有机化合物的改进的制作方法

专利名称:有机化合物的改进的制作方法
本发明涉及木质素改性和降解酶。木质素是由取代肉桂醇前体经自由基的聚合作用生成的复合聚合物，含有15～35%(重量)干木材。浆化处理时，必须从包有木质素基质中将纤维素离解出来，使他们能互相结合，得到具有强度的最终产物。这种聚合物的分离，可以采用化学浆化方法去除木质素，或采用高得率的机械浆化方法保持木质素。漂白处理时，去除木质素，得到发亮的浆料。
木质素对生物腐蚀具有很高的抗性，业已证明，任何有机体都不能以木质素作为唯一碳源进行生长。但是，这种复杂的木质素聚合物通过各种高级真菌的纯培养物可以完全降解。对白蚀菌(white-rotfungi)的木质素生物降解作用进行的最广泛的生理研究证明，使用Corticra-ceae族系的PhanerochaeteChrysosporiumBurds能够对木质素进行充分的降解。
在一定的实验室条件下，大约培养3天的时间，还观察不到真菌对木质素的降解作用。接着，培养菌对碳或氮产生饥饿现象，培养4或5天至多6天，开始观察到木质素的降解。根据对碳氮的饥饿诱导木质素降解，说明真菌的木质素代谢属于一种次级代谢性质。
目前真菌的木质素降解由于若干原因还不能实现工业化。由于诱导降解木质素的效率仅仅是作为次级代谢的结果，所以木质素降解的速度慢得令人难以接受。为此，要求继饥饿之后即开始生长时期。此外，真菌把纤维素作为其主要营养来源，导致浆料产量降低和浆料制品质量低劣。
世界专利文件WO 87/00550号介绍了名为rLDMTM6的木质素降解酶制剂，它是由P.Chrysosprium衍生得到的(rLDMTM6是由麻省坎布里奇Repligen公司制造的木质素降解和改性酶的商品牌号)。这种酶制剂基本上是纯化的，因此基本上也不含其他rLDMTM，它是一种天然的降解蛋白酶。这种酶含有与血红素单位相结合的蛋白质成分(脱辅基蛋白)，该血红素单位等同于以氧化形式(Fe+3)存在的正铁血红素Ⅸ。这种rLDMTM6制剂具有适用于木材制浆和污水处理的理想性质。rLDMTM显示有过氧化物酶的活性，其重要性质的特征在于，在有过氧化氢存在的条件下，能将藜芦基醇催化氧化为藜芦基醛。关于rLDMTM的物理参数公诸如下(1)用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶泳(SDS-PAGE)测定的分子量;
(2)氨基酸组分;
(3)血红素含量;
(4)与抗体反应速度的等同性;
(5)对木质素模拟底物作用的特异性;
(6)按规定的乙酸钠体积摩尔浓度洗脱FPLC层析柱。
尽管可按WO87/00550号专利文件所述方法制备rLDMTM6，但是如果能够克隆编码rLDMTM6蛋白的DNA异在适宜的宿主中表达，则用遗传工程方法可期望更有效地实现是rLDMTM6的制备。然而由于P.Chrysosporium基因的活性在异种宿主中的表达，以前从未取得成功，并且现有技术也从未提供过如何成功地进行这种克降和表达，所以对此能否获得成功还很难预料。
本发明通过克隆编码木质素酶蛋白的DNA顺序及其在适宜宿主细胞中的表达和用正铁血红素Ⅸ重建重组木质素酶蛋白，提供重组rLDMTM6木质素酶。
于是，本发明提供源于天然P.Chrysosporium的编码rLDMTM6蛋白的DNA顺序，其顺序示于表1。从DNA顺序中推导得到的蛋白质的氨基酸顺序示于同一表中。
为rLDMTM6蛋白编码的DNA顺序的克隆开始于从Phanerochaete chrysosporium的发酵中制备足够量的RNA。大量RNA是从名为SC26，NRRL 15978的ATCC24725的紫外线诱导突变体制备的。
在用逆转录酶复制mDNA后，基因库包括为次级代谢中的基因编码的DNA顺序，该次级代谢包括木质素改酶或木质素降解酶的构建。对rLDMTM6的抗体反应用来检验基因库。对交叉反应克隆进行检测。用常规方法，从克隆的分离物中制备噬菌体DNA。然后将该DNA插入到以后将rLDMTM6蛋白表达于反应潜能宿主的适宜载体中。
各种改性重组rLDMTM6蛋白，凡在用血红素重建时能基本上具有与rLDMTM6相同酶活性的，都包括在本发明的范围内。由于从其他天然等位基因所表达的rLDMTM蛋白存在的可能性极大，所以结构修饰既可用已知方法构建，也可采用天然来源。
用遗传工程修饰的rLDMTM6蛋白还证明，当用血红素重建时，能具有木质素酶活性。例如，含有由一个或多个氨基酸在正常的氨基末端延长的完全rLDMTM6顺序的蛋白质已按下述方法产生。含有由另外的氨基酸在正常的C末端延长的该完全顺序也可按本文所述方法，通过表达质粒在琥珀型宿主中的表达产生。
在rLDMTM6修饰蛋白的定义范围内，还有从DNA顺序所表达的原初蛋白的亚片段，该顺序与所揭示的原初rLDMTM6蛋白的DNA顺序杂交。
在用血红素重建时，原重组rLDMTM6蛋白或rLDMTM6修饰蛋白可按与天然酶相同方法，用于降解或改性木质素;并且对纸浆木质素有作用，如对未漂白牛皮纸浆;对磨制木质素如机制浆料，以及对本质素模拟化合物都有作用。
rLDMTM6蛋白的基因也可用作为操查物的rLDMTM6蛋白的cDNA中的部分顺序，从基因组DNA即所谓的基因组克隆中分离得到。在本领域中该项技术是众所周知的，参阅Maniates，T，Fritsch，E.F.和Sambsock，J.，《分子克隆实验室手册》(冷泉港实验验室，NY，1982年。由此得到的基因组克隆可插入到各种宿主的适宜载体中。
重建时，除了表1所列DNA顺序外，修饰DNA顺序包括天然等位基因和用遗传工程方法修饰的并能为具有rLDMTM6酶活性的rLDMTM6蛋白编码的DNA顺序，这些顺序也都属于本发明范围。
在为rLDMTM6蛋白编码的DNA顺序中，可得到以一个或多个饰变的等位基因，例如从天然有机体中经过探查后得到，即由P.Chsysosporium或类似木材降解菌衍生合适的cDNA或基因组DNA库，它们具有从为rLDMTM6完全顺序编码的DNA中切割得到的一个或多个适宜长度的标记DNA，至少含有大约20至300个核苷酸，这些方法在本文中已有介绍。
上述为修饰蛋白编码的修饰顺序也可以按本文所述，采用已经建立的技术直接由为rLDMTM6蛋白编码的cDNA或基因组DNA顺序得到，例如采用位点的特殊诱变、环出方法和其他取代核苷酸的已知方法。
关于rLDMTM6原蛋白和rLDMTM6修饰蛋白的核苷酸顺序，熟悉本领域的专业人员很容易理解，这是与为rLDMTM6蛋白编码的其他相当的核苷酸顺序相一致的。正如人们所知，不同的核苷酸顺序能够为同一个蛋白质编码，这是因为有多余的遗传密码，即大多数氨基酸都可由多个核苷酸三联(密码子)编码。因此，本发明的范围不仅包括本文所述的特殊核苷酸顺序，而且还包括在用血红素重建时，为基本上具有相同rLDMTM6木质素酶活性的分子编码的所有相应的核苷酸顺序。
基于本文公开了为rLDMTM6蛋白编码的核苷酸顺序，所以该顺序可用本领域已知方法通过“基因装配”合成。
因此，就本发明的广义而言，按本发明提供的核苷酸顺序包括为具有木质素酶活性的蛋白质编码，以及与为表1所列的rLDMTM6完全蛋白编码的顺序在约束杂交条件下(例如60℃，在2.5×柠檬酸盐缓冲液中)进行杂交的那些cDNA和/或基因组DNA顺序。然而，正如人们可以理解的，天然有机体的cDNA和/或基因组DNA编码顺序基本上可以修饰或重建，以产生为与上述相似的蛋白质，一般说来是为了提高在异种宿主系统或非天然宿主系统中表达的这种蛋白质编码的非常不相似的DNA顺序。因此，就其广义而言，本发明提供了为rLDMTM6和为具有rLDMTM6特征的木质素酶活性的rLDMTM6改性蛋白编码的独立重组体DNA顺序或合成DNA顺序。
在为了稳定地保持和表达基因的条件下，将rLDMTM6基因引入微生物宿主，可以采用各种方法。其中之一可为DNA结构提供包括;表达基因的转录和转译调节信号、在这些信号调节控制下的基因和相应于宿主有机体中的顺序的DNA顺序，借以进行整合，和/或在宿主中起作用的复制系统，借以进行整合并保持稳定性。
为rLDMTM6或为rLDMTM6生物活性亚片段编码的基本纯的核苷酸顺序，可以被连接到表达克隆载体中适宜的限制性内切酶的位点上。如有需要，可用连接分子将位点接到核苷酸顺序上。(例见Norris，K.E.等，Gene 7355～362，1979。)然后将被连接的DNA用于转化反应潜能的原核细胞或真核细胞。
rLDMTM6蛋白可以在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达，其所用质粒含有从该有机体中得到的诱导半乳糖酶启动子(Broach，J.R.，Li，Y.，Wu，L.C.and Jayaram，M.in Experimental Manipulation of Gene Expression，1983，P.83，ed.M.Jnouge，Academic Press)。这些质粒名为YEp51和YEp52(Broach，J.R.et al.，1983，supra)并且含有大肠杆菌(E.coli)复制源、-lactamase基因、酵母LEU2基因、2微米复制源和2微米环状REP3座位。重组体基因表达由酵母GAL10基因启动子操纵。
能够用于类似方法的其他酵母启动子如(乙)醇脱氢酶(Bennetqen，J.LandHall，B.D.1982，J.Biol.Chem257;3108;Ammerer，G.inMethodsinEnzymology，1983，第101卷，192页)、磷酸甘油酸激酶(Derynck，R.，Hitzemann，R.A.，Gray，P.W.，Goeddel，D.V，inExperimentalManipulationofGeneExpression，1983，p.247，ed.M.Inouye，AcadimicPress)、磷酸丙糖异构酶(Alber，T.andKawasaki.G.，1982，J.MolecandAppliedGenet.1419～434)，或烯醇酶(Innes，M.A.etal，1985，Science226～21)。
由于丝状真菌曲霉(Aspergillus)与P.chrysosposium有关，所以rLDMTM6基因也可由这种菌素达。能够用于在曲霉(Aspergillus)中表达基因的适宜的宿主载体就是由Buxton，F.P.，Gwynne，，D.J.和Davis，R.W.(Gene，1985，37207，214)介绍的载体。
rLDMTM6蛋白能够在哺乳动物细胞中表达，可采用的系统例如有Okayama-Berg克隆系统(Okayama，H.and Berg，P.，1983，Malec.and Cell.Biol.3280～289)、痘苗病毒表达系统(Moss，B.，1985，Immunology Today 6243;Chakrabarti，S.，Brechling，k.，Moss，B.，1985，Molec.and Cell.Biol.53403)或由鼠类还原病毒衍生的载体(Mulligan，R.C.in Experimental Manipulation of Gene Expression，1983，P.155，ed.M.Inouye，Acadimice Press)。
基于为了对木质素和由木质素衍生的底物显示过氧化物酶的活性，木质素酶蛋白必须用血红素重建，所以本发明还提供了重建血红素酶的方法，包括在有氧化还原系统存在下，酶蛋白与血红素的反应步骤。
根据该方法采用本发明的重组木质素酶蛋白还可得到重组木质素酶。该重组木质素酶具有与纯化的天然rLDMTM6相同的木质素酶活性。用DNA重组技术产生的酶能够降解/改性木质素而不明显地腐蚀纤维素或半纤维素。如同天然酶一样，rLDMTM6酶可直接发生作用，不必像用天然菌分离物那样需要经过代谢诱导。
术语“过氧化物酶蛋白”、“木质素脱辅基蛋白”或“木质素酶蛋白”，在本文中意指该类蛋白不是用血红素重建的，而在用血红素重建时能够具有过氧物酶和/或木质素酶的活性。
术语“正铁血红素Ⅸ”意指正铁血红素Ⅸ的氧化Fe+3的形式。
术语“木质素酶”意指用正铁血红素Ⅸ重建的木质素酶蛋白。
培养物的保藏根据布达佩斯条约关于微生物保藏的规定，本文所公开的下列培养物保藏在美国农业部北方研究中心农业研究菌种保藏委员会(NRRL)(美国伊利诺斯州匹奥里亚北方大学大街1815)。
菌种名称菌库编号保藏日期大肠杆菌(E.coli)(pLn105)NRRLB-181561986.12.31大肠杆菌(E.coli)(pLn106)NRRLB-181571986.12.31大肠杆菌(E.coli)(pBSR3)NRRLB-180681986.5.1大肠杆菌(E.coli)K12JM105NRRLB-180671986.5.1大肠杆菌(E.coli)(pREV2.2)NRRLB-180911986.7.30酿酒酵母(S.Cererisiae)(pLn1001)NRRLY-181631987.1.14图1克隆3-1和3-2的限制部位图和估计值。
图2完整的rLDMTM6氨基末端顺序。
图3完整的rLDMTM6氨基末端顺序与克隆3-2早期顺序的组合。
图4恢复重建rLDMTM6活性的时间表。
图5pLn106的物理图谱。
图6pLn106构建图。
图7pREV2.2和多克隆位点图。
图8pLn105构建图。
图9pTPR构建图。
图10pLn1001构建图。
以下的实施例说明实施本发明的方法。所有百分比以重量计算，所有溶剂混合物的比例以体积计算，除非另加说明。
用于提取mRNA、制备cDNA库、转移细胞和构建体等的大量方法，在本领域内都是广泛使用的方法，许多研究工作者也都熟悉所用的常规材料及其使用的条件和方法。这些方法，例如已由Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook，J.于1982年作过介绍(参阅纽约冷泉港实验室出版的《实验室手册-分子克隆》。因此，对于由微生物细胞中提取DNA，完成限制酶的消化，DNA片段的电泳测定，质粒的尾部连接和退火，DNA的插入、DNA的连接，细胞转移，质粒DNA的制备，蛋白质的电泳测定和DNA顺序的排列，这些方法都属遗传工程领域内专业人员熟悉的方法。
本文所用的全部核酸内切限制酶均购自贝塞斯达研究室(美国马里兰州盖瑟斯堡)或新英格兰生物实验室(美国麻省贝弗利);并按提供者的说明使用。
DNA顺序的测定采用Maxam和Gelbert(Maxam，A.andGelbert，W.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74560)和Heidecker等(Heidecker，G.，Messing，J.andGrouenborn.B.，1980，Gene1069)介绍的方法。
琼脂糖凝胶电泳的测定采用2XTris-乙酸酯凝胶缓冲液(80毫摩尔Tris-HCl，pH8.0;40毫摩尔乙酸钠;36毫摩尔NaCl;2毫摩尔NaEDTA在凝胶和1X缓冲液中展开。分析凝胶作为水平凝胶箱中的“海底凝胶”，按常规展开。采用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓(EtBr)，后着色(0.5毫克/毫升的1X凝胶缓冲液溶液)和SanGabriel(CA)紫外仪器公司制造的TM-36型紫外变换照射器(UVtransilluminator)对DNA谱带进行染色。
从制备的琼脂糖凝胶中提取DNA是以染色凝胶柱带上EtBr着色的谱带的位置开始的。将含有有意义的DNA片段的凝胶片手工切成小片，用1.5～2体积的DNA凝胶提取缓冲液(0.5摩尔乙酸铵，10毫摩尔EDTA，10毫摩尔乙酸镁，0.1%SDS)与该小片穿过20克针状物。加入用1毫摩尔乙酸铵、10毫摩尔EDTA饱和的等体积苯酚，置入Eppendorf管中，用旋转摇动器在23℃下提取过夜。将管子置于冰上30分钟，然后用微量离心分离水相。
用饱和苯酚溶液提取水相重复3～4次，继之用三氯甲烷提取，乙醇沉淀。常规回收大约40%少于15仟碱基的DNA片段。
实施例1RNA的菌种P.chrysosporiumNRRL15978生长在氮限制的痕量元素培养基上，补充葡萄糖，缓冲至pH4.5。
采用常规方法测量藜芦基醇氧化为藜芦基醛的速率，定时测定发酵液中木质素的活性。
采用阴离子交换柱，通过超滤和FPLC方法，分离和纯化细胞外液体中的新的rLDMTM。
(A)培养条件NRRL15978菌种培养在125毫升锥形烧瓶中，在发酵盘、1升或2升锥形摇瓶，或20升发酵罐中稳定生长。前两种的菌种培养在下列培养基(氮限制BⅢ/葡萄糖培养基)中1.08×10-3摩尔酒石酸铵，1.47×10-2摩尔KH2PO4，2.03×10-3摩尔MgSO4·7H2O、6.8×10-4CaCl2·2H2O，2.96×10-6摩尔维生素B1·HCl和10毫升·L-1痕量元素溶液。该痕量元素溶液含有7.8×10-3次氮基乙酸，1.2×10-2摩尔MgSO4·7H2O，1.7×10-2摩尔NaCl，3.59×10-4摩尔FeSO4·7H2O，7.75×10-4摩尔CoCl2，9.0×10-4摩尔CaCl2，3.48×10-4摩尔ZnSO4·7H2O，4×10-5摩尔CuSO4·5H2O，2.1×10-5摩尔AlK(SO4)2·12H2O，1.6×10-4摩尔H3BO3，4.1×10-5摩尔NaMoO4·2H2O和2.9×10-3摩尔MnSO4·H2O。
该培养基补充10%(重量/升)葡萄糖，并用10.8毫摩尔酒石酸铵缓冲，加7X痕量金属(基础水平+6X)和0.04摩尔藜芦基醇，将pH值调至4.5。摇瓶菌种和20升发酵罐使用相同培养基，但另加0.1%吐温80。
将0.5毫升菌丝体接种物接种到含有10毫升培养基的125毫升稳定生长的锥形烧瓶中，氧气吹洗0，3和6天。
发酵盘含有2升培养基，加100毫升菌丝体接种物接种。接种后一天，在修整过的发酵盘上复盖一薄层菌丝。旋转式生物接触器(RBC)以每分钟100毫升氧气流量连续吹洗菌丝覆盖部分。
1升或2升锥形摇瓶，分别含有300或600毫升培养基，用50或100毫升菌丝体接种物接种。摇瓶置于新Brunswick(NewBrunswickScientific，Edison，NJ)接种器中，在39℃下250rpm摇动。菌种用氧气吹洗0，2，4和6天。
20升Virto发酵罐(序号43)(VirTis公司，Gardiner，NY)含有10～14升培养基，用装在1升(300毫升)锥形摇瓶中的7天令木质素酶的非均匀菌接种。发酵罐的浆式搅拌器以300rpm转速转动。通过扩散将氧引入大约50英尺长0.058英寸科尔宁医用硅橡胶管(纽约科尔宁，科尔宁玻璃制造厂)。氧气流量为300毫升/分。
关于木质素酶的测定是通过测量藜芦基醇氧化为藜芦醛的速率(藜芦基醇的氧化作用缩写为VAO)定时测定摇瓶或RBC中木质素酶的活性。反应混合物含有275微升细胞外液体，或含有大约0.5微克纯化酶，2毫摩尔藜芦基醇，0.4毫摩尔H2O2和20或100毫摩尔酒石酸钠，最终体积为0.5毫升，pH2.9。反应以加入H2O2开始并在310毫微米上进行跟踪。蛋白质的测定按Bradford，M.M.(Anal.Biochem.72248～254，1976)方法，采用牛血清白蛋白(Sigma化学公司，St.louis.Mo)作为标准，或采用409毫微米吸光率的蛋白质溶液并且从木质素酶的消光系数中计算蛋白质的含量。
关于木质素酶的纯化，可将按上述方法制备的细胞外液体经0.45微米的微孔薄膜(微孔薄膜公司出品，Bedford，MA)预过滤，并经Amicon(Danvers，MA)YM10滤器超滤浓缩20倍(此浓缩物即为木质素混合物LMTM)，再经10毫摩尔pH6.0的乙酸钠渗析和0.45微米薄膜过滤(Acrodisc Protein Buiding，German，Ann Arbor，MI)。将滤过的LMTM置于装有LDC/Milton Roy(Milton Roy公司，罗彻斯特，NY)的Gilson(华盛顿Gilson公司，OH)系统上，固定在410毫微米波长检测器和Gilson可变波长检测器，采Pharmacia(Piscataway，NJ)FPLC单Q阴离子交换柱进行高性能液相色谱(HPLC)层析，根据从柱上洗脱的木质素酶进行纯化。含有pH6.0的梯度由10毫摩尔至1摩尔乙酸钠并且以一般方法制备的流动相，恒控在410毫微米和280毫微米时，40分钟内的流速为2毫升/分。从层析柱上以乙酸钠体积克分子浓度洗脱各个木质素酶(Kirk等，Enzyme Microb.Technol.827～32，1986)。
由P.chrysosporiumNRRL15978产生的木质素酶，按Laemmli，U.K.(Nature227680～685，1970)的SDS-聚丙烯酰胺平板凝胶电泳方法分析。天然平板凝胶的展开根据Ornstein，L.(Ann.N.Y.Acad.Sci.121321～349，1964)和Davis，B.g.(Ann.N.Y.Acad，Sci.121404～427，1964)的方法。电泳分离后，蛋白质用考马斯兰染色显示，或采用常规方法进行Western印迹法分析。
实施例2RNA的制备从P.chrysosporium的藜芦基醇氧化发酵培养液制备完全的RAN。将采集到的菌丝体经洗涤后用液态氮冷冻，并用研钵捣碎以便溶解。然后将细胞粉末悬浮在硫氰酸胍变性溶液中，并在CsCl中离心。分离出RNA带，将其通过低(dT)纤维素柱，得到如Maniatis手册中所述的含多聚腺苷酸的mRNA(PolyA+mRNA)。
实施例3cDNA的制备将实施例2所得的10微克polyA+mRNA注入低dT12-18，并用逆向转录酶复制，该方法基本上按Gnbler和Hoffman(Gnblur，U，and Hoffman，B.J.Gene25263～269，1983)所述进行。
将cDNA克隆到人们熟知并且可从市售得到的载体入-gtⅡ(Young，R.A.andDavis，R.W.Proc.Natl.Acad.Sci.USA801194～1198，1983;可从CA圣地亚哥载体克降系统公司得到)，用EcoRⅠ甲基化酶(新英格兰生物实验室，麻省贝弗利)并按供应商建议用S-腺苷甲硫氨酸对双股cDNA甲基化，再将其与三个EcoRⅠ联结子(GGAATTCC，CGGAATTCCG和CCGGAATTCCGG)的混合物连接。这些朕结子能使所有三个转译读码都得到融合。
连接EcoRⅠ的cDNA由EcoRI核酸内切酶切割，并从1%琼脂糖凝胶中分离得到一部分600～2000碱基对。这个经EcoRⅠ切割的纯cDNA经EcoRⅠ切割磷酸酶处理过的入-gtⅡDNA连接，再包装在噬菌体中，用于感染E.coliY1088，atcc37195。
实施例4抗体的筛选按Young等(Young.R.A.and Davis，R.W.Proc.Nat.Acad.Sci.801194～1198，1983)所述，将抗HPLC-纯化的P.chrysosporium LDMTM6反应的家兔抗rLDMTM6抗体用于探查由600～2000碱基对cDNA得到的基因库。检测交叉反应的克隆。
按常规方法(例见Tmaniatis.T.等)，从各个交叉反应的克隆的分离物中制备噬菌体DNA，并用EcoRⅠ消化，以显示基其cDNA的插入量。克隆3-1的插入量估计为820碱基对，其他四个克隆含有相似的扦入量，约为650碱基对，其中克隆3-2具有代表性。
图1给出克隆3-1和-3-2的DNA插入的限制图。克隆3-1含有所期望的与EcoRⅠ联结子顺序连接的低dT区(用于供给cDNA合成)。
实施例5rLDMTM6蛋白的氨基末端的特征按Kirk等(Kirk，T.K.，Croan，S.，Tien，M.，Murtagh，K.M.and Farrell，R.L.，Enzyme Microb.Technol.827～32，1986)所述方法，通过离子交换HPLC，从突变体SC26的P.chrysosporium胞外生长培养基中纯化rLDMTM6。该分离物通过HPLC进行氨基末端的氨基酸分析(Hunkapiller，M.and Hood，L，Methods in Enzymol，91227，486，1983)。该氨基末端的分析结果在图2中给出。
在该系统中未检测半胱氨酸，因此图中第3、14和15的氨基酸为空白记录。
实施例6木质素酶rLDMTM6蛋白的编码顺序的特征如图3所示，从克隆3-2假定的5′端所进行的DNA顺序信息的分析，表明具有与实验测定的完整蛋白质氨基末端相一致的顺序。由于克隆3-1和3-2的145碱基对区域匹配良好，通过克隆3-2和3-1在其共同的Ss+Ⅰ位点的相互连接，可以重建完整长度的cDNA克隆，得到大约1280碱基对的Eco RⅠ-Ss+Ⅰ-Eco RⅠ片段。该片段的顺序在表Ⅰ中给出。
将该Eco RⅠ-Ss+Ⅰ-Eco RⅠ片段(本文中称为RⅠ片段)克隆到经Eco RⅠ消化的质粒pREV2.2(在美国专利申请文件序号892680中已予介绍)得到质粒pLn102。
这是一种非常不标准的克隆方法，分别各自得到预估中氨基未端和C末端各半的蛋白质。
当RⅠ片段适宜于插入合适的表达载体如质粒并且载体用于转移由非琥珀突变型抑制的细菌如E.coli JM105时，则宿主细菌通过培养表达1所示氨基酸顺序的蛋白质，并且恰好在345位终止信号之前，在丙氨酸1位延伸至丙氨酸氨基酸顺序的C-末端上(344位)。当由琥珀突变型抑制的宿主如E.coli JM103被载体转移时，表1所示氨基酸顺序的C-末端是在氨基酸361位上的甘氨酸其位于362位上强终止信号之前。完整的rLDMTM6脱辅基蛋白的氨基酸顺序，可从含有丙氨酸1位至丙氨酸344位的344个残基的cDNA顺序中预测得到。
实施例7质粒pBSR3的构建由于在完整的rLDMTM6脱辅基蛋白的起始点上一部分丙氨酸密码子包括一部分BssHⅡ位点(GCGCGC)，所述位点的平衡位于丙氨酸密码子之前，并且包括负1位上所有转氨酸CGC密码子，所以含有rLDMTM6脱辅基蛋白的所有编码链信息的BssHⅡ-Ss+Ⅰ-Eco RⅠ DNA片段，首先用核酸内切限制酶BssHⅡ切割同一片段，并通过DNA聚合酶的克列诺夫片段处理插入形成的5′端突出部位，从克隆质粒pLn102(实施例6)切割得到，从而完全重新建立为丙氨酸和精氨酸编码的DNA。然后用核酸内切酶Eco RⅠ消化形成线型并经处理的质粒DNA，使之游离成为所需片段。经凝胶分离后的这个片段可用于形成表达质粒pBSR3，它是与图7所示质粒pREV2.2构成融合系统的一部分。如图7所示，质粒pREV2.2包括自启动子(P)下游区的多克隆位点(MCS)。多克隆位点内的限制位点示于图7直线MCS部分。为了制备pBSR3，用核酸内切限制酶Eco RⅠ和Eco RⅤ彻底消化质粒pREV2.2，形成的线性化质粒，按常规连接方法与以上得到的并经修饰的BssHⅡ-Ss+Ⅰ-Eco RⅠ片段连接。因此，在以pBSR3的GCC开始的完整蛋白的编码顺序，在其5′端成上游端前面的是精氨酸的CGC密码，依次直接在其前面的是为29个氨基酸编码的87个碱基对(由于MCS部分的影响)，依次直接在该29个氨基酸前面的是蛋氨酸的密码ATG。于是，pBSR3为氨基酸顺序编码，该顺序具有rLDMTM6脱辅基蛋白完整顺序，在其原始的氨基末端前面的是具有蛋氨酸作为其氨基末端的31个氨基酸部分。pBSR3在非琥珀型宿主中的表达将在实施例8中介绍。
实施例8E.coli(pBSR3)的发酵和重组(rLDMTM6)蛋白的提取20升E.coli(pBSR3)，NRRLB-18068发酵液在改进的2%酵母提取液培养基中，无氧培养24～32小时。培养基的组分如下成分含量酵母提取液20.0克/升酪蛋白胨20.0克/升酪蛋白氨基酸20.0克/升KH2PO42.0克/升K2HPO42.0克/升Na2HPO4·7H2O 2.0克/升氯霉素100.0克/升将采集的各等份细胞进行溶解，并采用SDS-PAGE法分析和考马斯兰蛋白染料染色，表观分子量约为41.000的蛋白带与非转移细胞控制相比更为主要。代表rLDMTM6脱辅基蛋白的这条蛋白带是采用对天然rLDMTM6反应的抗体和Western印迹分析法进行鉴定的(Towbin，H.，Staehelin，T.and Gordon，J.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.764350～4354，1979)，它与相对应的这个分子量而言，也是主要的免疫反应蛋白。该蛋白质未经糖基化，以区别于天然的(由P.chsysosporium产生的蛋白质。
当细胞经顺序溶解酶和珠磨处理溶解时，重组rLDMTM6脱辅基蛋白只有经离心后在细胞小片中能被检测到。
为了使重组rLDMTM6蛋白基本上得到溶解，细胞小片用4～8摩尔尿素溶液或用大约6摩尔的胍溶液进行处理。使用8摩尔的尿素溶液可使90～95%的rLDMTM6蛋白得到溶解，而4摩尔的尿素溶液只能溶解50%蛋白。
当将4摩尔尿素溶液(在50毫摩尔Tris-HCl和1毫摩尔EDTA组成的pH为8的TE缓冲液中含4摩尔尿素)加到溶解的培养物小片中时，50%的蛋白仍保留在小片中，需进一步与上清液分离。接着加8摩尔尿素溶液可使保留着的50%全部或几乎全部得到溶解。因此，95%以上的蛋白通过上述方法都能得到溶解。
此外还发现，在加入大约10毫摩尔的二硫苏糖醇时，其4摩尔尿素中的溶解效率几乎与8摩尔尿素的溶解水平相同。
实施例9表达质粒pLn104的制备质粒pBSR3(实施例7)是标准环出实验产生改性pBSR3的基础，其中除了一个密码子外(在1位Ala的GCC前的Arg的CGC密码)，这些密码子在1位Ala的起始ATG和GCC之间的核苷酸顺序中被切割(环出)。为得到这一结果，用核酸内切限制酶EcoRⅠ和NdeⅠ处理质粒pBSR3，生成的含木质素酶编码顺序的片段是凝胶分离，另一部分pBSR3通过核酸内切限制酶pstⅠ和凝胶分离的处理而线性化。于是，分离的两个片段与单链40碱基核苷酸组合，用来实现所要求的环出和具有如下顺序TTAATGAGGAGTCCCTTATGCGCGCCACCTGTTCCAACGG.
生成的异源双链用DNA聚合酶处理，并且生成的系统以常规方法分离出所要求的表达质粒pLn104。通过用pLn104转移E，coli JM105和培养成功的转化株，表达的345氨基酸木质素酶具有完整rLDMTM6蛋白的氨基酸顺序，Arg位于其正常的氨基末端之前。
实施例10表达质粒pLn105的构建在直接将起始因子ATG密码子置于为完全蛋白的1位丙氨酸编码的GCC前之后，用由pREV2.2得到E.coli启动子和连锁下游含常规非编码核蛋白体结合位的低核苷酸，按操纵于融合构建质粒pLn105。此后，pln105用来编码在其氨基末端前是精氨酸的完全蛋白的氨基酸顺序。更详细地说，用核酸内切限制酶BssHⅡ消化克隆实施例6的质粒(由EcoRⅠ切割与约1280bpEcoRⅠ-SstⅠ-EcoRⅠ片段的简单连接pREV2.2形成)制备质粒pln105。然后，通过标准方法用S1核酸酶消化得到的线性化质粒，除去由BssHⅡ消化产生的5′端突出部位。用在质粒pREV2.2多克隆的位点部分切割的核酸内切限制酶，消化生成的片段。生成的大片段通过连AGCTATAATGAGGAGTCCCTTATGGCTATTACTCCTCAGGGAATACCG接方法与低核苷酸相连接，该顺序含有与起始蛋氨酸(ATG)密码子和丙氨酸密码子的GC部位连接的非编码核蛋白体结合位GGAGTCCCTT(以便重新建立为完全蛋白的1-Ala编码的GCC)。用E.Coli宿主JM103.NRRLB-39403表达pln105。氨基末端可表示为蛋氨酸-丙氨酸-苏氨酸等，如表1。在大量分离的rLDM6蛋白中未测定蛋氨酸。
实施例11质粒pln106的构建如图6所示构建质粒pln106。从图6可归纳得到用在pREV2.2的MCS区切割的核酸内切限制酶BamHⅠ和SmaⅠ消化质粒pREV2.2。从消化片段分离得到的3980bpDNA大片段，用核酸内切限制酶BamHⅠ(在pREV2.2的MCS部位切割)及用NaeⅠ(在1170位和1171位的核苷酸之间切割)消化质粒pln105，生成的约1118bp片段与消化片段分离。用常规连接方法将上述约3980bp和1118bp的分离片段连接起来，生成的质粒pln106包含这些基因，如表1给出的抗氯霉素和抗氨必西林、复制起点、E.Coli启动子、顺序GGAGTCCCTT的非编码核蛋白体结合部位、起始密码子ATG和位91GCC起始至位1170 GTGGCC的DNA顺序。这个DNA顺序包括在位91开始，延伸至位1122(末端为GGTGCT)顺序的编码rLDMTM6蛋白。
实施例12重组rLDMTM6脱辅基蛋白在E.Coli(pln106)中的表示质粒pln106通过常规方法转移入E.Coli SG20251(NRRL 15918)，如实施例7在20升发酵液中培养，诱导rLDMTM6脱辅基蛋白的表达。采用顺序溶菌酶和珠磨处理溶解所采集的细胞，离心分离后，主要在小片部分测定重组rLDMTM6脱辅基蛋白。如实施例8所述，重组rLDMTM6脱辅基蛋白与不溶解的小片部分分离。该蛋白溶液在4摩尔尿素、50毫摩尔乙酸钠、10毫摩尔二硫苏糖醇(DTT)，pH6中，通过萃取纯化至30%，并用POLYTRON(Brinkman Instrunements，Westbury，NY)再悬浮30秒至3分钟。用适宜的离心分离法将上清萃取液与小片分离。蛋白溶液用于缓冲液A(4摩尔尿素、50毫摩尔乙酸钠和5毫摩尔DTT，pH6)的DEAESEPHAROSE阴离子交换柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)。梯度0至0.5～1.0摩尔的Nacl在缓冲液A中展开，收集的馏分用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定(见实施例1)，经电泳分离后，用考马斯蓝着色蛋白质。用这种方法从E.Coli菌株SG 20251(NRRL B-15918)产生rLDMTM6的表观分子量的39.5千道尔顿(Kd)。从E.Coli的pln106产生的rLDMTM6未被糖基化，以与天然(产生的P.Chrysosporium)蛋白区别。
对由DEAD-Sepharose柱收集的馏分，还检验其带有抗rLDM6木质素酶抗体的免疫反应活性。汇集具有最强免疫反应活性的馏分(25毫升)，并用于4摩尔尿素、50毫摩尔KH2PO4、4毫摩尔DTT，pH7.0的分级柱，即S-300(400毫升)Sephacryl(Pharmacia)。还检验分级柱中馏分(各10毫升)的免疫反应活性，汇集最强烈的反应部分。当用SDS-PAGE检查时，根据扫描考马斯蓝着色型判断，所汇集的这部分馏分约含20%rLDMTM6。
如此制备的rLDMTM6的前8个氨基末端氨基酸测定Ala Thr-Ser Asn Gly lys Thr，其中该系统中的空位一般是半胱氨酸残基，因此，在这些发酵和生产条件下，没有发现编码蛋氨酸的起始密码子ATG。氨基末端的蛋氨酸可存在于其它rLDMTM6制剂中，取决于E.Coli菌株，表示水平和纯化方法。
实施例13重组rLDMTM6木质素酶的重建从P.Chrysosporium中血红素重建木质素酶或血红素重建重组木质素酶，迄今未获得成功。
为了获得良好的rLDMTM6活性，原理可以是冰冻细胞或新鲜的采集细胞。如实施例10所述制备蛋白溶液。尿素萃取混合物在室温下不超过6小时，在此期间，萃取液离心30分钟至15小时，这取决于离心力。直接在阴离子交换柱展开，在24小时内将汇集的组分放入重建protocol，除非在-20℃存储含所汇集rLDMTM6组分，他们可在重建之前存储较久。
用纯度5～100%的rLDMTM6制剂达到成功的重建，具有rLDMTM6的活性至少由藜芦基醇/分/毫克rLDMTM6产生26单位的藜芦基醛的比活性。这些rLDMTM6制剂中表示克隆pln105或pln106的细胞制成(见实施例10、11和12)。这些制剂的蛋白质浓度在由一般为0.1～0.3摩尔Nacl的阴离子交换柱的洗脱缓冲液中为0.1～1毫克/毫升制剂。如实施例12所述，在DEAE-Sepharase柱收集组分的分级柱上洗脱后，也可得到用来重建酶的蛋白制剂。由分级柱分离的rLDMTM6蛋白的纯度估计达20%。
操作重建过程之前，从DEAE-Sepharose柱或分级柱得到的蛋白溶液必需首先渗析，从蛋白溶液中除去尿素。由于在缓冲的蛋白溶液中存在DTT，蛋白质在还原形式下用于重建。
采用一个方法如下所述从蛋白质总浓度3毫克/毫升的分级柱汇集的组分和表示约20%全蛋白的重组rLDMTM6是处于pH7.0的4摩尔尿素、50毫摩尔KH2PO4、4毫摩尔DTT缓冲液中。为去除尿素，在4℃下，用超过200倍体积的pH8.0的50毫摩尔Tris-Cl、1毫摩尔DTT、20%(体积/体积)甘油的缓冲液渗析过夜。渗析后，将刚溶解于0.1克当量KOH的超过4倍摩尔的正铁血红素Ⅸ(3)加入这种蛋白溶液。然后，在4℃下，在pH8.0的50毫摩尔Tris-Cl、1毫摩尔还原谷胱甘肽、100微摩尔氧化谷胱甘肽渗析过夜。最后，样品在4℃下，用pH6.0的10毫摩尔乙酸钠水溶液渗析过夜。也已证明这种重建方法的改进是有效的。改进包括在正铁血红素加入前，用含还原和氧化谷胱甘肽的缓冲液，渗析rLDMTM6蛋白溶液。实验如下所述在4℃下，用超过200倍体积的包括pH8.0的50毫摩尔Tris-Cl、1毫摩尔还原谷胱甘肽、100微摩尔氧化谷胱甘肽的缓冲液对由上述分级柱得到的蛋白溶液渗析过夜。然后，将超过4倍摩尔的正铁血红素加入渗析过的蛋白溶液，最终在4℃下，用pH6.0的10毫摩尔乙酸钠水溶液对得到的溶液渗析过夜。
409毫微米索里特氏吸收带的存在表示重建成功。
概括地说，重建protocol包括(a)将1至10倍的过量血红素加到脱辅基蛋白溶液(b)用渗析溶液渗析在(a)中得到的溶液，该渗析溶液包括pH5～10的0.1至5毫摩尔还原硫氢基氧化还原系统和10至500微摩尔氧化的硫氢基氧化还原系统。
渗析溶液还可含5～30%(体积/体积)甘油为佳，以20%甘油更佳。
改进重建protocol的特征概括如下(a)用pH5～10的包括1～5毫摩尔还原硫氢基氧化还原系统和10微摩尔至500微摩尔氧化的硫氢基氧化还原系统的渗析溶液，渗析脱辅基蛋白的缓冲液。
(b)将1至10倍的过量摩尔血红素加入在(a)中得到的脱辅基蛋白溶液。
为去除过量血红素，最好用pH4～8的水溶液再渗析在两种重建方法的(b)中得到的溶液。
如果重建过程得不到藜芦基醇氧化的良好比活性，还有一些称作再活化方法会导至rLDMTM6具有高比活性。这样的一种再活化方法是用10～200毫摩尔磷酸钾或等量的pH5～7缓冲液稀释初始重建溶液至0.1～0.5毫克/毫升rLDMTM6，添加4倍过量摩尔(超过rLDMTM6蛋白质)的正铁血红素Ⅸ，在4～37℃孵化1～24小时。在4～37℃下和4～24小时内，在10～200毫摩尔磷酸钾或等量的pH5～7缓冲液中重复渗析步骤。此外，未经稀释的初始重建溶液加入4倍过量摩尔的正铁血红素Ⅸ，接着通过10～200毫摩尔磷酸钾或等量的pH5～7缓冲液的Sephadex G-50柱，生成含rLDMTM6的洗脱液，与起始重组溶液相比具有优良的比活性。
实施例14重组rLDMTM6木质素酶的活性业已证明按实施例13得到的重建重组木质素酶rLDMTM6在木质素模拟化合物测定和含有木质素的测定中是有效的。
所用的木质素模拟化合物测定是(1)藜芦基醇氧化测定(VAO)，(2)1，2，4，5-四甲氧基苯(TMB)测定，以及(3)adlerol测定。
C2芳香醇对醛的氧化作用的VAO测定试验如实施例1所述。
脱甲氧基化的TMB测定试验。每1摩尔作用物消耗1摩尔过氧化氢的木质素酶反应产物是2摩尔甲醇和2，5-甲氧苯醌。反应条件为2至5微克纯化酶、20毫摩尔酒石酸钠(pH2.5)、64微摩尔过氧化氢和1毫摩尔1，2，4，5-四甲氧基苯。在450毫微米跟踪反应，表现出黄色芳基阳离子基团的中间产物。
Cα-Cβ键的切开和对Cα醛产生氧化作用的测定试验。反应条件和控制与VAO测定相同，只是alderol替换藜芦基醇。
用带有YSI2510氧化酶探查物的YSI型25氧化酶测定器(YellowSpringsInstrumentCo.，Inc.，YellowSprings，OH)测量过氧化物随时间的消耗速率，进行木质素测定。反应条件与VAO测定相同，但具有用磨制的木质素或木质素纸浆取代的40微摩尔过氧化氢和藜芦基醇20至250微克/毫升。
图表1给出典型的比活性，用rLDMTM6蛋白的VAO和TMB测定方法测量，由E.Coli NRRL B-18157(非琥珀型宿主)表达(见实施例12)，以及如实施例13所述，与天然木质素酶库的比活性相比进行重建，其中P.Chrysosporium rLDMTM6是主要的。asloerol对rLDMTM6酶的比活性可与P.Chrysospori rLDMTM6酶相比拟。
图表1具有模拟化合物的木质素酶活性VAO(单位/毫克)+TMB(任意单位/毫克)＊重建rLDMTM6 25.5 510P.Chrysosporium rLDMTM6 22.9 422＊TMB测定比活性可以表示为在450毫微米每毫克rLDMTM6每分钟增加的吸收单位。
+VAO测定比活性可以表示为每毫克rLDMTM6的国际单位(每分钟形成藜芦基醛的微摩尔)。
重建重组木质素酶与木质素的比活性，在加入5分钟后表明对纯松木质素AT(木质素纸浆)是76.9单位/毫克rLDMTM6，对磨制的木质素为66.0单位/毫克rLDMTM6(1个单位表示每分钟消耗1毫摩尔过氧化氢)。
重建的最后步骤是用pH6.0的10毫摩尔乙酸钠渗析，在这最后渗析后，重建rLDMTM6的活性在储藏中提高。图4表示在4℃储藏8天中重建rLDMTM6的VAO活性的提高。0天表示从pH6.0的10毫摩尔乙酸钠渗析中取出样品的时间。按上述进行VAO测定，8天中活性提高10倍。再储藏5天后，活性不再增加，但相当稳定。在渗析后4℃下储藏，P.Chrysosporium木质素酶的活性无任何提高。
用木质素在过氧化物消耗测定和TMB测定中也可观察到活性随重建rLDMTM6时间而提高。用天然的P.Choysosporium材料观察不到离析后活性的提高。
从过氧化物消耗计算rLDMTM6储藏7天的活性是76.9单位/毫克rLDMTM6，其一个单位表示与储藏6天酶的39.1单位/毫克rLDMTM6比较，每分钟1毫摩尔过氧化氢的消耗。活性的提高依赖于温度。表2表示用同样的重建rLDMTM6所做实验的数据，并示于图4。上述其它实施例所要求蛋白质产物的重建，导致具有类似VAO活性的木质素酶蛋白质，pBSR3(实施例7)蛋白质的活性较低除外。
图表2rLDMTM6的活性提高与温度关系天数储藏温度 VAO活性单位/毫克rLDMTM6(37℃下测定)5原料5.5564℃5.705.6523℃7.257.05重复试验室温下活性比4℃时提高26%。
实施例15质粒pln1001的构建和重组rLDMTM6
蛋白在酿酒酵母的表达在磷酸酵母三碳糖同分异构酶(TPI)转录启动子和终止区之区，插入含91位起始和1172位末端(见表Ⅰ)的rLDMTM6核苷酸顺序，通过与线性酶母E.Coli穿梭机制载体YEp6(Struhl.，K.等Proc.Nat.Acad，Sci.761035～1039页(1979年)的连接构建pln1001;这种插入还包括在TPI启动子和rLDMTM6编码顺序之间，有含转化酶信号顺序(INV-SS)的66bp额外低核苷酸(Carison，M.，Taussig，R.，Kustu，S.and Bolein，D.，Mol.Biol(1983)439～447)，以致在酿酒酵母中表达时可分泌出rLDMTM6蛋白质。
按第二步骤在分离5′和3′与YEp6连接的构建插入。
A)从进一步分离TPI启动子构建质粒PTPR从图9可概括为用预先由SalⅠ消化的M13mp10载体(Messing，J.andViera，J.Gene19260～276页1982年)连接含TPI启动子和位于SalⅠ联结子旁的PTPIC-10的1200bpBglⅡ-BglⅡ片段(Alber，T.andKawasaki，G.J.Molec.andAppliedGen.1419～434〔1982)，以便得到MTPⅠ载体，其中M13mp10的HindⅢ和BamHⅠ位点分别连接到TPⅠ启动子的5′和3′端。
然后，产生直接致突变的低核苷酸(Vlasuk，G.P.andInouye，S.ExperimentalManipulationofgeneexpression(ed.H.Inouye)AcademicPress291～303页)和(Itakura，K.，Rossi，J.J.andWallace，R.B.(1984年)Ann.Rev.Biochem.53323～356页)，以致在TPⅠ的氨基末端蛋氨酸的密码子后，直接形成HaeⅢ位点。
含TPⅠ启动子的BamHⅠ-HindⅢ片段从MTPⅠ移动，质粒pTPR是该片段与预先BamHⅠ和Hind消化的具有pBR322片段连接的产物。
B)5′部分的构建(如图10所示)该TPⅠ启动子是与质粒pTPR凝胶分离得到的合适的1000bpEcoRⅠ-HaeⅢ片段。
用BssHⅡ和KpnⅠ(KpnⅠ切割728位和729位的核苷酸之间rLDM6编码顺序)线性化含RⅠ片段的质粒，当含从琼脂糖胶分离的rLDM6编码顺序的5′末端时，产生637bp片段66bp片段顺序为CTCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTTGCAGCAAAATATCTGCATCAATGGAGAAAACGTTCGAAAGGAAAAGGAAAACCGACCAAAACGTCGGTTTTATAGACGTAGTTGCGCGC其含有转化酶信号顺序，带有5′钝端和在3′末端的BsshⅡ重叠，并合成4个低核苷酸;1A是5′末端40碱基编码链，1B是3′末端22碱基编码链，2A是5′末端45碱基非编码链，2B是3′末端21碱基非编码链。为避免形成连环体，只有1B和2B被激酶催化。退火和连接4个低核苷酸，生成分离的INNss片段。
约1000bpEcoRⅠ-HaeⅢ片段、637bpBssHⅡ-KpnⅠ片段和66bp片段与EcoRⅠ-KpnⅠ消化的pUC19连接在一起(Yanisch-Perron，C.Viera，J.andMessing，J.(1985))。
c)3′部位的构建(如图10所示)从含TPI转录终止区的质粒pTPIC-10的约700bpEcoRⅠ-CcoRⅤ片段是凝胶分离。
rLDM6编码顺序的444bpNaeⅠ-KpnⅠ片段也是凝胶分离。
700bp和444bp片段与EcoRⅠ-KpnⅠ消化的pUC19连接。
D)pln1001的构建(如图10所示)含5′单位的KpnⅠ-EcoRⅠ片段和含3′部位的KpnⅠ-EcoRⅠ片段，分别与B)和C)构建的质粒凝胶分离，并且与用EcoRⅠ消化的YEp6连接。
E)重组木质素酶脱辅基蛋白H8在酿酒酵母中的表示。
生成的质粒pln1001转入宿主酿酒酵母DBY747(伯克利，加利福尼亚大学酵母三传原料中心)，在用亮氨酸、尿嘧啶、色氨酸、蛋氨酸、酪蛋白氨基酸(Difco，Detroit，MI)和葡萄糖补充的基本培养基中接种DBY747(pln1001)，随着剧烈振荡，在30℃孵化18小时，此外，宿主可在含0.67%酵母氮基质、2%葡萄糖和0.5%酪蛋白氨基酸(Difco)的合成培养基中生长。采集这些细胞，通过珠磨溶解，从未溶解细胞片中，用多克降抗体对P.ChoysosporiumrLDM6免疫反应测定rLDM6蛋白质的表观分子量为41000道尔顿。
表1RI片段的核苷酸顺序(其中包括编码rLDM6脱辅基蛋白顺序)和导出rLDM6脱辅基蛋白的氨基酸顺序位1→GAATTCCGAGAGAGATAGCTGCGAAGAGCTGCTATCTCTCTC位91GCTCTCTTGCTCTCGGCTGCGAACGCGGCTGCGGTGATCGAG位
ACC TGT TCC AAC GGC AAG ACC GTC GGC GAT GCGARGALATHRCYSSERASNGLYLYSTHRVALGLYASPALA(-1)(1)TCG TGC TGC GCT TGG TTC GAC GTC CTG GAT
CAG CAGSERCYSCYSALATRPPHEASPVALLEUASPASPILEGLNGLNAAC CTG TTC CAC
CAG TGC GGC
GCG CAC GAGASNLEUPHEHISGLYGLYGLNCYSGLYALAGLUALAHISGLUTCGATTCGTCTCGTCTTCCACGACTCCATCGCAATTTCGCCCSERILEARGLEUVALPHEHISASPSERILEALAILESERPROGCCATGGAGGCACAGGGCAAGTTCGGCGGCGGTGGTGCTGACALAMETGLUALAGLNGLYLYSPHEGLYGLYGLYGLYALAASPGGCTCCATCATGATCTTCGACGATATCGAGACTGCGTTCCACGLYSERILEMETILEPHEASPASPILEGLUTHRALAPHEHISCCTAACATCGGTCTCGACGAGATCGTCAAGCTCCAGAAGCCAPROASNILEGLYLEUASPGLUILEVALLYSLEUGLNLYSPRO
TTCGTTCAGAAGCACGGTGTCACCCCTGGTGACTTCATCGCCPHEVALGLNLYSHISGLYVALTHRPROGLYASPPHEILEALATTCGCTGGTGCTGTCGCGCTCAGCAACTGCCCTGGTGCCCCGPHEALAGLYALAVALALALEUSERASNCYSPROGLYALAPROCAGATGAACTTCTTCACTGGTCGTGCACCTGCTACCCAGCCCGLNMETASNPHEPHETHRGLYARGALAPROALATHRGLNPROGCT CCT GAT
GTC CCC GAG CCC TTC CAC ACT GTC GACALAPROASPGLYLEUVALPROGLUPROPHEHISTHRVALASPCAAATCATCAACCGTGTCAACGACGCAGGCGAGTTCGATGAGGLNILEILEASNARGVALASNASPALAGLYGLUPHEASPGLUCTCGAGCTTGTCTGGATGCTCTCCGCGCACTCCGTCGCAGCGLEUGLULEUVALTRPMETLEUSERALAHISSERVALALAALAGTGAACGACGTCGACCCGACCGTCCAGGGTCTGCCCTTTBACVALASNASPVALASPPROTHRVALGLNGLYLEUPROPHEASPTCGACCCCCGGAATCTTCGACTCCCAGTTCTTCGTCGAGACTSERTHRPROGLYILEPHEASPSERGLNPHEPHEVALGLUTHRCAG CTT CGT GGT
TTC CCC GGC TCT GGC GGC AAC CAAGLNLEUARGGLYTHRALAPHEPROGLYSERGLYGLYASNGLNGGCGAGGTCGAGTCGCCGCTCCCTGGCGAAATTCGCATCCAGGLYGLUVALGLUSERPROLEUPROGLYGLUILEARGILEGLNTCCGACCACACTATCGCCCGCGACTCACGCACGGCGTGTGAASERASPHISTHRILEALAARGASPSERARGTHRALACYSGLUTGGCAGTCCTTCGTCAACAACCAGTCCAAGCTCGTCGATGACTRPGLNSERPHEVALASNASNGLNSERLYSLEUVALASPASPTTCCAATTCATTTTCCTCGCCCTCACCCAGCTCGGCCAGGACPHEGLNPHEILEPHELEUALALEUTHRGLNLEUGLYGLNASP
CCGAACGCGATGACCGACTGCTCGGATGTTATCCCGCAGTCCPROASNALAMETTHRASPCYSSERASPVALILEPROGLNSERAAGCCCATCCCTGGCAACCTCCCATTCTCGTTCTTCCCCGCTLYSPROILEPROGLYASNLEUPROPHESERPHEPHEPROALAGGCAAGACCATCAAAGACGTTGAGCAGGCGTGTGCGGAGACCGLYLYSTHRILELYSASPVALGLUGLNALACYSALAGLUTHRCCCTTCCCGACTCTCACCACTCTCCCGGGCCCCGAGACGTCCPROPHEPROTHRLEUTHRTHRLEUPROGLYPROGLUTHRSERGTCCAGCGCATCCCTCCGCCTCCGGGTGCTTAGATGATTCCAVAL GLN ARG ILE PRO PRO PRO PRO GLY ALA＊＊＊MET ILE PRO(344)TACAGAATACGCCTCGAACCGACTGTAACGGTG
TYRARGILEARGLEUGLUPROTHRVALTHRVALALAGLY(361)CTCGTGACGGAACTTCGGCTTTACTAGATTTCATCCATTGTATCTCTGCATCTGACTACGAATCTTATTCGTCTACTCTCTTAAAAAAAAAAAAACCGGAAT
在表1中，DNA核苷酸密码顺序以三联体排列组成，或密码子与DNA编码的氨基酸蛋白质顺序一致。在表1的各种位置标上核苷酸，或者标记在上面的行内，或者用箭头标记。表1还表示用核苷酸编码的氨基酸蛋白顺序，在这种蛋白质顺序中的氨基酸(或终止)用括弧标记在下面的行内完整顺序的第1个氨基酸用正数开始标记位置)。在预计的氨基酸顺序中，给以3个星号代表终止信号的核苷酸三联体(密码子)，可以认为，在抑制宿主中密码子TAG不是有效的终止区，于是该蛋白质延至下一个TAA密码子。反之，在无抑制基因宿主中，蛋白质在TAG密码子处终止。表示蛋白质的颗粒抑制基因菌株确定在3个星号标志的琥珀终止密码子处连接氨基酸。
业已查明在1位Ala之前的核苷酸顺序部分是人工制品，或换言之其与用天然mRNA编码的假设信号顺序无关。
权利要求
1.一种木质素酶蛋白的分离重组体或合成DNA的编码顺序。
2.用于木质素酶蛋白的DNA密码，包括下列氨基酸顺序。10ALATHRCYSSERASNGLYLYSTHRVALGLYASPALA20SERCYSCYSALATRPPHEASPVALLEUASPASPILEGLNGLN3040ASNLEUPHEHISGLYGLYGLNCYSGLYALAGLUALAHISGLU50SERILEARGLEUVALPHEHISASPSERILEALAILESERPRO60ALAMETGLUALAGLNGLYLYSPHEGLYGLYGLYGLYALAASP7080GLYSERILEMETILEPHEASPASPILEGLUTHRALAPHEHIS90PROASNILEGLYLEUASPGLUILEVALLYSLEUGLNLYSPRO100110PHEVALGLNLYSHISGLYVALTHRPROGLYASPPHEILEALA120PHEALAGLYALAVALALALEUSERASNCYSPROGLYALAPRO130GLNMETASNPHEPHETHRGLYARGALAPROALATHRGLNPRO140150ALAPROASPGLYLEUVALPROGLUPROPHEHISTHRVALASP160GLNILEILEASNARGVALASNASPALAGLYGLUPHEASPGLU170180LEUGLULEUVALTRPMETLEUSERALAHISSERVALALAALA190VALASNASPVALASPPROTHRVALGLNGLYLEUPROPHEASP200SERTHRPROGLYILEPHEASPSERGLNPHEPHEVALGLUTHR210220GLNLEUARGGLYTHRALAPHEPROGLYSERGLYGLYASNGLN230GLYGLUVALGLUSERPROLEUPROGLYGLUILEARGILEGLN240250SERASPHISTHRILEALAARGASPSERARGTHRALACYSGLU260TRPGLNSERPHEVALASNASNGLNSERLYSLEUVALASPASP270PHEGLNPHEILEPHELEUALALEUTHRGLNLEUGLYGLNASP280290PROASNALAMETTHRASPCYSSERASPVALILEPROGLNSER300LYSPROILEPROGLYASNLEUPROPHESERPHEPHEPROALA310320GLYLYSTHRILELYSASPVALGLUGLNALACYSALAGLUTHR330PROPHEPROTHRLEUTHRTHRLEUPROGLYPROGLUTHRSER340344VALGLNARGILEPROPROPROPROGLYALA.
3.用于木质素酶蛋白的DNA密码，包括下列氨基酸顺序10ALATHRCYSSERASNGLYLYSTHRVALGLYASPALA20SERCYSCYSALATRPPHEASPVALLEUASPASPILEGLNGLN3040ASNLEUPHEHISGLYGLYGLNCYSGLYALAGLUALAHISGLU50SERILEARGLEUVALPHEHISASPSERILEALAILESERPRO60ALAMETGLUALAGLNGLYLYSPHEGLYGLYGLYGLYALAASP7080GLYSERILEMETILEPHEASPASPILEGLUTHRALAPHEHIS90PROASNILEGLYLEUASPGLUILEVALLYSLEUGLNLYSPRO100110PHEVALGLNLYSHISGLYVALTHRPROGLYASPPHEILEALA120PHEALAGLYALAVALALALEUSERASNCYSPROGLYALAPRO130GLNMETASNPHEPHETHRGLYARGALAPROALATHRGLNPRO140150ALAPROASPGLYLEUVALPROGLUPROPHEHISTHRVALASP160GLNILEILEASNARGVALASNASPALAGLYGLUPHEASPGLU170180LEUGLULEUVALTRPMETLEUSERALAHISSERVALALAALA190VALASNASPVALASPPROTHRVALGLNGLYLEUPROPHEASP200SERTHRPROGLYILEPHEASPSERGLNPHEPHEVALGLUTHR210220GLNLEUARGGLYTHRALAPHEPROGLYSERGLYGLYASNGLN230GLYGLUVALGLUSERPROLEUPROGLYGLUILEARGILEGLN240250SERASPHISTHRILEALAARGASPSERARGTHRALACYSGLU260TRPGLNSERPHEVALASNASNGLNSERLYSLEUVALASPASP270PHEGLNPHEILEPHELEUALALEUTHRGLNLEUGLYGLNASP280290PROASNALAMETTHRASPCYSSERASPVALILEPROGLNSERLYSPROILEPROGLYASNLEUPROPHESERPHEPHEPROALA310320GLYLYSTHRILELYSASPVALGLUGLNALACYSALAGLUTHR330PROPHEPROTHRLEUTHRTHRLEUPROGLYPROGLUTHRSER340VAL GLN ARG ILE PRO PRO PRO PRO GLY ALA＊＊＊MET ILE PRO350TYRARGILEARGLEUGLUPROTHRVALTHRVALALAGLY.
4.根据权利要求
2或3的DNA顺序，其中用于蛋氨酸的ATG密码在用于丙氨酸的氨基末端密码之前。
5.根据上述权利要求
之任一项的DNA顺序，系天然来源的基因组DNA顺序。
6.一种与权利要求
2、3和4限定的DNA在约束杂交条件下进行杂交的DNA密码顺序。
7.根据上述权利要求
之任一项的DNA顺序，其5′端与信号顺序可经操作连接。
8.根据上述权利要求
之任一项的DNA顺序，与用于原核宿主和/或真核宿主中表达的控制顺序可经操作连接。
9.一种含有并能表达权利要求
1至8中任一项限定的DNA顺序的转移载体。
10.一种选自pBSR，pLn104，pLn105，pLn106和pLn1001的质粒。
11.用权利要求
1至8之任一项限定的DNA顺序转化的重组宿主细胞。
12.一种产生木质素酶蛋白的方法，其中包括培养权利要求
11的转化细胞。
13.一种按权利要求
12的方法得到的重组木质素酶蛋白。
14.一种未糖基化的木质素酶蛋白，包括下列氨基酸顺序ALATHRCYSSERASNGLYLYSTHRVALGLYASPALASERCYSCYSALATRPPHEASPVALLEUASPASPILEGLNGLNASNLEUPHEHISGLYGLYGLNCYSGLYALAGLUALAHISGLUSERILEARGLEUVALPHEHISASPSERILEALAILESERPROALAMETGLUALAGLNGLYLYSPHEGLYGLYGLYGLYALAASPGLYSERILEMETILEPHEASPASPILEGLUTHRALAPHEHISPROASNILEGLYLEUASPGLUILEVALLYSLEUGLNLYSPROPHEVALGLNLYSHISGLYVALTHRPROGLYASPPHEILEALAPHEALAGLYALAVALALALEUSERASNCYSPROGLYALAPROGLNMETASNPHEPHETHRGLYARGALAPROALATHRGLNPROALAPROASPGLYLEUVALPROGLUPROPHEHISTHRVALASPGLNILEILEASNARGVALASNASPALAGLYGLUPHEASPGLULEUGLULEUVALTRPMETLEUSERALAHISSERVALALAALAVALASNASPVALASPPROTHRVALGLNGLYLEUPROPHEASPSERTHRPROGLYILEPHEASPSERGLNPHEPHEVALGLUTHRGLNLEUARGGLYTHRALAPHEPROGLYSERGLYGLYASNGLNGLYGLUVALGLUSERPROLEUPROGLYGLUILEARGILEGLNSERASPHISTHRILEALAARGASPSERARGTHRALACYSGLUTRPGLNSERPHEVALASNASNGLNSERLYSLEUVALASPASPPHEGLNPHEILEPHELEUALALEUTHRGLNLEUGLYGLNASPPROASNALAMETTHRASPCYSSERASPVALILEPROGLNSERLYSPROILEPROGLYASNLEUPROPHESERPHEPHEPROALAGLYLYSTHRILELYSASPVALGLUGLNALACYSALAGLJTHRPROPHEPROTHRLEUTHRTHRLEUPROGLYPROGLUTHRSERVALGLNARGILEPROPROPROPROGLYALA.
15.一种未糖基化的木质素酶蛋白，包括下述氨基酸顺序ALATHRCYSSERASNGLYLYSTHRVALGLYASPALASERCYSCYSALATRPPHEASPVALLEUASPASPILEGLNGLNASNLEUPHEHISGLYGLYGLNCYSGLYALAGLUALAHISGLUSERILEARGLEUVALPHEHISASPSERILEALAILESERPROALAMETGLUALAGLNGLYLYSPHEGLYGLYGLYGLYALAASPGLYSERILEMETILEPHEASPASPILEGLUTHRALAPHEHISPROASNILEGLYLEUASPGLUILEVALLYSLEUGLNLYSPROPHEVALGLNLYSHISGLYVALTHRPROGLYASPPHEILEALAPHEALAGLYALAVALALALEUSERASNCYSPROGLYALAPROGLNMETASNPHEPHETHRGLYARGALAPROALATHRGLNPROALAPROASPGLYLEUVALPROGLUPROPHEHISTHRVALASPGLNILEILEASNARGVALASNASPALAGLYGLUPHEASPGLULEUGLULEUVALTRPMETLEUSERALAHISSERVALALAALAVALASNASPVALASPPROTHRVALGLNGLYLEUPROPHEASPSERTHRPROGLYILEPHEASPSERGLNPHEPHEVALGLUTHRGLNLEUARGGLYTHRALAPHEPROGLYSERGLYGLYASNGLNGLYGLUVALGLUSERPROLEUPROGLYGLUILEARGILEGLNSERASPHISTHRILEALAARGASPSERARGTHRALACYSGLUTRPGLNSERPHEVALASNASNGLNSERLYSLEUVALASPASPPHEGLNPHEILEPHELEUALALEUTHRGLNLEUGLYGLNASPPROASNALAMETTHRASPCYSSERASPVALILEPROGLNSERLYSPROILEPROGLYASNLEUPROPHESERPHEPHEPROALAGLYLYSTHRILELYSASPVALGLUGLNALACYSALAGLUTHRPROPHEPROTHRLEUTHRTHRLEUPROGLYPROGLUTHRSERVAL GLN ARG ILE PRO PRO PRO PRO GLY ALA＊＊＊MET ILE PROTYRARGILEARGLEUGLUPROTHRVALTHRVALALAGLY.
16.根据权利要求
14或15的木质素酶蛋白，其中蛋氨酸位于丙氨酸氨基末端之前。
17.一种重建活性血红蛋白的方法，其中包括在存在氧化还原系统的条件下，脱辅基蛋白与血红素反应的步骤。
18.根据权利要求
17的方法，其中包括(a)用含有氧化还原系统的渗析溶液渗析脱辅基蛋白溶液。(b)将血红素加到步骤(a)中得到的脱辅基蛋白溶液。
19.根据权利要求
18的方法，其中步骤(a)的渗析溶液含有5～30%(体积/体积)的丙三醇。
20.根据权利要求
17的方法，其中包括(a)将血红素加到脱辅基蛋白溶液;(b)用含有氧化还原系统的渗析溶液渗析按步骤(a)得到的溶液。
21.根据权利要求
18，19或20的方法，其中包括用水溶液渗析按步骤(b)得到的溶液。
22.根据权利要求
17至21之任一项的方法，其中氧化还原系统是硫氢基氧化还原系统。
23.根据权利要求
18至22任一项的方法，其中渗析溶液含有0.1至5毫摩尔还原的硫氢基氧化还原系统和10至500微米氧化的氧化还原系统，pH为5至10。
24.根据权利要求
17至23之任一项的方法，其中所述氧化还原系统为谷胱甘肽。
25.根据权利要求
17至24之任一项的方法，其中以1倍至10倍过量摩尔数的血红素加到脱辅基蛋白溶液。
26.根据权利要求
17至25之任一项的方法，其中以4倍过量摩尔数的血红素加到脱辅基蛋白溶液。
27.根据权利要求
17至26之任一项的方法，其中蛋白质为还原蛋白。
28.根据权利要求
17至27之任一项的方法，其中蛋白质是过氧化物酶蛋白。
29.根据权利要求
17至28之任一项的方法，其中蛋白质是木质素酶蛋白，血红素是正铁血红素Ⅸ。
30.根据权利要求
17至29之任一项的方法，其中蛋白质是权利要求
13、14、15或16限定的木质素酶蛋白。
31.一种根据权利要求
17至30之任一项的方法得到的活性血红蛋白。
32.一种根据权利要求
17至30之任一项的方法得到的木质素酶。
专利摘要
通过克隆编码木质素酶脱辅基蛋白的P.Chrysosporium的DNA顺序，获得重组木质素酶，在适宜的宿主细胞中表达重组脱辅基蛋白，以及用血红素重建重组木质素酶蛋白。
文档编号C12N15/09GK87106313SQ87106313
公开日1988年5月4日 申请日期1987年9月11日
发明者罗伯特·L·法雷尔, 保罗·吉利普, 阿尔吉斯·安尼里昂尼斯, 卡沙雅·贾, 瓦哈利安, 西奥多·E·梅昂, 姆斯斯·R·鲁希布鲁斯·A·萨多尼克, 詹尼弗·A·杰克逊 申请人:山道士有限公司