酸酯的制备方法，其中侧链结构的单体单元对应于每种链烷酸酯，特别地由源自每种链烷酸酯的每种单体单元组成的，此方法是使用多种类型的链烷酸酯作为原料，作为单体单元，根据选择的结构式(12)表示的多种类型的链烷酸酯，其可以反应生成聚羟基链烷酸酯。
在此方法中，当使用一种结构式(12)表示的链烷酸酯作为原料时，可以制备含有相应单体单元的PHA，而且在有些情况下，还含有减少了伴随碳链的副产物单体单元。另一方面，如上所述，用结构式(12)表示的链烷酸酯作为原料时，可以使用多种链烷酸酯作为培养物。考虑到制备的聚合物所需的功能和物理性能，优选使用适当的几种。通常，最多使用大约5种结构式(12)表示的链烷酸酯作为原料，预计足以完成上述目的。另外，为了精确地控制功能和物理性能，可以使用五种以上的多种原料。例如，可以包含上述结构式(2)、(3)或(4)的全部，最多选择三种，且它们总计使用5种原料。
在结构式(2)的苯环上的取代基团R1和在结构式(3)的苯环上的取代基R2可以选自邻位(位置2和位置6)、间位(位置3和位置5)和对位(位置4)的任何一个位置。生产出的聚羟基链烷酸酯是含有具有取代苯环的单体单元的聚羟基链烷酸酯。根据目标功能和物理性能适当地确定选为原料的异构体。对于上述功能和物理性能的差异不是问题的情况下，考虑到产率或容易快速形成聚合物，与未取代的相比，通常可以更优选使用对于苯环的对位(位置4)上有取代基的聚羟基链烷酸酯。同样地，在结构式(4)的环己基环上取代基R3可以选自位置1、位置2(或位置6)、位置3(或位置5)，和位置4的任何一个位置。另外，可以选择顺式构型或反式构型二者之一。生产出的聚羟基链烷酸酯是含有相应取代环己基环的单体单元的聚羟基链烷酸酯。根据目标功能和物理性能适当地确定选为原料的异构体。在上述功能和物理性能的差异不是问题的情况下，考虑到产率或容易快速形成聚合物，与未取代的相比，通常可以更优选使用在环己基环的位置4上有取代基的聚羟基链烷酸酯。在用这种微生物制备的聚羟基链烷酸酯中，单体单元位置3的碳原子具有中心的手性，且通常是仅由R体组成的聚合物，和全同立构聚合物。所以，用这种方法制备的PHA是具有生物降解性的聚合物。
以具有代表性的特殊形式详细描述本发明的聚羟基链烷酸酯的制备方法，使用以所需的基团取代链烷酸酯的侧链得到的衍生物作为原料，使用微生物可以选择地制备具有作为单体成分的不同侧链的聚羟基链烷酸酯，本发明也提供用这种方法获得的具有下列结构式(1)表示的单体组成的聚羟基链烷酸酯。换句话说，本发明新的聚羟基链烷酸酯是由结构式(1)表示的单体单元组成的聚羟基链烷酸酯。 (在结构式(1)中，R是选自下列结构式(2)、(3)或(4)表示的至少一个或多个基团) (在结构式(2)中，R1选自原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，q是选自1-8的整数；在结构式(3)中，R2选自选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，r选自1-8的整数；在结构式(4)中，R3是选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，s是选自1-8的整数。
这里，作为上述结构式(1)中的R，如果选择一种基团，从待选基团中排除下述基团在结构式(2)中，q=2且R1=H的基团，和q=3且R1=H的基团在结构式(3)中，r=2且R2=卤原子的基团，r=3且R2=-CN的基团，和r=3且R2=-NO2的基团如果选择二种基团，从待选基团中排除下列基团在结构式(2)中，在R1=H时q=3和5的两个基团的组合，在结构式(3)中，在R2=H且r=1和3时的两个基团的组合，在R2=H且r=2和4时的两个基团的组合，在R2=H且r=2和6时的两个基团的组合，以及在R2=卤原子且r=2和4时的两个基团的组合。
如果选择三种基团，从待选基团中排除下列基团在结构式(2)中，在R1=H且q=3、5和7时的三个基团的组合，在结构式(3)中，在R2=H且r=1、3和5时的三个基团的组合，以及在R2=H且r=2、4和6时三个基团的组合。
如上所述，本发明的聚羟基链烷酸酯可以包含一种结构式(1)表示的单体单元，以及包含多种单体单元。考虑到目标聚合物所需的功能和物理性能，优选使用适当的几种单体单元。通常，选择总计10种结构式(1)表示的单体单元，预计足以达到上述目的。另外，为了精确地控制功能和物理性能，在结构中可以含有10种以上的多种单体单元。
例如，当制备含有结构式(1)表示的多种单体单元的聚羟基链烷酸酯时，除了与作为原料的链烷酸酯相对应的单体单元之外，有时，会减少附带碳链上的副单体单元。因此，本发明包括即使使用大约5种链烷酸酯作为原料，每个产生的两种或以上的单体单元，该单体单元包括副产单体单元，结果获得包含总计10种以上单体单元的PHA。另外，例如，本发明包括包含三种上述结构式(2)、(3)和(4)的全部(其中每个最多选择大约3种)，且使用总计大约10种链烷酸酯作为原料，以生产出含有10种或以上的单体单元和含有少量多种副产单体单元的PHA。
在结构式(2)的苯环上的取代基团R1的取代位置和在结构式(3)的苯环上的取代基R2的取代位置可以选自邻位(位置2和位置6)、间位(位置3和位置5)和对位(位置4)。生产出的聚羟基链烷酸酯含有具有相应取代苯基的单体单元。根据目标功能和物理性能适当地确定选为原料的异构体。在上述功能和物理性能的差异不是问题的情况下，考虑到产率或容易快速形成聚合物，与未取代的相比，通常可以更优选使用在苯环的对位(位置4)上有取代基的聚羟基链烷酸酯。同样地，在结构式(4)的环己基环上R3的取代位置可以选自位置1、位置2(或位置6)、位置3(或位置5)，和位置4的任何一个位置。另外，可以选择顺式构型或反式构型二者之一。制备的聚羟基链烷酸酯含有相应取代环己基环的单体单元。根据目标功能和物理性能适当地确定选为原料的异构体。在上述功能和物理性能的差异不是问题的情况下，考虑到产率或容易快速形成聚合物，与未取代的相比，通常可以更优选使用在环己基环的位置4上有取代基的聚羟基链烷酸酯。在用这种微生物制备的聚羟基链烷酸酯中，单体单元位置3的碳原子具有中心的手性，且通常是仅由R体组成的聚合物，和全同立构聚合物。所以，用这种微生物方法制备的PHA是具有生物降解性的聚合物。
本发明PHA的制备方法其特征在于将酵母提取物加入到在培养基中的作为原料的结构式(12)的链烷酸酯中，在培养微生物过程中，在PHA中目标单体单元的含量比例增加很高，或在用微生物制备且存储的PHA中，PHA仅仅由目标单体单元组成。通过仅仅将酵母提取物加入到作为碳源的培养基中，而不使用链烷酸酯作PHA的原料，由此达到提高优化规定的单体单元的效果。
举例来说，在日本专利申请公开号549487描述的用微生物生产PHA方法中，在培养基中使用了酵母提取物，如使用的微生物属于rhodobacter种。然而，这些常规方法是使用没有取代基的羟基链烷酸作为单体单元制备普通的PHB和PHV。已经知道本发明目标PHA的生物合成方法是不同于生物合成方法制备PHB和PHV的新颖方法。在日本专利申请公开号5-49487中，没有提到酵母提取物在PHA生物合成本发明产品方法中的作用。另外，已经清楚地叙述了关于酵母提取物对于通常用微生物制备PHB和PHV的作用，即加入酵母提取物的效果是仅仅增加细胞中PHA聚集作用，不是为细胞增殖而加入酵母提取物。本发明通过结构式(12)的链烷酸酯与酵母提取物共存实现了PHA的制备和累积过程，以及增殖，酵母提取物表示出完全不同的作用。另外，优化是本发明的作用，以前从来没有提到列举的单体单元的优化，因此，本发明发现在用微生物制备的PHA组成中，具有作为取代基的苯氧基、苯基和环己基的特定的单体单元没有显示出优化的效果。
举例来说，上述日本专利号2989175描述了使用酵母提取物以微生物制备PHA，即使用了腐臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。在该专利中公开的PHA制备方法使用了两步骤培养，而且公开了在不同于碳源的营养源条件的限制下，仅仅在第二步骤的培养中进行PHA累积过程。在这点上，这些方法在结构和效果方面完全不同于本发明的方法，本发明方法在含有结构式(12)的链烷酸酯和酵母提取物的培养基中仅仅是单步培养以进行生物合成和累积所需的PHA。在日本专利2989175中酵母提取物的作用仅仅在于增殖微生物，在使用两步骤培养法中该微生物用于在第一步骤培养之后的第二步骤培养，而且已经清楚地叙述了第一步骤培养是在富营养物条件下进行的。这里，PHA的底物没有与第一步骤的培养同时存在。在本发明的两步骤培养中，酵母提取物的效果是在第一步骤培养中结构式(12)的链烷酸酯和酵母提取物同时存在的条件下进行PHA的制备和累积以及细胞增殖，这与在第一步骤培养中由酵母提取物的作用是完全不同的。另外，在日本专利2989175中，在第一步骤培养中，柠檬酸、辛酸、壬酸的任何一个共存作为碳源，因此，它在结构方面也不同于本发明，本发明是结构式(12)的链烷酸酯和酵母提取物共存。
作为能制备PHA(在本发明中，PHA含作为单体单元的3HPxB)以使其在细胞中集聚的微生物的例子，在高分子29卷，3432-3435页，1996中描述了使用食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)的方法。然而，使用食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)的该方法仅仅运用了8-苯氧基辛酸(PXOA)作为底物，因此，本质区别是它不能通过本发明的β氧化作用制备乙酰辅酶A，这完全不同于使用作为底物的PxBA和酵母提取物的方法。对于生物合成的PHA，制备由来源于作为底物的PxOA的3-羟基-8-苯氧基辛酸、来源于代谢产物副产品的3-羟基-6-苯氧基己酸、和3HPxB三种单体组成的共聚物。相反，在本发明中，使用酵母提取物可制备只含有3HPxB的PHA，该3HPxB来源于作为含苯氧基单体单元的PxBA。在上述报道的和本发明制备的PHA本身两者之间明显不同。另外，没有报道过使用PxBA作为底物，通过微生物制备含有3HPx作为单体单元的PHA的方法。另外，没有报道过使用PxBA作为底物，用微生物制备只含有作为单体单元的3HPxB的PHA的方法，该3HpxB含有苯氧基。
下面将详细地描述本发明的制备方法。
用于本发明的微生物可以是任何微生物，该微生物是能够使用作为底物的结构式(12)的链烷酸酯由链烷酸酯制备PHA和积聚的微生物。根据本发明人的研究，假单胞菌属的细菌是好的，且在它们中间，我们发现了菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)YN2,FERM BP-7375；菊苣假单胞菌(Pseudomonascichorii)H45,FERM BP-7374；腐臭假单胞菌(Pseudomonas putida)P91,FERM BP-7373；和jessenii假单胞菌P161 FERM BP-7376是优选的微生物。也使用不同于这些菌株的细胞，使用作为底物的链烷酸酯进行培养，进行筛选例如属于假单胞菌属种的细菌，可以获得可用于本发明PHA的制备方法的微生物。例如，作为属于假单胞菌属种的细菌，可以使用食油假单胞菌(Pseudomonasoleovorans)。除了属于假单胞菌属种的微生物之外，使用属于气单胞菌属、丛毛单胞菌属和伯克霍尔德氏菌属种的微生物，使用链烷酸酯作为原料(底物)，也可以制备含有相应3-羟基链烷酸酯作为单体单元的PHA。然而，考虑到生产率，建议使用上述4菌株作为最优选的菌株。
菌株YN2、H45、P91、和P161的详细资料列于如下。
<菌株YN2的细菌学上的性质>
培养温度30℃形态学细胞形状棒状，0.8μm×(1.5-2.0)μm革兰氏染色阴性孢子形成阴性可动性能动的菌落形状圆形的、完全平滑的边缘，低凸面的、光滑的表面，有光泽的，半透明的生理学的性能过氧化氢酶阳性氧化酶阳性O/F试验不可发酵的硝酸盐还原作用阴性吲哚产生阳性葡萄糖酸化作用阴性精氨酸二水解酶阴性脲酶阴性七叶苷(6-β-葡萄糖苷)水解阴性明胶水解阴性β-半乳糖苷酶阴性底物同化
葡萄糖阳性左旋阿拉伯糖阳性右旋甘露糖阴性右旋甘露糖醇阴性正乙酰-右旋葡萄糖胺阴性麦芽糖阴性葡糖酸钾阳性正癸酸阳性己二酸阴性消旋苹果酸阳性柠檬酸钠阳性乙酸苯酯阳性在King的B琼脂上荧光的制备阳性在4％NaCl中的生长阳性的(弱的)聚β-羟基丁酸的聚集阴性的(用苏丹黑染色法根据在营养琼脂上面的菌落生长确定)吐温80的水解阳性<菌株H45的细菌学上的性能>
形态特征晶胞形状和大小棒状，0.8μm×(1.0-1.2)μm细胞多形性不存在可动性阳性孢子形成阴性革兰氏染色阴性菌落形状圆形的、完全平滑的边缘，低凸面的、光滑的表面，有光泽的和奶油色生理学的性能过氧化氢酶阳性氧化酶阳性O/F试验氧化硝酸盐还原作用阴性吲哚制备阴性葡萄糖酸化作用阴性精氨酸二水解酶阴性脲酶阴性七叶苷(6-β-葡萄糖苷)水解阴性明胶水解阴性β-半乳糖苷酶阴性在King的B琼脂上荧光的制备阳性在4％ NaCl中的生长阴性聚β-羟基丁酸的聚集阴性底物同化葡萄糖阳性左旋阿拉伯糖阴性右旋甘露糖阳性右旋甘露糖醇阳性正乙酰-右旋葡萄糖胺阳性麦芽糖阴性葡糖酸钾阳性正癸酸阳性己二酸阴性消旋苹果酸阳性柠檬酸纳阳性乙酸苯酯阳性<菌株P91的细菌学上的性质>
形态特征晶胞形状和大小棒状，0.6μm×1.5μm细胞多形性不存在可动性阳性孢子形成阴性革兰氏染色阴性菌落形状圆形的、完全平滑的边缘，低凸面的、光滑的表面，有光泽的，奶油色生理学的性能过氧化氢酶阳性氧化酶阳性O/F试验氧化硝酸盐还原作用阴性吲哚制备阴性葡萄糖酸化作用阴性精氨酸二水解酶阳性脲酶阴性七叶苷(6-β-葡萄糖苷)水解阴性明胶水解阴性β-半乳糖苷酶阴性在King的B琼脂上荧光的制备阳性底物同化葡萄糖阳性左旋阿拉伯糖阴性右旋甘露糖阴性右旋甘露糖醇阴性正乙酰-右旋葡萄糖胺阴性麦芽糖阴性葡糖酸钾阳性正癸酸阳性己二酸阴性消旋苹果酸阳性柠檬酸钠阳性乙酸苯酯阳性<菌株P161的细菌学上的性质>
形态特征晶胞形状和大小球菌，直径为0.6μm或杆菌，0.6μm×1.5-2.0μm细胞多形性伸长可动性阳性孢子形成阴性革兰氏染色阴性菌落形状圆形的、完全光滑的边缘，低凸面的、光滑的表面，和浅黄色生理学的性能过氧化氢酶阳性氧化酶阳性O/F试验氧化硝酸盐还原作用阳性吲哚制备阴性葡萄糖酸化作用阴性精氨酸二水解酶阳性脲酶阴性七叶苷(6-β-葡萄糖苷)水解阴性明胶水解阴性β-半乳糖苷酶阴性在King的B琼脂上荧光的制备阳性底物同化葡萄糖阳性左旋阿拉伯糖阳性右旋甘露糖阳性右旋甘露糖醇阳性正乙酰-右旋葡萄糖胺阳性麦芽糖阴性葡糖酸钾阳性正癸酸阳性己二酸阴性消旋苹果酸阳性柠檬酸钠阳性乙酸苯酯阳性从上面描述的细菌学上的性能中，按照基于Bergey细菌分类学手册(1卷(1984))和Bergey细菌学签定手册(第9版本(1994))鉴别，菌株YN2和H45属于菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)而菌株P91属于腐臭假单胞菌(Pseudomonas putida).因此，我们将这些菌株命名为菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)YN2，菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)H45和腐臭假单胞菌(Pseudomonas putida)P91。
另一方面，尽管菌株P161识别为属于假单胞菌属种，但是根据细菌学上的性能不可能分类识别。于是，为了试图基于遗传学的标准识别，如图12所示，确定了P 161的16s rRNA的DNA序列(SEQ ID No:1)以试验与已知的假单胞菌属种微生物的16s rRNA的DNA序列的同种性。结果，发现在菌株P161和jessenii假单胞菌的序列两者之间具有很高的同种性。另外，发现在System.Appl.Microbiol.20:137-149(1997)和System.Appl.Microbiol.22:45-58(1999)中描述的jessenii假单胞菌的细菌学上的性能，与菌株P161的细菌学上的性能两者之间具有高的相似性、从上述结果可知，菌株P161可以无可非议地识别为jessenii假单胞菌，因此，我们将菌株P161命名为jessenii假单胞菌P161。
菌株YN2、H45、P91和P161保藏在国家生物科学和人类技术研究院，工业科学技术代理机构，日本国际贸易与工业部，接收的标识码分别为FERM BP-7375、FERM BP-7374、FERM BP-7373和FERM BP-7376。
使用能引入所需的单体单元的原料，和含有结构式(12)的链烷酸酯和酵母提取物的培养基，培养这些微生物，可以制备PHA。
为了常规培养用于制备本发明PHA的方法中的微生物，例如制备保藏细胞株和保持细胞数量和活性状态的培养，除严重地影响微生物的生长和存活的以外，可以使用任何种类的培养基，例如已经加入营养源的常规培养基和合成的培养基。根据使用的微生物，适当地调节培养条件例如温度、通风和搅拌。
另一方面，对于用微生物进行PHA的制备和聚集的情况，可以使用含有至少结构式(12)的链烷酸酯的无机培养基作为制备PHA的培养基、其特点是在这种情况下，作为碳或能源的非链烷酸酯的PHA原料的，只加入了酵母提取物。作为用于上述培养法中的无机培养基，可以使用含有增殖微生物必需的成分(例如磷源如磷酸盐和氮源如铵盐和硝酸盐)的任何一种。例如，可以列举的具有代表性的无机培养基有MSB培养基、E培养基(J.Biol.Chem.218:97-106(1956))和M9培养基。
用于本发明实施例中的M9培养基的组成如下Na2HPO4:6.2gKH2PO4:3.0gNaCl:0.5gNH4Cl:1.0g(一升培养基；pH7.0)作为培养条件，例如在15-40℃，优选20-35℃条件下振荡培养和搅拌培养。
对于培养步骤来说，可以使用用于正常微生物的任何方法，例如分批式系统、液化分批式系统、半连续培养、连续培养和反应器型式。可以使用连结许多步骤的多步骤系统。
例如，作为包括二阶段培养步骤的方法，第一步，使用含有大约0.1重量％-1.0重量％的酵母提取物和大约0.01重量％-0.5重量％的结构式(12)的链烷酸酯的无机培养基作为细胞增殖的碳源，从指数生长期的后期到持续状态期进行培养，在第二步中，通过离心法收集在第一步完成培养的细胞，接着在含有大约0.01重量％-0.5重量％作为原料的结构式(12)的链烷酸酯且缺乏任何氮源的无机培养基中进一步培养，完成培养之后，收集细胞以提取所需的PHA。
另一方法是在含有大约0.1重量％-1.0重量％的酵母提取物和大约0.01重量％-0.5重量％的结构式(12)的链烷酸酯的无机培养基中，且从指数生长期的后期到持续状态期进行培养，收集细胞以提取所需的PHA。
在这种情况下，根据结构式(12)的链烷酸酯的种类、微生物的种和属、细胞的密度或培养法合适地选择加入到培养基中的酵母提取物的浓度。其加入量通常优先选择在培养基中浓度为大约0.1重量％-1.0重量％的含量范围。另一方面，对于酵母提取物来说，可以优选使用任何一种市售的通常用于微生物培养的酵母提取物。另外，也可以使用将自然包含酵母提取物成分的冻干酵母制品粉碎制备的物质以代替酵母提取物。另一方面，根据微生物的种和属、细胞的密度或培养法合适地选择作为原料的结构式(12)的链烷酸酯的浓度。其加入量通常优先选择在培养基中浓度为大约0.01重量％-0.5重量％的含量范围。
对于使用任何一种前述菌株YN2、H45、P91和P161的情况，例如可以使用并混合C6-C12的中链脂肪酸(例如辛酸、壬酸等等)代替酵母提取物作为细胞增殖的碳源，生产出PHA是单体单元来源于已经加入的中链脂肪酸的PHA。特别地，例如使用下述方法，即其中使用了无机培养基，在此培养基中加入了中链脂肪酸例如辛酸、壬酸等等作为细胞增殖的碳源，以及加入了结构式(12)的链烷酸酯作为原料，从指数生长期的后期到持续状态期进行培养，通过离心法收集细胞，然后在没有氮源的无机培养基中加入中链脂肪酸和结构式(12)的链烷酸酯进行进一步的培养。或着，例如使用下述方法，即其中在无机培养基中氮源的浓度被限制在1/10，在加入了链脂肪酸和结构式(12)的链烷酸酯的培养基中进行培养，从指数生长期的后期到持续状态期的期间中收集细胞以提取所需的PHA。对于这些方法，其中将中链脂肪酸加入到培养基中作为细胞增殖的碳源，生产出PHA是已经混合了单体单元的PHA，其中该单体单元来源于作为细胞增殖的碳源加入的中链脂肪酸。
相反，在本发明中，如上所述，在含有酵母提取物、结构式(12)的链烷酸酯且没有其它碳源的培养基中培养上述微生物，制备和积聚含有少量或没有任何不必要的单体单元(即不同于来源于结构式(12)的链烷酸酯的单体单元)的所需的PHA。
按照本发明方法，使用有机溶剂如通常使用的氯仿提取方法，可非常方便地从细胞中收集PHA。然而，在难以使用有机溶剂的环境中，可以使用下述方法收集PHA，即用表面活性剂如十二烷基磺酸钠(SDS)处理，用酶如溶菌酶处理和用试剂如乙二胺四乙酸、次氯酸钠和铵处理以除去非PHA的细胞成分。
培养微生物、用微生物制备PHA并在细胞中积聚，然后从细胞中收集PHA并不局限于上述方法。
例如，可以使用用于本发明制备PHA方法中的微生物，不同于上述4菌株的具有本发明制备PHA的生产能力的微生物，以及类似于这4种菌株的微生物。使用上述方法，可以生产出具有结构式(1)表示的重复单元的PHA。PHA的数均分子量优选至少为10000或更多，且更优选为10000-200000。换句话说，特别是为了稳定地获得所需特性的聚合物，PHA优选具有数均分子量至少为大约10000的重复单元，以使特性例如由组成单体的单体单元结构决定的玻璃态转化温度、熔点、结晶度和取向在特定范围内。另一方面，对于处理等等来说，考虑到处理例如溶解操作的方便性，数均分子量优选低于大约200000。通常，更优选10000-100000的范围。本发明制备方法生产出的PHA的数均分子量为10000或更多，和大约20000或更多，且是在能预期足够地表现稳定的物理性能的上述聚合物的范围内。下面将描述具体的实施例，和更详细地说明本发明。这些具体的实施例是本发明最佳方式的实施例。然而，本发明并不局限于下列具体的实施例。
A描述下列实施例，其中本发明聚羟基链烷酸酯的制备方法用于制备聚羟基链烷酸酯由单体单元组成的聚3-羟基-4-苯氧基丁酸(PHPxB)，其中使用结构式(14)的4-苯氧基丁酸(PxBA)作为原料，所述单体单元源自于结构式(5)表示的3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)。在200毫升含有0.5％酵母提取物和0.1％PxBA的M9培养基中接种菌株P91，并在30℃下以125次振动/分钟进行振动培养。在24小时之后，通过离心沉淀收集细胞，再一次悬浮于200毫升含有0.1％PxBA且没有氮源(NH4Cl)的M9培养基中，然后在30℃下以125次振动/分钟进行振动培养。24小时之后，通过离心沉淀收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冻干。
将这些冻干的颗粒悬浮在100毫升的氯仿中，然后在60℃下搅拌20小时提取PHA。使用孔径为0.45μm的膜滤器过滤提取的液体，接着用旋转蒸发器浓缩，然后在冷的甲醇中再一次沉淀浓缩的液体，并只收集沉淀物，在真空中干燥生产出PHA。用常规方法将生产出的PHA经过甲醇分解，接着用气相色谱法质谱分析装置(GC-MS,Shimadzu QP-5050,E1方法)分析，并识别PHA单体单元甲基酯化了的产物。另一方面，使用凝胶渗透色谱法(GPC；Toso,HLC-8020,柱Polymer Laboratory(聚合物实验室)，PLgel-MIXED-C(5μm)，溶剂氯仿，聚苯乙烯转换的分子量)测量这些PHA的分子量。
表3表示了识别的结果和平均分子量。得知生产出的PHA只含有作为单体单元的来源于结构式(5)表示的3-羟基-4-苯氧基丁酸的单体单元，并且是聚3-羟基-4-苯氧基丁酸。在200毫升含有0.5％酵母提取物和0.2％PxBA的M9培养基中接种菌株P91，并在30℃下以125次振动/分钟进行振动培养。48小时之后，通过离心沉淀收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将这些冻干的颗粒悬浮在100毫升的氯仿中，然后在60℃下搅拌20小时提取PHA。使用孔径为0.45μm的膜滤器过滤提取的液体，接着用旋转蒸发器浓缩，然后在冷的甲醇中再一次沉淀浓缩的液体，并只收集沉淀物，在真空中干燥生产出PHA。用常规方法将生产出的PHA经过甲醇分解，接着用气相色谱法质谱分析装置(GC-MS,Shimadzu QP-5050,E1方法)分析，并识别PHA单体单元甲基酯化了的产物。表4表示了识别的结果。得知生产出的PHA只含有作为单体单元的来源于结构式(5)表示的3-羟基-4-苯氧基丁酸的单体单元，并且是聚3-羟基-4-苯氧基丁酸。使用核磁共振仪(傅里叶变换-核磁共振(FT-NMR):BrukerDPX400)在下列条件下分析从菌株P91的培养细胞中收集的PHA。测量用的核素1H，使用的溶剂重氯仿(含有四甲基硅烷(TMS))图1表示测量的结果，而表5表示每个信号的分析结果(属性)。表5表示下述3-羟基-4-苯氧基丁酸的结果。从结果中可知PHA只含有来源于结构式(5)表示的3-羟基-4-苯氧基丁酸的单体单元，并且证实它是聚3-羟基-4-苯氧基丁酸。
B下列将描述的实施例，其中本发明聚羟基链烷酸酯的制备方法用于制备聚羟基链烷酸酯由单体单元(源自于结构式(6)表示的3-羟基-5-苯氧基戊酸(HPXVA))组成的聚3-羟基-5-苯氧基戊酸(PHPXV)，其中使用结构式(15)的5-苯氧基戊酸(PxVA)作为原料。合成PxVA将240毫升无水丙酮装入3颈圆底烧瓶中，加入碘化钾(0.06摩尔)、碳酸钾(0.11摩尔)和苯酚(0.07摩尔)充分地搅拌。在该溶液中，在氮保护气氛中滴入5-溴基戊酸乙酯(0.06摩尔)，并在60±5℃下回流反应24小时。完成反应之后，使用蒸发器使反应溶液干燥浓缩，再一次溶解在二氯甲烷中，并将水加入到该溶液中分离，使用硫酸镁酐使有机层脱水，接着使用蒸发器干燥浓缩。将热的甲醇加入到干燥物质(反应物)中使之溶解，并再一次慢慢地冷却沉淀，得到5-苯氧基戊酸乙酯(PxVA)。在这一点上，这些酯与5-溴基戊酸乙酯的产量比是72摩尔％。
将生产出反应物(酯)溶于乙醇水(9∶1(体积/体积))中制成5重量％，加入10倍摩尔的氢氧化钾在0-40℃下反应4小时使酯水解。将这些反应溶液加入到10倍体积的0.1摩尔盐酸水溶液中，通过过滤收集沉淀物。在减压下于室温中将收集的沉淀物(反应物)干燥36小时。将产生的干燥物质溶于少量体积的热甲醇中，再一次使该溶液逐渐地冷却沉淀，在减压下于室温干燥沉淀物24小时，产生目标化合物5-苯氧基戊酸。这些目标化合物与5-溴基戊酸乙酯的产量比是53摩尔％。
用核磁共振仪(NMR)在下列条件下分析产生的化合物。
<使用的仪器>
傅里叶变换-核磁共振(FT-NMR)Bruker DPX4001H共振频率400MHz<测量的条件>
用于测量的核素1H使用的溶剂CDCl3参比物密封在毛细管中的TMS/CDCl3测量的温度室温图2表示了光谱的图，而表6表示了识别的结果。
结果证实了所需的PxVA的合成。用菌株P91制备PHPxV均聚物。
在200毫升含有0.5重量％酵母提取物(DIFCO公式生产)和0.1重量％PxVA的M9培养基中接种菌株P91，并在30℃下以125次振动/分钟进行振动培养。在24小时之后，通过离心沉淀收集细胞，再一次使细胞悬浮于200毫升含有0.1％PxVA且没有任何氮源(NH4Cl)的M9培养基中，然后进一步在30℃下和125次振动/分钟进行振动培养。24小时之后，通过离心沉淀收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥并称量。
将这些冻干的颗粒悬浮在100毫升的氯仿中，然后在60℃下搅拌20小时提取PHA。使用孔径为0.45μm的膜滤器过滤提取的液体，接着用旋转蒸发器浓缩，然后在冷的甲醇中再一次沉淀浓缩的液体，并只收集沉淀物，在真空中干燥生产出PHA并称重。表7表示细胞和聚合物的产率。
按照下列步骤分析生产出的PHA的组成。将5毫克的PHA试样装入25毫升体积的卵形的烧瓶中，加入含有2毫升氯仿和3％的硫酸(体积/体积)的2毫升甲醇在100℃下回流3.5小时，加入水使之分离，然后，用气相色谱法质谱分析装置(GC-MS,Shimadzu QP-5050,DB-WAXETR(J & W公司制造)，EI方法)分析有机层，识别PHA单体单元甲基酯化了的产物。结果，有单一的主峰。从其质谱中，得知是3-羟基-5-苯氧基戊酸的甲基酯化了的化合物。另外，其它少量的成分与PHA的单体单元没关系。图3A和3B表示了GC-MS的总的离子色谱图(TIC)和主峰的质谱。
在下列条件下将生产出的聚合物进行核磁共振分析。
<使用的仪器>
傅里叶变换-核磁共振(FT-NMR):Bruker DPX4001H共振频率400MHz<测量的条件>
用于测量的核素1H使用的溶剂CDCl3参比物密封在毛细管中的TMS/CDCl3测量的温度室温。
图4表示了光谱图，而表8表示了识别的结果。
另外，使用凝胶渗透色谱法(GPC；Toso,HLC-8020，柱Polymer Laboratory(聚合物实验室)，PLgel-MIXED-C(5μm)，溶剂氯仿，聚苯乙烯换算)测量生产出的PHA的分子量。结果是Mn=70000和Mw=121000。
作为上述结果，按照本发明，表示了使用PxVA作为原料的聚3-羟基-5-苯氧基戊酸的均聚物及其制备方法。用菌株H45制备PHPxV均聚物。
在200毫升含有0.5重量％酵母提取物(DIFCO公式生产)和0.1重量％PxVA的M9培养基中接种菌株H45，并在30℃下以125次振动/分钟进行振动培养。24小时之后，通过离心沉淀收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥并称量。
将这些冻干的颗粒悬浮在100毫升的氯仿中，然后在60℃下搅拌20小时提取PHA。使用孔径为0.45μm的膜滤器过滤提取的液体，接着用旋转蒸发器浓缩，然后在冷的甲醇中再一次沉淀浓缩的液体，并只收集沉淀物，在真空中干燥生产出PHA并称重。表9表示细胞和聚合物的产率。
按照下列步骤分析生产出的PHA的组成。将5毫克的PHA试样装入25毫升体积的卵形的烧瓶中，加入含有2毫升氯仿和3％的硫酸(体积/体积)的2毫升甲醇在100℃下回流3.5小时，加入水使之分离，然后，用气相色谱法质谱分析装置(GC-MS,Shimadzu QP-5050,DB-WAXETR(J&W公司制造)，EI方法)分析有机层，识别PHA单体单元甲基酯化了的产物。结果，有单一的主峰。从其质谱中，得知是3-羟基-5-苯氧基戊酸的甲基酯化了的化合物。另外，其它少量的成分与PHA的单体单元没关系。图5A和5B表示了GC-MS总的离子色谱图(TIC)和主峰的质谱。另外，使用凝胶渗透色谱法(GPC；Toso,HLC-8020,柱Polymer Laboratory(聚合物实验室)，PLgel-MIXED-C(5μm)，溶剂氯仿，聚苯乙烯换算)测量生产出的PHA的分子量。结果是Mn=64000和Mw=116000。
作为上述结果，按照本发明，表示了使用PxVA作为原料的聚3-羟基-5-苯氧基戊酸的均聚物及其制备方法。
C下列将描述的实施例，其中本发明聚羟基链烷酸酯的制备方法用于制备聚羟基链烷酸酯由单体单元(源自于结构式(16)表示的3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸(HFPxVA))组成的聚3-羟基-(4-氟苯氧基)戊酸(PHFPxV)，其中使用结构式(17)的5-(4-氟苯氧基)戊酸(FPxVA)作为原料。合成FPxVA在三颈圆底烧瓶中将碘化钠(0.06摩尔)、碳酸钾(0.11摩尔)和4-氟苯酚(0.07摩尔)加入到240毫升的无水丙酮中，然后充分地搅拌该混合物。在氮保护气氛中将5-溴戊酸乙酯(0.06摩尔)滴入该溶液中，并在60±5℃下将该混合物回流和反应24小时。完成反应之后，使用蒸发器使反应物溶液浓缩干燥。再一次将剩余物溶于氯代甲烷中并加入水，接着分离。用无水的硫酸镁使分离的有机溶剂层脱水，和使用蒸发器使之浓缩干燥获得反应物。
加入热水溶解获得的反应物，和再一次逐渐地使该溶液冷却沉淀为5-(4-氟苯氧基)戊酸乙酯。这里，化合物与5-溴基戊酸乙酯的产出率是68摩尔％。
将生产出反应物(酯)溶于乙醇-水(9∶1(体积/体积))中制成5重量％的溶液，加入10倍摩尔的氢氧化钾，在0-40℃下使该混合物反应4小时使酯水解。
在10倍体积的0.1M盐酸中加入反应物溶液，然后通过过滤收集沉淀物。在减压下于在室温下将收集的沉淀物(反应物)干燥36小时。将干燥的反应物溶于少量的热乙醇中，然后使该溶液逐渐地冷却以再沉淀。在减压下于室温下将该沉淀物干燥24小时，获得结构式(17)表示的目标化合物5-(4-氟苯氧基)戊酸。这些化合物与5-溴基戊酸乙酯的产出率是49摩尔％。
在下列条件下使用核磁共振分析获得的化合物。
<仪器>
傅里叶变换-核磁共振(FT-NMR):Bruker DPX4001H共振频率400MHz<测量条件>
核素1H溶剂CDCl3参比物TMS/CDCl3，密封在毛细管中温度室温图6表示1H-核磁共振光谱图，而表10表示了识别的结果。
从上述结果证实合成了FPxVA。使用菌株P91制备PHFPxV均聚物在200毫升含有0.5重量％酵母提取物(DIFCO)和0.1重量％FPxVA的M9培养基中接种菌株P91，并在30℃下以125次/分钟振荡培养。在24小时之后，通过离心沉淀收集细菌细胞，再一次使之悬浮于200毫升含有0.1％FPxVA且没有任何氮源(NH4Cl)的M9培养基中，然后进一步在30℃下和125次/分钟振荡培养。24小时之后，通过离心沉淀收集该细菌细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥并称量。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升的氯仿中，然后在60C下搅拌20小时提取PHA。用0.45μm的膜滤器过滤提取的溶液，然后使用旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中使浓缩物再沉淀，然后收集沉淀物并真空干燥获得PHA。称重获得的PHA。表11表示细菌细胞和聚合物的产率。
按照如下方法分析获得的PHA的组成将5毫克的PHA试样装入25毫升茄子型烧瓶中，加入2毫升的氯仿和2毫升含有3％(体积/体积)硫酸的甲醇，在100℃下将该混合物回流3.5小时，然后加入水来分离。分离后，使用气相色谱-质谱分析法(GC-MS,Shimadzu QP-5050，柱DBWAXETR(J&W公司制造)，E1方法)分析该有机溶剂层，识别出PHA单体单元的甲酯。结果，通过质量光谱测定法，呈现唯一的主峰，识别为3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸的甲酯。其它痕量组分与PHA单体单元无关。图7A和7B表示3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸的甲酯的TCI和质谱。
使用凝胶渗透色谱法(GPC；Toso,HLC-8020，柱Polymer Laboratory(聚合物实验室)，PLgel-MIXED-C(5μm)，溶剂氯仿，聚苯乙烯换算)确定获得的PHA的分子量Mn=68000和Mw=120000。
使用核磁共振(NMR)在下列条件下进一步分析获得的PHA的结构。
<仪器>
傅里叶变换-核磁共振(FT-NMR):Bruker DPX4001H共振频率400MHz<测量条件>
核素1H溶剂CDCl3参比物TMS/CDCl3，密封在毛细管中温度室温图8表示1H-核磁共振光谱图，而表12了识别的结果。
所以，已经说明了发明使用FPxVA原料制备的聚3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸酯均聚物及其制备方法。使用菌株H45制备PHFPxV均聚物在200毫升含有0.5重量％酵母提取物(DIFCO)和0.1重量％FPxVA的M9培养基中接种菌株H45的细胞，并在30℃下以125次/分钟振荡培养。24小时之后，通过离心沉淀收集该细菌细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥并称量。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升的氯仿中，然后在60℃下搅拌20小时提取PHA。用0.45μm的膜滤器过滤提取的溶液，然后使用旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中使浓缩物再沉淀，然后收集沉淀物并真空干燥获得PHA并称重。表13表示细菌细胞和聚合物的产率。
按照如下方法分析获得的PHA的组成将5毫克的PHA试样装入25毫升茄子型烧瓶中，加入2毫升的氯仿和2毫升含有3％(体积/体积)硫酸的甲醇，在100℃下将该混合物回流3.5小时，然后加入水来分离。分离后，使用气相色谱-质谱分析法(GC-MS,Shimadzu QP-5050，柱DBWAXETR(J&W公司制造)，EI方法)分析该有机溶剂层，识别出PHA单体单元的甲酯。结果，通过质谱分析呈现唯一的主峰，识别为3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸的甲酯。图9A和9B表示了GC-MS总的离子色谱图(TIC)和主峰的质谱。
使用凝胶渗透色谱法(GPC；Toso,HLC-8020，柱Polymer Laboratory(聚合物实验室)，PLgel-MIXED-C(5μm)，溶剂氯仿，聚苯乙烯换算)确定获得的PHA的分子量Mn=67000和Mw=119000。
所以，已经说明了本发明使用FPxVA原料制备的聚3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸酯均聚物及其制备方法。
D举例如本发明聚羟基链烷酸酯的制备方法应用于制备由来源于结构式(9)表示的3-羟基-5-苯基戊酸(HPVA)的单体单元组成的聚羟基链烷酸酯聚3-羟基-5-苯基戊酸酯(PHPV)，其中原料是结构式(18)表示的5-苯基戊酸(PVA)。在200毫升含有0.5％酵母提取物(Difco公司)和0.05％PVA的M9培养基中接种菌株H45，并在30℃下以125次/分钟振荡培养。24小时之后，通过离心沉淀收集该细菌细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升的氯仿中，然后在60℃下搅拌20小时提取PHA。用0.45μm的膜滤器过滤提取的溶液，然后使用旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中使浓缩物再沉淀，然后收集沉淀物并真空干燥获得PHA。通过通常的方法使获得的PHA经过甲醇分解，然后使用气相色谱-质谱分析法(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)分析识别出为PHA单体单元的甲酯。使用凝胶渗透色谱法(GPC:Toso HLC-8020，柱聚合物Laboratory.PLgel.MIXEDC.5μm，溶剂氯仿，聚苯乙烯换算的分子量)确定PHA的分子量。表14表示了识别的结果、平均分子量和生产量，以及冻干的颗粒和收集的聚合物的产出率。
如表14所示，已经证实了从细菌细胞提取和收集的聚合物只包含作为PHA单体单元的来源于结构式(9)表示的3-羟基-5-苯基戊酸的单体单元。在200毫升含有0.5％酵母提取物(Difco公司的)和0.1％PVA的M9培养基中接种菌株H45，并在30℃下以125次/分钟振荡培养。在24小时之后，通过离心沉淀收集细菌细胞，再一次使之悬浮于200毫升含有0.2％PVA且没有任何氮源(NH4Cl)的M9培养基中，然后在30℃下以125次/分钟振荡培养。24小时之后，通过离心沉淀收集该细菌细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升的氯仿中，然后在60℃下搅拌20小时提取PHA。用0.45μm的膜滤器过滤提取的溶液，然后使用旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中使浓缩物再沉淀，然后收集沉淀物并真空干燥获得PHA。通过常见的方法使获得的PHA经过甲醇分解，然后使用气相色谱-质谱分析法(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)分析识别出PHA单体单元的甲酯。使用凝胶渗透色谱法(GPC:Toso HLC-8020，柱聚合物Laboratory.PLgel.MIXEDC.5μm，溶剂氯仿，聚苯乙烯换算的分子量)确定PHA的分子量。表15表示了识别的结果、平均分子量和生产量，以及冻干的颗粒和收集的聚合物的产出率。
如表15所示，已经证实了从细菌细胞提取和收集的聚合物只包含作为PHA单体单元的来源于结构式(9)表示的3-羟基-5-苯基戊酸的单体单元。在200毫升含有0.5％酵母提取物(Difco公司生产)和0.1％PVA的M9培养基中接种菌株P91，并在30℃下以125次/分钟振荡培养。在24小时之后，通过离心沉淀收集细菌细胞，再一次使之悬浮于200毫升含有0.1％PVA且没有任何氮源(NH4Cl)的M9培养基中，然后在30℃下以125次/分钟振荡培养。24小时之后，通过离心沉淀收集该细菌细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将干燥的颗粒悬浮在100毫升的氯仿中，然后在60℃下搅拌20小时提取PHA。用0.45μm的膜滤器过滤提取的溶液，然后使用旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中使浓缩物再沉淀，然后收集沉淀物并真空干燥获得PHA。通过常见的方法使获得的PHA经过甲醇分解，然后使用气相色谱-质谱分析法(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)分析识别出PHA单体单元的甲酯。表16表示了识别的结果、平均分子量和生产量，以及冻干的颗粒和收集的聚合物的产出率。
如表16所示，已经证实了从细菌细胞提取和收集的聚合物只包含作为PHA单体单元的来源于结构式(9)表示的3-羟基-5-苯基戊酸的单体单元。在200毫升含有0.5％酵母提取物(Difco公司生产)和0.1％PVA的M9培养基中接种菌株P161，并在30℃下以125次/分钟振荡培养。在24小时之后，通过离心沉淀收集细菌细胞，再一次使之悬浮于200毫升含有0.1％PVA且没有任何氮源(NH4Cl)的M9培养基中，然后在30℃下以125次/分钟振荡培养。24小时之后，通过离心沉淀收集该细菌细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将这些冻干的颗粒悬浮在100毫升的氯仿中，然后在60℃下搅拌20小时提取PHA。用0.45μm的膜滤器过滤提取的溶液，然后使用旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中使浓缩物再沉淀，然后收集沉淀物并真空干燥获得PHA。通过常见的方法使获得的PHA经过甲醇分解，然后使用气相色谱-质谱分析法(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)分析识别出PHA单体单元的甲酯。通过凝胶渗透色谱法(GPC:TosoHLC-8020，柱聚合物Laboratory.PLgel.MIXEDC.5μm，溶剂氯仿，聚苯乙烯换算的分子量)确定获得的PHA的分子量。表17表示了识别的结果、平均分子量和生产量，以及冻干的颗粒和收集的聚合物的产出率。
如表17所示，已经证实了从细菌细胞提取和收集的聚合物只包含作为PHA单体单元的来源于结构式(9)表示的3-羟基-5-苯基戊酸的单体单元。使用核磁共振(傅里叶变换-核磁共振(FT-NMR):BrukerDPX400)在下列条件下核素1H和13C，溶剂重氯仿(含有四甲基硅烷(TMS))分析用菌株H45制备的PHPV。图10表示1H-核磁共振光谱图，而表18列出了每个峰的识别标志。图11表示碳-13核磁共振光谱图，而表19列出了每个峰的识别标志。
所以，已经证实了从细菌细胞提取和收集的聚合物是聚3-羟基-5-苯基戊酸，其只含有作为PHA单体单元的来源于结构式(9)表示的3-羟基-5-苯基戊酸的单体单元。
E举例说明本发明聚羟基链烷酸酯的制备方法应用于制备由来源于结构式(7)表示的3-羟基-5-(4-氟苯基)戊酸(HFPVA)的单体单元组成的聚羟基链烷酸酯聚3-羟基-5-(4-氟苯基)戊酸酯(PHFPV)，其中原料是结构式(19)表示的5-(4-氟苯基)戊酸(FPVA)。首先按照高分子(29卷，1762-1766(1996)和27卷，45-49(1994))中所示通过格利雅反应(Grignard reaction)合成底物FPVA将5-溴基戊酸溶于无水的四氢呋喃(THF)中，然后在-20℃下于氢气氛中滴加入3M甲基氯化镁四氢呋喃溶液。搅拌15分钟之后，进一步滴入1-溴基-4-氟代苯与镁的四氢呋喃溶液，并加入0.1M Li2CuCl4四氢呋喃溶液(温度保持在-20℃)。使反应溶液的温度返回到室温。搅拌该溶液过夜，然后注入20％冰冷的硫酸中并搅拌。收集水层并用氯化钠使之饱和，接着用醚提取用100毫升包括50克氢氧化钾的去离子水提取该提取物，并用20％硫酸氧化，接着收集沉淀物。
使用核磁共振(傅里叶变换-核磁共振(FT-NMR):BrukerDPX400)在下列条件下核素1H和13C，溶剂重氯仿(含有四甲基硅烷(TMS))分析这些沉淀物。图13和表20表示了分析的结果。在200毫升含有0.5％酵母提取物(Difco公司的)和0.1％ FPVA的M9培养基中接种菌株H45，并在30℃下以125次/分钟振荡培养。24小时之后，通过离心沉淀收集该细菌细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将这些冻干的颗粒悬浮在100毫升的氯仿中，然后在60℃下搅拌20小时提取PHA。用0.45μm的膜滤器过滤提取的溶液，然后使用旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中使浓缩物再沉淀，然后收集沉淀物并真空干燥获得PHA。通过常见的方法使获得的PHA经过甲醇分解，然后使用气相色谱-质谱分析法(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)分析识别出PHA单体单元的甲酯。表21表示了该结果。在200毫升含有0.5％酵母提取物(Difco公司的)和0.1％FPVA的M9培养基中接种菌株P91，并在30℃下以125次/分钟振荡培养。在24小时之后，通过离心沉淀收集细菌细胞，再一次使之悬浮于200毫升含有0.1％FPVA且没有任何氮源(NH4Cl)的M9培养基中，然后在30℃下以125次/分钟振荡培养。24小时之后，通过离心沉淀收集该细菌细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。
将冻干的颗粒悬浮在100毫升的氯仿中，然后在60℃下搅拌20小时提取PHA。用0.45μm的膜滤器过滤提取的溶液，然后使用旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中使浓缩物再沉淀，然后收集沉淀物并真空干燥获得PHA。用常见的方法使获得的PHS经过甲醇分解，然后使用气相色谱-质谱分析法(GC-MS,ShimadzuQP-5050,EI方法)分析识别出PHS单体单元的甲酯。表22列出了该结果。在200毫升含有0.5％酵母提取物(Difco公司的)和0.1％FPVA的M9培养基中接种菌株P161，并在30℃下以125次/分钟振荡培养。在24小时之后，通过离心沉淀收集细菌细胞，再一次使之悬浮于200毫升含有0.1％FPVA且没有任何氮源(NH4Cl)的M9培养基中，然后在30℃下以125次/分钟振荡培养。24小时之后，通过离心沉淀收集该细菌细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥。将冻干的颗粒悬浮在100毫升的氯仿中，然后在60℃下搅拌20小时提取PHA。用0.45μm的膜滤器过滤提取的溶液，然后使用旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中使浓缩物再沉淀，然后收集沉淀物并真空干燥获得PHA。用常见的方法使获得的PHA经过甲醇分解，然后使用气相色谱-质谱分析法(GC-MS,ShimadzuQP-5050,EI方法)分析识别出PHA单体单元的甲酯。表23表示了该结果。使用核磁共振波谱仪(傅里叶变换-核磁共振波谱仪(FT-NMR):BrukerDPX400)在下列条件下测量的核素1H和13C，使用的溶剂重氯仿(含有四甲基硅烷(TMS))分析来源于菌株H45的PHFPV。结果示于图14、表24、图15和表25中。
F下面是本发明方法的一个实施例，其中使用4-环己基丁酸(CHBA，结构式20)作为原料制备由3-羟基-4-环己基丁酸(3-HCHBA)单体单元(结构式8)组成的聚羟基链烷酸酯。用菌株YN2制备含有3-羟基-4-环己基丁酸作为单体单元的PHA(一步培养)在200毫升补充有0.5％酵母提取物和0.1％4-环己基丁酸的液体M9培养基中接种菌株YN2的菌落，其中该菌落长在补充有0.1％酵母提取物的M9琼脂培养基的上面，然后在30℃下培养。24小时之后，通过离心沉淀收集该细胞，用甲醇洗涤，然后冷冻干燥。
称量之后，将冻干的颗粒悬浮在100毫升的氯仿中，在60℃下混合20小时提取PHA。然后通过0.45μm的滤波器过滤该混合物，用蒸发器浓缩该滤出液。将冷的甲醇加入到该浓缩物中以再沉淀聚合物材料。然后在室温下真空干燥该聚合物并称重。表26表示获得的冻干颗粒和收集的聚合物的重量，以及聚合物的产率(CDW细胞质量(干重)，PDW聚合物(干重))。
在上述现有技术(表2)中，由3-HCHBA单元组成的PHA的产率是89.1毫克/升培养物。另一方面，上述本发明实施例的结果表明产率比现有技术高2.5倍。而且，显著地提高了单位干燥细胞质量的产率。
获得的PHA的组成分析如下将大约10毫克的PHA放入25毫升茄子型烧瓶中，并溶于2毫升的氯仿中，然后将2毫升含有3％硫酸的甲醇加入到该溶液中，并反应3.5小时在100℃回流。当完成反应时，将10毫升的去离子水加入到该溶液中并用力摇动10分钟。随后，取去分离的下层氯仿层，并用硫酸镁干燥。使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)识别氯仿层中的甲基酯化的PHA成分。结果，PHA单体单元的98％是结构式(8)的3-HCHBA，而PHA单体单元的2％是3-羟丁酸。也存在少量的环己基甲醇。
如上所述，按照本发明的制备方法，可以获得含有显著高含量的3-HCHBA的PHA。证明了在本发明方法中加入酵母提取物的作用。该制备方法是一种效率很高的方法，即每单位体积培养物或每单位重量细胞质量的产率高。因此，证明了本制备方法在下面两方面效率很高，即3-HCHBA单元的含量高和产率高。
用菌株H45制备含有3-羟基-4-环己基丁酸作为单体单元的PHA(一步培养)。
在200毫升补充有0.5％酵母提取物和0.14-环己基丁酸的液体M9培养基中接种菌株H45的菌落，并在30℃下培养，其中该菌落长在补充有0.1％酵母提取物的M9琼脂培养基的上面。24小时之后，通过离心沉淀收集该细胞，用甲醇洗涤，然后冷冻干燥。
称量之后，将冻干的(lyophiled)颗粒悬浮在100毫升的氯仿中，在60℃下混合20小时提取PHA。然后通过0.45μm的滤波器过滤该混合物，用蒸发器浓缩该滤出液。将冷的甲醇加入到该浓缩物中以再沉淀聚合物材料。然后在室温下真空干燥该聚合物并称重。表27表示获得的冻干颗粒的重量(CDW)和收集的聚合物的重量(PDW)，以及聚合物的产率。
在上述现有技术(表2)中，由3-HCHBA单元组成的PHA的产率是89.1毫克/升培养物。另一方面，本发明上述实施例的结果表明产率比现有技术高1.3倍。而且，显著地提高每单位干燥细胞质量的产率。
获得的PHA的组成分析如下将大约10毫克的PHA放入25毫升茄子型烧瓶中，并溶于2毫升的氯仿中，然后将2毫升含有3％硫酸的甲醇加入到该溶液中，并反应3.5小时在100℃回流。当完成反应时，将10毫升的去离子水加入到该溶液中并用力摇动10分钟。随后，去掉分离的下层氯仿层，并用硫酸镁于燥。使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)识别氯仿层中的甲基酯化的PHA成分。结果，PHA单体单元的97％是结构式(8)的3-HCHBA，而PHA单体单元的3％是3-羟丁酸。也存在少量的环己基甲醇。
如上所述，按照本发明的制备方法，用菌株H45也可以获得含有3-HCHBA的显著高质量的PHA。
用菌株P161制备含有3-羟基-4-环己基丁酸作为单体单元的PHA(一步培养)在200毫升补充有0.5％酵母提取物和0.1％4-环己基丁酸的液体M9培养基中接种菌株H45的菌落，并在30℃下培养，其中该菌落长在补充有0.1％酵母提取物的M9琼脂培养基的上面。24小时之后，通过离心沉淀收集该细胞，用甲醇洗涤，然后冷冻干燥。
称量之后，将冻干的(lyophiled)颗粒悬浮在100毫升的氯仿中，在60℃下混合20小时提取PHA。然后通过0.45μm的滤波器过滤该混合物，用蒸发器浓缩该滤出液。将冷的甲醇加入到该浓缩物中以再沉淀聚合物材料。然后在室温下真空干燥该聚合物并称重。表28表示了获得的冻干颗粒和收集的聚合物的重量，以及聚合物的产率。
在上述现有技术(表2)中，由3-HCHBA单元组成的PHA的产率是89.1毫克/升培养物。另一方面，本发明上述实施例的结果表明产率比现有技术高1.5倍。而且，显著地提高了单位干燥细胞质量的产率。
获得的PHA的组成分析如下将大约10毫克的PHA放入25毫升茄子型烧瓶中，并溶于2毫升的氯仿中，然后将2毫升含有3％硫酸的甲醇加入到该溶液中，并反应3.5小时在100℃回流。当完成反应时，将10毫升的去离子水加入到该溶液中并用力摇动10分钟。随后，去掉分离的下层氯仿层，并用硫酸镁干燥。使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS,Shimadzu QP-5050,EI方法)识别氯仿层中的甲基酯化的PHA成分。结果，PHA单体单元的94％是结构式(8)的3-HCHBA，而PHA单体单元的6％是3-羟丁酸。也存在少量的环己基甲醇。
如上所述，按照本发明的制备方法，用菌株P161也可以获得含有3-HCHBA的显著高质量的PHA。使用菌株YN2制备含有3-羟基-4-环己基丁酸单元的PHA(二阶段培养)。
在含有0.5％酵母提取物和0.1％4-环己基丁酸的M9液体培养基(200毫升)中接种菌株YN2的菌落，然后在30℃下培养，其中该菌落长在含有0.1％酵母提取物的M9琼脂培养基的上面。24小时之后，通过离心沉淀收集该细胞。随后，将该细胞转移进含有0.1％4-环己基丁酸但是没有NaCl和NH4Cl的新鲜的M9培养基中，并在30℃下培养21小时。接着，用甲醇洗涤该细胞一次，然后冻干。
称重这些冻干的颗粒，然后按照与实施例F-1相同的方法收集聚合物。在室温下真空干燥这些聚合物并称重。获得的冻干颗粒的重量(CDW)和收集聚合物的重量(PDW)，以及聚合物的产率示于表29中。
尽管上述常规报道(表2)中含有来源于3-羟基-4-环己基丁酸的单元的PHA的产量为89.1毫克/升培养基，本发明实施例会获得大约为该产量的3.2倍。而且也显著地提高了单位干细胞质量的产率。
用按照与本发明实施例F-1相同的方法评定获得的PHA的组成，结果，其99％是源自于结构式(8)表示的3-羟基-4-环己基丁酸的单元，而1％是3-羟丁酸的单元。也存在少量的环己基甲醇。
使用气相分布色谱法(TOSOH,HLC-8020，柱Polymer Laboratory(聚合物实验室)PLgel MIXED-C(5μm)，溶剂氯仿，换算成聚苯乙烯)确定获得的聚合物的分子量Mn=49000和Mw=100000。
上述的结果表明使用本发明的制备方法能够获得含有显著高含量单元的PHA，其中该单元来源于结构式(8)表示的3-羟基-4-环己基丁酸。证明了在本发明方法中在培养基中加入酵母提取物的作用。另外，显著地提高了每单位培养基的产率和每单位细胞质量的产率。因此，证明了本发明的方法在下面两方面是有效率很高的制备方法聚合物中3-羟基-4-环己基丁酸单元的含量高和产率高。
将实施例F-1与这些实施例比较，然后证明了通过在含有酵母提取物和4-环己基丁酸的无机培养基中培养该细胞，然后转移到不含有酵母提取物的矿物培养基中培养的这一方法，也可获得含有显著高含量的3-羟基-4-环己基丁酸单元的PHA。纯化和核磁共振分析由3-羟基-4-环己基丁酸单元组成的PHA进行下列纯化方法以便从实施例F-2获得的聚合物中除去混入的PHB(聚3-羟丁酸)组分和认为是环己基甲醇的组分。
将该聚合物悬浮在丙酮中，并在60℃下进行提取24小时。通过离心沉淀收集上层清液，然后用丙酮从沉淀的部份中再一次进行提取。重复这些操作5次，然后用蒸发器浓缩收集的上层清液和彻底地干燥。将完全干燥的试样溶于少量的氯仿中，然后在冷的甲醇中再一次沉淀。重复这些操作3次，然后真空干燥获得的聚合物。称重获得的干燥聚合物为281毫克。
对聚合物进行1H-核磁共振和碳-13核磁共振分析(傅里叶变换-核磁共振(FT-NMR):BrukerDPX400，使用的溶剂重氯仿(含有四甲基硅烷(TMS)))。1H-核磁共振的图示于图16，其分布表示在表30中，而碳-13核磁共振的图示于图17，其该分布表示在表31中。
从这些评估中，可以断定除去了混入的PHB(聚3-羟基丁酸)组分和认为是环己基甲醇的组分，以及收集了由3-羟基-4-环己基丁酸组成的PHA。
G本发明制备聚羟基链烷酸酯方法的一个例子是用于制备下列化合物使用7-苯氧基庚酸作为原料，由包括3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)的单体单元组成的聚羟基链烷酸酯，其是由3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)组成的共聚物。使用菌株YN2(酵母提取物-一阶段培养)制备P(HPxV/HPxHp)聚合物将菌株YN2接种到200毫升含有0.5％酵母提取物(Difco公司制备)和0.1％7-苯氧基庚酸(PxHpA)的M9培养基中，并在30℃以125次/分振动培养。64小时之后，通过离心沉淀收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥并称重。
将这些冻干的颗粒悬浮在100毫升的丙酮中，并在室温(23℃)下通过混合提取该聚合物72小时。通过0.45μm孔径的膜滤器过滤提取物，然后通过旋转蒸发器浓缩。接着，在冷的甲醇中再沉淀浓缩物，然后收集沉淀物。真空干燥获得的聚合物并称重。
使用凝胶渗透色谱法(GPC:Toso HLC-8020，柱聚合物Laboratory.PLgel.MIXEI)-C.5μm，溶剂氯仿，以聚苯乙烯换算的分子量)确定获得的聚合物的分子量。用下列方法分析获得的聚合物单元的组成将5毫克的聚合物试样装入25毫升茄子型的烧瓶中，将2毫升的氯仿和2毫升含有3％(体积/体积)硫酸的甲醇加入到该溶液中，然后在100℃下进行回流3.5小时。通过在该溶液中加入水来分离。然后用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS,ShimadzuQP-5050，柱DB-WAXETR(J&W公司制造)，EI方法)分析该有机层，然后对PHA单体单元的甲基酯化的化合物进行识别。细胞和聚合物的产出率，以及单体单元的分析结果示于表32中。使用气相色谱-质谱联用法获得的3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯和3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯的质谱分别示于图18和图19中。
因此，说明用7-苯氧基庚酸作为底物，使用菌株YN2可以制备只由3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV3HPxV)和3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)的2个单元组成的PHA共聚物。使用菌株H45(酵母提取物单步骤培养)制备P(HPxV/HPxHp)聚合物在200毫升含有0.5％酵母提取物(Difco公司制备)和0.1％7-苯氧基庚酸(PxHpA)的M9培养基中接种菌株H45，并在30℃下以125次/分振动培养。64小时之后，通过离心沉淀收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥并称重。
将这些冻干的颗粒悬浮在100毫升的丙酮中，并在室温(23℃)下通过混合72小时提取聚合物。通过0.45μm孔径的膜滤器过滤液体提取物，然后通过旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中再沉淀浓缩的液体，然后收集沉淀物并真空干燥获得的聚合物并称重。
使用凝胶渗透色谱法(GPC；Toso；HLC-8020；柱Polymer Laboratory(聚合物实验室)；PLgel-MIXED-C(5μm)；溶剂氯仿；聚苯乙烯-换算的分子量)测量获得的聚合物的分子量。
获得的聚合物的单元组成分析如下将5毫克的聚合物试样装入25毫升茄子型的烧瓶中，加入2毫升的氯仿和2毫升含有3％(体积/体积)硫酸的甲醇，然后在100℃下回流3.5小时。加入水使相分离之后，用色谱法分析气体-质谱仪(气相色谱-质谱联用法(GC-MS):ShimadzuQP-5050；柱DB10WAXETR(J&W公司制备)；EI方法)分析该有机层识别出PHA单体单元的甲基酯化了的化合物。细胞和聚合物的产率，以及单体单元的分析该结果示于表33中。用气相色谱-质谱联用法获得的3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯和3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)甲酯的质谱分别示于图20和图21中。
从上述结果，说明了使用7-苯氧基庚酸作为底物，用菌株H45可以制备只由3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)和3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)的双单元组成的PHA共聚物。
H在这里说明一个例子使用8-苯氧基辛酸(PxOA)作为原料制备本发明聚羟基链烷酸酯的方法，其中这些方法用于制备由来源于三种物质的单体单元组成的聚羟基链烷酸酯，其中三种物质包括3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)、3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羟基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)，且该聚羟基链烷酸酯是由3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)、3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羟基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)组成的共聚物。使用菌株YN2(酵母提取物，单阶段培养)制备P(HPxB/HPxHx/HPxO)聚合物在200毫升含有0.5％酵母提取物(Difco公司制备)和0.1％8-苯氧基辛酸(PxOA)的M9培养基中接种菌株YN2，并在30℃下以125次/分振动培养。24小时之后，通过离心沉淀收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥并称重。
将这些冻干的颗粒悬浮在100毫升的丙酮中，并在室温(23℃)下通过混合72小时提取聚合物。通过0.45μm孔径的膜滤器过滤液体提取物，然后通过旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中再沉淀该浓缩物，然后收集沉淀物，和真空干燥获得的聚合物并称重。
使用凝胶渗透色谱法(GPC；Toso；HLC-8020；柱Polymer Laboratory(聚合物实验室)，PLgel-MIXED-C(5μm)；溶剂氯仿；聚苯乙烯-换算的分子量)测量获得的聚合物的分子量。
获得的聚合物的单元组成分析如下将5毫克的聚合物试样装入25毫升茄子型的烧瓶中，加入2毫升的氯仿和2毫升含有3％(体积/体积)硫酸的甲醇，然后在100℃下回流3.5小时。加入水使相分离之后，用色谱法分析气体-质谱仪(气相色谱-质谱联用法(GC-MS):Shimadzu QP-5050；柱DBWAXETR(J&W公司制备)；EI方法)分析该有机层识别出PHA单体单元的甲基酯化了的化合物。细胞和聚合物的产率，以及单体单元的分析该结果示于表34中。用气相色谱-质谱联用法测量获得的3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)甲酯、3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羟基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)甲酯的质谱分别示于图22、图23和图24中。
从上述结果，说明了使用8-苯氧基辛酸作为底物，用菌株YN2可以制备只由3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)、3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羟基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)的三单元组成的PHA共聚物。使用菌株H45(酵母提取物，单阶段培养)制备P(HPxB/HPxHx/HPxO)聚合物在200毫升(体积)含有0.5％酵母提取物(Difco公司制备)和0.1％8-苯氧基辛酸(PxOA)的M9培养基中接种菌株H45，并在30℃下以125次/分振动培养。24小时之后，通过离心沉淀收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥并称重。
将这些冻干的颗粒悬浮在100毫升的丙酮中，并在室温(23℃)下通过混合72小时提取聚合物。通过0.45μm孔径的膜滤器过滤液体提取物，然后通过旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中再沉淀浓缩的液体，然后收集沉淀物并真空干燥获得聚合物并称重。
使用凝胶渗透色谱法(GPC；Toso；HLC-8020；柱Polymer Laboratory(聚合物实验室)；PLgel-MIXED-C(5μm)；溶剂氯仿；聚苯乙烯-换算的分子量)测量获得的聚合物的分子量。获得的聚合物的单元组成分析如下将5毫克的聚合物试样装入25毫升茄子型的烧瓶中，加入2毫升的氯仿和2毫升含有3％(体积/体积)硫酸的甲醇，然后在100℃下回流3.5小时。加入水使相分离之后，用色谱法分析气体-质谱仪(气相色谱-质谱联用法(GC-MS):ShimadzuQP-5050；柱DBWAXETR(J&W公司制备)；EI方法)分析该有机层识别出PHA单体单元的甲基酯化了的化合物。细胞和聚合物的产率，以及单体单元的分析该结果示于表35中。用气相色谱-质谱联用法测量获得的3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)甲酯、3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羟基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)甲酯的质谱分别示于图25、图26和图27中。
从上述结果，说明了使用8-苯氧基辛酸作为底物，用菌株H45可以制备只由3-羟基-4-苯氧基丁酸(3HPxB)、3-羟基-6-苯氧基己酸(3HPxHx)和3-羟基-8-苯氧基辛酸(3HPxO)的三单元组成的PHA共聚物。
I这里说明一个例子使用11-苯氧基十一酸(PxUDA)作为原料制备本发明聚羟基链烷酸酯的方法，其中这些方法用于制备由来源于三种物质的单体单元组成的聚羟基链烷酸酯，其中三种物质包括3-羟基-5苯氧基戊酸(3HPxV)、3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羟基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)，且该聚羟基链烷酸酯是由3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)、3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羟基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)组成的共聚物。使用菌株YN2(酵母提取物，单阶段培养)制备P(HPxN/HPxHp/HPXV)聚合物在200毫升含有0.5％酵母提取物(Difco公司制备)和0.1％11-苯氧基十一酸(PxUDA)的M9培养基中接种菌株YN2，并在30℃下以125次/分振动培养。64小时之后，通过离心沉淀收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥并称重。
将这些冻干的颗粒悬浮在100毫升的丙酮中，并在室温(23℃)下通过混合72小时提取聚合物。通过0.45μm孔径的膜滤器过滤提取物，然后通过旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中再沉淀该缩合物，然后收集沉淀物，和真空干燥获得聚合物并称重。
使用凝胶渗透色谱法(GPC；Toso；HLC-8020；柱Polymer Laboratory(聚合物实验室)；PLgel-MIXED-C(5μm)；溶剂氯仿；聚苯乙烯-换算的分子量)测量获得的聚合物的分子量。获得的聚合物的单元组成分析如下将5毫克的聚合物试样装入25毫升茄子型的烧瓶中，加入2毫升的氯仿和2毫升含有3％(体积/体积)硫酸的甲醇，然后在100℃下回流3.5小时。加入水使相分离之后，用色谱法分析气体-质谱仪(气相色谱-质谱联用法(GC-MS):ShimadzuQP-5050；柱DB-WAXETR(J&W公司制备)；EI方法)分析该有机层识别PHA单体单元的甲基酯化了的化合物。细胞和聚合物的产率，以及单体单元的分析该结果示于表36中。用气相色谱-质谱联用法测量获得的3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯、3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羟基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)甲酯的质谱分别示于图28、图29和图30中。
上述结果说明了使用11-苯氧基十一酸作为底物，用菌株YN2可以制备只由3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)，3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羟基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)的三单元组成的PHA共聚物。使用菌株H45(酵母提取物，单步骤培养)制备P(HPxN/HPxHp/HPxV)聚合物在200毫升含有0.5％酵母提取物(Difco公司制备)和0.1％11-苯氧基十一酸(PxUDA)的M9培养基中接种菌株H45，并在30℃下以125次/分振动培养。64小时之后，通过离心沉淀收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥并称重。
将这些冻干的颗粒悬浮在100毫升的丙酮中，并在室温(23℃)下混合72小时提取聚合物。通过0.45μm孔径的膜滤器过滤提取物，然后通过旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中再沉淀浓缩的液体，然后收集沉淀物并真空干燥获得聚合物并称重。
使用凝胶渗透色谱法(GPC；Toso；HLC-8020；柱Polymer Laboratory(聚合物实验室)；PLgel-MIXED-C(5μ m)；溶剂氯仿；聚苯乙烯-换算的分子量)测量获得的聚合物的分子量。获得的聚合物的单元组成分析如下将5毫克的聚合物试样装入25毫升茄子型的烧瓶中，加入2毫升的氯仿和2毫升含有3％(体积/体积)硫酸的甲醇，然后在100℃下回流3.5小时。加入水使相分离之后，用色谱法分析气体-质谱仪(气相色谱-质谱联用法(GC-MS)ShimadzuQP-5050；柱DBWAXETR(J&W公司制备)；EI方法)分析该有机层识别出PHA单体单元的甲基酯化了的化合物。细胞和聚合物的产率，以及单体单元的分析该结果示于表37中。用气相色谱-质谱联用法测量获得的3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)甲酯、3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羟基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)甲酯的质谱分别示于图31、图32和图33中。
上述结果说明了使用11-苯氧基十一酸作为底物，用菌株H45可以制备只由3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)，3-羟基-7-苯氧基庚酸(3HPxHp)和3-羟基-9-苯氧基壬酸(3HPxN)的三单元组成的PHA共聚物。
J这里说明一个例子使用6-苯基己酸(PHxA)作为原料制备本发明聚羟基链烷酸酯的方法，其中这些方法用于制备由来源于3-羟基-6-苯基己酸(3HPHx)的单体单元组成的聚羟基链烷酸酯，即聚3-羟基-6-苯基己酸(PHPHx)，或用于制备由来源于3-羟基-6-苯基己酸(3HPHx)和3-羟基-4-苯丁酸(3HPB)的单体单元组成的聚羟基链烷酸酯，且此聚羟基链烷酸酯是由3-羟基-6-苯基己酸(3HPHx)和3-羟基-4-苯丁酸(3HPB)组成的共聚物。使用菌株YN2(酵母提取物，单阶段培养)制备PHPHx聚合物在200毫升含有0.5％酵母提取物(Difco公司制备)和0.1％6-苯基己酸(PHxA)的M9培养基中接种菌株YN2，并在30℃下以125次/分振动培养。27小时之后，通过离心沉淀收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥并称重。
将这些冻干的颗粒悬浮在100毫升的丙酮中，并在在室温下(23℃)下混合72小时提取聚合物。通过0.45μm孔径的膜滤器过滤提取物，然后通过旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中再沉淀浓缩的液体，然后收集沉淀物并真空干燥获得聚合物并称重。
使用凝胶渗透色谱法(GPC；Toso；HLC-8020；柱Polymer Laboratory(聚合物实验室)；PLgel-MIXED-C(5μm)；溶剂氯仿；聚苯乙烯-换算的分子量)测量获得的聚合物的分子量。获得的聚合物的单元组成分析如下将5毫克的聚合物试样装入25毫升茄子型的烧瓶中，加入2毫升的氯仿和2毫升含有3％(体积/体积)硫酸的甲醇，然后在100℃下回流3.5小时。加入水和分步分离该液体之后，用色谱法分析气体-质谱仪(气相色谱-质谱联用法(GC-MS):Shimadzu QP-5050；柱DB-WAXETR(J&W公司制备)；EI方法)分析该有机层识别出PHA单体单元的甲基酯化了的化合物。细胞和聚合物的产率，以及单体单元的分析该结果示于表38中。用气相色谱-质谱联用法测量获得的3-羟基-6-苯基己酸(3HPHx)甲酯的质谱示于图34中。
上述结果说明了使用6-苯基己酸作为底物，用菌株YN2可以制备只由3-羟基-6-苯基己酸(3HPHx)组成的PHA聚合物。使用菌株H45(酵母提取物，单步骤培养)制备P(HPHx/HPB)聚合物在200毫升含有0.5％酵母提取物(Difco公司制备)和0.1％6-苯基己酸(PHxA)的M9培养基中接种菌株H45，并在30℃下以125次/分振动培养。27小时之后，通过离心沉淀收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥并称重。
将这些冻干的颗粒悬浮在100毫升的丙酮中，并在室温(23℃)下混合72小时提取聚合物。通过0.45μm孔径的膜滤器过滤提取物，然后通过旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中再沉淀浓缩的液体，然后收集沉淀物并真空干燥获得聚合物并称重。
使用凝胶渗透色谱法(GPC；Toso；HLC-8020；柱Polymer Laboratory(聚合物实验室)；PLgel-MIXED-C(5μm)；溶剂氯仿；聚苯乙烯-换算的分子量)测量获得的聚合物的分子量。获得的聚合物的单元组成分析如下将5毫克的聚合物试样装入25毫升茄子型的烧瓶中，加入2毫升的氯仿和2毫升含有3％(体积/体积)硫酸的甲醇，然后在100℃下回流3.5小时。加入水使相分离之后，用色谱法分析气体-质谱仪(气相色谱-质谱联用法(GC-MS):ShimadzuQP-5050；柱DBWAXETR(J&W公司制备)；EI方法)分析该有机层识别出PHA单体单元的甲基酯化了的化合物。细胞和聚合物的产率，以及单体单元的分析该结果示于表39中。用气相色谱-质谱联用法获得的3-羟基-4-苯丁酸(3HPB)甲酯和3-羟基-6-苯基己酸(3HPHx)的质谱分别示于图35和图36中。
上述结果说明了使用6-苯基己酸作为底物，用菌株H45可以制备只由3-羟基-4-苯丁酸(3HPB)和3-羟基-6-苯基己酸(3HPHx)组成的PHA聚合物。
K
这里说明一个例子使用5-苯基戊酸(PVA)和5-苯氧基戊酸(PxVA)两者作为原料制备本发明聚羟基链烷酸酯的方法，其中这些方法被用于制备由3-羟基-5-苯基戊酸(3HPV)和3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)的单体单元组成的聚羟基链烷酸酯，且该聚羟基链烷酸酯是由3-羟基-5-苯基戊酸(3HPV)和3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)组成的共聚物。使用菌株YN2(酵母提取物，单步骤培养)制备P(HPV/HpxV)聚合物在200毫升含有0.5％酵母提取物(Difco公司制备)、0.05％的5-苯基戊酸(PVA)和0.05％的5-苯氧基戊酸(PxVA)的M9培养基中接种菌株YN2，并在30℃下以125次/分振动培养。24小时之后，通过离心沉淀收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥并称重。
将这些冻干的颗粒悬浮在100毫升的丙酮中，并在在室温下(23℃)下混合72小时提取聚合物。通过0.45μm孔径用膜滤器过滤提取物，然后通过旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中再沉淀该浓缩物，然后收集沉淀物，和真空干燥获得聚合物并称重。
使用凝胶渗透色谱法(GPC；Toso；HLC-8020；柱Polymer Laboratory(聚合物实验室)；PLgel-MIXED-C(5μm)；溶剂氯仿；聚苯乙烯-换算的分子量)测量获得的聚合物的分子量。获得的聚合物的单元组成分析如下将5毫克的聚合物试样装入25毫升茄子型的烧瓶中，加入2毫升的氯仿和2毫升含有3％(体积/体积)硫酸的甲醇，然后在100℃下回流3.5小时。加入水和分步分离该液体之后，用色谱法分析气体-质谱仪(气相色谱-质谱联用法(GC-MS):Shimadzu QP-5050；柱DB-WAXETR(J&W公司制备)；EI方法)分析该有机层识别出PHA单体单元的甲基酯化了的化合物。细胞和聚合物的产率，以及单体单元的分析该结果示于表40中。用气相色谱-质谱联用法测量获得的3-羟基-5-苯基戊酸(3HPxV)甲酯和3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)的质谱分别示于图37和图38中。
上述结果说明了用菌株YN2可以制备只由3-羟基-5-苯基戊酸(3HPv)和3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)组成的PHA共聚物(相当于5-苯基戊酸和5-苯氧基戊酸作为底物)。
使用菌株H45(酵母提取物，单步骤培养)制备P(HPV/HPxV)聚合物在200毫升含有0.5％酵母提取物(Difco公司制备)、0.05％的5-苯基戊酸(PVA)和0.05％的5-苯氧基戊酸(PxVA)的M9培养基中接种菌株H45，并在30℃下以125次/分振动培养。24小时之后，通过离心沉淀收集细胞，用冷的甲醇洗涤一次，然后冷冻干燥并称重。
将一些冻干的颗粒悬浮在100毫升的丙酮中，并在在室温下(23℃)下混合72小时提取聚合物。通过0.45μm孔径的膜滤器过滤提取物，然后通过旋转蒸发器浓缩。在冷的甲醇中再沉淀该浓缩物，然后收集沉淀物，和真空干燥获得聚合物并称重。
使用凝胶渗透色谱法(GPC；Toso；HLC-8020；柱Polymer Laboratory(聚合物实验室)；PLgel-MIXED-C(5μm)；溶剂氯仿；聚苯乙烯-换算的分子量)测量获得的聚合物的分子量。获得的聚合物的单元组成分析如下将5毫克的聚合物试样装入25毫升茄子型的烧瓶中，加入2毫升的氯仿和2毫升含有3％(体积/体积)硫酸的甲醇，然后在100℃下回流3.5小时。加入水使相分离之后，用色谱法分析气体-质谱仪(气相色谱-质谱联用法(GC-MS):ShimadzuQP-5050；柱DBWAXETR(J&W公司制备)；EI方法)分析该有机层识别出PHA单体单元的甲基酯化了的化合物。细胞和聚合物的产率，以及单体单元的分析该结果示于表41中。用气相色谱-质谱联用法测量获得的3-羟基-5-苯基戊酸(3HPV)甲酯和3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)的质谱分别示于图39和图40中。
上述结果说明了用菌株H45可以制备只由3-羟基-5-苯基戊酸(3HPV)和3-羟基-5-苯氧基戊酸(3HPxV)组成的PHA共聚物(相当于5-苯基戊酸和5-苯氧基戊酸作为底物)。
表1
表2
CDW细胞干重(毫克/升)PDW聚合物干重(毫克/升)产率POW/CDW(％)表3腐臭假单胞菌P91细胞(干重) 520毫克/升聚合物(干重)14毫克/升聚合物(干重)／细胞(干重)2.7％聚合物分子量Mn=42,000Mw=84.000单体单元组成(面积比例)3-羟基丁酸 0％3-羟基戊酸 0％3-羟基己酸 0％3-羟基庚酸 0％3-羟基辛酸 0％3-羟基壬酸 0％3-羟基癸酸 0％3-羟基-4-苯氧基丁酸 100％
表4腐臭假单胞菌P91细胞(干重)590毫克/升聚合物(干重)8毫克/升聚合物(干重)/细胞(干重) 1.4％单体单元组成(面积比)3-羟基丁酸 0％3-羟基戊酸 0％3-羟基己酸 0％3-羟基庚酸 0％3-羟基辛酸 0％3-羟基壬酸 0％3-羟基癸酸 0％3-羟基-4-苯氧基丁酸 100％表51H NMR谱共振频率400MHz
m多重峰，t三重峰，d双峰表61H核磁共振光谱共振频率400MHz
m多重峰， t三重峰，d双峰表7
表2
表11
表121H核磁共振光谱共振频率400MHz
m多重峰，t三重峰，d双峰表13
表14菊苣假单胞菌H45
表15菊苣假单胞菌H45
表16腐臭假单胞菌P91
表17P.jessenii P161
表181H核磁共振光谱共振频率400MHz
m多重峰，s单峰表19碳-13核磁共振光谱共振频率100MHz
表20
m多重峰，t三重峰表21菊苣假单胞菌H45
表22腐臭假单胞菌P91
表23P.jessenii P161
表241H核磁共振光谱共振频率400MHz
m多重峰， t三重峰，s单峰表25碳-13核磁共振光谱共振频率100MHz
表26
CDW细胞干重(毫克/升)PDW聚合物干重(毫克/升)产出率PDW/CDW(％)表27
CDW细胞干重(毫克/升)PDW聚合物干重(毫克/升)产出率PDW/CDW(％)
表28
CDW细胞干重(毫克/升)PDW聚合物干重(毫克/升)产出率PDW/CDW(％)表29
CDW细胞干重(毫克/升)PDW聚合物干重(毫克/升)产出率PDW/CDW(％)表301H光谱共振频率400MHz
d双峰，dd两倍双峰表3113C光谱共振频率100MHz
表32
表33
表34
表35
表36
表37
表38
表39
表40
表4权利要求
1．一种聚羟基链烷酸酯，含有一个或多个结构式(1)表示的单体单元， 其中R为至少一种选自由结构式(2)、(3)和(4)任何一个表示的基团； 在结构式(2)中，R1是选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，q是1-8的整数；在结构式(3)中，R2是选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，r是1-8的整数；在结构式(4)中，R3是选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，s是1-8的整数；只要不选择下列的R当选择一种R时在结构式(2)中R为R1=H和q=2,R为R1=H和q=3，在结构式(3)中R是R2=卤素和r=2，或R是R2=-CN和r=3，以及R是R2=-NO2和r=3；当选择两种R时在结构式(2)中一种组合是R1=H，而q=3和5，在结构式(3)中一种组合是R为R2=H，而r=2和4，一种组合是R为R2=H，而r=2和6，以及一种组合是R为R2=卤，而r=2和4；当选择三种R时在结构式(2)中一种组合是R为R1=H，而q=3、5和7，在结构式(3)中一种组合是R为R2=H和r=1、3和5，以及一种组合是R为R2=H和r=2、4和6。
2．按照权利要求1的聚羟基链烷酸酯，其中单体单元是结构式(5)的3-羟基-4-苯氧基丁酸单元。
3．按照权利要求1的聚羟基链烷酸酯，其中单体单元是结构式(6)的3-羟基-5-苯氧基戊酸单元。
4．按照权利要求1的聚羟基链烷酸酯，其中单体单元是结构式(7)的3-羟基-5-(4-氟苯基)戊酸单元。原文15
5．按照权利要求1的聚羟基链烷酸酯，其中单体单元是结构式(8)的3-羟基-4-环己基丁酸单元。
6．按照权利要求1的聚羟基链烷酸酯，其中单体单元是结构式(6)的3-羟基-5-苯氧基戊酸单元和结构式(9)的3-羟基-5-苯基戊酸单元
7．按照权利要求1的聚羟基链烷酸酯，其中单体单元是结构式(10)的3-羟基-4-苯丁酸单元和结构式(11)的3-羟基-6-苯基己酸单元。
8．按照权利要求1-7任一个的聚羟基链烷酸酯，其中数均分子量是1-20万。
9．一种制备聚羟基链烷酸酯的方法，包括下列步骤在包含原料链烷酸酯和酵母抽提物的培养基中培养微生物，其中微生物利用链烷酸酯产生聚羟基链烷酸酯．
10．按照权利要求9的方法，其中链烷酸酯由结构式(12)表示，且聚羟基链烷酸酯有一个或多个由结构式(13)表示的单体单元。 在结构式(12)中，R为至少一种选自由结构式(2)、(3)和(4)任何一个表示的基团； 其中，在结构式(2)中，R1是选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，q是1-8的整数；在结构式(3)中，R2是选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2R5和-C3F7的基团，r是1-8的整数；在结构式(4)中，R3是选自氢原子(H)、卤原子、-CN、-NO2、-CF3、-C2F5和-C3F7的基团，s是1-8的整数； 其中R’为链烷酸酯选择的R，或具有与R相同的R1、R2或R3的基团，除了q=q0、q=q0-2、q=q0-4、q=q0-6；或r=r0、r=r0-2、r=r0-4或r=r0-6；或s=s0或s=s0-2、s=s0-4或s=s0-6，其中q0、r0和s0是R的q、r或s，而q0-2、r0-2；s0-2,q0-4、r0-4；s0-4、q0-6、r0-6；或s0-6是1或更大的整数。
11．按照权利要求10的方法，其中单体单元是结构式(5)的单元，并且在含有结构式(14)的4-苯氧基丁酸和酵母提取物的培养基中培养微生物，该微生物利用4-苯氧基丁酸制备聚3-羟基-4-苯氧基丁酸。
12．按照权利要求10的方法，其中单体单元是结构式(6)的单元，并且在含有结构式(15)的5-苯氧基戊酸和酵母提取物的培养基中培养微生物，该微生物利用5-苯氧基戊酸制备聚3-羟基-5-苯氧基戊酸。
13．按照权利要求10的方法，其中单体单元是结构式(16)的单元，培养基中含有结构式(17)的5-(4-氟苯氧基)戊酸和酵母提取物，而该微生物利用5-(4-氟苯氧基)戊酸制备聚3-羟基-5-(4-氟苯氧基)戊酸。
14．按照权利要求10的方法，其中单体单元是结构式(9)的单元，培养基中含有结构式(18)的5-苯基戊酸和酵母提取物，该微生物利用5-苯基戊酸制备聚3-羟基-5-苯基戊酸。
15．按照权利要求10的方法，其中单体单元是结构式(7)的单元，培养基中含有结构式(19)的5-(4-氟苯基)戊酸和酵母提取物，而该微生物利用5-(4-氟苯基)戊酸制备聚3-羟基-5-(4-氟苯基)戊酸。
16．按照权利要求10的方法，其中单体单元是结构式(8)的单元，培养基中含有结构式(20)的4-环己基丁酸和酵母提取物，该微生物利用4-环己基丁酸制备聚3-羟基-4-环己基丁酸。
17．按照权利要求10的方法，其中单体单元是结构式(6)和(9)的单元，培养基中含有结构式(15)的5-苯氧基戊酸、结构式(18)的5-苯基戊酸和酵母提取物，该微生物利用5-苯氧基戊酸和5-苯基戊酸制备含有3-羟基-5-苯氧基戊酸和3-羟基-5-苯基戊酸的聚羟基链烷酸酯。
18．按照权利要求10的方法，其中单体单元是结构式(10)和(11)的单元，培养基中含有结构式(21)的6-苯基己酸和酵母提取物，该微生物利用6-苯基己酸制备含有3-羟基-4-苯基丁酸和3-羟基-6苯基己酸的聚羟基链烷酸酯。
19．按照权利要求10的方法，其中单体单元是结构式(6)和(22)的单元培养基中含有结构式(23)的7-苯氧基庚酸和酵母提取物，该微生物利用7-苯氧基庚酸制备含有3-羟基-5-苯氧基戊酸和3-羟基-7苯氧基庚酸的聚羟基链烷酸酯。
20．按照权利要求10的方法，其中单体单元是结构式(5)、(24)和(25)的单元，培养基中含有结构式(26)的8-苯氧基辛酸和酵母提取物，该微生物利用8-苯氧基辛酸制备含有3-羟基-4-苯氧基丁酸、3-羟基-6-苯氧基己酸和3-羟基-8-苯氧基辛酸的聚羟基链烷酸酯。
21．按照权利要求10的方法，其中单体单元是结构式(6)、(22)和(27)的单元，培养基中含有结构式(28)的11-苯氧基十一酸和酵母提取物，该微生物利用11-苯氧基十一酸制备含有3-羟基-5-苯氧基戊酸、3-羟基-7-苯氧基庚酸和3-羟基-9-苯氧基壬酸的聚羟基链烷酸酯。
22．按照权利要求9的方法，其中培养步骤是在含有链烷酸酯和酵母提取物的培养基中一步培养。
23．按照权利要求9的方法，其中培养步骤是二步培养即在含有链烷酸酯和酵母提取物的培养基中培养，接着在含有链烷酸酯的限氮培养基中培养。
24．按照权利要求9的方法，还包括聚羟基链烷酸酯的分离/精制步骤。
25．按照权利要求9的方法，其中微生物属于假单胞菌属种。
26．按照权利要求25的方法，其中微生物是至少选自菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)YN2(FERM BP-7375)；菊苣假单胞菌(Pseudomonascichorii)H45(FERM BP-7374)；腐臭假单胞菌(Pseudomonas putida)P91(FERM BP-7373)和jessenii假单胞菌P161(FERM BP-7376)的一种。
全文摘要
一种微生物聚羟基链烷酸酯,含有一个或多个结构式(1)表示的单体单元,其中R为至少一种选自由结构式(2)、(3)和(4)任何一个表示的官能团;在结构式(2)中,r1.是选自氢原子(H)、卤原子、－CN、－NO
文档编号C08G63/685GK1322768SQ0013765
公开日2001年11月21日 申请日期2000年12月27日 优先权日1999年12月27日
发明者本间务, 小林登代子, 矢野哲哉, 小林辰, 今村刚士, 须田荣, 见目敬 申请人:佳能株式会社